Способ иммобилизации фермента субтилизиноподобная протеиназа, продуцируемого штаммом бактерии рода bacillus вида bacillus sp. 7р/3-19, на инструменте

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ иммобилизации фермента субтилизиноподобная протеиназа, продуцируемого штаммом бактерии рода Bacillus вида Bacillus sp. 7Р/3-19, на инструменте. Поверхность инструмента механически очищают, обезжиривают и стерилизуют. Далее инструмент погружают в раствор полиаллиламина гидрохлорида (ПАГ) на 30-40 мин, промывают физиологическим раствором. Затем инструмент погружают в водный раствор полистиролсульфоната (ПСС) на 30-40 мин, промывают физиологическим раствором и снова погружают в раствор ПАГ на 30-40 мин. Затем инструмент с модифицированной поверхностью погружают в раствор фермента, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором. Далее инструмент окунают в раствор ПАГ на 30-40 мин, промывают физиологическим раствором. Затем инструмент окунают в раствор фермента на 30-40 мин, промывают физиологическим раствором. Закрепляют на инструменте фермент путем последовательного нанесения защитных слоев ПАГ и ПСС. После чего инструмент высушивают в стерильной газовой среде в течение 1 часа. Изобретение может быть использовано для иммобилизации субтилизиноподобной протеиназы на медицинские инструменты для предотвращения тромбообразования при выполнении, например, операций по введению лекарств в кровеносную систему больного, при переливании крови. 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской техники, более точно - к методам нанесения ферментов на медицинские инструменты, используемые при медицинском вмешательстве. Может быть использовано в медицине и ветеринарии для иммобилизации (нанесения) на медицинские инструменты ферментов для предотвращения образования кровяных сгустков, образующихся на медицинских инструментах в результате реакции крови на инородное тело, проникающее в кровяное русло (вену или артерию).

При проведении хирургических манипуляций или терапии различных органов пациентов с применением катетеров и/или медицинских игл существует проблема залипания инструмента, например – закупорки катетеров из-за тромбообразования. То есть, у места входа медицинского инструмента в вену или артерию, например – катетера в кровеносный сосуд, в зоне соприкосновения инструмента с кровью происходит неконтролируемое тромбообразование, вызванное естественным свойством крови к сворачиванию при поступлении в кровоток посторонних предметов. Указанная реакция крови наблюдается в ходе продолжительных во времени (часы) медицинских процедур, например – при гемодиализе у почечных больных или малоинвазивных операций на сердце с применением гибкого катетера с рабочими каналами, проводимого по кровеносным сосудам к оперируемому органу пациента.

Свертывание крови — сложный процесс, который подвержен влиянию около 30 факторов. Активную роль при свертывании играет белок тромбин. Этот белок образуется в форме неактивного предшественника протромбиногена. В результате каскада реакций из протромбина образуется активный тромбин, который вызывает полимеризацию молекул фибриногена. Проходя через стадию фибрин-мономеров, молекулы фибриногена образуют фибрин. Нити фибриногена, складываясь в фибриногеновые волокна, образуют пучки волокон фибрина. Патологические изменения, такие как повреждение сосуда, травма, изменение химического состава крови, замедление кровотока и т. п. смещают равновесие в сторону свертывания, что может быть причиной тромбоэмболии — закупорки сосудов, оторвавшимися тромбами и их частицами. Тромбы, состоящие из скоплений тромбоцитов, заключенных в сеть фибрина, могут растворяться под действием протеаз – ферментов, обладающих тромболитическим и фибринолитическим свойствами («Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний», Петрищев, 1999) [1].

Образовавшийся тромб закрывает просвет кровеносного сосуда, чем существенно нарушает процессы жизнедеятельности организма в целом. Например, это наблюдается при проведении лечебных процессов с использованием полостей и сосудов тела путем соединения их с внешней средой, например – с целью их опорожнения, введения в них жидкостей, промывания, либо проведения через них (сосуды) хирургических инструментов, например – при выполнении малоинвазивных операций на сердце с применением проводимого по кровеносным сосудам к оперируемому органу пациента гибкого катетера с рабочими каналами или при введении лекарственных растворов в кровоток.

Из уровня техники известны профилактические меры для предотвращения залипания медицинского инструмента, например – катетера: применение катетеров из мягких материалов, что позволяет снизить травмирование сосудов; использование катетеров различной конструкции, освобождающей от необходимости замены места забора крови при залипании катетера; использование катетеров с не зависящими друг от друга несколькими просветами, позволяющими достигать желаемых потоков и существенно уменьшающих риск тромбирования катетера [De Borst G.J., Moll F.L. Percutaneous venous valve designs for treatment of deep venous insufficiency. Endovasc Ther, 2012. – V. 19(2). – P. 291-302][2]; создание катетеров с разным сечением, например – катетера с круглым сечением, обеспечивающим легкое введение (катетера) и меньший дискомфорт пациента, снижающим травмирование и риск тромбообразования, например – по сравнению с катетером овального сечения [Suh D.C., Kim K.S., Lim S.M., Shi H.B., Choi C.G., Lee H.K., Seo D.M. Technical feasibility of embolizing aneurysms with glue (N-butyl 2-cyanoacrylate): experimental study in rabbits. Neuroradiol., 2003. – V. 24(8). – P. 1532-9][3].

Актуальным остается поиск новых средств и способов предотвращения тромбообразования на и в введенном в кровеносное русло инструменте, например – катетере при выполнении продолжительных во времени медицинских процедур – гемодиализа или искусственного кровообращения при оперативном вмешательстве.

Риск тромбообразования традиционно устраняют применением лекарственных препаратов, вводимых в кровеносную систему или соприкасающихся с кровью и действующих в зоне риска тромбообразования, в том числе препаратов, иммобилизованных на вводимых в кровеносную систему и контактирующих с кровью инструментах.

Способы иммобилизации, их применимость напрямую зависимы от свойств иммобилизуемого препарата и среды, используемой в качестве носителя иммобилизованного препарата.

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: [https://studopedia.ru/12_87148_metodi-immobilizatsii-fermentov.html]:

без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации),

с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации).

Каждый из этих методов осуществляется разными способами:

- Физические методы иммобилизации ферментов реализуются посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем включения энзимов в поры поперечно-сшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы.

- Химические методы иммобилизации ферментов реализуются посредством иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем.

Из исследованного заявителем уровня техники известны физические и химические методы иммобилизации фермента на медицинские инструменты.

Заявленное техническое решение относится к физическим методам иммобилизации фермента на медицинские инструменты.

Известно изобретение по авторскому свидетельству СССР SU 950771 «Способ иммобилизации ферментов» [4]. Сущность способа заключается в иммобилизации ферментов абсорбцией на углеродсодержащих носителях, а в качестве носителя используют окись алюминия или окись кремния или алюмосиликаты, зауглероженные при пиролизе углеводородов.

Недостатком известного способа является то, что он (способ) пригоден только для иммобилизации ферментов на носителях, зауглероженных при пиролизе углеводородов окиси алюминия или окиси кремния или алюмосиликатах – материалах, не применяемых для изготовления медицинских инструментов (мединструменты изготавливают из нержавеющих сталей, сплавов титана, полимеров).

Недостаток исключает применение способа по а.с. SU 950771 в медицине для иммобилизации ферментов на мединструментах, что ограничивает область применения известного технического решения.

Известно изобретение по авторскому свидетельству СССР SU 770072 «Способ иммобилизации ферментов» [5]. Сущность способа заключается в иммобилизации ферментов путем обработки модифицированного γ-аминопропилтриэтоксисиланом кремнеземсодержащего носителя сшивающим реагентом с последующим связыванием фермента, в качестве сшивающего агента используют ацетали диальдегидов, а обработку ими осуществляют в присутствии кислоты, в качестве кремнеземсодержащего носителя используют силохром или пористое стекло или силикагель.

Недостатком известного способа по а.с. SU 770072 является непригодность использования технического решения для нанесения на медицинские инструменты, т.к. способ предназначен исключительно для иммобилизации ферментов на носителях – материалах, не применяемых для изготовления медицинских инструментов (мединструменты изготавливают из нержавеющих сталей, сплавов титана, полимеров). Недостаток исключает возможность применения способа по а.с. SU 770072 в медицине для целей иммобилизации ферментов на мединструментах.

Известно изобретение по авторскому свидетельству СССР SU 545648 «Способ иммобилизации ферментов» [6]. Сущность способа заключается в иммобилизации ферментов путем ковалентного связывания молекул фермента с полимерным носителем, фермент предварительно ацилируют хлорангидридом ненасыщенной кислоты при pH 6,0-9,0 с последующей сополимеризацией ацилированного фермента с ненасыщенным полимеризующимся мономером.

Недостатком известного способа является то, что он (способ) пригоден только для иммобилизации ферментов на носителях – материалах, не применяемых для изготовления медицинских инструментов (мединструменты изготавливают из нержавеющих сталей, сплавов титана, полимеров). Недостаток исключает применение способа по а.с. SU 545648 в медицине для иммобилизации ферментов на мединструментах.

Известен патент на изобретение RU № 1748324 «Способ получения препарата стрептодеказы» [7], применяемый для тромболитической терапии. Сущностью его является способ получения препарата стрептодеказы путем связывания стрептокиназы с окисленным периодатом калия декстраном с последующим его восстановлением боргидридом натрия, обессоливанием, стерилизующей фильтрацией и диофилизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности по белку и увеличения выхода по активности целевого продукта, в качестве стрептокиназы используют раствор чистой стрептокиназы, смешивают ее с глутаминатом натрия и полигелином по 1 мг на 30000 ед. активности, процесс связывания ведут в 0,5 М содовом буферном растворе, pH 8,6 - 8,8, при температуре 18 – 24 °С в течение 60 - 90 мин, а восстановление осуществляют боргидридом натрия при соотношении окисленный полиглюкин : боргидрид натрия 14,5 : 1. Окисление полиглюкина проводят периодатом калия при соотношении декстран : периодат калия 1 : 0,36 - 0,46.

Препарат стрептодеказа (иммобилизованная стрептокиназа) – продукт жизнедеятельности B-гемолитического стрептококка.

Недостатком известного способа является техническая сложность и трудоемкость получения препарата, ограничивающая его применение высокая аллергенность. Аллергенность объясняется тем, что практически каждый человек в жизни переносит вызванные широкораспространенным микроорганизмом стрептококком инфекции и у каждого человека существует титр антител к стрептодеказе. При этом чем выше концентрация антител, тем бόльше вероятность аллергологической реакции от применения стрептодеказы, что подтверждает описание «Способа лечения кровоизлияний во внутренние среды и оболочки глаза, сопровождающихся гиперагрегацией тромбоцитов» по патенту RU № 2161020 [8]. Недостатки в виде высокой аллергенности стрептодеказы, способ иммобилизации и применяемые при этом материалы исключает применение препарата по Патенту RU № 1748324 для иммобилизации на медицинских инструментах для предотвращения тромбообразования при медицинском вмешательстве.

Известна обладающая тромболитическим и антикоагулянтным свойствами терапевтическая композиция по патенту на изобретение US № 7429377 «Терапевтическая композиция, содержащая несколько иммобилизованных протеаз» [9]. Сущностью композиции является водный раствор, содержащий множество активных протеаз и смесь водорастворимых полимеров, которую (композицию) получают путем облучения раствора ионизирующим излучением. Недостатком известной терапевтической композиции для достижения цели заявляемого технического решения является особо высокая сложность технологического процесса производства композиции, вызванная необходимостью включения в исходную реакционную (содержащую ферментный препарат и полимеры) смесь дополнительного буферного раствора, необходимость использования опасного для здоровья занятых производством работников ионизирующего излучения. Недостатки получения способа терапевтической композиции (путем иммобилизации ферментного препарата на носителе в виде смеси водорастворимых полимеров) и необходимость применения при этом ионизирующих излучений существенно ограничивают область применения препарата по Патенту US № 7429377, в том числе – для иммобилизации композиции на медицинских инструментах.

Известен патент на изобретение RU № 2213557 [10] «Фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическими, противовоспалительными и цитопротективными свойствами». Сущностью известного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая ферментный препарат и полиэтиленоксид, отличающаяся тем, что в качестве ферментного препарата она (композиция) содержит протосубтилин марок Г3Х, или Г10Х, или Г20Х, полиэтиленоксид используют с молекулярной массой 400-20000 Да и дополнительно содержит декстран с молекулярной массой 10-70 кДа и буферную смесь при следующем содержании компонентов, масс.%: Протосубтилин Г3Х, или Г10Х, или Г20Х – 0,5-5,0; Полиэтиленоксид – 0,1-10,0; Декстран – 1,0-10,0; Буферная смесь – остальное. Для получения фармацевтической композиции раствор (фермента протосубтилин и растворителя полиэтиленоксид) подвергают облучению гамма-лучами или потоком ускоренных электронов (с энергией 2,0 МэВ) в дозе 1,0 Мрад.

Недостатком композиции по патенту RU № 2213557 является ее многокомпонентность, причем производство каждого из компонентов происходит путем выполнения сложных технологических процессов, с использованием опасного для здоровья людей облучения гамма-лучами или потоком ускоренных электронов. Вследствие этого производство известной композиции оказывается весьма сложным и дорогостоящим. Кроме того, в описании известного патента полностью отсутствует информация о возможности иммобилизации фармацевтической композиции на материалах, из которых изготавливают медицинские инструменты. Недостатки существенно ограничивает область применения изобретения по патенту RU № 2213557, в том числе – для иммобилизации композиции на медицинских инструментах.

Наиболее близким по существу заявляемого изобретения, выбранному заявителем в качестве прототипа является изобретение по патенту РФ № 2416643, «Иммобилизированный продуцируемый бактериями Bacillus licheniformis субтилизин, обладающий тромболитическим и антикоагулянтным свойствами» [11]. Сущностью известного технического решения является иммобилизированный на водорастворимом фармакологически приемлемом полимере субтилизин, получаемый глубинной ферментацией бактерий вида Bacillus licheniformis, обладающий тромболитическим и/или антикоагулянтным свойствами, полученный путем воздействия ионизирующим излучением на водный раствор, содержащий субтилизин и фармакологически приемлемый полимер, выбранный из группы: полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, полиакриламид, плюроник, декстран. Иммобилизированный субтилизин по п.1, для получения которого в качестве ионизирующего излучения использовано γ-излучение, поток ускоренных электронов, ультрафиолетовое излучение. Иммобилизированный субтилизин по п.1, для получения которого полимер использован преимущественно в концентрации, превышающей 10%, а реакционную смесь (водный раствор полимера с субтилизином) перед облучением замораживают до температуры (-20)-(-140) °С. Иммобилизированный субтилизин по п.1, в котором продуцируемым бактериями вида Bacillus licheniformis субтилизином является алкалаза 2,4 LFG.

Таким образом, можно констатировать, что прототип относится к медицине, в частности к фармакологии и лекарственным средствам на основе ферментных препаратов, и может быть использовано для лечения и профилактики тромбозов, тромбофлебита, тромбоэмболии, тромбоэмболических осложнений и т.д. в комплексной терапии ишемической болезни сердца, ишемических инсультов мозга и других заболеваний, сопровождающихся явлениями тромбообразования, ишемии. Прототип охватывает область создания и применения препаратов для ферментативного гидролиза белков, образующих тромб.

Исходя из изложенного, представляется возможным сделать вывод о том, что недостатком прототипа является то, что иммобилизацию продуцируемого бактериями Bacillus licheniformis субтилизина на полимере осуществляют посредством воздействия ионизирующего излучения на водный раствор, содержащий указанный субтилизин и полимер. Таким образом, известный способ является небезопасным для работников, что не обеспечивает возможности его широкого применения в исследуемой области техники. При этом реакционную смесь (полимер с субтилизином) перед облучением замораживают до температуры минус (20...140)°C для увеличения сохранности субтилизина от разрушения ионизирующим излучением, что существенно усложняет технологический процесс производства прототипа.

Следует принимать во внимание то, что в известном техническом решении для реализации поставленной задачи препарат вводят в кровеносную систему человека в большом количестве, при этом его (препарата) действие начинается не сразу, а после продолжительного интервала времени. Таким образом, собственно действие предотвращения тромбообразования в кровеносной системе по известному техническому решению начинается через продолжительный временной интервал.

При этом следует акцентировать внимание на том, что указанные процедуры делают после выполнения как простых, так и достаточно сложных операций, например – при хирургическом вмешательстве с использованием искусственного кровообращения, например – при операции на сердце.

Основываясь на изложенном, представляется возможным констатировать факт того, что известное техническое решение нецелесообразно использовать для цели предотвращения сворачивания крови (тромбообразования) одновременно при выполнении, например, операций по введению лекарств в кровеносную систему больного, при переливании крови.

Целью заявленного технического решения является разработка способа иммобилизации на медицинских инструментах фермента субтилизиноподобная протеиназа, продуцируемого штаммом бактерии рода Bacillus вида Bacillus sp. 7Р/3-19 – вещества, действующего долговременно, обладающего тромболитическими свойствами.

Техническим результатом заявленного технического решения является способ иммобилизации на медицинских инструментах фермента субтилизиноподобная протеиназа, продуцируемого штаммом бактерии рода Bacillus вида Bacillus sp. 7Р/3-19 – вещества, действующего долговременно и обладающего тромболитическими свойствами, который (способ) дает:

- упрощение процесса иммобилизации тромболитического средства на медицинских инструментах;

- повышение безопасности труда при иммобилизации тромболитика на инструментах;

- расширение области применения тромболитиков на область медицинских инструментов, в том числе – катетеров и медицинских игл.

Сущностью заявленного технического решения является способ иммобилизации фермента субтилизиноподобная протеиназа, продуцируемого штаммом бактерии рода Bacillus вида Bacillus sp. 7Р/3-19 на инструменте, заключающийся в том, что поверхность инструмента механически очищают, обезжиривают, стерилизуют и подвергают первичной модификации поверхности, для чего инструмент погружают в раствор полиаллиламина гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем подвергают вторичной модификации поверхности, для чего инструмент погружают в водный раствор полистиролсульфоната, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем подвергают третичной модификации поверхности, для чего инструмент погружают в раствор полиаллиламина гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем проводят иммобилизацию фермента субтилизиноподобная протеиназа на поверхности инструмента - наносят первый слой фермента, для чего инструмент с модифицированной поверхностью погружают в раствор фермента, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, наносят на инструмент полиаллиламин гидрохлорид, для чего инструмент окунают в раствор полиаллиламин гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем наносят на инструмент второй слой фермента, для чего инструмент окунают в раствор фермента, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем закрепляют на инструменте фермент, для чего последовательно наносят защитные слои полиаллиламина гидрохлорида и полистиролсульфоната, для чего инструмент окунают в раствор полиаллиламин гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, затем инструмент окунают в раствор полистиролсульфоната, выдерживают в течение 30-40 мин, после чего инструмент высушивают в стерильной газовой среде в течение 1 часа.

Ниже описано осуществление заявленного технического решения, состоящее из нескольких этапов.

Этап 1. Получение фермента - субтилизиноподобной протеиназы

Для реализации заявленного способа вначале выполняют предварительные действия, связанные с необходимостью предварительного получения фермента - субтилизиноподобной протеиназы из штамма Bacillus sp. 7Р/3-19, для чего выполняют следующие действия:

Берут штамм Bacillus sp. 7Р/3-19, задепонированный в каталоге микроорганизмов Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером B3833 [12, 13], который (штамм) характеризуется сведениями о гарантированном неоднократном воспроизведении штамма Bacillus sp. 7Р/3-19, родовое и видовое название культуры: Bacillus sp. 7Р/3-19, семейство Bacillaceae.

Культивируют штамм в питательной среде, например, состава: пептон (1,70 %); дрожжевой экстракт (0,50%); желатин (1,00 %); CaCl₂·2H₂O (0,01 %); MgSO₄·7H₂O (0,05 %); NaCl (0,30 %); MnSO₄ (0,01 %); NH₄Cl (0,01 %); Na₂HPO₄ (0,04 %), остальное – вода дистиллированная, pH 8,5. При этом культивирование штамма проводят при атмосферном давлении, на лабораторных качалках BIOSAN, при температуре от плюс 25 до плюс 37°C, с интенсивностью качания 200 об/мин. Соотношение среда в колбе : воздух = 1 : 7,5.

Длительное время хранения (до трех лет) осуществляют методом лиофилизации и замораживания культуры с 50% глицерином при минус 80°С при соотношении культуры к раствору 1 : 1.

По мере необходимости хранимый штамм обновляют путем его культивирования. При хранении до года: 1,2 мл 0,7% агара заливают в пробирки столбиком, уколом делают посев культуры, после выращивания в течение суток при плюс 37°С заливают сверху стерильным вазелиновым маслом (2 мл) и культуру хранят в темноте при комнатной температуре.

Описанный выше штамм, помещенный в указанную выше питательную среду, продуцирует внеклеточные ферменты – глутамилэндопептидазу, металлопротеиназу, рибонуклеазу и субтилизиноподобную протеиназу, доля которой в пуле белков (в общей массе ферментов) составляет не менее 80 %.

Далее известным способом - методом ионообменной хроматографии с использованием КМ-целлюлозы [14] получают собственно продукт жизнедеятельности штамма – субтилизиноподобную протеиназу.

Для этого в культуральной жидкости Bacillus sp. 7Р/3-19 доводят рН до значения 6,3. Культуральную жидкость освобождают от клеток центрифугированием в течение 50 мин при 3000 об/мин на центрифуге К-70 (Janetzki, Польша).

Супернатант (надосадочную жидкость) разбавляют дистиллированной водой в 10 раз и добавляют к КМ-целлюлозе (Карбоксиметилцеллюлоза - адсорбент), уравновешенной 0,015 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3.

Ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе проводят в объеме в течение 35-45 мин, постоянно перемешивая ионообменник.

Затем КМ-целлюлозу помещают на колонку, промывают тем же буфером и элюируют (сгоняют с колонки) белки (в нашем случае фермент субтилизиноподобную протеиназу) 0,2 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3.

В собранных фракциях определяют количество белка и специфическую активность. Фракции с высокой протеолитической активностью объединяют, разбавляют водой в 12 раз.

Далее выполняют очистку субтилизиноподобной протеиназы, которая обеспечивает возможность использования заявленного фермента по назначению, описанным методом «Методы очистки белков», Скоупс Р. [15].

Для этого объединенные фракции фермента наносят на колонку Mono S 5/5 в системе FPLC «Pharmacia» (Швеция), уравновешенную Na-ацетатным буфером, рН 6,3, содержащим 0,5 мМ CaCl₂. Элюцию проводят линейным градиентом NaCl (0 – 0,5 М) в том же буфере со скоростью 1мл/мин.

В собранных фракциях определяют специфическую протеолитическую активность и количество белка.

При этом следует иметь в виду, что в случае отсутствия ее (субтилизиноподобной протеиназы) очистки по описанному методу не представляется возможным ее использование, т.к низкая степень очистки фермента снижает его эффективность использования по назначению.

Далее по тексту заявителем более подробно представлена информация об активности субтилизиноподобной протеиназы (Пример 2).

После очистки получают пригодную для иммобилизации на медицинских инструментах субтилизиноподобную протеиназу в буферном растворе.

Полученная заявленным способом субтилизиноподобная протеиназа обладает способностью разрушать фибриновые сгустки крови млекопитающих, в том числе – человека, что описано в статье «Тромболитическая и фибринолитическая активность бактериальных протеаз». [16].

Этап 2. Иммобилизация фермента субтилизиноподобная протеиназа на инструменте

После получения фермента субтилизиноподобная протеиназа приступают к выполнению заявленной последовательности действий по заявленному способу.

Иммобилизацию субтилизиноподобной протеиназы Bacillus sp. 7Р/3-19 производят на соприкасающихся с кровью поверхностях инструментов, широко применяемых в медицине и ветеринарии и выполненных из любых используемых в медицине материалов.

Процесс иммобилизации ведут при нормальной комнатной температуре, атмосферном давлении и атмосферной влажности.

Процесс ведут в несколько этапов.

Для этого используют послойное нанесение на инструмент противоположно-заряженных полиэлектролитов, например – полиаллиламина гидрохлорида (поликатион) и полистиролсульфоната (полианион).

Выдерживание инструмента в наносимых на пластину растворах проводят в течение 30-40 мин. Времени менее 30 мин недостаточно для нанесения слоя, время более 40 мин не целесообразно, так как слой наносится за указанное время.

Далее заявителем приведен пример конкретного выполнения процесса иммобилизации субтилизиноподобной протеиназы на медицинском инструменте с использованием материала, наиболее широко применяемого в производстве медицинских инструментов – нержавеющей стали.

При этом следует акцентировать внимание на то, что иммобилизация фермента не ограничивается медицинскими инструментами из нержавеющей стали, как это показано в приведенном Примере 1, так как иммобилизация осуществима на инструментах, изготовленных из других применяемых в медицине материалов, например – титане, титановых сплавах, полимерах.

Пример 1. Иммобилизация субтилизиноподобной протеиназы на медицинском инструменте из нержавеющей стали

Берут изготовленный из нержавеющей стали фрагмент медицинского инструмента – металлическую пластину, например – применяемую в электронной микроскопии для приготовления образцов.

Процесс собственно иммобилизации ведут в следующей последовательности.

Производят модификацию инструмента (пластины), для чего:

- производят механическую очистку поверхности пластины, например – промыванием мыльной водой с использованием щетки. Затем поверхность пластины обезжиривают и стерилизируют, например – путем трехкратного протирания пропитанной спиртом тканью;

- подготовленную пластину опускают в раствор полиаллиламин гидрохлорида (далее по тексту – ПАГ, 1 мг/мл, молекулярная масса 15 кДа), содержащий 0,15 M NaCl. Пластину в растворе выдерживают, например – в течение 30-40 мин, в результате поверхность пластины модифицируется первично. Затем пластину промывают физиологическим раствором;

- далее модифицированную (покрытую) ПАГ пластину опускают в водный раствор полистиролсульфоната (далее по тексту ПСС), например – с концентрацией 1 мг/мл, молекулярной массой 70 кДа, содержащий 0,15 M NaCl и выдерживают, например – в течение 30-40 мин. В результате поверхность пластины модифицируется вторично;

- затем пластину промывают физиологическим раствором и повторяют вышеописанную процедуру модификации с ПАГ. В результате поверхность пластины модифицируется третично.

В результате на поверхности пластины образуется трехслойная полиэлектролитная подложка для нанесения иммобилизуемого фермента. Таким образом, модифицированная поверхность пластины (или используемого медицинского инструмента, например – катетера) подготовлена для нанесения и иммобилизации на своей поверхности фермента – субтилизиноподобной протеиназы, производимой бактериями Bacillus sp. 7Р/3-19.

Производят иммобилизацию фермента на модифицированной поверхности, для чего:

- готовят раствор фермента в концентрации 0,2 мг/мл, например – с использованием известного буферного раствора 0,1 М Трис HCl; pH 8,5.

- подготовленную пластину с модифицированной поверхностью окунают и выдерживают (при комнатной температуре и атмосферном давлении) в растворе фермента, например – в течение 30-40 мин, в результате чего наносят первый слой фермента;

- затем пластину вынимают из раствора фермента и без просушки, окунанием промывают физиологическим раствором;

- далее без просушки, окунанием наносят первый защитный слой ПАГ, для чего пластину выдерживают в растворе ПАГ, например, 30-40 мин;

- после нанесения ПАГ пластину сразу же промывают физиологическим раствором и наносят (на пластину) второй слой фермента аналогично тому, как был нанесен первый слой. При этом первый и второй слои фермента оказываются разделенными слоем ПАГ.

- после нанесения второго слоя фермента его (фермент) закрепляют, например – путем последовательного нанесения по одному защитному слою ПАГ и ПСС аналогично тому, как был нанесен первый слой ПАГ;

- после нанесения защитных слоев ПАГ и ПСС пластину (или медицинский инструмент) высушивают в стерильной газовой среде при комнатной температуре, например – в течение 1 часа.

По завершении сушки инструмент с иммобилизированным на его поверхности ферментом готов для применения по назначению.

Далее для проверки качества полученного покрытия исследуют биологическую активность иммобилизованного фермента.

Пример 2. Исследование активности свободного и иммобилизованного фермента

Активность иммобилизованной субтилизиноподобной протеиназы исследуют, опуская пластину с иммобилизованной на трехслойной полиэлектролитной подложке протеиназой в раствор известного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa [П-нитроанилиды пироглутамил-пептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ.][17].

За единицу активности принято количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкМ субстрата за 1 мин.

По результатам эксперимента получено, что:

- активность неиммобилизованной (свободной) субтилизиноподобной протеиназы равна 0,73 ед/мл;

- активность иммобилизованного фермента равна 0,51 ед./мл, что составляет 70% от активности свободного фермента.

Таким образом, сравнение активностей свободного и иммобилизованного фермента показывает, что после иммобилизации заявленным способом фермент сохраняет активность в достаточной для промышленного применения степени. Это в полной мере обеспечивает применение иммобилизованного фермента – субтилизиноподобной протеиназы бактерий Bacillus sp. 7Р/3-19 в медицинской практике, например – для предотвращения залипания катетеров, что доказывает промышленную применимость заявленного технического решения.

Заявленное техническое решение по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами:

– повышается безопасность работ при подготовке инструмента вследствие отсутствия потребности применения ионизирующего излучения (используемого в прототипе), замененного послойным нанесением фермента на поверхность инструмента в заявленном техническом решении;

– упрощается технологический процесс производства мединструментов целевого назначения с применением ферментов;

– отсутствует необходимость применения замораживания фермента, снижающего (замораживание) активность действующего вещества;

- повышается производительность труда работников вследствие отсутствия потребности применения замораживания фермента;

– медицинский персонал освобождается от необходимости введения тромболитиков в кровяное русло;

- существенно сокращается расход употребляемых тромболитиков в результате отсутствия необходимости обработки тромболитиком всего массива крови в организме, а также снижается продолжительность выполнения действий для предотвращения тромбообразования при использовании локально иммобилизованного на медицинском инструменте препарата;

– отсутствует кровоточивость операционного поля (происходящее при применении прототипа) вследствие локальной (на медицинском инструменте, а не во всем массиве циркулирующей в организме крови – как у прототипа) иммобилизованности тромболитика;

– отсутствуют последствия введения тромболитика, например – в виде аллергических реакций, что способствует экономии медицинских препаратов, сокращает продолжительность процедур за счет устранения подготовительных работ, что также способствует повышению производительности труда медработников;

– повышается энергосбережение и упрощается процесс получения и применения тромболитика вследствие отсутствия потребности замораживания фермента, используемого в прототипе.

Кроме того, отсутствие тромбообразования в зоне применения медицинского инструмента избавляет обслуживаемого пациента от возникающих вследствие тромбообразования неприятных ощущений, например – возникающих при повторном вводе катетера, наблюдаемых при получении им (пациентом) медицинской помощи, например – при гемодиализе.

Преимущества заявленного технического решения способствуют не только повышению производительности труда, как производителей медицинского оборудования, так и применяющего это оборудование персонала, но и обеспечивают повышение качества жизни для пациентов, т.к. обеспечивает возможность менее травматичного и надежного оказания медицинских услуг в силу исключения возможности тромбообразования, в результате чего исключаются и последствия, следующие за тромбообразованием. Это, в свою очередь, не только значительно расширяет область применения средств предотвращения тромбообразования при инструментальных медицинских и ветеринарных вмешательствах, но и существенно повышает как качество оказания услуг, так и качество жизни пациентов в целом.

Таким образом, можно сделать общий вывод, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат, а именно: разработан способ иммобилизации на медицинских инструментах фермента субтилизиноподобная протеиназа, продуцируемого штаммом бактерии рода Bacillus вида Bacillus sp. 7Р/3-19 - вещества, действующего долговременно, обладающего тромболитическими свойствами, который (способ) дает:

- упрощение процесса иммобилизации тромболитического средства на медицинских инструментах;

- повышение безопасности труда при иммобилизации тромболитика на инструментах;

- расширение области применения тромболитиков, на область медицинских инструментов, в том числе – катетеров и медицинских игл.

Приведённые примеры осуществления и исследования предлагаемого технического решения показывают его эффективность при использовании по назначению в области медицины и ветеринарии. Применение заявленного способа при медицинском вмешательстве с применением инструментов по сравнению с прототипом производится с мéньшей затратой лечебных препаратов, дорогостоящего оборудования, труда и времени медицинских работников, с наименьшим ущербом для здоровья пациентов, с повышением их (пациентов) качества жизни.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружен способ, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Применение инструментов по основному назначению с одновременным предотвращением тромбообразования при медицинском вмешательстве имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками заявленного технического решения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности организаций здравоохранения, животноводства посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. «Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний», Петрищев, 1999.

2. De Borst G.J., Moll F.L. Percutaneous venous valve designs for treatment of deep venous insufficiency. Endovasc Ther, 2012. – V. 19(2). – P. 291-302.

3. Suh D.C., Kim K.S., Lim S.M., Shi H.B., Choi C.G., Lee H.K., Seo D.M. Technical feasibility of embolizing aneurysms with glue (N-butyl 2-cyanoacrylate): experimental study in rabbits. Neuroradiol. 2003. – V. 24(8). – P. 1532-9.

4. Патент СССР SU 950771. Опубликовано: 15.08.1982. Способ иммобилизации ферментов. // Шитова Н.Б., Коваленко Г.А., Рачковская Л.Н., Соколовский В.Д., Левицкий Э.А.

5. Патент СССР SU 770072. Опубликовано: 07.01.1982. Способ иммобилизации ферментов // Борисова В. Н, Меняйлова И. И, Мотина Л. И, Нахапетян Л. А.

6. Патент СССР SU 545648. Опубликовано: 05.02.1977. Способ иммобилизации ферментов. // Баранова Н.А., Валуев Н.И., Егоров Н.С., Аль-Нури М.А., Платэ Н.А.

7. Патент RU № 1748324, приоритеты: публикация патента:  10.11.2000 (заявка №31-2000). Способ получения препарата стрептодеказы // Москвичев Б.В. [RU], Иванова Г.П. [RU], Савельева Н.В. [RU], Таратина Т.М. [RU]. Описание патента.

8. Патент RU № 2161020, приоритеты: подача заявки: 23.09.1998 (№98117534/14); публикация патента: 27.12.2000. Способ лечения кровоизлияний во внутренние среды и оболочки глаза, сопровождающихся гиперагрегацией тромбоцитов // Муха А.И. [RU], Филина А.А. [RU], Лысенко В.С. [RU] / Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца [RU]. Описание патента.

9. Патент US № 7429377 В2, приоритеты: дата приоритета: 26.12.2001; подача заявки: 24.12.2002; публикация патента: 30.09.2008. Терапевтическая композиция, содержащая несколько иммобилизованных протеаз // Артамонов A.B. [RU], Верещагин Е.И. [RU], Гришин О.В. [RU], Троицкий А.В. [RU]. Описание патента.

10. Патент RU № 2213557, Фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическими, противовоспалительными и цитопротективными свойствами // Артамонов А.В. [RU], Верещагин Е.И. [RU], Гришин О.В. [RU], Троицкий А.В. [RU] / Лицензиар(ы): Закрытое акционерное общество "Аксис" Лицензиат(ы): Закрытое акционерное общество "Сибирский Центр фармакологии и биотехнологии", Договор № РД0043336, зарегистрирован 14.11.2008, Извещение опубликовано: 27.12.2008, БИ: 36/2008. Изменена сторона договора - новый лицензиар ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент". Изменен порядок выплаты и размер вознаграждения. Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 14.11.2008 № РД0043336, Извещение опубликовано: 27.02.2010, БИ: 06/2010. Описание патента.

11. Патент RU № 2416643, приоритеты: подача заявки 05.12.2008; публикация патента: 20.04.2011. Иммобилизированный продуцируемый бактериями Bacillus licheniformis субтилизин, обладающий тромболитическим и антикоагулянтным свойствами // Бекарев А. А. [RU], Верещагин Е. И. [RU], Артамонов А. В. [RU] / ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management, "SFM") [RU]. Описание патента.

12. Удостоверение штамма, выдаваемого из коллекции ВКПМ, от 14. Февраля 2017. Регистрационный номер в коллекции ВКПМ: В-3833. Название штамма: Bacillus sp. 7Р/3-19 (Bacillus intermedius). Дата депонирования 09 января 1987 г.

13. Шарипова М.Р., Тойменцева А.А., Сабирова А.Р., Мухаметзянова А.Д., Ахметова А.И., Марданова А.М., Балабан Н.П. Новое филогенетическое положение штамма Bacillus intermedius 3-19. Микробиология, 2011. – Т. 80. – № 3. – С. 1–3.

14. Фритц Дж., Гьертде Д., Поланд К. Ионная хроматография, 1984. – С. 221.

15. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – С. 358.

16. Данилова Ю.В., Черемин А.М., Замалеева А.И., Марданова А.М., Замалютдинова Н.М., Шарипова М.Р. Тромболитическая и фибринолитическая активность бактериальных протеаз. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2012.–Т. 7. – № 3. – С. 49-51.

17. Люблинская Л.А., Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н. П-нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. Биоорг. химия, 1987. – Т. 13 (6). – С. 748-753.

Способ иммобилизации фермента субтилизиноподобная протеиназа, продуцируемого штаммом бактерии рода Bacillus вида Bacillus sp. 7Р/3-19, на инструменте, заключающийся в том, что поверхность инструмента механически очищают, обезжиривают, стерилизуют и подвергают первичной модификации поверхности, для чего инструмент погружают в раствор полиаллиламина гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем подвергают вторичной модификации поверхности, для чего инструмент погружают в водный раствор полистиролсульфоната, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем подвергают третичной модификации поверхности, для чего инструмент погружают в раствор полиаллиламина гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем проводят иммобилизацию фермента субтилизиноподобная протеиназа на поверхности инструмента - наносят первый слой фермента, для чего инструмент с модифицированной поверхностью погружают в раствор фермента, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, наносят на инструмент полиаллиламин гидрохлорид, для чего инструмент окунают в раствор полиаллиламин гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем наносят на инструмент второй слой фермента, для чего инструмент окунают в раствор фермента, выдерживают в течение 30-40 мин, промывают физиологическим раствором, затем закрепляют на инструменте фермент, для чего последовательно наносят защитные слои полиаллиламина гидрохлорида и полистиролсульфоната, для чего инструмент окунают в раствор полиаллиламин гидрохлорида, выдерживают в течение 30-40 мин, затем инструмент окунают в раствор полистиролсульфоната, выдерживают в течение 30-40 мин, после чего инструмент высушивают в стерильной газовой среде в течение 1 ч.