Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования днк



Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования днк
Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования днк
Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования днк

Владельцы патента RU 2631935:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Настоящее изобретение относится к биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путём амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК. Указанный набор содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям консервативных участков региона гена 28S рРНК микромицетов. Олигонуклеотидные праймеры имеет следующую структуру: 5'-CATATCAATAAGCGGAGG-3' (прямой праймер Fungi 28S-f) и 5'-CGACCAATATTTAGCTTTAG-3' (обратный праймер Fungi 28S-r). Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для амплификации и секвенирования фрагмента гена 28S рибосомальной РНК различных видов возбудителей микозов для анализа нуклеотидных последовательностей, установления видовой принадлежности чистых культур микромицетов, изучения их филогенетического родства на видовом уровне и идентификации медицински значимых микромицетов. 4 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК и идентификации медицински значимых микромицетов в пробах чистых культур специалистами учреждений практического здравоохранения, Роспотребнадзора и в научно-исследовательских лабораториях.

Причиной заболевания микозами миллионов людей во всем мире могут являться первично-патогенные микромицеты - возбудители кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза, бластомикоза, паракокцидиоидомикоза, эндемического пенициллиоза, дерматофитий и некоторых других заболеваний, а также условно-патогенные микромицеты, имеющие повсеместное распространение - Candida spp., Aspergillus spp. и т.д. За последние десятилетия отмечается постоянный рост заболеваемости микотическими инфекциями, в том числе, вызываемыми условно-патогенными микромицетами, на фоне увеличения числа пациентов с поражениями иммунной системы (первичные или вторичные иммунодефициты).

Идентификация медицински значимых микромицетов чрезвычайно важна для проведения своевременного лечения, поскольку клинические симптомы не всегда позволяют дифференцировать микозы как между собой, так и от многих бактериальных и вирусных инфекций.

Согласно данным большинства исследователей для идентификации микромицетов и изучения их филогенетического родства на видовом уровне наиболее часто применяют анализ ядерной рибосомальной ДНК (18S-5.8S-28S), обладающей большой копийностью в геноме [Redecker D. Phylogenetic analysis of a dataset of fungal 5.8S rDNA sequences shows that highly divergent copies of internal transcribed spacers reported from Scutellospora castanea are of ascomycete origin / D. Re-decker, M. Hijri, H. Dulieu, I.R. Sanders // Fungal Genetics and Biology. - 1999 - Vol. 28. - №3. - P. 238-244.]. Исследователями установлена высокая вариабельность нуклеотидного состава входящих в данный регион участков и показана потенциальная возможность применения рибосомальной ДНК в качестве маркерной области для анализа широкого спектра микроскопических грибов [Eberhardt U. Methods for DNA barcoding of fungi. / U. Eberhardt // Methods Mol Biol. - 2012. - Vol. - 858. - P. 183-205. doi: 10.1007/978-1-61779-591-6_9]. Уникальность кластера рибо-сомальных генов в том, что он состоит из последовательно расположенных генов и межгенных промежутков различной степени генетической вариабельности 18S-ITS1-5,8S-ITS2-28S. На основе сравнительного анализа секвенированных последовательностей нуклеотидов описываемых участков генома изучаемого микроорганизма с последовательностями ДНК, представленными в генетических базах данных, возможно определить его видовую принадлежность, а также проанализировать степень родства обнаруженных микромицетов с использованием филогенетического исследования.

Наиболее близким аналогом является набор для секвенирования ДНК микромицетов MicroSeq® D2 LSU rDNA Fungal Identification Kit, производства компании «Applied Biosystems» (США). В основе метода лежит амплификация и последующее секвенирование региона D2 LSU рибосомальной ДНК. Однако данный набор рекомендован для проведения научных исследований и для его работы производитель настоятельно рекомендует оборудование и реактивы собственного производства, что не позволяет использовать приборы и реагенты других производителей (в том числе российских) для сокращения затрат на проведение анализа.

Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов путем амплификации и последующего секвенирования фрагмента гена 28S pРНК.

Цель достигается конструированием набора олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путем амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена 28S рРНК, содержащего пару олиго-нуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям консервативных участков региона гена 28S pРНК микромицетов и имеющих следующую структуру:

Характеристика олигонуклеотидных праймеров.

При выборе олигонуклеотидных затравок основывались на данных, представленных в различных генетических базах данных (GenBank, EMBL, DDBJ и Broad Institute). Для идентификации медицински значимых микромицетов были подобраны праймеры, обозначенные Fungi 28S-f/Fungi 28S-r, комплементарные консервативным фрагментам гена 28S рРНК и обеспечивающие амплификацию и секвенирование вариабельного участка ДНК различных микромицетов, который ограничен данными праймерами. Длина специфического фрагмента ДНК микромицетов составляла около 300 п.н.

Эксперименты проводили на коллекционных штаммах микромицетов II-IV групп патогенности, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии грибов. Апробация разработанного набора олигонуклеотидных праймеров была осуществлена на наборе штаммов различных возбудителей микозов лаборатории коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. По результатам амплифицикации и секвенирования фрагментов гена 28S рРНК опытных образцов с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров, построены дендрограммы сравнения с последовательностями микромицетов, представленными в генетической базе данных GenBank, Broad Institute. На основе выявленных отличий в нуклеотидных последовательностях подтверждена видовая принадлежность исследуемых микромицетов.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Конструирование набора олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путем амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S рРНК.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителей микозов, представленных в базах данных (Broad Institute - http://www.broadinstitute.org/scientific-community/data, GenBank, США - www.ncbi.nlm.nih.gov, EMBL - European Bioinformatics Institute, или EBI - www.ebi.ac.uk, DDBJ, Япония - www.ddbj.nig.ac.jp, а также International Nucleotide Sequence Database (INSD), возникшей в результате сотрудничества между GenBank, EMBL и DDBJ), для конструирования прямого Fungi 28S-f и обратного Fungi 28S-r праймеров были выбраны участки, комплементарные консервативным фрагментам, фланкирующим вариабельный участок гена 28S рРНК, кодирующего рибосомальную РНК большой субъединицы рибосомы микромицетов (GenBank NCBI). Расчетная длина предполагаемого ампликона составляла около 300 п.н. Ее размер может варьировать, например для микромицетов порядка Onygenales, включающего большинство первично-патогенных микромицетов длина фрагмента, амплифицируемого праймерами Fungi 28S-f/Fungi 28S-r может варьировать от 289 до 294 п.н. у Blastomyces dermatitidis, от 293 до 295 п.н. у Histoplasma capsulatum, от 295 до 298 п.н. у Trichophyton spp., 295-296 п.н. у Arthroderma spp., 295 п.н. у Coccidioides spp. и 296 п.н. у Microsporum spp.

При конструировании праймеров из доступных баз данных были выбраны нуклеотидные последовательности различных видов медицински значимых микромицетов, проведено их множественное выравнивание и, с помощью программного обеспечения или вручную, выполнен поиск участков для отжига праймеров, локализованных в консервативных областях, разделенных вариабельным регионом гена 28S рРНК, пригодным для идентификации методом секвенирования ДНК (рис. 1).

На рисунке 1 отображена схема выравнивания последовательностей и выбор вариабельного региона гена 28S рРНК при конструировании праймеров для идентификации исследуемых микромицетов методом секвенирования.

При выборе последовательностей праймеров руководствовались общими требованиями к олигонуклеотидным затравкам, используемым в ПЦР и секвенировании. С помощью компьютерного моделирования была проанализирована структура выбранных пар праймеров (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации и секвенирования нуклеотидной последовательности фрагмента гена 28S pPHК медицински значимых микромицетов.

Праймеры Fungi 28S-f/Fungi 28S-r были проанализированы с использованием компьютерных программ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) и Primer-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) для установления гомологии праймеров и нуклеотидных последовательностей гетерологичных микромицетов, представленных в генетических базах данных. На момент проведения компьютерного анализа выявлена лишь специфическая гомология праймеров Fungi 28S-f/Fungi 28S-r для широкого спектра медицински значимых микромицетов.

Пример 2. Амплификация и электрофоретическая детекция специфичных фрагментов ДНК гена 28S рРНК с использованием разработанного набора праймеров Fungi 28S-f/Fungi 28S-r для идентификации медицински значимых микромицетов.

Обеззараживание исследуемых образцов проводили согласно требованиям СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли методом гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [Sandhu G.S. et al., 1995].

В состав реакционной смеси для амплификации входили ДНК анализируемых микромицетов, разработанные комплементарные специфическому фрагменту ДНК прямой Fungi 28S-f и обратный Fungi 28S-r праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ), MgCl2, буфер, фермент Taq-полимераза (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). Амплификацию проводили с использованием «горячего старта», который обеспечивали разделением реакционной смеси воском на два слоя. В «нижнем» слое находились дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и праймеры, «верхний» слой содержал ДНК-матрицу и буферный раствор с ионами Mg2+ и ферментом Taq-полимеразой. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходило на этапе предварительной денатурации ДНК при 95°С. Для предотвращения испарения смеси сверху наслаивали по 30 мкл минерального масла. В качестве отрицательного контрольного образца использовали ТЕ-буфер.

Амплификацию проводили на приборе «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Россия). Условия проведения реакции ПЦР: предварительная денатурация 95°С - 5 мин, затем денатурация 95°С - 10 с, отжиг 60°С - 10 с, элонгация 72°С - 30 с, в течение 45 циклов.

Присутствие специфического ПЦР-продукта детектировали электрофоретическим разделением амплификационной смеси в 1,5% агарозном геле, приготовленном на трис-боратном буфере, при градиенте напряжения 5 В/см. Время проведения электрофореза составляло 30 мин.

Окрашивание гелей для визуализации в проходящем ультрафиолетовом свете (трансиллюминатор фирмы «LKB», Швеция) проводили бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Результаты оценивали по наличию или отсутствию в геле ампликонов микромицетов необходимого размера (рис. 2).

На рисунке 2 отображены результаты амплификации ДНК различных видов медицински значимых микромицетов с помощью разработанного набора праймеров Fungi 28S-f/Fungi 28S-r (1. Coccidioides posadasii 36-S; 2. Coccidioides immitis 158; 3. Histoplasma capsulation 6652; 4. Blastomyces dermatitidis 6/85; 5. Cryptococcus neoformans 9/22; 6. Candida parapsilosis BKMY-58; 7. Candida glabrata BKM Y-1481; 8. Candida kefyr BKM Y-257; 9. Candida guilliermondii BKM Y-41; 10. Rhodotorula mucilaginosa BKM Y-339; 11. Geotrichum fermentans BKM Y-813; 12. Fusarium javanicum (solani) BKM F-134; 13. Absidia hyalospora BKM F-1435; 14. Aspergillus fumigatus BKM F-753; 15. Rhizopus microsporia var. microsporus BKM F-774; 16. Fusarium culmorum BKM F-1017; 17. Gymnoascus reesii BKM F-1707; 18. Mucor racemosus var. racemosus BKM F-1128; 19. Phialophora verrucosa BKM F-1990; 20. Scopulariopsis brevicaulis BKM F-406; 21. Отрицательный контроль, К-).

Пример 3. Определение нуклеотидной последовательности ДНК с помощью разработанного набора праймеров Fungi 28S-f/Fungi 28S-r для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК.

После проведения ПЦР амплифицированные фрагменты вырезали из агарозного геля и проводили очистку от агарозы центрифугированием в спин-колонках при 8000 об/мин в течение 8 мин. Элюент высушивали и подвергали дальнейшей очистке добавлением экзонуклеазы и щелочной фосфатазы (ExoI/SAP, «Thermo Fisher Scientific», США). Реакцию секвенирования проводили с использованием BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Thermo Fisher Scientific», США). Термоциклирование проводили в соответствие со стандартной программой.

Далее добавляли в каждую пробирку по 1 мкл 2,2% SDS (додецил сульфат натрия) и термоциклировали (95°С - 5 мин; 25°С - 10 мин). Определение нуклеотидной последовательности проводили на приборе ABI 3130 («Applied Biosystems», США).

После проведения секвенирования осуществляли сравнение анализируемой последовательности ДНК со всеми известными последовательностями ДНК микромицетов в режиме «on-line» с помощью программы BLASTn на сервере (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), депонированными в базе данных GenBank. На основе установления гомологии определяли видовую принадлежность исследуемых микромицетов.

С использованием разработанного набора олигонуклеотидных праймеров Fungi 28S-f/Fungi 28S-r было проведено секвенирование ДНК 40 штаммов из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, среди которых представители группы особо опасных микромицетов: 6 штаммов Coccidioides immitis, 2 штамма Coccidioides posadasii, 9 штаммов Histoplasma capsulatum, 3 штамма Blastomyces dermatitidis, а также условно-патогенные микромицеты: 5 штаммов Cryptococcus neoformans и по 1 штамму Candida parapsilosis BKM Y-58, Candida glabrata BKM Y-1481, Candida kefyr BKM Y-257, Candida guilliermondii BKM Y-41, Rhodotorula mucilaginosa BKM Y-339, Geotrichum fermentans BKM Y-813, Fusarium javanicum (solani) BKM F-l34, Absidia hyalospora (syn. Mycocladus hyalospora) BKM F-1435, Aspergillus fumigatus BKM F-753, Rhizopus microsporia var. microsporus BKM F-774, Fusarium culmorum BKM F-1017, Gymnoascus reesii BKM F-1707, Mucor racemosus var. racemosus BKM F-l128, Phialophora verrucosa BKM F-l990, Scopulariopsis brevicaulis BKM F-406.

В результате сравнительного анализа секвенированных последовательностей ДНК с гомологичными нуклеотидными последовательностями доступных генетических баз данных подтверждена видовая принадлежность коллекционных штаммов исследуемых микромицетов. На основании полученных данных построены филогенетические деревья, отражающие степень родства изучаемых микроскопических грибов. Показана 100% точность в процессе идентификации 40 исследуемых штаммов микромицетов II-IV групп патогенности (рис. 3 и 4).

Рисунок 3 отображает дендрограмму сходства, построенную на основе сравнения секвенированных с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров последовательностей фрагментов гена 28S рРНК исследуемых штаммов возбудителей особо опасных микозов и последовательностей, депонированных в генетической базе данных GenBank. Рамкой выделены штаммы коллекции живых культур ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Рисунок 4 отображает дендрограмму сходства, построенную на основе сравнения секвенированых с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров фрагмента гена 28S рРНК исследуемых штаммов микромицетов III-IV групп и последовательностей, представленных в базе данных GenBank. Рамкой выделены штаммы коллекции живых культур ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Таким образом, разработанный набор праймеров Fungi 28S-f/Fungi 28S-r может быть использован для амплификации и секвенирования фрагмента гена 28S рибосомальной РНК различных видов возбудителей микозов для анализа нуклеотидных последовательностей, установления видовой принадлежности чистых культур микромицетов, изучения их филогенетического родства на видовом уровне и идентификации медицински значимых микромицетов.

Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования ДНК путем амплификации и последующего определения нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена 28S рРНК, содержащий пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям консервативных участков региона гена 28S рРНК микромицетов и имеющих следующую структуру:

5'-CATATCAATAAGCGGAGG-3'-Fungi 28S-f

5'-CGACCAATATTTAGCTTTAG-3'-Fungi 28S-r



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Заявлен набор для оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР, включающий компоненты для выделения ДНК, видоспецифичные олигонуклеотидные пары праймеров для проведения одностадийной экспресс-идентификации нескольких однонуклеотидных замен в аллелях генов MTHFR, MTR, MTRR и компоненты для детекции результатов гель-электрофорезом.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью.

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике и онкологии, и касается способа выявления генных мутаций BRAF в опухолях человека. Осуществляют амплификацию исследуемого фрагмента гена BRAF посредством асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan: BRAF-15-sense – 5'-ROX-aggtgattttggtctagctacagtgaaatc-BHQ2 и BRAF-15-antisense – 5'-Су5-acccactccatcgagatttcactgta-BHQ2 и праймерами: прямой – 5'-gagatctactgttttcctttactt, обратный – 5'-ggccaaaaatttaatcagt.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для стандартизации эффективности амплификации набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации перестроенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, полученном из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный участок и соединительный участок, причем композиция содержит: множество синтетических матричных олигонуклеотидов, причем каждый синтетический матричный олигонуклеотид имеет известную концентрацию до амплификации и олигонуклеотидную последовательность общей формулы: , причем: (а) V представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20 и не более 1000 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей вариабельный (V) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый V содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка; (b) J представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 15 и не более 600 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей соединительный (J) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый J содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка; (с) U1 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) первой специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (d) U2 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) второй специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (e) присутствует по меньшей мере один из B1, В2, В3 и В4 и каждый из B1, В2, В3 и В4 содержит олигонуклеотид В, содержащий последовательность штрихкода из 3-25 последовательных нуклеотидов, которая уникальным образом идентифицирует в качестве спаренной комбинации, (i) уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка из (а) и (ii) уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка из (b); (f) R либо отсутствует, либо содержит сайт распознавания рестрикционного фермента, который содержит олигонуклеотидную последовательность, отсутствующую в (а)-(е); и причем: (g) множество синтетических матричных олигонуклеотидов содержит количество по меньшей мере а или по меньшей мере b уникальных олигонуклеотидных последовательностей в зависимости от того, какое значение больше, причем а представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, и композиция содержит по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности V-участка и по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности J-участка.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1 (A>G), rs11856808 LINGO1 (C>Т), rs10968280 LINGO2 (А>Т), rs7033345 LINGO2 (C>Т), rs1412229 LINGO2 (А>Т), rs10812774 LINGO2 (C>Т) и rs3794087 SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, композицию для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, набор для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, который включает в себя композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом и реакционную пробирку, набор для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ обратной транскрипции РНК-матрицы, способ амплификации нуклеиновой кислоты, композицию ПЦР с обратной транскрипцией для диагностики злокачественного новообразования.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности гена fad-3c в растении канолы. Также раскрыт набор для осуществления указанного способа.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метелирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР и способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, и набору для его осуществления.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН).

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы. Проводят молекулярно-генетическое исследование биопсийных образцов опухолевой ткани с последующим выделением РНК и определением уровня гена YKL-39 с помощью количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой уровень экспрессии YKL-39 составляет 1 УЕ. При уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют низкий риск развития лимфогенных метастазов. При уровне экспрессии YKL-39 менее 1 УЕ прогнозируют высокий риск лимфогенного метастазирования. Изобретение обеспечивает повышение точности способа за счет выявления новых маркеров и их числовых показателей, позволяющих прогнозировать течение заболевания и оценивать риск возникновения лимфогенного метастазирования у больных раком молочной железы. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к зонду для детекции полиморфизма V600 в гене BRAF. Изобретение представляет собой флуоресцентно меченый олигонуклеотид (Р1), который, по меньшей мере, на 80% идентичен последовательности оснований длиной от 10 до 50 оснований, включающей основания 228-237 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, в котором основание, соответствующее основанию 237, представляет собой цитозин, меченный флуоресцентным красителем, причем олигонуклеотид распознает полиморфизм, по меньшей мере, в одном из оснований 228-230 последовательности оснований, указанной в SEQ ID NO:1, при условии, что олигонуклеотид отличается от олигонуклеотида, указанного в SEQ ID NO:7 или 19. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 2 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда - фторхинолонам, аминогликозидам и капреомицину, наборы зондов детекции и праймеров амплификации и применение способа для подтверждения клинического диагноза туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью. Способ включает одновременную детекцию мутаций в ДНК микобактерий туберкулеза биологического образца, приводящих к устойчивости микроорганизмов к противотуберкулезным препаратам второго ряда в участках гена gyrA (кодоны 89, 90, 91, 94), гена gyrB (кодоны 538, 539, 540), гена rrs (позиции 1401, 514, 517) и промоторной области eis (позиции -10, -12, -37), посредством МПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров для амплификации и зондов детекции, комплементарных указанным участкам генов. Способ обеспечивает одновременное и быстрое определение устойчивости микобактерий туберкулеза к препаратам второго ряда и может быть использован в диагностике туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен суспензионный микрочип для мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, содержащий набор праймеров для выявления Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi, Bartonella, вируса энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, бабезиоза и эрлихиоза. Также рассмотрены способы мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, с применением суспензионного микрочипа. Данное изобретение может быть использовано для обнаружения основных патогенов, передающихся клещами, с целью профилактики заболеваний. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

Изобретение относится к области диагностической медицины. Образец цельной крови, собранный в антисвертывающий раствор, центрифугируют. Отбирают плазму. Из плазмы выделяют внДНК, которые модифицируют при помощи бисульфита натрия. Проводят МС-ПЦР с использованием специально подобранных праймеров и зондов для контрольного гена FDPS и аберрантно-метилированных маркерных генов RARbeta2, RASSF1A и TCF21. Далее проводят сравнительный анализ результатов ПЦР с учетом полученного Ct для выявляемых генов. Если значение Ct≤35,1 для гена FDPS и Ct≤41 для генов RARbeta2 и/или RASSF1A и/или Ct≤42,5 для гена TCF 21, то делают заключение о наличии рака легкого у пациента. Технический результат заключается в упрощении известного способа, повышении его чувствительности и специфичности. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера. Всего разработаны четыре системы праймеров для четырех типов мутаций мтДНК m.11778G>A, m.8993T>G, m.3243A>G, m.8344A>G, ассоциированных с наследственными митохондриальными заболеваниями, представленные в виде лиофилизированных веществ. Изобретение обеспечивает молекулярно-генетическую детекцию патогенных мутаций митохондриальной ДНК, ассоциированных с наследственными митохондриальными патологиями, и определение уровня гетероплазмии по данным мутациям. 1 з. п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к молекулярной генетике. Описан способ определения полиморфизма генов, ассоциированных с летальным рецессивным генетическим дефектом крупного рогатого скота. Конкретно гена аполипротеина В (АРОВ), ассоциированного с гаплотипом HCD. Определяют полиморфизм гена АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, с помощью специфичного однопробирочного метода полимеразной цепной реакции. При этом продукты амплификации аллелей А и N различаются по длине - фрагмент длиной 215 п.о. соответствует аллелю А, фрагмент длиной 327 п.о. соответствует аллелю N, а идентификация генотипов животных осуществляется по результатам электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле. Способ может быть использован в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене АРОВ крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом фертильности HCD, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к сельскохозяйственной области биотехнологии и животноводству и касается способа оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая. Способ включает выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена LIF с использованием праймеров 5'-ATGTGGATGTGGCCTACGG-3' и 5'GGGAACAAGGTGGTGATGG-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF эндонуклеазой рестрикции DraIII, определение генотипов и отбор животных с генотипом AA/LIF, причем один фрагмент размером 407 п. н. соответствует генотипу АА, два фрагмента размером 266- и 144 н.п. - генотипу ВВ, три фрагмента 407-, 266- и 144 н.п. - генотипу АВ. Животные с генотипом AA/LIF обладают высокими показателями плодовитости. Изобретение позволяет эффективнее проводить оценку плодовитости свиноматок пород ландрас и крупная белая и отбирать свиней, генетически предрасположенных к более высоким показателям плодовитости. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложены способ и набор для прогнозирования высокой вероятности положительного эффекта от лечения антагонистами VEGF у пациента с метастатическим раком молочной железы, где такой эффект определяют у пациента с генотипом VEGF (-1154АА). Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы для прогнозирования высокой вероятности положительного эффекта от лечения антагонистами VEGF у пациента с метастатическим раком молочной железы. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта. В образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР. При обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз. Изобретение обеспечивает повышение точности при диагностике риска малигнизации эпителия пищевода. 1 ил., 1 табл., 1 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-08-04 2017-10-12T11:46:41
Наверх