Способ адоптивной иммунотерапии злокачественных опухолей
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для повышения цитотоксической активности лимфоцитов in vitro. Для этого проводят контактирование культуры опухолевых клеток с выделенными из периферической крови натуральными киллерами и Т-цитотоксическими клетками с помощью реагентов CD 8 Micro Beads, human и CD 56 Micro Beads, human. Насыщают их дейтерием путем инкубирования и культивирования в присутствии интерлейкина-2 в концентрации 10000 МЕ/мл и концентрации тяжелой воды 7,7% при температуре 37°С в течение 72 часов. Использование данного способа позволяет повысить цитотоксическую активность лимфоцитов, ответственных за противоопухолевый иммунитет, путем насыщения дейтерием, что приводит к выделению более стабильных агентов окисления в противоопухолевом ответе.
Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для лечения онкологических больных.
Проблема лечения злокачественных опухолей по сей день остается актуальной для современной медицины. Особенно это касается лекарственного системного воздействия - химиотерапии. Внедрение высокотоксичных и дорогостоящих режимов химиотерапии не привело к значительному улучшению отдаленных результатов. Анализ публикаций последних 20 лет показывает, что химиотерапия достигла предела эффективности, а ее интенсификация не коррелирует с лучшей выживаемостью. Поэтому последние десятилетия наблюдается новый всплеск повышенного интереса к иммунотерапии злокачественных опухолей. Дело в том, что основную роль в противоопухолевой защите организма играет определенная группа лимфоцитов, называемых натуральными киллерами (убийцами). Натуральные киллеры, в отличие от других лимфоцитов, способны эффективно лизировать опухолевые клетки, однако их численность не велика, всего 10-15% всех лимфоцитов крови, что не позволяет им справиться с опухолевой массой. Чтобы увеличить количество лимфоцитов-киллеров используются методы так называемой адоптивной (adoptive- привнесенный) иммунотерапии. Все это открывает путь к применению совершенно новых классов лекарственных препаратов - адоптивной (привнесенной) иммунотерапии. С этой целью для проведения первого этапа клинических испытаний in vivo активно разрабатываются экспериментальные препараты с принципиально новым механизмом действия, эффективным и безопасным для организма в целом.
Известен «Способ получения активированных лейкоцитов для адъювантной адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований» по патенту №2414915 с приоритетом от 12.03.2009 г., опубл. 20.09.2010 г. Для осуществления указанного способа выделяют лейкоциты из стабилизированной гепарином периферической крови посредством смешивания с полиглюкином в течение 30 мин, культивируют их в среде RPMI или DMEM с 2-10% сыворотки пациента (или АВ сыворотки крови). Затем к среде добавляют Г-КСФ в конечной концентрации 500-5000 МЕ/мл и лейкоциты культивируют в течение 48-72 ч в условиях СО2-инкубатора. Использование способа позволяет упростить выделение лимфоцитов из крови и использовать полученные активированные лейкоциты для лечения онкологических больных и профилактики гнойно-септических осложнений после расширенных операций и химиолучевой терапии.
Но данный метод не позволяет активировать иммунокомпетентные клетки, ответственные непосредственно за противоопухолевый иммунитет.
Самым близким к заявляемому изобретению по своей технической сущности является (EN) Способ одновременной стимуляции и усиления V alphaiNKT клеток и CDCDNK клеток.
(EN) Способ одновременной стимуляции и усиления V alphaiNKT клеток и CDCDNK клеток. Предложен способ для одновременной стимуляции и усиления V alphaiNKT клеток и CDCDNK клеток. Способ содержит этапы: мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют из периферической крови; концентрацию РВМС доводят до 2×10/мл посредством бессывороточной среды, содержащей аутологичную плазму; добавляют Анти-CD антитела, GalCer, IL-2, IL-18, IL-21, затем смесь переносят в колбы для культивирования культуры; Анти-CD3 антитело вводят в клеточную суспензию на 24 часа; бессывороточную среду, содержащую интерлейкин-2, IL-18, IL-21, вводят каждые два дня в условия роста клеток; ячейки регулируют концентрацию 1,5×10/мл и после непрерывного культивирования в течение 14-21 суток, большие количества высокочистого V alphaiNKT клеток и CDCDNK клеток могут быть получены одновременно. Общее количество клеток может достичь эффективного значения, требуемого для клинической адоптивной иммунотерапии злокачественной опухоли. Способ одновременной и эффективной амплификации V alphaiNKT клеток и CDCDNK клеток является простым, удобным и эффективным.
Но данный способ не позволяет достичь дейтеризации NK-клеток и Т-цитотоксических клеток, то есть насыщения дейтерием, и в конечном итоге не приводит к выделению более стабильных агентов окисления в противоопухолевом ответе.
Предлагаемое изобретение направлено на получение следующего технического результата: обеспечить высокую противоопухолевую эффективность при персонифицированном подходе к лечению каждого больного, при этом обеспечить отсутствие токсичности.
Поставленная задача решается за счет того, что способ повышения цитотоксической активности лимфоцитов на культуре опухолевых клеток in vitro включает контактирование опухолевых клеток с выделенными из периферической крови натуральными киллерами и Т-цитотоксическими клетками с помощью реагентов CD 8 Micro Beads, human и CD 56 Micro Beads, human, насыщение их дейтерием путем инкубирования и культивирования в присутствии интерлейкина-2 в концентрации 10000 МЕ/мл и концентрации тяжелой воды 7,7% при температуре 37°С в течение 72 часов.
Высокая противоопухолевая эффективность предлагаемого способа достигается посредством нового механизма действия, а именно за счет выделения более стабильных агентов окисления. Персонифицированный подход к лечению достигается за счет введения в организм больного собственных активированных иммунных клеток, а эффект отсутствия токсичности достигается за счет применения химических веществ, безопасных для человеческого организма.
Цитотоксическую активность лимфоцитов определяли на NK-чувствительной линии клеток эритробластного лейкоза человека К-562. В основной группе инкубировались насыщенные дейтерием натуральные киллеры и Т-цитотоксические клетки, в группе контроля инкубировались лимфакин-активированные киллеры (ЛАК). ЛАК-клетки посредством иммуномагнитного сепаратора выделялись из периферической крови ресуспендировались в полной культуральной среде (среда RPMI 1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамин, гентамицин) в концентрации 1×106 в 1 мл среды. Затем добавлялся ИЛ-2 в концентрации 10000 МЕ/мл. Клетки инкубировали при 4,5% СО2 и 37°С в течение 3 суток. В контрольной и основной группе опухолевые клетки инкубировались в культуральной среде в плоскодонных 96-луночных микропланшетах в течение 16 часов. Затем в лунки добавлялся витальный краситель МТТ и по оптической плотности, измеряемой на мультискане МСС-340, рассчитывался процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности). При этом максимальная киллерная активность в основной группе составила 77-86%, в группе контроля - 55-62% (р<0,01). С целью отслеживания накопления/разложения окислительных агентов после дегрануляции NK-клеток иммунная реакция в основной и контрольной группе была исследована на инфракрасном Фурье-спектрофотометре Tensor 27 Bruker optics, оснащенном приставкой нарушенного полного внутреннего отражения в реальном масштабе времени. В результате был сделан вывод, что в основной группе дейтерированные окислительные агенты более устойчивы к разложению опухолевыми клетками, чем в группе контроля.
Совокупность признаков нова и позволяет активировать иммунокомпетентные клетки, ответственные непосредственно за противоопухолевый иммунитет, при этом позволяет достичь дейтеризации NK-клеток и Т-цитотоксических клеток, то есть насыщения дейтерием, что приводит к выделению более стабильных агентов окисления в противоопухолевом ответе.
Способ повышения цитотоксической активности лимфоцитов на культуре опухолевых клеток in vitro, включающий контактирование опухолевых клеток с выделенными из периферической крови натуральными киллерами и Т-цитотоксическими клетками с помощью реагентов CD 8 Micro Beads, human и CD 56 Micro Beads, human, насыщение их дейтерием путем инкубирования и культивирования в присутствии интерлейкина-2 в концентрации 10000 МЕ/мл и концентрации тяжелой воды 7,7% при температуре 37°С в течение 72 часов.
