Способ получения изображения образца

Изобретение относится к способу получения изображения образца. Способ измерения образца (3) содержит этапы: (I) предоставление света первого состава; (II) выбор частицы из группы частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света первого состава; (III) формирование света первого состава, чтобы обеспечить распределение интенсивности света, содержащее пространственно ограниченный минимум; (IV) применение распределения интенсивности света к образцу так, что частица локализована в пространственно ограниченном минимуме распределения интенсивности света; (V) обнаружение фотонов, испускаемых частицей; и отслеживание перемещения частицы с помощью минимума распределения интенсивности света посредством (VI) перемещения распределения интенсивности света относительно образца так, что скорость испускаемых частицей фотонов остается минимальной, и (VII) получение фактического положения минимума распределения интенсивности света в образце в качестве фактического положения частицы в образце. Для получения изображения образца способ содержит дополнительные этапы: (VIII) определение времени пребывания частицы для каждой из множества частей образца и (IX) отображение распределения времени пребывания в образце. 27 з.п. ф-лы, 10 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способу получения изображения образца.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с известным способом отслеживания перемещения одиночной молекулы в образце молекулу возбуждают светом для испускания фотонов, а фотоны, испускаемые молекулой, обнаруживаются двумерным детектором, получающим изображение образца. Затем текущее положение молекулы определяют из пространственного распределения фотонов, обнаруженных детектором. При соответствующей плотности пикселей детектора текущее положение молекулы может быть определено из пространственного распределения фотонов с пространственным разрешением или точностью, превосходящей дифракционный предел. Тем не менее, это является предварительным условием отслеживания частицы с пространственной точностью за дифракционным пределом, при котором большое число фотонов обнаруживается для каждого положения молекулы, то есть до того как молекула изменяет свое положение. Это связано с тем, что большее число фотонов улучшает пространственную точность, достигнутую в определении положения молекулы, только если эта позиция остается неизменной в течение всего периода, в течение которого большее число фотонов испускается молекулой.

Пространственная точность задается радиусом Δr окружности вокруг положения молекулы, определенного из центра интенсивности распределения положений, в котором фотоны, испускаемые молекулой, обнаруживаются посредством двумерного детектора. Истинное положение молекулы локализуется в пределах этой окружности. Радиус Δr задается:

Δr=ПШПВ/N^1/2 (1)

и зависит от числа N обнаруженных фотонов и полной ширины на полувысоте максимума ПШПВ дифракционной картины.

Так как известный метод отслеживания движения одиночной молекулы требует огромного числа N фотонов для каждого положения молекулы в образце, молекула подвергается серьезному воздействию, что приводит к повышенному риску обесцвечивания молекулы. В процессе обесцвечивания молекула химически изменяется таким образом, что больше никаких фотонов не выдается молекулой после обесцвечивания. Кроме фотохимического обесцвечивания также возможно, что молекула, которая интенсивно и/или многократно возбуждалась для испускания фотонов, переходит в метастабильное темновое состояние. Из метастабильного темнового состояния молекула может вернуться через некоторое время. В метастабильном темновом состоянии, однако, молекула не испускает каких-либо фотонов, необходимых для непрерывного отслеживания молекулы.

Следовательно, существуют только некоторые молекулы, т.е. только некоторые так называемые флуоресцентные красители или флуорофоры, которые подходят для использования в известном способе. Многие флуорофоры обесцвечиваются слишком быстро и, следовательно, их движение или движение молекулы, отмеченной флуорофором, не может быть отслежено в течение длительного периода времени или на более длительном расстоянии, пройденном внутри образца.

В способе, описанном выше, положение молекулы определяют из распределения положений, в которых фотоны, испускаемые молекулой, обнаруживаются двумерным детектором. Такой подход называется локализацией. Другой подход для достижения высокого разрешения или точности в определении пространственного положения молекул, испускающих фотон, представляет собой, так называемую STED или RESOLFT флуоресцентную микроскопию. В этом случае пространственная область, в которой молекулы в образце эффективно возбуждаются для испускания фотонов, уменьшается до размера, меньшего, чем дифракционный предел. Таким образом, фотоны, испускаемые из образца, могут быть отнесены к этой конкретной пространственной области уменьшенного размера независимо от положения, в котором обнаружены фотоны, и независимо от количества обнаруженных фотонов. На практике, уменьшение пространственной области эффективного возбуждения молекул для испускания фотонов достигается путем применения сфокусированного пучка возбуждающего света, который совмещается с интерференционной картиной одного или более когерентных пучков подавляющего флуоресценцию света. Эта интерференционная картина содержит точку практически нулевой интенсивности в фокальной области пучка возбуждающего света. Для высоких абсолютных интенсивностей пучков подавляющего флуоресценцию света интенсивность подавляющего флуоресценцию света превышает интенсивность I_S насыщения в любом месте, кроме точки практически нулевой интенсивности так, что испускание фотонов молекулами в образце подавляется практически в любом месте, кроме точки практически нулевой интенсивности. Достигнутое пространственное разрешение или точность задается в виде:

Δr=λ/n sin α (1+I/I_S)^1/2) (2),

причем I - это максимальная интенсивность интерференционной картины в образце.

В STED флуоресцентной микроскопии подавление флуоресценции достигается за счет вынужденной эмиссии. В случае RESOLFT флуоресцентной микроскопии подавление флуоресценции достигается за счет временного переноса молекул в конформационное или состояние другого типа, в котором молекулы не способны к флуоресценции. Поскольку в STED флуоресцентной микроскопии требуются высокие абсолютные интенсивности подавляющего флуоресценцию света, риск обесцвечивания флуорофоров является относительно высоким. Для RESOLFT флуоресцентной микроскопии относительно низкие интенсивности подавляющего флуоресценцию света являются достаточными. Тем не менее, этот подход может быть применен только при использовании специальных флуорофоров, которые могут быть переключены в конформационное или состояние другого типа, в котором флуорофоры не способны флуоресцировать.

В целом, подходы, подобные STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии могли бы применяться для отслеживания перемещения частицы в образце, в котором частица отслеживается в области пространственно уменьшенного размера, где частица эффективно возбуждается для эмиссии светом флуоресценции. В этом случае критерием для частицы, находящейся в области пространственно уменьшенного размера могла бы быть максимальная скорость фотонов, испускаемых отслеживаемой частицей. Несмотря на то, что в соответствии с этим подходом для отслеживания могло бы потребоваться меньшее количество фотонов, чем для непрерывной локализации частицы, число частиц и маркеров, которые подходят для отслеживания перемещения на большие расстояния не могло бы быть в значительной степени увеличено. Кроме того, в STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии для получения света возбуждения и света для подавления флуоресценции должны быть применены различные световые пучки. Как правило, это требует дополнительных усилий, поскольку различные световые пучки имеют разные длины волн, и поскольку различные световые пучки должны быть тщательно пространственно выровнены.

Из DE 25 46 952 A1 известно, что оптическая система, основанная на так называемом затухающем полном отражении, может быть применена для отслеживания перемещений частиц в образце. В соответствии с DE 25 46 952 A1 на образец воздействует свет, побуждающий частицы испускать фотоны. Поскольку распределение интенсивности света, освещающего образец, не является однородным, а пространственно модулированным, перемещение частиц приводит к соответствующей флуктуации числа испускаемых фотонов. Таким образом, учитывая модуляцию распределения интенсивности, перемещение частицы может быть определено исходя из обнаруженной флуктуации испускаемых фотонов, то есть модуляции сигнала детектора. Однако, перемещение частицы, движущейся по траектории вдоль постоянной интенсивности света, не может быть отслежено. Кроме того, частица, на которую никогда или редко воздействует свет во время своего перемещения, не может быть отслежена вовсе. Таким образом, важно для отслеживания перемещений частиц в образце с помощью оптической системы, известной из DE 25 46 952 А1, чтобы на частицы часто воздействовал свет. Следовательно, риск обесцвечивания частиц или маркеров, маркирующих частицы эффективно не уменьшается, но должен быть принят во внимание.

Способ отслеживания перемещения одиночной молекулы в образце, содержащий признаки ограничительной части независимого пункта 1 формулы изобретения известен из WO 2013/072273 A1.

Существует потребность в способе получения изображения образца, основанном на частицах, которые движутся в образце.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения изображения образца. Способ содержит этапы: (I) предоставление света первого состава; (II) выбор частицы из первой группы частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света первого состава; (III) формирование света первого состава, чтобы обеспечить распределение интенсивности света, содержащее пространственно ограниченный минимум; (IV) применение распределения интенсивности света к образцу так, что частица локализована в пространственно ограниченном минимуме распределения интенсивности света; (V) обнаружение фотонов, испускаемых частицей; отслеживание перемещения частицы с помощью минимума распределения интенсивности света посредством (VI) перемещения распределения интенсивности света относительно образца так, что скорость испускаемых частицей фотонов остается минимальной, и (VII) получение фактического положения минимума распределения интенсивности света в образце в качестве фактического положения частицы в образце; (VIII) определение времени пребывания частицы для каждой из множества частей образца; и (IX) отображение распределения времени пребывания в образце.

Выгодные дальнейшие разработки раскрытия изобретения следуют из формулы изобретения, описания и чертежей. Преимущества признаков и сочетаний множества признаков, упомянутых в этом описании служат только в качестве примеров и могут быть использованы в качестве альтернативы или совокупно без необходимости вариантов осуществления, соответствующих раскрытию изобретения, которые должны достичь этих преимуществ. Без изменения объема защиты, как это определено в прилагаемой формуле изобретения, нижеследующее имеет место в отношении раскрытия первоначальной заявки и патента: дополнительные признаки могут быть взяты из чертежей, в частности, из показанных конструкций и размеров множества компонентов относительно друг друга, а также из их относительного расположения и их функционального соединения. Сочетание признаков различных вариантов осуществления раскрытия изобретения или признаков различных пунктов формулы изобретения независимо от выбранных ссылок формулы изобретения также возможно, и при этом мотивировано. Это также относится к признакам, которые проиллюстрированы на отдельных чертежах, или о которых было упомянуто при их описании. Эти признаки также могут быть объединены с признаками различных пунктов формулы изобретения. Кроме того, возможно, что дополнительные варианты осуществления этого раскрытия не имеют всех признаков, упомянутых в формуле изобретения. Они могут даже не иметь всех признаков, упомянутых в независимых пунктах формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее, раскрытие изобретения дополнительно поясняется и описывается со ссылкой на предпочтительные примерные варианты осуществления, проиллюстрированные на чертежах.

Фиг. 1 иллюстрирует примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения варианта осуществления способа в соответствии с настоящим раскрытием изобретения, при этом прибор содержит один источник света, точечный детектор и камеру.

Фиг. 2 показывает другой примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения другого варианта осуществления способа в соответствии с настоящим раскрытием изобретения, при этом прибор содержит один источник света и камеру.

Фиг. 3 показывает частицу в области минимума распределения интенсивности для побуждения частицы испускать фотоны.

Фиг. 4 показывает интенсивность из распределения интенсивности в соответствии с фиг. 3, в зависимости от положения вдоль линии профиля, кроме того, показана результирующая скорость фотонов, испускаемых частицей в соответствии с фиг. 3.

Фиг. 5 показывает ситуацию после перемещения частицы из ее положения в соответствии с фиг. 3.

Фиг. 6 показывает ситуацию после того, как распределение интенсивности последовало за перемещением частицы.

Фиг. 7 показывает дополнительный примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения дополнительного варианта осуществления способа по настоящему раскрытию изобретения, при этом прибор содержит один источник света, включающий в себя источник белого света и селектор, а также три расположенных рядом точечных детектора.

Фиг. 8 показывает еще один примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения еще одного варианта осуществления способа по настоящему раскрытию изобретения, при этом аппарат содержит два источника света и четыре расположенных рядом точечных детектора.

Фиг. 9 показывает распределение интенсивности света и распределение интенсивности сигнала отключения, вмещенное в распределение интенсивности света в сечении по оси Х вдоль фокальной плоскости; а также

Фиг. 10 показывает эффективную функцию h_eff рассеяния точки, полученную из распределения интенсивности в соответствии с фиг. 9.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Частица, чье перемещение в образце отслеживается в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой одиночную молекулу, группу молекул, движущихся вместе, комплекс, квантовую точку, отражающую частицу золота или тому подобное.

Процессом, лежащим в основе эмиссии фотонов частицей, подверженной воздействию света, может быть флуоресценция. Тем не менее, многие другие процессы также могут быть использованы в качестве основы для испускания фотонов, например, рассеяние света.

Соответствующий процесс, вызывающий эмиссию фотонов, может быть связан со свойствами самой частицы, подлежащей отслеживанию, или маркера, в частности, красителя, маркирующего частицу, подлежащую отслеживанию.

В способе по настоящему изобретению распределение интенсивности света, прикладываемое к образцу, характеризуется наличием пространственно ограниченного минимума. Как и в случае с подавляющим флуоресценцию светом, используемым в STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии, это распределение интенсивности может быть сформировано с помощью интерференционной картины одного или более когерентных световых пучков, в которой пространственно ограниченный минимум представляет собой точку практически нулевой интенсивности интерференционной картины. Таким образом, может быть обеспечен минимум с малыми пространственными размерами. В частности, пространственные размеры минимума могут быть меньше, чем дифракционный предел.

В отличие от STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии, однако, свет, отображающий это конкретное распределение интенсивности, не используется для подавления флуоресценции. Вместо этого, он используется для побуждения отслеживаемой частицы к эмиссии фотонов, подлежащих обнаружению, в качестве измерительного сигнала. Кроме того, образец не сканируется с помощью минимума распределения интенсивности, а распределение интенсивности только непрерывно перемещается по отношению к образцу так, что скорость фотонов, испускаемых частицей и впоследствии обнаруживаемых, минимизируется. Сведенная к минимуму или минимальная скорость фотонов означает, что частица по-прежнему локализуется в положении минимума распределения интенсивности света. И наоборот, увеличивающаяся скорость фотонов означает, что частица стремится покинуть минимум распределения интенсивности света; и что положение минимума должно быть отрегулировано, чтобы отслеживать перемещение частицы.

В способе из настоящего изобретения фотоны или положения их обнаружения не используются для определения фактического положения частицы в образце. Таким образом, нет никакой необходимости получать большое число фотонов для каждого положения частицы в образце, чтобы определить соответствующее положение с высокой точностью. Вместо этого, фактическое положение минимума распределения интенсивности света в образце принимается в качестве фактического положения частицы в образце.

При подходящих условиях перемещение частицы может быть отслежено с пространственной точностью, которая значительно ниже дифракционного предела. Кроме малых размеров минимума и высокой точности в перемещении распределения интенсивности света эти подходящие условия включают достаточно резкое увеличение интенсивности света снаружи от минимума, а также достаточно быструю перенастройку положения минимума в ответ на возрастающую скорость фотонов.

Поскольку не требуется, чтобы частица испускала много фотонов в способе по настоящему изобретению, риск обесцвечивания частиц сильно снижается. Следовательно, даже частицы, которые склонны к обесцвечиванию, могут быть отслежены в течение более длительных периодов времени или на больших расстояниях, преодолеваемых частицей в образце. Кроме того, в отличие от методов, основанных на STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии, образец подвергается только воздействию распределения интенсивности, содержащему минимум. Таким образом, не нужно выставлять свет, в соответствие с другим пучком света, ни пространственно, ни в отношении его длины волны. Из-за этого, оптическая настройка для применения способа в соответствии с настоящим изобретением значительно менее сложна, чем у STED или RESOLFT флуоресцентного микроскопа.

Существует также еще одно отличие для STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии. В способе, согласно настоящему изобретению, распределение интенсивности света с минимумом необходимо только для того, чтобы иметь небольшую абсолютную интенсивность при условии, что свет уже вызывает эмиссию фотонов при низких интенсивностях. Тем более не требуется, чтобы насыщение возбуждения для эмиссии фотонов достигалось за пределами нулевой точки, чтобы достичь пространственной точности ниже дифракционного предела. Вместо этого, во многих случаях, является предпочтительным, чтобы возбуждение непрерывно возрастало с увеличением расстояния до нулевой точки. Последнее, но немаловажное, является признаком настоящего изобретения, состоящим в том, что число фотонов, испускаемых отслеживаемой частицей, сводится к минимуму и, таким образом, риск ее обесцвечивания также минимизируется.

Перемещение или отклонение распределения интенсивности относительно, то есть по отношению к образцу, для непрерывной минимизации скорости обнаруженных детектором фотонов может быть основано на методе проб и ошибок. То есть распределение интенсивности перемещают на экспериментальной основе небольшими шагами. Если перемещение вызывает уменьшение скорости обнаруживаемых фотонов, схожей со скоростью испускаемых фотонов, распределение интенсивности перемещают далее в том же направлении. В противном случае, т. е. если перемещение вызывает увеличение скорости обнаруживаемых фотонов, распределение интенсивности перемещают в другом направлении, например, в противоположном направлении. Различные подходящие алгоритмы и варианты осуществления, подобные тем, что указаны ключевыми словами "отслеживающий алгоритм" и "нечеткая логика", известны специалистам в области техники.

Из STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии известны различные методы для формирования распределения интенсивности подавляющего флуоресценцию света, содержащего минимум, см. например, Klar и др., PNAS, 97 (2000), Westphal и др., Phys. Rev. Lett. 94 (2005) и Donnert и др., PNAS, 103 (2003), раскрытие которого включено в данное описание по ссылке во всей ее полноте. Любой из этих методов может быть также использован в способе согласно настоящему изобретению для формирования распределения интенсивности света, побуждающего отслеживаемую частицу испускать фотоны. Чтобы дать лишь несколько примеров, фазовые фильтры, пространственные модуляторы света, 4Pi устройства, использующие противоположные линзы и тому подобное, могут использоваться для формирования распределения интенсивности света, содержащего минимум.

Для перемещения или отклонения распределения интенсивности света с минимумом относительно образца может быть применен сканер, как известно также из STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии. Например, такой сканер содержит акустооптические или электрооптические дефлекторы, вращающиеся зеркала, пьезоэлектрические приводы, с помощью которых образец регулируется по отношению к световым пучкам, или пьезоэлектрические приводы, которые приводят в действие линзы объектива и, с помощью которых световые пучки регулируются по отношению к образцу.

Альтернативно или дополнительно к отклонению распределения интенсивности света перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца также может быть выполнено путем сдвига образца относительно распределения интенсивности света, содержащего минимум. Перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца требует только относительного перемещения между распределением интенсивности света с минимумом и образцом. В частности, перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца в направлениях x и у может быть достигнуто путем отклонения распределения интенсивности света, а перемещение распределения интенсивности света с минимумом по отношению к образцу в направлении z может быть достигнуто путем сдвига образца. Направление z может быть направлением ортогональным к плоскости основной протяженности поверхности образца, по которой распределение интенсивности света применяется к образцу, а направления x и у могут простираться вдоль или параллельно этой плоскости основной протяженности.

В соответствии со способом из настоящего изобретения минимум распределения интенсивности света может быть пространственно ограничен в одном, двух или трех измерениях, т.е. минимум может простираться вдоль плоскости, вдоль линии или вокруг точки. Для отслеживания перемещения частицы распределение интенсивности затем перемещается или отклоняется относительно образца во всех направлениях этих измерений, в которых минимум ограничен. Движение в направлении, в котором минимум не ограничен, не будет приводить к уменьшению скорости фотонов, испускаемых частицей и, таким образом, не может быть эффективно использовано. Это также означает, что перемещение частицы в этом направлении не может быть отслежено. Следовательно, это направление, предпочтительно, ориентируется так, что перемещение частицы в этом направлении не ожидается. Во многих случаях перемещения частиц в образце так или иначе ограничены вдоль направления определенной структуры. В случае двумерного образца перемещение частицы в направлении третьего измерения исключается в принципе.

Уже упоминалось, что распределение интенсивности с минимумом может быть сформировано как интерференционная картина одного или более когерентных парциальных световых пучков, в которой пространственно ограниченный минимум является точкой практически нулевой интенсивности. Интерференционная картина может, например, быть образована из одного когерентного пучка путем модуляции его волновых фронтов или из множества наложенных друг на друга когерентных световых пучков.

В одном варианте осуществления способа из настоящего изобретения модуляцию волновых фронтов одного когерентного светового пучка динамически изменяют так, что только одно- или двумерно ограниченный минимум распределения интенсивности света является попеременно пространственно ограниченным в различных пространственных измерениях. Например, фазовое отношение может изменяться между первым и вторым фазовым отношением так, что минимум ограничен кольцом в плоскости x-y - в случае первого фазового отношения, и так, что минимум ограничен в направлении z - в случае второго фазового отношения. Подходящие распределения интенсивности света для ограничения минимума либо в направлении x и у, либо в направлении z, а также соответствующие модуляции волновых фронтов когерентного светового пучка описаны в J. Keller at al.: "Efficient fluorescence inhibition patterns for RESOLFT microscopy", Optics Express 3361, Vol. 15, No. 6 (2007), а также B. HArke et al., NanoLetters, 8, 1309 (2008), раскрытия которых включены в данное описание по ссылке во всей ее полноте. J. Keller и др. и B. Harke и др. используют свои модели для подавления флуоресценции. Такие же модели, однако, могут быть использованы в способе из настоящего изобретения для распределения интенсивности света, побуждающего частицу эмитировать фотоны. В другой разновидности этого варианта осуществления из настоящего изобретения разные последовательные фазовые отношения могут привести к минимумам линейного или плоскостного вида, которые ориентированы в разных направлениях. Эти минимумы могут быть описаны как вращающиеся полосы и содержать точку или линию в качестве их пространственного пересечения. Если быстро переключаться между такими фазовыми отношениями и если минимум скорости фотонов, испускаемых частицей, локализован либо отдельно для каждого фазового отношения, либо во всему изменению фазовых отношений, то перемещение частицы в образце может быть отслежено во всех трех измерениях.

В способе из настоящего изобретения свет может состоять из световых компонентов различных длин волн. Кроме того, свет может изменяться по длине волны, чтобы иметь возможность отслеживать различные частицы, принадлежащие к разным группам частиц. Во всех этих случаях, является преимуществом, если распределение интенсивности света формируется так, что пространственное положение его пространственно ограниченного минимума не изменяется при изменении длины волны света.

В способе из настоящего изобретения фотоны, испускаемые частицей, не обязательно должны обнаруживаться с помощью матрицы двухмерного детектора. Вместо этого достаточно использовать точечный детектор для обнаружения фотонов, так как отслеживание в первую очередь зависит от скорости этих фотонов. Текущее положение частицы в образце будет определяться исходя из текущего положения распределения интенсивности с минимумом относительно образца. Вывод об этом положении может быть сделан из положений тех устройств, с помощью которых распределение интенсивности перемещается относительно образца, например текущим положением сканера, используемого для перемещения распределения интенсивности. Положение распределения интенсивности относительно образца может также быть непосредственно определено с помощью, например, обнаружения испускаемых частицей фотонов камерой, получающей изображение образца, и путем оценки изображения распределения интенсивности света, состоящего из этих фотонов, в камере. В соответствии с принципами локализации это определение также позволяет достичь точности положения за дифракционным пределом.

Кроме того, камера, получающая изображение образца может быть использована для определения начального положения частицы путем освещения образца светом, побуждающим частицу эмитировать фотоны, без пространственно структурированного света. В случае, когда обнаруживаются две или более частиц, которые испускают фотоны, и которые не могут быть отслежены отдельно друг от друга, возможно фотохимическим способом обесцветить лишние частицы путем целенаправленного применения высоких интенсивностей света, в том виде как они, например, присутствуют в максимумах распределения интенсивности света, примыкающих к его минимуму. Такое обесцвечивание возмущающих частиц также может быть применено, если увеличение скорости обнаруживаемых фотонов происходит не из-за отслеживаемой переместившейся частицы, а из-за другой частицы подобного рода, пересекающей путь отслеживаемой частицы. Эта другая частица может, например, быть распознана через камеру посредством большого числа фотонов, испускаемых дополнительно вдали от минимума распределения интенсивности света.

Камера, получающая изображение образца, может быть также использована для определения направления перемещения частицы из положений, где фотоны, испускаемые частицей, обнаруживаются камерой. Для этого определения, также возможно, чтобы выполнялась локализация частиц, при этом локализация основывается на фотонах, испускаемых частицей, когда она покидает минимум распределения интенсивности света. Здесь, однако, не требуется, чтобы локализация выполнялась с высокой точностью. Таким образом, не требуется, чтобы частица испускала много фотонов, так как испускаемые фотоны используются только для определения направления, в котором минимум распределения интенсивности света, необходимо переместить, чтобы следовать за частицей. Тем не менее, испускаемые фотоны не требуются для достижения желаемой пространственной точности в отслеживании частицы. Вместо этого пространственная точность достигается за счет последовательной минимизации скорости фотонов, испускаемых частицей и, таким образом, за счет формы и/или расположения минимума распределения интенсивности света. Эта минимизация также может быть основана на методе проб и ошибок для повторной регулировки пространственно ограниченного минимума распределения интенсивности света.

Не требуется, однако, использовать полную камеру для определения направления перемещения частицы на основе положений, где фотоны, испускаемые частицей, обнаруживаются. Достаточная информация для такого определения является также доступной при использовании по меньшей мере двух расположенных рядом точечных детекторов для отслеживания частицы в одном измерении или по меньшей мере трех расположенных рядом точечных детекторов для отслеживания частицы в двух или трех измерениях. Аналогичная концепция используется в известных четырехквадрантных фотодиодах для определения положения лазерного пучка, например. Кроме того, в S.J. Sahl et al.: Fast molecular tracking maps nanoscale dynamics of plasma membrane lipids, PNAS, April 13, 2010, Vol. 107, No. 15, 6829-6834, раскрытие которой включено в настоящее описание по ссылке во всей ее полноте, раскрыто использование трех, расположенных рядом точечных детекторов, снабженных тремя входными поверхностями волокон, для отслеживания флуоресцентной частицы в стандартной процедуре молекулярного отслеживания. Эти точечные детекторы также могут быть использованы в способе из настоящего изобретения для обнаружения фотонов, испускаемых частицей.

Поскольку способ в соответствии с настоящим изобретением направлен на минимизацию скорости фотонов, испускаемых частицей, фон, который обнаруживается в дополнение к тем фотонам, которые являются объектом исследования, приобретает особое значение. Фон может быть, например, из-за света, который применяется к образцу, чтобы побудить частицы испускать фотоны, и который рассеивается на детекторе, или из-за автофлюоресценции образца. Для того чтобы минимизировать влияние фона, свет, побуждающий частицы испускать фотоны может быть применен к образцу в импульсах, и фотоны, испускаемые частицами могут быть обнаружены в течение ограниченного интервала времени после каждого из импульсов света. Этот временной интервал или окно может быть отрегулирован так, чтобы достичь максимального соотношения сигнал-шум. Другим подходом для снижения фона является выбор частицы так, чтобы она побуждалась испускать фотоны светом через многофотонный процесс. Тогда, фотоны, испускаемые частицей, имеют в значительной степени более короткую длину волны, чем свет, который применяется к образцу, и фон, благодаря этому свету может быть легко подавлен по длине волны. Кроме того, многофотонное возбуждение или поглощение ограничивается областью, окружающей частицу во всех трех измерениях. Многофотонное возбуждение не распространяется на увеличенном объеме образца, таким образом, сводя к минимуму нежелательное возбуждение (авто)флуоресценции. Это ограничение многофотонного возбуждения хорошо известно из микроскопии многофотонного флуоресцентного возбуждения.

В способе из настоящего изобретения свет для побуждения частицы испускать фотоны может быть выбран по длине волны из белого света. Изменяя этот выбор, могут быть отслежены различные частицы, принадлежащие к разным группам частиц. Источники света, обеспечивающие белый свет, как правило, известны. Они представляют собой, например, доступные от NKT Photonics, Дания. Эти источники света обеспечивают импульсы света практически постоянной интенсивности в расширенном диапазоне длин волн. Свет, используемый в способе из настоящего изобретения, может быть выбран из этого диапазона.

В одном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению фотоны, испускаемые отслеживаемой частицей, дополнительно анализируются для определения по меньшей мере одного параметра, выбранного из группы параметров, состоящей из длины волны, поляризации, абсолютной скорости, относительных чисел, обнаруженных расположенными рядом точечными детекторами, совпадения и момента времени после каждого импульса света. Это позволяет собрать дополнительную информацию или подробности об отслеживаемой частице. Эти подробности могут изменяться на треке частицы. Результирующие изменения в длине волны фотонов и момента времени фотонов после каждого импульса света можно проанализировать для мониторинга эти подробностей. В частности, может быть применен подобный метод, описанный в A. Schönle and S.W. Hell: Fluorescence nanoscopy goes multicolor, Nature Biotechnology, Vol. 25, No. 11, November 2007, 1243-1235, раскрытие которого включено в настоящее описание по ссылке во всей ее полноте. Анализ подробностей о частице в этом способе является высокочувствительным. Это связано с тем, что только одиночная частица отдает анализируемые фотоны, т. е. нет никакого разбавления фотонами от других частиц с другими подробностями. Это, в частности, обеспечивает точную классификацию отслеживаемой частицы на основе тонких отличий длины волны или других характеристик фотонов, испускаемых частицей.

Анализ фотонов, приходящих от частицы, также позволяет определить, содержит ли частица один или более светоизлучающих центров, и остаются ли эти светоизлучающие центры, вместе или отдельно друг от друга в какой-то момент времени. Так, например, могут контролироваться связи и комплексы с учетом их индивидуальных партнеров по связи или партнеров по комплексу, соответственно.

В способе из настоящего изобретения детектор, используемый для обнаружения фотонов, испускаемых частицей, также обнаруживает все фотоны, испускаемые другими частицами, принадлежащими к той же группе частиц, и также локализующимися в зоне обнаружения детектора. Способ из настоящего изобретения, тем не менее, будет работать должным образом только, если одиночная частица испускает все фотоны, обнаруженные и рассмотренные при скорости фотонов, сведенной к минимуму для отслеживания частицы. Чтобы подтвердить, что это условие выполняется, фотоны, испускаемые из зоны обнаружения детектора, т. е. из зоны, содержащей минимум распределения интенсивности света, могут быть проанализированы для определения одного или более из перечисленных выше параметров, и определенные параметры могут быть проверены на предмет соответствия одинарной частице, испускающей анализируемые фотоны. В частности, в этом контексте, параметр абсолютной скорости фотонов, испускаемых частицей, может также называться яркостью частицы. Если фотоны испускаются более чем одной частицей, все, кроме одной частицы должны быть выключенными или обесцвеченными, или другая частица должна быть выбрана в другой части образца.

Способ в соответствии с настоящим изобретением может быть применен для отслеживания переключаемой частицы, например переключаемой молекулы, причем свет для побуждения эмиссии фотонов может вызвать активацию переключаемой молекулы из состояния, в котором частица не может быть побуждена испускать фотоны, в состояние флуоресценции, в котором частица может быть побуждена испускать фотоны. Один пример такой переключаемой молекулы, которая называется PADRON, которая представляет собой протеин, подобный зеленому флуоресцентному белку (GFP). Хотя это и не требуется, может быть предпочтительным, в данном варианте осуществления, что частица быстро возвращается в не флуоресцентное темновое состояние, так как это поддерживает эффект минимизации скорости испускаемых фотонов, достигнутой в минимуме распределения интенсивности побуждающего излучение фотонов света. Возвращение частиц в темновое состояние может происходить спонтанно или может быть вызвано любым физическим или химическим сигналом. Так как не требуется, чтобы этот индуцирующий сигнал был пространственно структурированным, он предпочтительно пространственно не структурирован.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, использующем переключаемые частицы, свет другой длины волны, чем у света, побуждающего испускание фотонов, может, например, использоваться для настройки небольшой концентрации активированных частиц, которые могут быть побуждены испускать фотоны в образце, как это требуется для любого отслеживания одиночных частиц. Для этой цели могут быть использованы фотопереключаемые белки, называемые DRONPA, rsEGFP, EOS и Dendra2, которые активируются на другой длине волны, чем длина волны их возбуждения. DRONPA и rsEGFP не только возбуждаются для испускания фотонов, но и деактивируется на длине волны их возбуждения. Благодаря низкому числу фотонов, необходимому для способа из настоящего изобретения, тем не менее, они могут быть успешно отслежены в течение некоторого времени с помощью распределением интенсивности возбуждающего света. EOS и Dendra2 вообще не деактивируются на длине волны их возбуждения, они могут только обесцвечиваться.

Во всех вариантах осуществления настоящего изобретения, использующих переключаемые частицы, свет для побуждения эмиссии фотонов, который формируется для обеспечения распределения интенсивности света с пространственно ограниченным минимумом, может либо содержать только один световой компонент одной длины волны или два компонента различных длин волн. В случае только одного компонента света, компонент света может либо возбуждать частицы для эмиссии фотонов, которые уже были включены или активированы другим способом, или он и активирует и возбуждает частицы для эмиссии фотонов. В случае двух компонентов света, один из этих двух компонентов света может быть использован для активации частиц, в то время как другой из компонентов света возбуждает их для эмиссии фотонов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения отдельный сигнал выключения обеспечивается распределением интенсивности сигнала и вмещает в себя распределение интенсивности света. Этот сигнал выключения выключает другие частицы, принадлежащие к группе частиц, которые побуждаются испускать фотоны под воздействием света. Выключение может происходить путем фотохимического обесцвечивания или путем переключения фото-деактивируемых частиц в устойчивое темновое состояние, например. Этот вариант осуществления настоящего изобретения гарантирует, что частицы, пересекающие трек отслеживаемой частицы не нарушат ее отслеживание испусканием фотонов, вносящих вклад в скорость фотонов, которая должна быть сведена к минимуму. Сигнал отключения может быть отключающим светом. Сигнал отключения обычно может быть сформирован таким же образом, как свет и концентрично по отношению к минимуму распределения интенсивности света, но с большим минимумом сигнала выключения в общем центре. Этот больший минимум сигнала выключения не допускает, чтобы отслеживаемая частица выключилась.

В одном варианте осуществления способа из настоящего изобретения подсчитывают фотоны, испускаемые частицей и обнаруженные, и указывают абсолютное число фотонов, которые уже были испущены частицей и обнаружены. Каждая частица обычно может побуждаться к испусканию числа фотонов до того, как частица обесцвечивается и, таким образом, больше не способна отслеживаться. Это число фотонов не является абсолютно фиксированным, но не изменяется сильно в пределах каждой группы частиц. Таким образом, абсолютное число фотонов, которые были уже испущены частицей и обнаружены, является хорошим показателем той части отслеживаемой продолжительности жизни частицы, которая уже истекла, и оставшейся части отслеживаемой жизни, в которой частица еще может отслеживаться.

В одном варианте осуществления способа из настоящего изобретения по меньшей мере две частицы, отобранные из той же самой группы частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света, поочередно отслеживаются посредством минимума распределения интенсивности света. Эти сканеры, уже упомянутые выше, которые известны из STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии, подходят, чтобы изменить положение минимума распределения интенсивности света с высокой точностью намного быстрее, чем любая частица может двигаться в образце. Другие подходящие сканеры являются теми, которые уже используются для отслеживания и захвата нескольких частиц, как, например, в оптических пинцетах. Таким образом, множество частиц, могут быть отслежены параллельно в тех этапах способа, соответствующего настоящему изобретению, которые выполняются поочередно по отношению к каждой из множества частиц.

В разновидности варианта осуществления настоящего изобретения, описанного в предыдущем абзаце, распределение интенсивности света периодически перемещается вперед и назад вдоль линии или траектории через образец, на котором локализуется две или более частицы, отобранные из той же группы частиц. Во всех направлениях, перпендикулярных к этой линии или траектории, две или более частицы, непосредственно отслеживается в том направлении этой линии, которое перенастраивается, чтобы свести к минимуму скорость фотонов, испускаемых частицами. Положения частиц вдоль линии, тем не менее, могут быть определены из положений локальных минимумов скорости обнаруженных фотонов, излучаемых частицами вдоль линии. Этот вариант осуществления также допускается для отдельного отслеживания частиц, которые находятся очень близко друг к другу. В этом случае линия, вдоль которой распределение интенсивности света перемещается вперед и назад может, в частности, простираться в направлении расстояния между частицами. В этом варианте осуществления расстояние между частицами является расстоянием от локальных минимумов скорости обнаруженных фотонов вдоль линии.

Возможно, также отслеживать перемещения двух или более разных частиц согласно способу из настоящего изобретения. Для этой цели может быть использован свет двух или более различных длин волн или поляризаций, и могут быть обнаружены фотоны длин волн или поляризаций, характерных для соответствующих частиц. Помимо обычных линз объектива это отслеживание двух или более различных частиц может быть выполнено отдельными устройствами. В другом варианте осуществления настоящего изобретения существуют только отдельные источники света, в то время как все другие части установки отслеживания являются совместно используемыми. Все совместно используемые части будут использоваться попеременно для обеих частиц, т.е. путем переключения между отслеживанием одной частицы и отслеживания другой частицы.

Согласно настоящему изобретению отслеживание частицы используется для получения изображения образца. Для этой цели время пребывания частицы определяется для каждой из множества частей образца. Эти части образца могут быть, в частности, объемными элементами или вокселами, на которые разделен весь объем образца. Когда отображается распределение времени пребывания в образце, получается изображение образца. В базовом варианте осуществления полученное изображение образца может указывать все области образца, в которых отслеживаемая частица была, или все области, в которых отслеживаемая частица не была. Более детализированное изображение может указывать на различные области с разными временами пребывания. Например, область, в которой частица была редко, отображается отдельно от области, в которой частица была часто. Из этих различных времен пребывания частицы в соответствующих областях, можно сделать вывод, что эти области образца различны сами по себе. Они будут, в частности, отличаться по доступности к частице или подвижности частицы или сродством с частицей, или даже склонностью связывать частицы.

Области могут дополнительно отличаться между собой, например, абсолютным временем пребывания частицы, вычисленным как сумма всех отдельных времен пребывания частицы в соответствующей части образца, и, например, непостоянным временем пребывания, вычисленным как среднее значение отдельных времен пребывания частицы в соответствующей части образца. Абсолютное время пребывания может быть более характерным при сродстве соответствующей части образца частице, в то время как непостоянное время пребывания может быть более характерным при подвижности частицы в соответствующей части образца.

Следует понимать, что такой способ получения изображения образца не только позволяет получить одно фиксированное изображение образца. Напротив, для получения последовательности изображений, то есть фильма, показывающего развитие образца во времени, также может быть использовано временное развитие времен пребывания в различных частях образца.

Пространственное разрешение этого способа получения изображения образца зависит от размера вокселов, для которых определяются времена пребывания. Так как положение частицы в образце может быть отслежено с точностью за пределами дифракционного барьера, изображение может также иметь пространственное разрешение за пределами дифракционной барьера.

Если частица была отслежена на протяжении длительного пути в образце, это может быть достаточным для получения изображения всего образца. Если отображение времени пребывания, тем не менее, повторяется для каждого из множества частиц, могут быть распознаны различные области образца, каковые разделяются перегородками, через которые частицы не могут проходить или могут проходить только на низкой скорости.

Если различные частицы, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света различных составов, используются в этом варианте осуществления настоящего изобретения, получается многоцветное изображение образца. Каждый «цвет» этого изображения связан с другим свойством образца, для которого частицы из соответствующей группы частиц служат в качестве зонда.

Прибор в соответствии с настоящим раскрытием изобретения содержит источник света, обеспечивающий свет, который используется для побуждения частицы испускать фотоны, и детектор для обнаружения фотонов, испускаемых частицей. Прибор дополнительно содержит средства формирования пучка, выполненные с возможностью применять свет с распределением интенсивности, содержащим пространственно ограниченный минимум, к образцу. Кроме того, предусмотрены средства отклонения пучка, которые управляются в зависимости от сигнала детектора. Фактическая зависимость такова, что скорость фотонов, обнаруженных детектором, поддерживается минимальной путем перемещения или отклонения распределения интенсивности света по отношению к образцу. Таким образом, перемещение частиц отслеживается минимумом распределения интенсивности света.

В одном варианте осуществления прибора согласно настоящему раскрытию изобретения средства формирования пучка модулируют волновые фронты когерентного пучка света, а затем фокусируют пучок на образец, чтобы обеспечить минимум распределения интенсивности света в качестве точки практически нулевой интенсивности интерференционной картины света. Для модуляции волновых фронтов светового пучка средства формирования пучка могут содержать динамически управляемый пространственный модулятор света.

В другом варианте осуществления прибора согласно настоящему раскрытию изобретения средства формирования пучка фокусируют по меньшей мере два когерентных пучка света в одной и той же фокальной области в образце. Кроме того, в этом случае они обеспечивают минимум распределения интенсивности света в качестве точки практически нулевой интенсивности интерференционной картины.

Кроме того, средства формирования пучка могут быть ахроматическими, так что пространственное положение пространственно ограниченного минимума не изменяется при изменении длины волны света.

Для получения изображения образца может быть предусмотрена камера. Камера может, например, использоваться для определения того где частица, подлежащая отслеживанию, локализована в образце. Для этого определения образец может быть подвергнут воздействию света без пространственной структуры. Камера также может быть использована для определения положения распределения интенсивности света, когда частица отслеживается в образце. Кроме того, камера может быть использована для определения направления, в котором распределение интенсивности необходимо перемещать для отслеживания частицы. Для определения направления, в котором распределение интенсивности начинает двигаться для отслеживания частицы, кроме камеры могут быть предусмотрены один или предпочтительно два или более, расположенных рядом точечных детектора. В частности, набор многомодовых оптических волокон, как описано в S.J. Sahl et al.: Fast molecular tracking maps nanoscale dynamics of plasma membrane lipids, PNAS, April 13, 2010, Vol. 107, No. 15, 6829-6834, может быть использован в качестве расположенных рядом точечных детекторов.

Для отслеживания двух различных частиц могут быть предусмотрены два источника света, обеспечивающие свет различных длин волн. Для одновременного отслеживания для каждого из источников света могут быть предусмотрены отдельные средства формирования пучка и средства отклонения пучка. Тем не менее, также возможно, что обычные средства предусмотрены для обоих источников света, которые используются попеременно. Также возможно, что для одновременного или быстро чередующегося отслеживания более двух частиц предусмотрено более чем два источника света.

В частности, источник света может быть импульсным источником света, подобным импульсному лазеру такому, что свет, подводится к образцу в импульсах. Детектор может затем быть снабжен окном и синхронизирован с импульсным источником света, так что фотоны, испускаемые частицей, обнаруживаются после каждого импульса света в течение ограниченного интервала времени при максимальном соотношении сигнал-шум. Эта процедура также известна как детектирование с временной синхронизацией.

В одном варианте осуществления прибора согласно настоящему раскрытию изобретения источник света содержит селектор, выполненный с возможностью выбора света из белого света, например, по длине волны или поляризации. Белый свет может, в частности, быть обеспечен некоторым известным импульсным источником света, например, доступным от NKT Photonics, Дания.

Детектор прибора согласно настоящему раскрытию изобретения может дополнительно содержать анализатор, выполненный с возможностью анализировать фотоны, испускаемые из объема, включающего в себя минимум распределения интенсивности света по меньшей мере одного параметра, выбранного из группы параметров, состоящей из длины волны, поляризации, абсолютной скорости, относительных чисел, обнаруживаемых расположенными рядом точечными детекторами, совпадения и момента времени обнаружения после каждого импульса света. Анализатор позволяет собирать информацию о постоянных и изменяющихся подробностях о частице. На основе этой информации частица может быть идентифицирована или отнесена к конкретному классу частицы. Анализатор позволяет также определять испускаются ли фотоны только одной или более частицами, которые могут быть связаны.

Детектор прибора согласно настоящему раскрытию изобретения может дополнительно обнаруживать фотоны, испускаемые частицей избирательно на длине волны, которая является практически половиной длины волны света, поданного от источника света. Это означает, что частица побуждается к испусканию фотонов через двухфотонный процесс. Благодаря высокой разнице в длине волны между светом, побуждающим частицу испускать фотоны, и испускаемыми частицей фотонами, подавление фона при обнаружении фотонов становится особенно легким. Кроме того, в случае двухфотонного процесса, побуждающего частицу испускать фотоны, вероятность того, что свет, также ошибочно побуждает частицы испускать фотоны в других областях образца, сильно снижается. Это особенно относится к частицам в других положениях в направлении оси z, нежели чем в фокальной плоскости, в которой свет фокусируется, причем Z, обозначает оптическую ось, вдоль которой фокусируется свет. Многофотонные индуцированные процессы в основном происходят в фокальной области наибольшей интенсивности, тем самым ограничивая возбуждение во всех трех измерениях.

То же свойство отбора по оси Z многофотонных процессов может быть также использовано через многофотонный процесс, выборочно активируя активируемую частицу в некотором z положении в образце светом активации, сфокусированным в фокальной области в этом z положении, т.е. на этой глубине в направлении оптической оси.

Кроме того, прибор согласно настоящему раскрытию изобретения может содержать источник сигнала, обеспечивающий сигнал выключения, в частности, свет выключения, с распределением интенсивности сигнала, вмещающим распределение интенсивности света. Если сигнал выключения выключает другие частицы, испускающие фотоны под воздействием света, эти другие частицы уже выключаются, прежде чем они будут подвергнуты воздействию света, благодаря перемещению распределения интенсивности света или других частиц. Таким образом, другие частицы не будут испускать фотоны, которые могли бы помешать отслеживанию частицы. Сигнал выключения может, например, деактивировать активную частицу в деактивированное состояние, в котором она больше не может быть побуждена к испусканию фотонов. В другом варианте осуществления, сигнал выключения посредством вынужденной эмиссии запрещает занятие возбужденного молекулярного состояния, из которого частицы испускают обнаруживаемые фотоны. Таким образом, эффективная функция рассеяния точки, указывающая область образца, в которой частица эффективно побуждается к испусканию фотонов посредством комбинированного распределения интенсивности света и сигнала выключения, является пространственно ограниченной для небольшой области, вмещающей минимум распределения интенсивности света.

Прибор согласно настоящему раскрытию изобретения может содержать счетчик, подсчитывающий фотоны, испускаемые из объема, включающего в себя минимум распределения интенсивности света, и обнаруживаемые детектором, чтобы указывать абсолютное число подсчитанных фотонов. Индикация абсолютного числа подсчитанных фотонов может быть относительным показателем, указывающим процент фотонов, уже подсчитанных для одной частицы, по отношению к ожидаемому числу фотонов, которое можно ожидать от эмиссии частицей, прежде чем она станет обесцвеченной.

Прибор согласно настоящему раскрытию изобретения может содержать по меньшей мере один дополнительный источник света, чтобы обеспечить дополнительный свет для побуждения дополнительной частицы испускать фотоны. Дополнительный свет может отличаться от света по длинам волн или поляризации по меньшей мере одного из своих компонентов света. Источник света и по меньшей мере один дополнительный источник света могут быть выполнены с возможностью одновременно или попеременно отслеживать перемещения частицы и дополнительной частицы.

Даже только с одним источником света прибор согласно настоящему раскрытию изобретения может быть использован для отслеживания некоторого числа частиц параллельно, т. е. практически в одно и то же время. Это может, например, быть достигнуто в том, что средства отклонения пучка выполнены с возможностью попеременно отслеживать частицы и по меньшей мере одну другую частицу с помощью минимума распределения интенсивности света. Если средства отклонения пучка, например, содержат акустооптический дефлектор или быстрый электрооптический дефлектор, пространственно ограниченный минимум распределения интенсивности света может быть попеременно настроен для двух или даже большего количества частиц намного быстрее, чем любое возможное движение частиц.

Как уже указывалось ранее, минимум распределения интенсивности света может быть проведен на высокой скорости вдоль линии или траектории так, что обнаруживаемый, зависимый от времени сигнал измерения, то есть скорость обнаруживаемых фотонов, характеризует минимумы, как функции времени или положения вдоль траектории. Каждый минимум представляет собой одну частицу. Положение соответствующей частицы может быть определено из расположения соответствующего минимума сигнала измерения, либо непосредственно, либо после математической оценки. Математическая оценка может включать в себя линейную или нелинейную деконволюцию с математическим откликом на одиночную частицу. Таким образом, множество частиц может быть отслежено на высокой скорости и с высоким пространственным разрешением.

Так как прибор согласно настоящему раскрытию изобретения необходим только, чтобы обеспечить свет для побуждения частиц к эмиссии, его установка может быть простой. Тем не менее, прибор согласно настоящему раскрытию изобретения также может быть реализован на основе или в виде комбинации с (потенциально уже существующим) STED или RESOLFT флуоресцентным микроскопом. В частности, средства формирования пучка, которые используются для света, подавляющего флуоресценцию в STED или RESOLFT флуоресцентном микроскопе могут быть использованы для света, с помощью которого частица побуждается испускать фотоны в настоящем раскрытии изобретения. Кроме того, средства отражения пучка, используемые для сканирования образца, могут быть легко приспособлены, чтобы использовать их для отслеживания частицы путем минимизации скорости обнаруженных фотонов. При осуществлении настоящего раскрытия изобретения на STED или RESOLFT флуоресцентном микроскопе, есть возможность дополнительно получить изображение образца путем STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии в любое время, как, например, до или после выполнения способа из настоящего раскрытия изобретения или даже в течение некоторого времени между ними.

Обратимся теперь более подробно к чертежам, фиг. 1 показывает прибор 1 для отслеживания перемещения частицы 2 в образце 3. Частица 2 может, например, быть флуоресцентным маркером, или частица 2, может быть маркирована таким флуоресцентным маркером. Под действием света 4 от источника света 5 флуоресцентный маркер побуждается к испусканию фотонов. Это происходит практически только за пределами минимума распределения интенсивности света 4 в образце 3. Это распределение интенсивности описывается более подробно со ссылкой на фиг. 3-6. Источник света 5 содержит лазер 6. Средство 7 формирования пучка предусматривается для формирования требуемого распределения интенсивности света в фокальной объеме линзы 8 объектива; а средства 9, 10 и 11 отклонения пучка предназначены для регулировки положения минимума распределения интенсивности света 4 в образце 3. Средства 9 и 10 отклонения пучка непосредственно воздействуют на свет 4 и передвигают или отклоняют минимум в направлении x и/или у, то есть в поперечном направлении относительно траектории света. Средство 11 отклонения пучка, тем не менее, непосредственно воздействует на образец 3 и перемещает или отклоняет минимум распределения интенсивности света 4 относительно образца 3 в направлении z. За дихроичным светоделителем 13 предусматривается точечный детектор 12 для выборочного обнаружения фотонов, испускаемых частицей 2. Светоделитель 13 находится на оптической траектории между лазером 6 и образцом 3 и, в частности, между лазером 6 и средствами 9 и 10 отклонения пучка. Другой светоделитель 14 находится между средствами 9 и 10 отклонения пучка и линзами 8 объектива. С помощью светоделителя 14 камера 15, включающая в себя двухмерный детектор, контролирует образец 3. Для первоначальной локализации частицы 2 свет 4 подводят к образцу 3 на большой площади, и частица 2 локализуется на основании фотонов, испускаемых частицей 2, а изображение получают с помощью камеры 15. Затем, распределение интенсивности света 4 регулируют по отношению к частице 2 так, что частица 2 локализована в положении минимума распределения интенсивности света 4. То, что частица 2 действительно локализована в положении минимума проверяют путем перемещения распределения интенсивности света 4 относительно образца 3 на экспериментальной основе. При этих движениях скорость фотонов, испускаемых частицей 2, которые обнаруживаются точечным детектором 12, должна увеличиваться. Однако уменьшение скорости указывает на то, что распределение интенсивности света 4 должно быть отрегулировано так, чтобы отслеживать частицу 2 с помощью минимума, поскольку частица 2 переместилась. Увеличение скорости фотонов без перемещения распределения интенсивности света 4 также означает, что частица 2 переместилась в образце 3. Затем, распределение интенсивности света 4 должно быть смещено для того, чтобы отслеживать частицу 2 с помощью минимума, пока скорость фотонов вновь не достигнет своего минимума. Для этого отслеживания средства 9 до 11 отклонения пучка управляются с помощью контроллера 16 в зависимости от сигнала детектора 12. Положение и/или перемещение минимума распределения интенсивности света 4, которое определяют во время слежения, имеет сходство с движением частицы 2 в образце 3. Направление движения частицы 2 может быть определено из тех положений, где фотоны, испускаемые частицей 2, обнаруживаются камерой 15, т.е. где частица выходит из минимума, чтобы поддерживать отслеживание частицы с помощью минимума.

На рис. 1 показано, что контроллер 16 также управляет средством 7 формирования пучка. Практически средство 7 формирования пучка может представлять собой пространственный модулятор света, с помощью которого различные распределения интенсивности света 4 в образце 3 могут быть соответствующим образом отрегулированы. Каждый из минимумов этих распределений интенсивности света ограничен в одном или двух измерениях, и содержат только общую точку пересечения, с помощью которой частица 2 может быть отслежена в образце 3. Этот вариант осуществления позволяет отслеживать частицу 2 по отношению к ее движению в образце 3 с максимальной пространственной точностью во всех трех измерениях.

Вариант осуществления прибора 1, показанный на фиг. 2, не содержит точечный детектор 12 в соответствии с фиг. 1. Здесь предусмотрена только камера 15 для обнаружения фотонов, испускаемых частицей 2 в образце 3. Кроме того, образец 3 представляет собой образец, простирающийся практически только в двух измерениях. Распределение интенсивности света 4 содержит центральный минимум, окруженный кольцеобразным максимумом, которым отслеживается частица 2. Это распределение интенсивности света 4 в тороидальной формы генерируется с помощью статического средства 7 формирования пучка. В плоскости двумерного образца 3 минимум распределения интенсивности света 4 локализуется с помощью средств 9 и 10 отклонения пучка, которые непосредственно воздействуют на свет 4. Камера 15 располагается позади дополнительной линзы 17 объектива, которая расположена со стороны образца 3, противоположно линзам 8 объектива. Здесь камеру 15 дополнительно используют для определения положения распределения интенсивности света 4 в образце 3. Это позволяет, с одной стороны, определять текущее положение средств 9 и 10 отклонения пучка. С другой стороны, это может быть использовано для определения положения минимума распределения интенсивности света 4 в образце. В частности, положение минимума в образце может, таким образом, также быть определено с пространственной точностью за дифракционным пределом.

Для того чтобы установить направление перемещения частицы в направлении Z оптической оси, может быть предусмотрено дополнительное оптическое средство (не показано здесь). Такое средство является известным из отслеживания и перемещения одиночной частиц на основе центра формы. Средства, например, используют астигматизм (см, например, Huang и др., Science, 319 (2008)) или двуспиральное детектирование PSF (смотри, например, Pavani и др., PNAS, 106 (2009)). Астигматизм может, например, быть обеспечен путем вставки цилиндрических линз на пути фотонов, испускаемых частицей, то есть где-то между образцом и детектором или камерой.

Фиг. 3 схематически показывает распределение интенсивности света 4 в образце 3, причем частица 2 локализована в центральном минимуме 19 распределения 18 интенсивности света. Фиг.4 представляет собой график, показывающий интенсивность I распределения 18 интенсивности света (сплошная линия) вдоль линии профиля через образец 3, в соответствии с фиг. 3 (в увеличенном масштабе). В области минимума 19 распределение 18 интенсивности света имеет практически синусоидальную кривизну, симметричную относительно минимума 19. Помимо распределения 18 интенсивности света фиг. 3 показывает результирующую скорость R фотонов, испускаемых частицей 2 (пунктирная линия) в предположении, что частица 2 подвергается воздействию соответствующих интенсивностей I света 4. В положении минимума 19 скорость R также имеет свое минимальное значение R_min. Как только частица 2 покидает этот минимум 19, скорость R быстро возрастает. В частности, даже при небольшом расстоянии до минимума 19 скорость R уже достигает значения, близкого или равного максимальному значению R_max. Такое поведение преимущественно используется для отслеживания частицы 2 в образце 3 с помощью минимума 19 распределения 18 интенсивности света с высокой пространственной точностью.

Когда частица 2 изменяет свое положение по отношению к распределению 18 интенсивности и покидает минимум 19, как показано на фиг. 5, обнаруживается увеличенная скорость R фотонов, испускаемых частицей 2. Путем перемещения распределения 18 интенсивности в образце 3 на экспериментальной основе, скорость снова уменьшается и сохраняется минимальной. Таким образом, определяется, в каком направлении и на какое расстояние переместилась частица 2, так как минимум скорости не будет достигнут, прежде чем распределение 18 интенсивности света с минимумом 19 не будет смещено в том же направлении и на такое же расстояние относительно образца 3, как показано на фиг. 6. Направление, в котором распределение 18 интенсивности с минимумом 19 должно быть перемещено, чтобы отслеживать частицу 2, также может быть определено из положений, в которых фотоны, испускаемые частицей 2, обнаруживаются камерой.

Вариант осуществления прибора 1, показанный на фиг. 7, отличается от варианта, показанного на фиг. 1 в следующих деталях. Источник света 5 содержит источник 20 белого света 21, а селектор 22 выбирает свет 4 из белого света 21 по длине волны. Кроме того, вместо только одного точечного детектора 12 согласно фиг. 1, три расположенных рядом точечных детектора 23-25 обеспечивают вход в контроллер 16. Относительные числа фотонов, испускаемых частицей 2 и обнаруживаемых точечными детекторами 23-25, указывают направление, в котором частица 2 перемещается в образце 3. Кроме того, прибор 1 согласно фиг. 7 содержит дополнительный светоделитель 27 и анализатор 28 для длины волны фотонов, испускаемых частицей 2. В этом варианте осуществления средства 9 и 10 отклонения пучка выполнены так, чтобы попеременно отслеживать перемещения частицы 2 и дополнительной частицы 29 в образце 3. Следовательно, этот пространственно ограниченный минимум распределения интенсивности света 4 попеременно используется для отслеживания частицы 2 и частицы 29, соответственно.

Вариант осуществления прибора 1 согласно фиг. 8 также основан на приборе 1, согласно фиг. 1 и, таким образом, описывается только в отношении его отличий в этом варианте. Точечный детектор 12 согласно фиг. 1 заменен четырьмя расположенными рядом точечными детекторами 23-26. Кроме, источника света 5, содержащего лазер 6 и обеспечивающего свет 4, дополнительный источник света 30 содержит дополнительный лазер 31, обеспечивающий дополнительный свет 32 другого состава длины волны, чем состав длины волны света 4. Дополнительный свет 32 совмещен со светом 4 через дихроичный светоделитель 33. Дополнительный свет 32 формируется в дополнительное распределение света с помощью средства 7 формирования пучка таким же образом, как и свет 4. Для этой цели, средство 7 формирования пучка является ахроматическим. Поскольку оба источника света 5 и 30 работают в импульсном режиме, фотоны, испускаемые частицей 2 в ответ на свет 4, и дополнительной другой частицей 34 в ответ на свет 32, могут быть разделены по времени на точечных детекторах 23-26. Точечные детекторы 23-26 также могут быть использованы для анализа фотонов за определенный момент времени после каждого импульса света 4 и 32, соответственно. Прибор 1 согласно фиг. 8 также содержит такой же дополнительный светоделитель 27 и анализатор 28 для длины волны фотонов, испускаемых частицей 2, как и прибор 1 фиг. 7.

Фиг. 9 показывает поперечное сечение в направлении x через распределение 18 в тороидальной форме интенсивности света 4, побуждающего или возбуждающего частицы к испусканию фотонов. Это распределение 18 интенсивности света накладывается на распределение 35 интенсивности сигнала отключения, предотвращающего испускание тех фотонов, которые обнаруживают в способе из настоящего раскрытия изобретения. В частности, сигнал отключения является STED-светом 36, запрещающим занятие возбужденного молекулярного состояния частицы посредством вынужденной эмиссии. Распределения 18 и 35 интенсивностей являются концентрическими, т.е. они оба показывают минимум 19 в общем центре. Расстояние между максимумами распределения 18 интенсивности света в направлении оси x, тем не менее, несколько меньше, чем расстояние между максимумами распределения 35 интенсивности STED-света 36 в направлении оси х. Это соответствует более длинной длине волны STED-света 36 по сравнению со светом 4. Кроме того, распределение 35 интенсивности превышает интенсивность I_s насыщения за пределами области, диаметр которой обозначен двунапралвенной стрелкой 37 на фиг. 9. Таким образом, только локализуясь в пределах этой области, частица эффективно побуждается светом 4 к испусканию фотонов, тогда как эмиссия фотонов, которые обнаруживаются, подавляется STED-светом 36, где-либо еще.

Фиг. 10 показывает эффективную функцию h_eff рассеяния точки в результате двух наложенных друг на друга распределений 18 и 35 интенсивности света с фиг. 9. Для испускания фотонов побуждается частица, только если она локализуется в пределах области, обозначенной двунаправленной стрелкой 37. В результате, частица может индивидуально отслеживаться с помощью способа из настоящего раскрытия изобретения до тех пор, пока ни одна другая частица не локализуется в той же узкой области. Не обязательно, чтобы полный объем покрываемый распределением 18 интенсивности света, согласно фиг. 9, был свободен от других частиц, которые могли бы также побуждаться к испусканию фотонов светом 4.

Многие варианты и модификации могут быть сделаны в вариантах осуществления настоящего раскрытия изобретения, не отступая по существу от сущности и принципов настоящего раскрытия. Все такие модификации и варианты должны быть включены в этот документ в пределах объема настоящего раскрытия изобретения, как определено нижеследующей формулой изобретения.

СПИСОК ПОЗИЦИЙ

1 прибор

2 частица

3 образец

4 свет

5 источник света

6 лазер

7 средство формирования пучка

8 линзы объектива

9 средство отклонения пучка

10 средство отклонения пучка

11 средство отклонения пучка

12 точечный детектор

13 светоделитель

14 светоделитель

15 камера

16 контроллер

17 линзы объектива

18 распределение интенсивности

19 минимум

20 источник

21 белый свет

22 селектор

23 точечный детектор

24 точечный детектор

25 точечный детектор

26 точечный детектор

27 светоделитель

28 анализатор

29 частица

30 источника света

31 лазер

32 свет

33 светоделитель

34 частица

35 распределение интенсивности

36 STED-свет

37 стрелка

I интенсивность

R скорость.

1. Способ получения изображения образца, содержащий этапы:

- предоставление света первого состава;

- выбор частицы из группы частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света первого состава;

- формирование света первого состава, чтобы обеспечить распределение интенсивности света, содержащее пространственно ограниченный минимум;

- применение распределения интенсивности света к образцу так, что частица локализована в пространственно ограниченном минимуме распределения интенсивности света;

- обнаружение фотонов, испускаемых частицей, и

- отслеживание перемещения частицы с помощью минимума распределения интенсивности света посредством

- перемещения распределения интенсивности света относительно образца так, что скорость испускаемых частицей фотонов остается минимальной, и

- получение фактического положения минимума распределения интенсивности света в образце в качестве фактического положения частицы в образце;

отличающийся дополнительными этапами:

- определение времени пребывания частицы для каждой из множества частей образца и

- отображение распределения времен пребывания в образце.

2. Способ по п. 1, причем этапы отслеживания, определения и отображения повторяют для каждой из множества частиц, выбранных из упомянутой группы частиц.

3. Способ по п. 1, содержащий:

- обеспечение дополнительного света второго состава, отличающегося от первого состава;

- выбор дополнительной частицы из дополнительной группы частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием дополнительного света;

- формирование дополнительного света, чтобы обеспечить дополнительное распределение интенсивности света, содержащее дополнительный пространственно ограниченный минимум;

- применение дополнительного распределения интенсивности света к образцу так, что дополнительная частица локализована в дополнительном пространственно ограниченном минимуме дополнительного распределения интенсивности света;

- обнаружение фотонов, испускаемых дополнительной частицей;

- отслеживание перемещения дополнительной частицы с помощью минимума дополнительного распределения интенсивности света посредством

- перемещения дополнительного распределения интенсивности света относительно образца так, чтобы скорость фотонов, испускаемых дополнительной частицей, оставалась минимальной, и

- получение фактического положения дополнительного минимума из дополнительного распределения интенсивности света в образце в качестве фактического положения дополнительной частицы в образце;

- определение дополнительного времени пребывания дополнительной частицы для каждой из множества частей образца и

- отображение распределения дополнительных времен пребывания в образце.

4. Способ по п. 3, причем этапы отслеживания, определения и отображения повторяют для каждой из множества частиц, выбранных из упомянутой группы частиц, и для каждой из множества дополнительных частиц, выбранных из упомянутой дополнительной группы частиц.

5. Способ по п. 1, причем минимум распределения интенсивности света пространственно ограничен в по меньшей мере одном пространственном измерении; причем частицу или дополнительную частицу отслеживают с помощью минимума распределения интенсивности света по всем направлениям всех измерений, в которых минимум пространственно ограничен, и причем каждую из упомянутого множества частей образца, для которой определяется время пребывания частицы или дополнительной частицы, пространственно ограничивают во всех направлениях всех измерений, в которых минимум пространственно ограничен.

6. Способ по п. 1, причем свет или дополнительный свет формируют, чтобы обеспечить распределение интенсивности света или дополнительное распределение интенсивности света, в котором волновые фронты когерентного пучка света или дополнительного света модулированы, и в котором пучок света или дополнительного света с модулированными волновыми фронтами фокусируют на образец, чтобы обеспечить минимум распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света в качестве точки практически нулевой интенсивности интерференционной картины.

7. Способ по п. 6, причем модуляцию волновых фронтов динамически изменяют так, что минимум распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света попеременно пространственно ограничивают в различных пространственных измерениях.

8. Способ по п. 1, причем свет или дополнительный свет формируют так, чтобы обеспечить распределение интенсивности света или дополнительное распределение интенсивности света, при котором по меньшей мере два когерентных пучка света или дополнительного света фокусируются в одной и той же фокальной области на образце, чтобы получить минимум распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света в качестве точки практически нулевой интенсивности интерференционной картины.

9. Способ по п. 1, причем свет или дополнительный свет формируют, чтобы обеспечить распределение интенсивности света или дополнительное распределение интенсивности света так, что пространственное положение пространственно ограниченного минимума не изменяется с длиной волны света или дополнительного света.

10. Способ по п. 1, причем фотоны обнаруживают точечным детектором.

11. Способ по п. 1, причем фотоны обнаруживают по меньшей мере двумя расположенными рядом точечными детекторами.

12. Способ п. 11, причем направление первоначального движения частицы определяют из относительных чисел фотонов, испускаемых частицей или дополнительной частицей и обнаруженных расположенными рядом точечными детекторами.

13. Способ по п. 1, причем изображение образца получают с помощью камеры.

14. Способ по п. 13, причем начальное положение частицы или дополнительной частицы определяют камерой, когда на образец равномерно воздействует свет или дополнительный свет.

15. Способ по п. 13, причем фактическое положение минимума распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света в образце определяют на основании положений, в которых свет или дополнительный свет, отражаемый образцом, обнаруживается камерой.

16. Способ по п. 1, причем фактическое положение минимума распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света в образце определяют на основе текущих настроек сканеров, используемых для перемещения распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света по отношению к образцу.

17. Способ по п. 13, причем направление первоначального движения частицы или дополнительной частицы определяют на основании положений, в которых фотоны, испускаемые частицей или дополнительной частицей, обнаруживаются камерой.

18. Способ по п. 1, причем свет или дополнительный свет подводят к образцу в импульсах, и причем фотоны, испускаемые частицей или дополнительной частицей, обнаруживают в течение ограниченного интервала времени после каждого из этих импульсов.

19. Способ по п. 18, причем свет или дополнительный свет выбирают из белого света.

20. Способ по п. 1, причем частицу или дополнительный свет выбирают из группы частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света, или дополнительного света посредством многофотонного процесса.

21. Способ по п. 1, причем фотоны, испускаемые частицей или дополнительной частицей, анализируют для определения по меньшей мере одного параметра, выбранного из группы параметров, состоящей из

- длины волны,

- поляризации,

- абсолютной скорости,

- относительных чисел, обнаруженных расположенными рядом точечными детекторами,

- совпадения и

- момента времени обнаружения после каждого импульса света.

22. Способ по п. 1, причем фотоны, испускаемые из объема обнаружения, включающего в себя минимум распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света, анализируют для определения по меньшей мере одного параметра, выбранного из группы параметров, состоящей из

- длины волны,

- поляризации,

- абсолютной скорости,

- относительных чисел, обнаруженных расположенными рядом точечными детекторами,

- совпадения и

- момента времени обнаружения после каждого импульса света, и

причем определяемый по меньшей мере один параметр проверяют на соответствие одиночной частице или дополнительной частице, испускающей анализируемые фотоны.

23. Способ по п. 1, причем число частиц или дополнительных частиц в образце, которые принадлежат к упомянутой группе частиц или упомянутой дополнительной группе частиц, уменьшают путем обесцвечивания по меньшей мере одной частицы или дополнительной частицы из упомянутого числа частиц или дополнительных частиц.

24. Способ по п. 1, причем частицу или дополнительную частицу выбирают из подгруппы частиц или дополнительных частиц, которые способны активироваться из первого состояния, в котором эти частицы или дополнительные частицы не могут быть побуждены к испусканию фотонов посредством света или дополнительного света, во второе состояние, в котором эти частицы или дополнительные частицы могут быть побуждены к испусканию фотонов посредством света или дополнительного света.

25. Способ по п. 24, причем частицу или дополнительную частицу выбирают из подгруппы частиц или дополнительных частиц, которые способны активироваться из первого состояния во второе состояние посредством света активации в многофотонном процессе, и причем эту частицу или дополнительную частицу активируют светом активации, сфокусированным на образец.

26. Способ по п. 1, причем сигнал выключения снабжают сигналом распределения интенсивности, охватывающим распределение интенсивности света, при этом сигнал выключения выключает другие частицы, принадлежащие к упомянутой группе частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света или дополнительного света.

27. Способ по п. 1, причем подсчитывают испускаемые частицей или дополнительной частицей и обнаруженные фотоны, и причем указывают абсолютное число фотонов, которые уже были испущены частицей или дополнительной частицей и обнаружены.

28. Способ по п. 1, причем перемещения двух частиц, выбранных из упомянутой группы частиц, или двух дополнительных частиц, выбранных из упомянутой дополнительной группы частиц, поочередно отслеживают с помощью минимума распределения интенсивности света или дополнительного распределения интенсивности света.