Композиция бактериальных штаммов, смесь для биоремедиации и применение указанной композиции для удаления из почвы загрязняющих веществ, а также способ очистки почвы от загрязняющих веществ

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для очистки почвы от загрязняющих веществ. Предложена композиция из 11 штаммов бактерий, способных метаболизировать ароматические нитросоединения и устойчивых к антибиотикам и тяжелым металлам. Композиция депонирована в Коллекции промышленных микроорганизмов IAFB - Института сельскохозяйственной и пищевой биотехнологии в Варшаве под номером KKP 2041p. Предложен способ обработки почвы с применением вакцины, содержащей композицию штаммов. Группа изобретений обеспечивает эффективную биоремедиацию почвы, загрязненной ароматическими нитросоединениями, тяжелыми металлами и антибиотиками. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 1 ил., 12 табл., 4 пр.

.

 

Область техники

Изобретение относится к композиции, состоящей из 11 штаммов: штамма Stenotrophomonas sp. 2L, штамма Stenotrophomonas sp. 5L, штамма Stenotrophomonas sp. 6L, штамма Stenotrophomonas sp. 3N, штамма Achromobacter sp.4P, штамма Arthrobacter sp. IN, штамма Brevundimonas sp. 2N, штамма Brevundimonas sp. 5N, штамма Brevundimonas sp. 6N, штамма Pseudomonas sp. 3G и штамма Pseudomonas sp. 4G, депонированной под номером KKP 2041р., вакцине для биоремедиации (смесь для биоремедиации), содержащей композицию данных бактериальных штаммов, применению ее для удаления загрязняющих веществ из почвы, а также способу обработки почвы.

Уровень техники

Непрерывное развитие промышленности связано с появлением в окружающей среде химических соединений, которые в природных условиях там не встречаются. В настоящее время нитросоединения представляют собой один из основных типов антропогенного загрязнения, причем особого внимания заслуживают следующие из них: нитробензол, 2- и 4-нитротолуол, 3-нитротолуол, 4-нитрофенол, 3-нитрофенол и п-нитроанилин. Их используют в производстве взрывчатых веществ, в получении пестицидов и гербицидов, в качестве субстратов в получении красителей, пластика, красок, а также в фармацевтической промышленности. Предполагается, что в мире каждый год производят примерно 10⁸ тонн органических нитросоединений, и в окружающую среду высвобождается более 8,5 тонн одного только нитробензола. В течение почти 80 лет широкое применение данных соединений во многих отраслях промышленности, а также получение огромных количеств материалов и боевых припасов для военного дела в первой половине прошлого столетия в связи с двумя мировыми войнами внесли вклад в серьезное загрязнение окружающей среды нитросоединениями. Вышеупомянутые типы соединений и их метаболиты являются высокотоксичными и опасными для людей. Некоторые из них представляют собой сильные яды, часто с сильными мутагенными и канцерогенными свойствами. Большинство ароматических нитросоединений отличаются своей стабильностью и сохранностью в биологических системах и своей значительной устойчивостью к разложению (Kulkarni and Chaudhari, 2007).

Дополнительной проблемой является тот факт, что загрязнение почвы нитросоединениями также представляет собой непосредственную угрозу для грунтовых вод и, следовательно, может приводить к проникновению данных загрязняющих веществ в проточные воды. Проблема загрязнения почвы и грунтовых вод органическими соединениями из разных отраслей промышленности касается не только Польши и других стран Европейского союза, но и практически всех промышленно развитых стран мира. Как в Польше, так и во всем мире проблема загрязнения окружающей среды данными соединениями касается главным образом территорий, окружающих химические заводы, где их использовали в качестве субстратов в органическом синтезе, а также территорий военных баз, где их держали и хранили.

Существует несколько традиционных способов физико-химической нейтрализации нитросоединений, таких как окисление и фотоокисление, гидролиз, выпаривание, сжигание, адсорбция и т.д. (Kanekar et al., 2003). Такие способы, однако, имеют множество недостатков и ограничений. Сжигание не является ни экономически эффективным, ни экологически безопасным. Кроме того, сжигание сопровождается высвобождением в окружающую среду значительных количеств токсичного дыма. Во время таких процедур, как фильтрация, экстракция и адсорбция, на смоле нежелательные соединения только отделяются, и это не приводит к их разрушению. Окислительные процессы, тем временем, вызывают образование токсичных производных соединений и связаны с высокими затратами (Kulkarni and Chaudhari, 2007).

Было разработано несколько стратегий ремедиации земель на основе физических, химических и биологических способов. Однако полагают, что наиболее недорогими и наиболее эффективными и, таким образом, безопасными являются технологии биоремедиации, которые представляют собой технологии, использующие метаболический потенциал микроорганизмов.

Биоремедиация представляет собой процесс восстановления, в котором микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи и нитчатые грибы, применяют для разложения опасных веществ на менее токсичные или нетоксичные соединения.

В целях процессов биоремедиации микроорганизмы выделяют из естественной микрофлоры, присутствующей в загрязненной окружающей среде (повторная инокуляция) или получают методами генной инженерии. На практике в способах биодеградации используют специализированные наборы (консорциумы микроорганизмов), демонстрирующие определенную способность к разложению определенных групп углеводородов. Такие консорциумы помимо высокой детоксифицирующей активности должны быстро адаптироваться к загрязненной окружающей среде, взаимодействовать с индигенной микрофлорой и не аккумулировать токсичные промежуточные соединения распада.

Можно выделить два типа микробиологических препаратов: препараты, содержащие штаммы внешнего происхождения, и аутовакцины, содержащие эффективные индигенные штаммы, выделенные из обрабатываемой почвы с применением разных методик.

В патенте PL 180141 описан способ микробиологической ремедиации почв, загрязненных нефтью, в котором применяют индигенные микроорганизмы, выделенные из почвы, подлежащей обработке. Выделенные штаммы бактерий культивируют в аэробных условиях в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов нефти, и после идентификации отбирают бактерии с самой высокой активностью в отношении деградации данных загрязняющих веществ. Отобранные 5-10 разных видов бактерий культивируют при 26°C в течение 48-72 часов. Размноженную культуру вводят в загрязненную почву путем распыления ее с водной суспензией бактерий в концентрации больше чем 10⁵ клеток на 1 г сухой почвы.

В патенте PL 189586 описан способ получения аутовакцины, которая ускоряет обработку почвы и сточных вод, загрязненных нефтью, который основан на выделении бактерий из почвы и сточных вод путем разведения и селективного культивирования в средах, обогащенных стерильной неочищенной нефтью или нафталином в качестве единственного источника углерода.

Длительное присутствие ароматических нитросоединений, в частности нитроанилина, нитробензола и нитрофенола, в почве инициирует процесс естественной адаптации и селекции микроорганизмов на загрязненной территории, который влияет на качество, а также видовой состав автохтонных (местных по отношению к данной экосистеме) групп микроорганизмов. Эффективная биоремедиация требует помимо точного знания микроорганизмов, ответственных за деградацию данных ароматических нитросоединений, понимания путей деградации данных соединений на физиологическом, биохимическом и молекулярном уровнях, а также изучения оптимизации условий, необходимых для спокойного протекания процессов биоремедиации. Такие исследования были проведены авторами настоящего решения.

В почвах из военных мест (среди прочего, территории военной подготовки) и промышленных территорий очень часто сообщают о высоких концентрациях не только множества органических ксенобиотиков, но также тяжелых металлов, таких как мышьяк, кадмий, хром, медь, свинец, ртуть, никель, цинк и другие (Bahig and Altalhi, 2009). Считают, что тяжелые металлы представляют собой сильные ингибиторы процессов биодеградации органических ксенобиотиков (Silva et al., 2007). Полагают, что присутствие тяжелых металлов в промышленных сточных водах представляет собой один из главных факторов, ограничивающих применение способов биологической ремедиации (Kulkarni and Chaudhari, 2007). Длительное присутствие данных загрязняющих веществ в окружающей среде, однако, приводило к механизмам детоксикации данных соединений под действием бактерий. Более того, есть основания полагать, что микробиологическая устойчивость к тяжелым металлам может влиять на поддержание и передачу генов устойчивости к антибиотикам между бактериями, путем повышения селективного давления окружающей среды (Spain, 2003). Также существует доказательство наличия связи между устойчивостью бактерий ко многим клинически важным классам антибактериальных лекарственных средств, тяжелым металлам и четвертичным аммониевым соединениям, применяемым в качестве дезинфицирующих средств. Во многих случаях это связано с расположением генов, которые определяют такую устойчивость, в непосредственной близости на одной и той же бактериальной плазмиде, указывая на возможность передачи целых кластеров генов путем горизонтального переноса генов (Schluter et al., 2007).

Существует множество исследований, касающихся процесса биоремедиации разных ксенобиотиков, загрязняющих почву, например неочищенной нефти и ее производных, но в современном уровне техники не существует исследований, касающихся применения биоремедиации in situ зон, загрязненных ароматическими нитросоединениями. В профессиональной литературе по биоремедиации циклических нитросоединений данная проблема рассматривалась и анализировалась только в лабораторном масштабе. Кажется, что применение эффективного способа биодеградации нитросоединений, в частности нитроанилина, является оптимальным решением во многих отношениях, в первую очередь, потому что данные процессы являются процессами, которые встречаются в природе в окружающей среде, но также, что очень важно, они являются очень эффективными и связаны с более низкими затратами, чем традиционные способы, такие как физико-химические методы.

В польском патенте PL 380007 описан способ биоремедиации почвы и предупреждения распространения загрязнения органическими веществами, основанный на введении в почву вида дрожжей Yarrowia lipolytica в иммобилизованной форме. Дрожжи вводят непосредственно в загрязненные зоны или вокруг них, используя способ in situ, в форме вакцины (биологический препарат) на органической среде, которая представляет собой альгинат натрия, агар, желатин, коллаген или птичьи перья. Вакцину, в жидкой или сухой форме, можно вводить в виде гранул или биопленки, или биогеля, и дрожжи составляют от 5 до 50% вакцины (по массе), причем вакцина может составлять от 10 до 100% вещества, вводимого в почву. Вакцину помещают на глубину 0,1-2 м в отверстия диаметром 0,1-1,0 м, тогда как их распределение может быть линейным или поперечно перекрывающим, или концентрическим или опоясывающим данную зону, или может располагаться в ее самой низкой точке, согласно направлению потока сточных вод, и в случае защиты водных резервуаров рядом с береговой линией, вне зоны действия волн. Изобретение может найти применение особенно в зонах, загрязненных соединениями нефти, сточными водами нефтяной промышленности, растительными и минеральными маслами.

Описание изобретения

Настоящее изобретение представляет собой натуральный способ удаления опасных загрязняющих веществ из окружающей среды без введения в нее каких-либо синтетических продуктов. Биоремедиация in situ основана на естественных процессах, встречающихся в окружающей среде, которая связана со значительно меньшими затратами, чем традиционные физико-химические способы. Разработанная и депонированная композиция штаммов (вакцина) облегчает быстрое приобретение соответствующего количества композиции и проведение биоремедиации за короткое время.

Бактериальные штаммы, которые являются частью композиции вакцины для биоремедиации, являющейся объектом данного изобретения, способны разрушать/метаболизировать ароматические нитросоединения и, в общем, ароматические соединения, такие как фенолы, аминофенолы, нитрофенолы, а также полициклические ароматические соединения, которые могут использоваться данными микроорганизмами в качестве единственного источника углерода и энергии. Кроме того, штаммы могут расти в присутствии высоких концентраций тяжелых металлов (и тяжелые металлы также присутствуют в случае почв, загрязненных органическими нитросоединениями или нефтью). Они одновременно способны расти в присутствии высоких концентраций антибиотиков (в случаях биоремедиации зон, находящихся рядом с фармацевтическими компаниями или дополнительно загрязненных антибиотиками или их метаболитами, это является высокозначимым); при этом антибиотики относятся к следующим группам: макролиды (эритромицин), аминогликозиды (стрептомицин), фторхинолоны (ципрофлоксацин), тетрациклины (тетрациклин), бета-лактамы (пенициллин), гликопептиды (ванкомицин).

Целью данного изобретения является эффективный способ удаления токсичных ароматических нитросоединений с применением микробиологической смеси для биоремедиации (вакцины) для биоремедиации почвы, загрязненной ароматическими нитросоединениями.

Объектом изобретения является композиция штаммов, содержащая: штамм Stenotrophomonas sp. 2L, штамм Stenotrophomonas sp. 5L, штамм Stenotrophomonas sp. 6L, штамм Stenotrophomonas sp. 3N, штамм Achromobacter sp. 4P, штамм Arthrobacter sp. IN, штамм Brevundimonas sp. 2N, штамм Brevundimonas sp. 5N, штамм Brevundimonas sp. 6N, штамм Pseudomonas sp. 3G и штамм Pseudomonas sp. 4G, депонированная под номером KKP 2041р. (Коллекция промышленных микроорганизмов IAFB - Институт биотехнологии сельскохозяйственной и пищевой промышленности в Варшаве, Польша).

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к антибиотикам из следующих групп: аминогликозиды, фторхинолоны, гликопептиды, макролиды, пенициллины, сульфонамиды, тетрациклины.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к ципрофлоксацину.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к эритромицину.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к гентамицину.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к пенициллину.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к стрептомицину.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к сульфаметоксазолу.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к тетрациклину.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к ванкомицину.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, более предпочтительно все штаммы, демонстрировали устойчивость к тяжелым металлам, таким как As (III), Cu (II), Cr (VI), Zn (II) и Ni (II).

Другим объектом настоящего изобретения является вакцина для биоремедиации (смесь для биоремедиации), содержащая композицию штаммов, описанных выше.

Предпочтительно, вакцина содержит 105 бактериальных клеток в 1 мл среды.

Предпочтительно, помимо композиции из 11 штаммов вакцина содержит жидкую минеральную среду с добавлением нитросоединения в качестве единственного источника углерода.

Предпочтительно, помимо композиции из 11 штаммов композиция содержит твердую минеральную среду с добавлением нитросоединения в качестве единственного источника углерода.

Предпочтительно, нитросоединение в среде представляет собой нитробензол, п-нитроанилин, 2-нитротолуол, 4-нитротолуол, динитротолуолы, тринитротолуолы, мононитрофенолы или полинитрофенолы.

Предпочтительно, источником углерода в среде является по меньшей мере одно из вышеописанных нитросоединений.

Предпочтительно, нитросоединение добавляют к культуральной среде в количествах 50-200 мг/л, в зависимости от степени загрязнения почвы.

Другим объектом изобретения является применение вакцины для биоремедиации для удаления из почвы загрязняющих веществ в форме ароматических нитросоединений.

Другим объектом изобретения является способ обработки загрязненной почвы путем применения вакцины, основанный на выделении почвенных микроорганизмов из загрязненной почвы, их культивировании, селекции/идентификации микроорганизмов, и затем культивировании отобранных почвенных микроорганизмов, затем размноженную культуру вводят в загрязненную почву, которую механически обогащают кислородом, и ее влажность поддерживают на соответствующем уровне, при этом из загрязненной почвы удаляют ароматические нитросоединения, а почвенные микроорганизмы являются частью композиции, содержащей штаммы, описанные выше.

Предпочтительно, способ осуществляется в условиях in situ.

Предпочтительно, способ осуществляется в условиях ex situ.

Предпочтительно, культуры наращивают в жидкой минеральной среде с добавлением нитросоединения в качестве единственного источника углерода.

Предпочтительно, культуры наращивают на твердой минеральной среде с добавлением нитросоединения в качестве единственного источника углерода.

Предпочтительно, нитросоединение в среде представляет собой нитробензол, п-нитроанилин, 2-нитротолуол, 4-нитротолуол, динитротолуолы, тринитротолуолы, мононитрофенолы или полинитрофенолы.

Предпочтительно, источником углерода в среде является по меньшей мере одно из вышеописанных нитросоединений.

Предпочтительно, нитросоединение добавляют в культуральную среду в количествах 50-200 мг/л, в зависимости от степени загрязнения почвы.

Предпочтительно, культуру наращивают при температурах между 20-25°C.

Предпочтительно, на загрязненную почву распыляют суспензию бактерий (вакцина для биоремедиации) в объемном отношении вакцины к почве в интервале от 1:10 до 3:10.

Краткое описание графических материалов

На Фигуре 1 представлен рост смешанной культуры бактерий (11 штаммов) в жидкой среде (М9) с добавлением ароматического нитросоединения.

Описание вариантов реализации

Применение композиции, являющейся объектом настоящего изобретения, представляет собой натуральный способ, при котором в окружающую среду не вводят каких-либо синтетических продуктов. Тот факт, что объект настоящего изобретения состоит из автохтонных организмов, сокращает время, требующееся для биодеградации. Более того, способ основан на процессах, встречающихся в природе, в окружающей среде, которые являются эффективными и более действенными, например, по сравнению с физико-химическими способами.

Микроорганизмы выделяли из почвы, загрязненной нитросоединениями (в прошлом место военной подготовки в Померании).

В целях настоящего решения штаммы обозначали следующим образом:

Объект настоящего изобретения представлен в следующих неограничивающих вариантах реализации.

Примеры

Пример 1. Определение взаимного антагонистического эффекта штаммов, составляющих композицию

Для определения того, не оказывают ли отдельные штаммы друг на друга антагонистического эффекта (ингибирование роста некоторых штаммов другими в результате выделения бактериоцинов в окружающую среду), бактерии высевали с использованием стерильной бактериологической петли на чашки Петри со средой М9 (Na₂HPO₄×Н₂O - 0,134 г; КН₂РO₄ - 0,03 г; NaCl - 0,5 г; MgSO₄×7Н₂O - 2,47 г; CaCl₂ - 111 мг, добавление дистиллированной воды H₂O до объема 1000 мл) с добавлением 2-нитрофенола в концентрации 200 мг/л (вариант 1) или питательного агара (вариант II). Определенные бактериальные штаммы засевали на расстоянии примерно 2 мм, в установленных схемах расположения. Разработанные схемы были предназначены для проверки того, способен ли каждый из штаммов расти в непосредственной близости с другими штаммами. Результаты снимали через 24 часа инкубации при 30°C. Каждый из тестируемых штаммов был способен расти в непосредственной близости от другого. На этом основании можно сделать предположение о том, что не существует антагонистического действия между тестируемыми микроорганизмами, то есть ни один из исследуемых штаммов не меняет окружающую среду таким образом, чтобы ингибировать рост любых других штаммов, например, путем продукции бактериоцинов. Такие же результаты были получены в обоих вариантах эксперимента, что доказывает, что также в присутствии используемого ксенобиотика исследуемые штаммы не продуцируют биологически активных веществ, которые могли бы приводить к бактериостазу.

Пример 2. Определение чувствительности к антибиотикам штаммов, составляющих композицию

Определение чувствительности бактерий к отобранным антибиотикам осуществляли диско-диффузионным методом. Авторы изобретения применяли диски, пропитанные антибиотиком четко определенной концентрации (BioMerioux) (таблица 2), и проводили тестирование минимальной ингибирующей концентрации, используя Е-тесты (Oxoid) (таблица 3).

Цель проводимого исследования состояла в определении того, до какой степени выделенные штаммы бактерий являются чувствительными к отобранным антибиотикам. Антибиотики выбирали таким образом, чтобы они принадлежали к разным группам соответственно: аминогликозидам (гентамицин, стрептомицин); фторхинолонам второго поколения (ципрофлоксацин); гликопептидам (ванкомицин); макролидам (эритромицин); пенициллинам (пенициллин); сульфонамидам (сульфаметоксазол); тетрациклинам (тетрациклин).

Инокулят McFarland 0,5 получали из каждой культуры штамма с использованием денситометра (ЕМО). Затем, используя стерильные ватные палочки, суспензию бактериальных клеток распределяли по чашкам с готовой к использованию средой МНА (Oxoid), и, спустя 15 минут, на них помещали диски, пропитанные антибиотиками в определенной концентрации.

Чашки инкубировали при 25-30°C, и результаты снимали через 24 часа и 48 часов. Мерой чувствительности тестируемого штамма к данному антибиотику являлся размер зоны ингибирования, которая образовывалась вокруг диска, пропитанного антибиотиком. Снятые результаты (размеры зон, измеренные в мм) сравнивали с данными, содержащимися в стандартах Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам (EUCAST) 2010 (таблица 4).

Мерой чувствительности тестируемого бактериального штамма к данному антибиотику являлся размер зоны ингибирования, которая образовывалась вокруг диска (таблица 5).

На следующей стадии исследования определяли значения MIC (минимальная ингибирующая концентрация) данного антибиотика в отношении исследуемых штаммов, означающие самую низкую концентрацию лекарственного средства, выраженную в мг/л, определенную in vitro, которая ингибирует рост бактерий при определенной плотности инокулята, за данное время (Hryniewicz et al., 2001). Данные исследования предусматривают более точное определение степени чувствительности бактерий к применяемым антибиотикам.

Бактериальную суспензию равномерно распределяли на чашках с готовой к использованию средой МНА (Oxoid), и затем на них помещали пластиковые тест-полоски (Е-тесты), пропитанные антибиотиком с концентрационном градиентом. Чашки инкубировали при 25-30°C в течение 24 ч, и результаты тестов снимали, спустя данное время.

Пересечение эллиптической зоны ингибирования, которая появлялась вокруг тестовой полоски, с показателем значения на градиентной шкале полосы определяло самую низкую концентрацию антибиотика, ингибирующую рост микроорганизма (MIC). Подобным образом, как и в диско-диффузионном методе, полученные результаты сравнивали с руководствами, содержащимися в соответствующих стандартах. Полученные результаты показаны в таблице 6.

Значения MIC, определенные в данном исследовании, согласуются с результатом, полученным диско-диффузионным способом. Штаммы, для которых зоны ингибирования роста вокруг дисков, пропитанных определенным антибиотиком, как было обнаружено, больше по сравнению с другими штаммами, отличались более низкими значениями MIC, означающими более низкую концентрацию антибиотика, которая ингибирует рост микроорганизма и, вследствие этого, более высокую чувствительность штамма к данному лекарственному средству.

Сравнение значений MIC с результатами, полученными диско-диффузионным методом, показало высокую степень сходства между ними. В отношении штаммов бактерий, для которых были продемонстрированы высокие значения MIC, зон ингибирования роста вокруг диска с антибиотиком не наблюдали, или они были очень малы. Такой результат доказывает, что исследуемый штамм является устойчивым к данному антибиотику. Полученные значения MIC сравнивали с пороговыми значениями MIC (таблица 7), содержащимися в руководствах EUCAST (2010). На этом основании можно утверждать, что все из 11 исследованных штаммов являются устойчивыми к антибиотикам, используемым в исследовании.

Пример 3. Определение чувствительности штаммов в составе композиции к тяжелым металлам

Для получения маточного раствора металла (концентрированного) (таблица 8):

- 100 мМ водный раствор солей: As (III), Cd (II), Cr (VI), Ni (II), Zn (II),

- 1 M водный раствор Cu (II),

аликвоту соли металла растворяли в дистиллированной воде, затем фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм. Полученные растворы хранили при 4°C. В исследованиях применяли концентрации тяжелых металлов в диапазоне 0,2-30 мМ. С данной целью сразу перед применением в жидкую среду (питательный бульон) добавляли соответствующий объем концентрированного маточного раствора до конечной концентрации, определенной в таблице 9 для каждого металла.

Чувствительность выделенных штаммов к тяжелым металлам тестировали путем определения значений MIC. С этой целью применяли 96-луночные планшеты для титрования (ROTH). 150 мкл раствора соли металла в NB переносили с помощью пипетки в каждую лунку, так чтобы создать серию возрастающих концентраций каждого металла (градиент), затем их инокулировали 150 мкл инокулята, полученного из каждой культуры штамма, при плотности по стандарту McFarland 0,5. В каждом из 8 рядов (12 лунок) находилась отличная концентрация данного металла согласно таблице 9, в то время как в последнем ряду микропробирок находился отрицательный контроль (среда NB с физиологическим раствором или NB с маточным раствором металла, без инокулюма).

Планшеты накрывали пластиковыми крышками и дополнительно заворачивали в целлофановую пленку, чтобы защитить их от испарения. Планшеты инкубировали на качалке (80 об/мин) при 30°C. После 24 и 48 часов инкубации измеряли оптическую плотность (OD₆₀₀) культур в каждой из 96 лунок. Измерения осуществляли с использованием спектрофотометра «Sunrise» (TECAN).

Определяли значения минимальных концентраций металлов, ингибирующих рост бактерий (MIC). Считали, что самая низкая концентрация, при которой не наблюдали бактериального роста, представляла собой значение MIC. Результаты показаны в таблице 10.

Полученные результаты иллюстрируют широкое варьирование между значениями MIC для каждого металла. К сожалению, в случае кадмия было невозможно определять MIC. Ни один из исследуемых штаммов не мог расти даже при самой низкой концентрации соли кадмия в культуральной среде, несмотря на применение растворов с концентрацией данного элемента на порядок ниже по сравнению с концентрацией других металлов. На данном основании можно сделать вывод о том, что токсичность кадмия гораздо выше, чем токсичность других тяжелых металлов, используемых в эксперименте. В таблице 10 самая низкая используемая концентрация соли кадмия дана в виде значения MIC.

Полученные результаты указывают на то, что исследуемые штаммы бактерий являются устойчивыми к As (III), Cu (II), Cr (VI) и Zn (II), частично чувствительными к Ni (II) и чувствительными к Cd (II). Следует особо подчеркнуть, что в случаях мышьяка и хрома применяли их формы, рассматриваемые как наиболее токсичные по отношению к живым организмам (As III и Cr VI), и даже в этом случае высокие значения MIC регистрировали для всех исследуемых штаммов, по сравнению с литературными данными по модельному штамму (таблица 11) (Spain, 2003).

Пример 4. Способ биоремедиации почвы, загрязненной ароматическими нитросоединениями

Чистые культуры бактерий в жидкой среде с добавлением ароматического нитросоединения

Цель эксперимента состояла в определении эффективности роста каждого бактериального штамма в жидкой среде (М9) с добавлением ароматического нитросоединения (2-нитрофенол), представляющего собой единственный источник углерода для микроорганизмов. Исходную концентрацию нитросоединения в среде устанавливали на уровне 100 мг/л. Все исследуемые штаммы демонстрировали очень хороший рост на твердой среде (М9) с добавлением того же соединения, также при двойной концентрации (200 мг/л), по сравнению с концентрацией, используемой в жидких культурах.

Небольшой объем среды (примерно 20 мл) инокулировали микробиологическим материалом (чистые культуры бактерий). Штаммы бактерий, выделенных из окружающей среды, растут гораздо медленнее в лабораторных условиях (пролонгированная лаг-фаза), из-за неизвестных потребностей в питательных элементах и пролонгированного периода адаптации. Бактериальные монокультуры культивировали в течение 7 дней при комнатной температуре с качанием на качалке с платформой. Во время эксперимента измеряли оптическую плотность (OD₆₀₀) каждой культуры с интервалами, составляющими день. Результаты показаны в таблице 12.

После эксперимента изменение оптической плотности, выраженное в процентах, рассчитывали для каждой культуры относительно исходного значения (таблица 12) с исключением последнего результата (день 7, снижение OD₆₀₀), где наиболее вероятно происходило израсходование питательных элементов в среде или аккумуляция токсичных вторичных метаболитов, которые ингибируют дальнейший рост микроорганизмов.

Анализ результатов показал значительные различия в скоростях роста разных штаммов. Штаммы 4G, 4Р и 6N отличались самыми большими повышениями значения OD, выраженными в процентах, поэтому можно сделать вывод о том, что они были наилучшим образом адаптированы к условиям, используемым в эксперименте.

Смешенные бактериальные культуры в жидкой среде с добавлением ароматического нитросоединения

Многочисленные литературные данные указывают на то, что для эффективного разложения ароматических нитросоединений, включая мононитрофенолы, требуется синергический эффект консорциумов бактерий (Nielsen et al., 2006). Согласно вышесказанному было решено, что следует получать смешанные культуры, содержащие выделенные штаммы бактерий. Запускали смешенные культуры на основе данных штаммов. Образцы инкубировали в течение 2 недель. Подобно предыдущему эксперименту, спустя 24 ч измеряли оптическую плотность (OD₆₀₀) каждой культуры. Полученные результаты представлены на фигуре 1, на которой показан рост смешанной культуры бактерий (11 штаммов) в жидкой среде (М9) с добавлением ароматического нитросоединения.

Определение эффективности биоремедиации в микрокосмах. Получение почвы

Почву, используемую в исследовании, отбирали с глубины примерно 20 см в зоне, не загрязненной ароматическими нитросоединениями, расположенной на значительном расстоянии от дорог и заводов (сад на заднем дворе).

Перед закладкой микрокосмов почву стерилизовали три раза в автоклаве (0,7 атм, 30 минут) для уменьшения количества индигенной микрофлоры, которое контролировали путем посева соответствующих разведений почвенного экстракта перед процессом стерилизации и после него. Полученную почву загрязняли ароматическим нитросоединением, 2-нитрофенолом, в концентрации 200 мг/кг почвы. Аликвоты (0,5 кг) почвы помещали в овальные пластиковые контейнеры и накрывали крышками с небольшими отверстиями (обеспечивая оптимальные кислородные условия).

Получение инокулюма

Бактериальные инокулюмы получали на основе штаммов бактерий, которые представляют собой объект настоящего изобретения, выделенных из окружающей среды, загрязненной ароматическими нитросоединениями. Биомассу бактериальных клеток собирали с чашек Петри после нанесения на них 2 мл физиологического раствора и отмывки бактериальной пленки с помощью шпателя. Клеточную суспензию количественно переносили в стерильную колбу. Измеряли оптические плотности (OD₆₀₀) суспензий. Значения OD₆₀₀ каждой доводили до похожего значения, составляющего примерно 0,6.

Инокуляция почвы

Почву, загрязненную нитросоединением (2-нитрофенол в концентрации 1500 мкг/л), инокулировали бактериальным инокулюмом. Объемное отношение инокулюма к среде составляло 1:10, которое соответствовало 108 клеток на 1 г сухой массы почвы. Микрокосмы инкубировали в затемненной комнате при температуре окружающей среды примерно 20°C. Время от времени инокулированную почву смешивали для обеспечения подходящих кислородных условий. На протяжении 30 дней инкубации содержание влаги поддерживали на уровне приблизительно 50% от водоудерживающей способности (WHC). Потерянную воду восполняли соответствующим объемом стерильной дистиллированной воды.

Определение эффективности биоремедиации

Эффективность процесса биоремедиации почвы, загрязненной ароматическим нитросоединением (2-нитрофенол) (оценка восстановления нитрофенола в исследуемой почве), исследовали путем проведения измерений концентрации нитросоединения с помощью газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором ГХ-ПИД. Определение содержания было поручено лаборатории защиты окружающей среды "WESSLING" http://pl.wessling-group.com/pl/uslugi/), как и определение количества бактерий. Наблюдали значительное снижение содержания 2-нитрофенола в почве (в микрокосмах) в результате биологической деградации загрязняющих веществ.

Контрольный образец (неинокулированная почва) содержал 2-нитрофенол в концентрации 1500 мкг/л, и воздействие на него процессов биодеградации с применением вакцины для биоремедиации приводило к почти 3-кратному уменьшению содержания применяемого нитроарена. Более того, в исследуемой экспериментальной схеме (помимо контрольной схемы) регистрировали увеличение числа бактерий с 10⁵ клеток/мл (день 1) до примерно 10⁸ клеток/мл (день 30).

Полученные результаты указывают на высокую эффективность способа, и результаты биоремедиации в лабораторном масштабе, как оказалось, являются удовлетворительными.

Главная цель данного решения состояла в разработке на основе полученной коллекции штаммов микробиологической вакцины для применения в биоремедиации почвы, загрязненной нитросоединениями, а также для оценки эффективности процесса биодеградации в микрокосмах.

На основе автохтонной микрофлоры зон, загрязненных ароматическими нитросоединениями, определяли состав вакцины для биоремедиации для участка земли, загрязненного данными ксенобиотиками, и ее эффективность проверяли в микрокосмах. Данному этапу предшествовали исследования, которые приводили к отбору наиболее эффективных монокультур и групп бактерий (демонстрирующих наилучший рост в жидкой среде с добавлением ароматического нитросоединения в качестве единственного источника углерода).

Контроль процесса биоремедиации загрязненной почвы был основан на физико-химических и микробиологических анализах. Эффекты биоремедиации в микрокосмах были удовлетворительными. После применения бактериальных инокулюмов (набор 11 штаммов) после 30-дневного периода инкубации достигали порогового уменьшения загрязнения относительно контрольного образца (неинокулированная почва). Более того, определение числа микроорганизмов в начале процесса биоремедиации и после его завершения показало, что используемые микроорганизмы отличаются хорошей способностью к размножению даже в неблагоприятных условиях (наличие нитроарена в среде).

Кроме того, для 11 штаммов бактерий, включенных в вакцину для биоремедиации, была продемонстрирована способность расти в присутствии высоких концентраций тяжелых металлов и антибиотиков, и на основе существующих стандартов считали, что данные штаммы являлись устойчивыми. Рассматривая тот факт, что в случае загрязненных почв часто сообщают о высоких концентрациях не только множества органических ксенобиотиков, но также тяжелых металлов (Bahig and Altalhi, 2009), которые, как считается, представляют собой сильные ингибиторы процессов биодеградации органических ксенобиотиков (Silva et al., 2007), а также антибиотиков или их метаболитов, данное решение является очень ценным и важным в отношении эффективности процесса биоремедиации почвы.

Библиография

1. Bahig E.D., Altalhi A.D. 2009. Degradative plasmid and heavy metal resistance plasmid naturally coexist in phenol and cyanide assimilating bacteria. Am. J. Biochem. Biotech. 5 (2): 84-93.

2. EUCAST. 2011. Clinical Breakpoint Table v. 1.3 2011-01-05. http.//www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Disk_test_documents/E UCAST_breakpoints_vl.3_pdf.pdf.

3. Kanekar P., Doudpure P., Sarnaik S. 2003. Biodegradation of nitroexplosives. Indian J. Exper. Biol. 41: 991-1001

4. Kulkarni M., Chaudhari A. 2007. Microbial remediation of nitro-aromatic compounds: An overview. J. Environ. Manag. 85: 496-512.

5. Nielsen D.R., McLellan P.J., Dauguls A.J. 2006. Direct estimation of the oxygen requirements of Achromobacter xyloxidans tor aerobic degradation of monoaromatic hydrocarbons (BTEX) in a bioscrubber. Biotechnol. Lett. 28: 1293-1298.

6. Schluter A., Szczepanowski R., Puhler A., Top E.M. 2007. Genomics of IncP-1 antibiotic resistance plasmids isolated from wastewater treatment plants provides evidence for a widely accessible drug resistance gene pool. FEMS Microbiol. Rev. 31: 449-477.

7. Silva A.D.A., Pereira P.M., Filho S.G., Hofer E. 2007. Utilization of phenol in the presence of heavy metals by metal-tolerant non-fermentative gram-negative bacteria isolated from wastewater. Microbiol. 49: 68-73.

8. Spain A. 2003. Implications of microbial heavy metal tolerance in the environment. Rev. Undergrad. Res. 2: 1-6.

1. Композиция штаммов для биоремедиации почвы, загрязненной ароматическими нитросоединениями, содержащая штамм Stenotrophomonas sp. 2L, штамм Stenotrophomonas sp. 5L, штамм Stenotrophomonas sp. 6L, штамм Stenotrophomonas sp. 3N, штамм Achromobacter sp. 4P, штамм Arthrobacter sp. 1N, штамм Brevundimonas sp. 2N, штамм Brevundimonas sp. 5N, штамм Brevundimonas sp. 6N, штамм Pseudomonas sp.3G и штамм Pseudomonas sp. 4G, депонированная под номером KKP 2041р. (Коллекция промышленных микроорганизмов IAFB - Института сельскохозяйственной и пищевой биотехнологии в Варшаве).

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, предпочтительно все штаммы, демонстрируют устойчивость к антибиотикам следующих групп: аминогликозиды, фторхинолоны, гликопептиды, макролиды, пенициллины, сульфонамиды и тетрациклины;
предпочтительно по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, предпочтительно все штаммы, демонстрируют устойчивость к ципрофлоксацину, эритромицину, гентамицину, пенициллину, стрептомицину, сульфаметоксазолу, тетрациклину, ванкомицину.

3. Композиция по пп. 1, 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, содержащийся в композиции, предпочтительно все штаммы, демонстрируют устойчивость к тяжелым металлам, таким как As (III), Cu (II), Cr (VI), Zn (II) и Ni (II).

4. Вакцина для биоремедиации, содержащая композицию штаммов по пп. 1-3.

5. Вакцина для биоремедиации по п. 4, отличающаяся тем, что помимо композиции, содержащей 11 штаммов, вакцина содержит жидкую или твердую минеральную среду с добавлением нитросоединения в качестве единственного источника углерода.

6. Вакцина для биоремедиации по пп. 4, 5, отличающаяся тем, что вакцина содержит 10⁵ бактериальных клеток в 1 мл среды.

7. Вакцина для биоремедиации по п. 5, отличающаяся тем, что нитросоединение в среде выбрано из нитробензола, п-нитроанилина, 2-нитротолуола, 4-нитротолуола, динитротолуолов, тринитротолуолов, мононитрофенолов, полинитрофенолов.

8. Вакцина для биоремедиации по п. 5, отличающаяся тем, что источником углерода в среде является по меньшей мере одно из нитросоединений, описанных в п. 7, и при этом указанное нитросоединение добавлено в количествах 50-200 мг/л культуральной среды, в зависимости от степени загрязнения почвы.

9. Вакцина для биоремедиации по п. 6, отличающаяся тем, что нитросоединение в среде выбрано из нитробензола, п-нитроанилина, 2-нитротолуола, 4-нитротолуола, динитротолуолов, тринитротолуолов, мононитрофенолов, полинитрофенолов.

10. Вакцина для биоремедиации по п. 6, отличающаяся тем, что источником углерода в среде является по меньшей мере одно из нитросоединений, описанных в п. 9, и при этом указанное нитросоединение добавлено в количествах 100-200 мг/л культуральной среды, в зависимости от степени загрязнения почвы.

11. Применение вакцины для биоремедиации по пп. 4-10 для удаления из почвы загрязняющих веществ в виде ароматических нитросоединений.

12. Способ биоремедиации почвы, загрязненной ароматическими нитросоединениями, включающий следующие стадии:
введение в загрязненную почву размноженной культуры композиции штаммов по любому из пп. 1-3 или вакцины по любому из пп. 4-10,
механическое обогащение загрязненной почвы кислородом и поддержание ее влажности на подходящем уровне, составляющем приблизительно 50% от водоудерживающей способности (WHC),
при этом происходит удаление указанных ароматических нитросоединений из загрязненной почвы введенными микроорганизмами.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный способ осуществляют в условиях in situ или ex situ.

14. Способ по пп. 12, 13, отличающийся тем, что культуру размножают в жидкой или на твердой минеральной среде с добавлением нитросоединения в качестве единственного источника углерода,
причем нитросоединение в среде предпочтительно включает нитробензол, п-нитроанилин, 2-нитротолуол, 4-нитротолуол, динитротолуолы, тринитротолуолы, мононитрофенолы, полинитрофенолы.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что источником углерода в среде является по меньшей мере одно из нитросоединений, описанных в п. 14,
и при этом указанное нитросоединение добавляют в количествах 100-200 мг/л культуральной среды, в зависимости от степени загрязнения почвы.

16. Способ по пп. 12, 13, отличающийся тем, что культуру размножают при температурах между 20-25°C.

17. Способ по п. 14, отличающийся тем, что культуру размножают при температурах между 20-25°C.

18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что культуру размножают при температурах между 20-25°C.

19. Способ по пп. 12, 13, отличающийся тем, что на загрязненную почву распыляют суспензию бактериальной культуры в объемном отношении вакцины к почве 1:10.

20. Способ по п. 14, отличающийся тем, что на загрязненную почву распыляют суспензию бактериальной культуры в объемном отношении вакцины к почве 1:10.

21. Способ по п. 15, отличающийся тем, что на загрязненную почву распыляют суспензию бактериальной культуры в объемном отношении вакцины к почве 1:10.

22. Способ по п. 16, отличающийся тем, что на загрязненную почву распыляют суспензию бактериальной культуры в объемном отношении вакцины к почве 1:10.

23. Способ по п. 17, отличающийся тем, что на загрязненную почву распыляют суспензию бактериальной культуры в объемном отношении вакцины к почве 1:10.

24. Способ по п. 18, отличающийся тем, что на загрязненную почву распыляют суспензию бактериальной культуры в объемном отношении вакцины к почве 1:10.