Способ получения гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины против кампилобактериоза
Владельцы патента RU 2644654:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины против кампилобактериоза. Предложенный способ включает стадии выделения и накопления возбудителя кампилобактериоза Campylobacter fetus subspecies fetus на питательной среде, смыва накопленных колоний возбудителя 0,9%-ным раствором NaCl, инактивации накопленной биомассы теотропином в соотношении 0,3% теотропина к 100% биомассы с последующим соединением инактивированной биомассы с адъювантом гидроокись алюминия и внесением в масляный адъювант. Вакцина, получаемая предложенным способом, имеет следующее соотношение компонентов (мас. %): 0,14% суспензии клеток кампилобактера серогруппы fetus subspecies fetus в культуральной среде с концентрацией 2×1010 КОЕ*/см3; 26,81% 0,9%-ного раствора NaCl; 0,08% теотропина; 2,97% 2%-ной суспензии AL(OH)3; остальное - масляный адъювант. Предложенный способ является эффективным и безопасным и может быть использован в биотехнологии для производства вакцины против кампилобактериоза. 3 табл., 1 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, микробиологии и ветеринарии и может быть использовано в ветеринарной микробиологии и биотехнологии при разработке и производстве инактивированной вакцины против кампилобактериоза.
Из предшествующего технического уровня известно, что при изготовлении средств специфической профилактики инфекционных болезней животных нашли применение, главным образом, два типа адъювантов: сорбционные (гидрооксид алюминия, оксид кремний, алюмокалиевые квасцы) и масляные - для получения эмульсионных вакцин (адъювант Фрейнда и многочисленные его разновидности) [Sigma-FldrichFineChemicales, №4, 2002, s. 86].
Свойства масляных эмульсионных вакцин описываются положениями коллоидной химии и в соответствии с ними классифицируются по типу получаемой эмульсии: «вода в масле» или обратные эмульсии (антиген находится внутри мицелл и закрыт эмульгатором и маслом); «вода в масле в воде» или сложные эмульсии (антиген находится как внутри мицелл, так и в водной фазе), «масло в воде» или простые эмульсии (антиген находится в водной фазе) [Сумм Б.Д. Основы коллоидной химии. - М., 2007, с. 240].
Наиболее широкое применение в ветеринарии в настоящее время находят инъекционные эмульсионные вакцины типа «вода в масле».
Общим недостатком вакцин такого типа является высокая реактогенность. Под реактогенностью понимают способность вызывать воспаление, некроз или другие патологические явления в месте инокуляции, особенно для мелкого и крупного рогатого скота.
Известно применение гидроокиси алюминия в качестве адъюванта и формалина в качестве инактиватора при производстве гидроокись алюминиевой формол-вакцины против возбудителя Campylobacterfetussubspeciesfetus [«Современные проблемы профилактики и терапии заразных болезней сельскохозяйственных животных и птиц», Огородникова, Гришина, Горовенко, Киселева, Иванова. Опыт сравнительного изучения иммуногенности противокампилобактериозных вакцин на морских свинках, Ленинград, 1984, МСХ СССР ЛВИ, сборник научных трудов, с. 58-59.]. Данная вакцина выбрана в качестве прототипа.
Недостатком известного препарата (гидроокись алюминиевая-формол-вакцина) является недостаточная антигенная активность препарата, повышенная реактогенность инактиватора (формалина), используемого при производстве вакцины. Кроме того, формалин требует защиты дыхательных путей и кожных покровов специалиста при работе с ним.
Техническими результатами, которые могут быть получены при реализации изобретения, являются:
- снижение реактогенности вакцины;
- обеспечение высокой антигенной активности вакцины;
- осуществления назначения вакцины;
- повышение безопасности при производстве вакцины и ее введении;
- обеспечение прогнозируемого времени иммунного ответа.
Технический результат достигается благодаря тому, что в качестве инактивирующего агента используют теотропин в виде порошка, а в качестве адъюванта используют AL (ОН)3 и масляный адъювант, состоящий из эмульгатора (биологически инертное кремнийорганическое соединение цетил-ПЭГ/ППГ-10/1-диметикон) - 1,5% и масляной основы - вакцинное масло "М" по ТУ 381011224 - 98,5%), для смыва культуры кампилобактера используют 0,9%-ный раствор NaCl, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
суспензия клеток кампилобактepacepoгруппы fetussubspeciesfetus в культуральной среде с концентрацией 2×1010 КОЕ*/см3 (культура возбудителя Campylobacterfetussubspeciesfetus) - 0,14%;
0,9%-ный раствор NaCl - 26,81%;
теотропин - 0,08%;
2%-ная суспензия AL(OH)3 - 2,97%;
масляный адъювант - 70%.
Эффективность и безопасность вакцины контролируют в соответствии с требованиями существующей нормативной документации.
Реализация технического решения приведена в примере применения и иллюстрирована таблицами 1, 2, 3.
Пример 1. Получение инактивированной гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины типа «вода в масле».
В качестве адъюванта для гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины против Campylobacterfetussubspeciesfetus использовались гидроокись алюминия и масляный адъювант (состоит из эмульгатора (биологически инертное кремнийорганическое соединение цетил-ПЭГ/ППГ-10/1 - диметикон) - 1,5% и масляной основы - вакцинное масло "М" по ТУ 381011224 - 98,5%, патент РФ №2510845), в качестве инактиватора использовался теотропин в виде порошка.
Сперва выделяют, поддерживают и культивируют (накапливают) культуру (колонии) возбудителя кампилобактериоза (0,14% от итоговой массы вакцины), далее проводят смыв культуры возбудителя со среды 0,9%-ным раствором NaCl (26,81% от итоговой массы вакцины), затем инактивируют биомассу теотропином в виде порошка (0,08% от итоговой массы вакцины), далее добавляют адъювант Al (ОН)3 (2,97% от итоговой массы вакцины), после чего вносят получившийся препарат в масляный адъювант (70% от итоговой массы вакцины).
Установлено, что наилучший результат достигается именно при указанном соотношении компонентов. При использовании в более высоких концентрациях культуры клеток и/или использовании в меньших концентрациях теотропина возбудитель не инактивируется указанной концентрацией теотропина. При использовании адъюванта Al (ОН)3 в меньших концентрациях снижается уровень иммунного ответа. Использование теотропина и Al (ОН)3 в более высоких концентрациях не является научно и экономически обоснованным. При использовании масляного адъюванта в более высоких концентрациях повышается реактогенность препарата. При использовании масляного адъюванта в меньших концентрациях снижается уровень иммунного ответа. Использование 0,9% p-pa NaCl в меньших концентрациях не обеспечивает равномерный смыв культуры со среды. Использование 0,9% p-pa NaCl в больших концентрациях приводит к разрушению микробных клеток.
Ниже описано получение вакцины.
Производственный штамм Campylobacterfetussbsp. fetus (суспензия клеток с концентрацией 2×1010 КОЕ*/см3. Концентрацию микробных клеток определяют при помощи стандарта мутности (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), выделяют, поддерживают и культивируют на среде ПЖА в микроаэробных условиях в термостате при 37°C в течение 2 суток. После проверяют принадлежность возбудителя по его культурально-морфологическим и биохимическим свойствам.
Накопление колоний возбудителя осуществляют путем пересева возбудителя с ПЖА на фабричную питательную среду Himedia для поддержки и культивирования возбудителей кампилобактериоза и культивированием возбудителя на указанной среде в микроаэробных условиях в термостате при 37°C в течение 2 суток. Смыв колоний возбудителя со среды проводится стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида (объем раствора 99,2 мл) в стерильные флаконы по 100 мл.
Инактивацию проводят теотропином в виде порошка (0,3 г сухого вещества на 100 мл биомассы). Необходимую навеску теотропина стерильно вносят в смытую биомассу возбудителя. Перемешивают в течение 2 минут. Флаконы запечатывают, помещают в эксикатор для создания бескислородных условий. Эксикатор с флаконами помещают в термостат. Инактивация проходит в бескислородных условиях при 37°C в течение 2 суток. В качестве контроля аналогичный опыт проводят с формалином (0,5 мл 100%-ного раствора).
Контроль инактивации осуществляли путем посева полученной инактивированной биомассы на ПЖА, а также микроскопией инактивированных клеток.
Установлено, что препарат теотропин обеспечивает 100%-ную инактивацию штамма Campylobacterfetussubspeciesfetus в концентрации от 0,3% по отношению к биомассе возбудителя (табл. 1).
Образец гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины производят следующим образом:
1. В 100 мл инактивированной биомассы возбудителя вносится 2%-ная фабричная суспензия AL(OH)3 в количестве 11 мл, таким образом доводя концентрацию действующего вещества до 0,2% относительно общей массы препарата (ГОА тео-вакцина).
2. Перемешивают в течение 2 минут и ставят термостат на 24-48 часов при 37 градусах Цельсия.
3. Постепенно вносят (с использованием гомогенизатора Ultra-TurraxT-25) полученную ГОА тео-вакцину (30% итогового объема) в масляный адъювант (70% итогового объема) при 3000 об/мин в течение 3 минут;
4. Перемешивают полученную предварительную эмульсию при 14 тысяч оборотах в минуту в течение 5 минут.
В дальнейшем опытный образец вакцины прошел серию испытаний на стабильность, безвредность, реактогенность, иммуногенность и антигенную активность. Испытания проводились на лабораторных животных (морские свинки весом 500-600 г, по результатам серологического исследования не имеющие антител к возбудителю кампилобактериоза), поделенных на группы по 10 голов: 3 опытные и 1 контрольная.
Морские свинки первых 2-х групп были внутримышечно привиты гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакциной в следующих дозах:
1 группа - 5 млрд. м.т. (0,5 мл);
2 группа - 10 млрд. м.т. (1,0 мл).
Морские свинки 3-й группы были привиты гидроокисьалюминиевой-формол-вакциной в дозе 10 млрд. м.т. (1,0 мл).
Контрольная группа (4-ая) морских свинок не прививалась.
Иммуногенность вакцины оценивалась путем заражения подопытных животных культурой возбудителя. По общепринятой схеме проведено пассажирование патогенного штамма Campylobacterfetussubspeciesfetus на 4-х беременных морских свинках. Выделенная культура штамма второго пассажа в оптимальной концентрации 20 тыс. микробных клеток использована в качестве заражающей дозы. Заражение вакцинированных морских свинок проводилось подкожно в дозе 1 мл через 5 месяцев после вакцинации. Через 45 дней после заражения морские свинки опытных и контрольных групп убиты для бактериологического исследования.
Установлено, что большие прививочные дозы (10 млрд. м.т.) гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины и гидроокись алюминиевой-формол-вакцины могут обеспечить надежную защиту от заражения возбудителем кампилобактериоза. Во всех группах морских свинок, привитых в дозах 10 млрд. м.т., не установлено ни одного случая заболевания животных, в то время как в группе морских свинок, привитых дозой 5 млрд. м.т., из 10 животных заболело 3 (30%) при 100% заболевании морских свинок в контрольной группе. Таким образом, установлена высокая иммуногенность гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины в дозе 10 млрд. м.т. при 100% заболевании животных в контроле (табл. 2).
Длительность прививочного иммунитета испытанной вакцины достигает 150 дней (срок наблюдения). Стабильность вакцины более 10 месяцев (срок наблюдения).
Для определения безвредности (безопасности) вакцины осуществлялся ежедневный контроль состояния подопытных животных. Все животные из групп 1-3 по ходу всего эксперимента исправно и охотно принимали корм и воду, клинических признаков заболеваемости не выявлено, животные активны, аборты у беременных морских свинок отсутствовали. Признаков токсичности, пирогенности, аллергенности, тератогенности, мутагенности препарата не выявлено. Таким образом, установлена безвредность гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины.
При контроле реактогенности гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины у животных местных и общих побочных действий не выявлено (табл. 3).
Антигенная активность гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины устанавливалась путем определения титров антител в сыворотке крови животных через 3 и 6 недель после вакцинации. Две морские свинки из групп 3 и 4 пали до контрольного заражения во время планового взятия крови из сердца для контроля титров антител. Через 3 недели титр антител при дозе 5 мрлд. м.т. составил 1:25-1:200, при дозе 10 млрд. м.т. 1:25-1:400, через 6 недель при дозе 5 млрд. м.т. 1:25-1:200, при дозе 10 млрд. м.т. 1:25-1:800. Таким образом, установлена высокая антигенная активность гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины в дозе 10 млрд. м.т. (табл. 3).
Предложенный образец инактивированной гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины против кампилобактериоза более эффективен, безопасен и целесообразен, чем известный аналог гидроокись алюминиевая-формол-вакцина.
Для сравнения - максимальные титры антител, определенные при введении гидроокись алюминиевой-формол-вакцины - 1:25-1:200, тогда как при введении гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины определены титры 1:25-1:800. Кроме того, стоит отметить, что гидроокись алюминиевая-масляная-тео-вакцина не вызывала побочные реакции в организме подопытных животных, в отличие от гидроокись алюминиевой-формол-вакцины (дерматиты, воспалительные отеки в месте введения препарата).
Предложенный способ инактивации штамма кампилобактера Campylobacterfetussubspeciesfetus путем соединения с теотропином в виде порошка показателен и эффективен, практически более прост, безопасен и целесообразен, чем инактивация соединениями формалина.
Для сравнения - для инактивации возбудителя формалином необходимо внести не менее 0,5% компонента относительно биомассы возбудителя Campylobacterfetussubspeciesfetus, для 100%-ной инактивации штамма теотропином хватает 0,3%-ной концентрации. Кроме того, стоит отметить, что теотропин не вызывает у человека раздражения дыхательных путей при переводе сухого его вещества в жидкое агрегатное состояние (не выделяет токсичных паров).
Изобретение может быть использовано в биотехнологии при производстве инактивированной вакцины против кампилобактериоза. Предложенный способ производства гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакцины может применяться в деятельности лабораторий и в научной сфере.
Способ получения гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины против кампилобактериоза, включающий отдельные стадии выделения и накопления возбудителя кампилобактериоза Campylobacter fetus subspecies fetus на питательной среде, смыва накопленных колоний возбудителя кампилобактериоза Campylobacter fetus subspecies fetus 0,9%-ным раствором NaCl, инактивацию накопленной биомассы возбудителя кампилобактериоза Campylobacter fetus subspecies fetus путем смешивания накопленной биомассы возбудителя кампилобактериоза Campylobacter fetu ssubspecies fetus с инактивирующим агентом с последующей выдержкой в бескислородных условиях при 37°C в течение 2 суток, соединения инактивированной биомассы с адъювантом гидроокись алюминия и внесения получившейся биомассы в масляный адъювант, состоящий из эмульгатора (биологически инертное кремнийорганическое соединение цетил-ПЭГ/ППГ - 10/1-диметикон) - 1,5% и масляной основы - вакцинное масло "М" по ТУ 381011224 - 98,5%, отличающийся тем, что в качестве инактивирующего агента используют теотропин в соотношении 0,3% теотропина к 100% биомассы возбудителя кампилобактериоза Campylobacter fetus subspecies fetus, в качестве адъюванта гидроокись алюминия и масляный адъювант, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
суспензия клеток кампилобактера серогруппы fetus subspecies fetus в культуральной среде с концентрацией 2×1010 КОЕ*/см3 (культура возбудителя кампилобактериоза Campylobacter fetus subspecies fetus) - 0,14%;
0,9%-ный раствор NaCl - 26,81%;
теотропин - 0,08%;
2%-ная суспензия AL(OH)3 - 2,97%;
масляный адъювант - остальное.
