Способ определения ароматических микробных метаболитов в форме фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови

Авторы патента:

Белобородова Наталья Владимировна (RU)

G01N33/491 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

Владельцы патента RU 2663571:

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО НАУЧНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-КЛИНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР РЕАНИМАТОЛОГИИ И РЕАБИЛИТОЛОГИИ" (ФНКЦ РР) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно способу анализа сыворотки крови (СК) пациентов и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для определения продуктов метаболизма бактерий. Для этого проводят определение ароматических микробных метаболитов в форме фенилкарбоновых кислот (ФКК) в образцах СК пациентов. Способ включает извлечение ФКК из подкисленного раствора сыворотки крови путем микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18, их элюирования диэтиловым эфиром, упаривания элюата досуха, дериватизации с использованием N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и анализа полученных триметилсилильных производных методом газовой хроматомасс-спектрометрии. Заявленное изобретение позволяет определить содержание ФКК в сыворотке пациента для определения степени тяжести больных с наличием инфекции бактериальной этиологии или сепсиса. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к способам анализа биологических материалов, а именно сыворотки крови (СК). Предлагаемый способ может быть использован в клинической лабораторной диагностике для определения продуктов метаболизма бактерий в форме фенилкарбоновых кислот (ФКК): бензойной (БК), фенилпропановой (ФПК), фенилмолочной (ФМК), 4-гидроксибензойной (n-ГБК), 4-гидроксифенилуксусной (n-ГФУК), фенилпропеновой (коричной), 3-метокси-4-гидроксифенилуксусной (гомованилиновой, ГВК), 4-гидроксифенилпропановой (n-ГФПК) и 4-гидроксифенилмолочной (n-ГФМК) кислот в образцах СК здоровых доноров и пациентов.

Уровень техники

В настоящее время одним из самых распространенных способов извлечения ФКК при анализе СК является способ жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ). К числу известных способов анализа СК с использованием ЖЖЭ относится способ лабораторной диагностики сепсиса, который предусматривает оценку уровня содержания метаболитов, т.е. продуктов жизнедеятельности живых микроорганизмов в сыворотке крови, а именно низкомолекулярных химических соединений - ФКК (RU 2423704).

Способ включает количественное определение n-ГФМК, ФМК, n-ГФУК и ГВК кислот в образцах СК с помощью хроматомасс-спектрального анализа (ГХ/МС) после пробоподготовки путем ЖЖЭ. Однако использование указанного способа пробоподготовки предусматривает использование большого объема органических растворителей, что требует специально оборудованного помещения, а также значительных временных затрат, связанных с необходимостью двукратной экстракции и упаривания органического элюата. Известный способ не может быть автоматизирован из-за необходимости использования центрифуги.

Наиболее близким к заявляемому по совокупности существенных признаков является способ определения n-ГФМК, 4-гидроксифенилпировиноградной кислоты и тирозина в плазме крови здоровых людей методом изотопного разбавления с детектированием ГХ/МС, представленный в работе J.C. Deutsch (Deutsh J.C. Determination of p-hydroxyphenylpyruvate, p-hydroxyphenyllactate and tyrosine in normal human plasma by gas chromatography-mass spectrometry isotope-dilution assay. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 690. P. 1-6). Выбран в качестве прототипа.

При использовании способа-прототипа для извлечения указанных соединений из плазмы крови применяли сорбционное концентрирование на патронах с анионообменным сорбентом (50 мг). При этом необходимый объем анализируемой плазмы крови составляет 500 мкл. Элюирование проводили растворами уксусной и соляной кислот, а в качестве дериватизирующего (силилирующего) агента использовали N-метил-N-(трет-бутилдиметилсилил)трифторацетамид. Известная методика позволяет проводить определение указанных соединений на уровне 10-200 нг/мл и используется при диагностике заболеваний печени и нарушений метаболизма тирозина.

К числу причин, по которым при использовании способа-прототипа не могут быть достигнуты технические результаты заявляемого способа, относятся следующие.

- Использование плазмы крови вместо сыворотки может привести к потере целевых компонентов.

- Необходимость использования для анализа значительного количества (500 мкл) плазмы.

- Использование патронов с сорбентом массой порядка десятков мг уменьшает степень концентрирования и приводит к увеличению объемов органических элюентов, что, в свою очередь, приводит к увеличению продолжительности пробоподготовки из-за необходимости упаривания элюата перед дериватизацией.

- Автоматизация известного способа более трудоемкая, чем заявляемого.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи определения продуктов метаболизма бактерий в форме ФКК в СК.

Заявляемый способ является экспрессным, полуавтоматическим, чувствительным, воспроизводимым; для его выполнения нужны малые объемы пробы сыворотки (80 мкл) и органических растворителей.

Использование микросорбционного концентрирования (МСК) в шприце, при котором сорбцию проводят многократно через патрон с сорбентом, позволяет увеличить степень концентрирования, а также уменьшить объем органических элюентов и продолжительность пробоподготовки.

Указанные технические результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что так же как в известном способе определение ФКК осуществляют путем сорбционного концентрирования образца крови с последующим силилированием и анализом полученных производных методом ГХ/МС.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что извлечение ФКК из подкисленного раствора СК осуществляют путем МСК в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18, их элюирования диэтиловым эфиром, упаривания элюата досуха, дериватизации с использованием N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и анализа полученных триметилсилильных производных на газовом хроматомасс-спектрометре.

Раскрытие сущности изобретения

Метаболомные исследования с использованием СК являются важным и актуальным направлением, поскольку СК представляет собой сложный набор высоко- и низкомолекулярных компонентов в разных концентрациях, отражающих состояние организма. Для работы с такой сложной матрицей необходимо использование высокотехнологичных методов разделения, концентрирования и детектирования с целью определения содержания определенного набора химических или биологических соединений. Решение указанной проблемы заключается в расширении арсенала аналитических средств.

Для извлечения ряда низкомолекулярных ароматических метаболитов из СК авторами выбран наиболее перспективный полуавтоматический метод пробоподготовки, включающей в себя МСК в шприце, заполненном сорбентом.

Способ заключается в проведении МСК в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18, для извлечения 9 ФКК из подкисленного раствора СК, их элюировании диэтиловым эфиром, упаривании элюата досуха, дериватизации с использованием N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА) и анализом полученных триметилсилильных производных (ТМС) на газовом хроматомасс-спектрометре.

Далее получают хроматограммы, из которых строят масс-хроматограммы по характеристичным значениям m/z, определяют площади пиков ТМС производных ФКК по их временам удерживания, делят на площадь стандарта 2,3,4,5,6-D5-бензойной кислоты (D5-БK), которую вводят в сыворотку до проведения процедуры пробоподготовки. Полученные относительные сигналы используют для количественного определения ФКК с использованием градуировочных коэффициентов, полученных предварительно по методу добавок ФКК в известных концентрациях в сыворотку здорового добровольца. Продолжительность пробоподготовки составляет 21 мин, продолжительность ГХ/МС анализа - 25 мин. Степени извлечения ароматических кислот из сыворотки здорового добровольца с добавками кислот составили: БК - 50±10%; ФПК - 70±10%; Коричной - 40±10%; ФМК - 60±10%; n-ГБК - 30±5%; n-ГФУК - 40±10%; n-ГФПК - 50±10%; ГВК - 60±10%; n-ГФМК - 40±5%. Для всех ФКК выявлены области линейной зависимости в диапазоне 90-2200 мкг/л, что для большинства ФКК составляет 0.5-18 мкМ.

Применение разработанной методики позволяет сократить продолжительность и соответственно повысить производительность процедуры анализа. Кроме того, использование заявляемого способа в лабораторной практике позволяет снизить объем анализируемого образца крови, а также объем органических растворителей, применяемых на стадии пробоподготовки.

Способ осуществляют следующим образом.

До начала МСК к 75 мкл размороженной до комнатной температуры СК добавляют водный раствор внутреннего стандарта D₅-БК, подкисляют до pH<2 и разбавляют водой в 2 раза. Патрон с сорбентом (силикагель с привитой фазой С18) предварительно кондиционируют метанолом, водой, 0.1-1% раствором муравьиной кислоты (3×50 мкл, скорость загрузки для каждого растворителя 100-1000 мкл/мин). Затем проводят сорбцию целевых компонентов (10-25 раз по 50 мкл, 100-1000 мкл/мин), высушивание сорбента путем пропускания воздуха (5-20 раз по 50 мкл, 100-1000 мкл/мин), промывание сорбента 0.05-0.1% водным раствором кислоты (2-5 раз по 20 мкл, 100-1000 мкл/мин), десорбцию подходящим органическим растворителем, например диэтиловым или метил-трет-бутиловым эфиром. Полученный элюат высушивают досуха, дериватизируют с добавлением силилирующего реагента, например БСТФА, аликвоту полученного раствора (или разбавленного инертным растворителем) силильных производных анализируют методом ГХ/МС.

Анализ методом ГХ/МС проводят с использованием кварцевой капиллярной колонки типа TR-5ms (95% диметилполисилоксан + 5% фенилполисилоксан, толщина неподвижной фазы 0.25 мкм, длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм). Условия газохроматографического разделения: температура инжектора 200°C, расход газа-носителя 1.5 мл/мин. Режим программирования температуры термостата колонок: начальная температура 80°C в течение 4 мин; далее нагревание со скоростью 10°C/мин до 250°C, выдержка при этой температуре в течение 4 мин. Условия масс-спектрометрического анализа: электронная ионизация, энергия электронов 70 эВ, температура интерфейса 250°C, температура ионизационной камеры 200°C, диапазон сканирования m/z 50-450 а.е.м., скорость сканирования 3 скана/с.

Площади пиков силильных производных ФКК, зарегистрированные на масс-хроматограммах по фрагментным характеристичным ионам, деленные на площадь пика производного стандарта D5-BK (представлены в табл.1), используют в количественном анализе. Значения m/z характеристичных ионов выбраны исходя из информативности (отражения структуры вещества) и их отсутствия в фоновом масс-спектре. Масс-спектры исследуемых компонентов совпадают с соответствующими масс-спектрами из библиотеки NIST. Степень извлечения ароматических кислот рассчитывают путем деления относительного сигнала каждой кислоты после проведения МСК из СК здорового добровольца с добавкой ароматических кислот на относительный сигнал соответствующей кислоты из модельного раствора без пробоподготовки. Статистическую обработку данных проводят по результатам трех параллельных опытов с применением программы Microsoft Excel 2010.

Примеры выполнения

Проведен анализ образцов СК здорового донора и четырех реанимационных больных разной степени тяжести с наличием инфекции бактериальной этиологии или сепсисом. Приведено сравнение полученных результатов с аттестованной методикой, включающей в себя ЖЖЭ и дающей достоверные данные о концентрациях ФКК в образцах СК. Таким образом, подтверждено, что результаты, получаемые методом МСК, сопоставимы с результатами, получаемыми методом ЖЖЭ, и могут быть использованы в практике.

Способ определения фенилкарбоновых кислот (ФКК) в сыворотке крови, включающий сорбционное концентрирование из образца крови с последующим силилированием и анализом полученных производных методом газовой хроматомасс-спектрометрии, отличающийся тем, что извлечение ФКК из подкисленного раствора сыворотки крови осуществляют путем микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18, их элюирования диэтиловым эфиром, упаривания элюата досуха, дериватизации с использованием N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и анализа полученных триметилсилильных производных на газовом хроматомасс-спектрометре.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к проведению химического анализа жидкой пробы водного экстракта полиметилметакрилового изделия для зубопротезирования, и может быть использовано при проведении экспресс-анализов в практике стоматологических клиник и кабинетов.

Способ диагностики преэклампсии на сроках гестации до 34 недели по оценке уровней вазоконстриктора ang(1-8) и возодилятатора ang(1-7) // 2663456

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для диагностики преэклампсии на сроках до 34 недель гестацции. Способ включает оценку уровней вазоконстриктора Ангиотензина II (ANG (1-8) и вазодилататора Ангиотензина 1-7 (ANG (1-7).

Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения днк возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища // 2663454

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis и Candida parapsilosis в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой.

Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения днк ureaplasma parvum, ureaplasma urealyticum и mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища // 2663453

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой.

Пептидомиметики // 2662973

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидомиметикам эпитопа аполипопротеина А-I, и может быть использовано в медицине. Пептидомиметик эпитопа аполипопротеина А-I, способный специфично связываться с антителами против аполипопротеина А-I, используется в диагностическом иммунологическом методе анализа и позволяет выявить ряд сердечно-сосудистых заболеваний по образцу биологической жидкости.

Набор даб-содержащего субстрата для окрашивания, производимого ферментом для мечения // 2662681

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору диаминобензидин (ДАБ)-содержащего субстрата для окрашивания с использованием антитела, меченного пероксидазой.

Антитело к адреномедуллину (adm) или фрагмент анти-adm антитела, или анти-adm he-ig каркас для применения в терапии // 2662671

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу к адреномедуллину или его антигенсвязывающему фрагменту. Указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с N-концевой областью (ак-1-21) зрелого человеческого ADM, имеющей последовательность YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC, представленную в виде SEQ ID NO:23, и обладает аффинностью связывания с ADM, составляющей по меньшей мере 10-7 М.

Материал для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты // 2662174

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике туберкулеза. Материал для обнаружения возбудителей туберкулеза человека методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) представляет собой суспензию, полученную растворением в 0,5 мл физиологического раствора мазков мокроты, неокрашенных и окрашенных по Циль-Нильсену, содержащих возбудителей туберкулеза человека.

Способ выявления гепарина в крови // 2662171

Изобретение относится к медицине, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза. Способ выявления гепарина в пробах крови заключается в том, что выполняют тромбоэластографию с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида и тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида и инактиватора гепарина, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по показателям времени от начала свертывания до образования первых волокон фибрина, мин (R), времени изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления, мин (K), по показателям максимальной амплитуды (МА) и угла альфа (угол α) в пробе с инактиватором по сравнению с пробой без него, при этом в качестве инактиватора гепарина используют полибрен в конечной концентрации 15-30 мкг/мл, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по укорочению показателей R и K и увеличению МА и угла α в пробе с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида и полибрена по сравнению с пробой с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида.

Способ количественного определения фенобарбитала в таблетках "корвалол" способом уф-спектрофотометрии с использованием удельного показателя поглощения // 2662070

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к фармацевтическому анализу, и может быть использовано для количественного определения фенобарбитала в таблетках “Корвалол” методом УФ-спектрофотометрии.

Способ определения динамики изменения скорости оседания эритроцитов // 2660710

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной клинической диагностике и может быть использовано для проведения лабораторных анализов динамики изменения скорости оседания эритроцитов, а также в исследовательских целях.

Способ прогнозирования течения сенсоневральной тугоухости // 2660533

Изобретение относится к области медицины, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для прогнозирования прогрессирующего течения сенсоневральной тугоухости (СНТ).

Нагревательное устройство для прибора для измерения методом спектрометрии // 2658126

Изобретение относится к нагревательному устройству для прибора для измерения методом спектрометрии. Данное нагревательное устройство отличается тем, что оно выполнено в виде мягкого оптического элемента (1), который включает в себя мягкую гибкую опору (10) с верхней стороной (10a) и нижней стороной (10b).

Нагревательное устройство для прибора для измерения методом спектрометрии // 2658126

Способ оценки вероятности исходов безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза и сочетанного течения боррелиозно-энцефалитной инфекции // 2657830

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ оценки вероятности исходов безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза и сочетанного течения боррелиозно-энцефалитной инфекции, включающий определение значений лабораторных показателей пациента: в остром периоде заболевания в сроки 10-14 дней от начала заболевания – IgM и IgG, в период реконвалесценции в сроки 21-25 дней от начала заболевания – ИЛ-8; отличающийся тем, что оценивают значения лабораторных показателей пациента в баллах: IgM при значении >2,38 г/л – 7 баллов, IgG при значении <4,79 г/л – 32 балла, ИЛ-8 при значении >84,96 пг/л – 12 баллов; иные значения показателей оцениваю как 0 баллов; подсчитывают сумму баллов; при сумме >16 баллов оценивают вероятность развития хронического течения инфекционных заболеваний равной 77,24+0,14%; при сумме ≤16 баллов оценивают вероятность выздоровления равной 85,51+0,04%.

Способ выявления у детей ранних нарушений физиологической функции сердца в условиях контаминации фенолом // 2657821

Изобретение относится к области медицины и биологии. Способ выявления у детей ранних нарушений физиологической функции сердца в условиях контаминации фенолом включает отбор пробы крови у ребенка и определение в пробе содержания фенола, отбор пробы буккального эпителия и осуществление выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), генотипирование полиморфизма генов MTHFR и SULTIAI, исследование генотипов гена MTHFR С677Т (rs1801133) и гена SULTIAI G2663A (rs9282861), при одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена MTHFR С677Т (rs1801133) и гена SULTIAI G2663A (rs9282861), и при превышении концентрации фенола в крови выше фонового уровня более чем в 1,5 раза, диагностируют у ребенка наличие ранних нарушений физиологической функции сердца в виде функциональной кардиопатии, связанной с контаминацией фенолом.

Способ диагностики болезни виллебранда (субтип 2n) // 2657794

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для диагностики болезни Виллебранда. Способ диагностики болезни Виллебранда (субтип 2N) заключается в том, что для выявления указанного субтипа используется тромбоэластография до и после двухкратной инфузии концентрата фактора Виллебранда (ФВ) в дозе 40-50 МЕ/кг, а диагностику осуществляют определением показателя Ratio как отношение времени рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) до двухкратной инфузии ко времени рекальцификации крови после двукратной инфузии концентрата ФВ, и при значении показателя Ratio больше 1,3 диагностируют болезнь Виллебранда (субтип 2N).

Устройство для быстрого анализа и способ // 2657187

Группа изобретений относится к медицинской технике. Испытательное устройство для исследования крови или компонентов крови содержит первую часть и вторую часть, содержащие взаимодействующие первый и второй соединительные элементы для соединения первой части со второй частью, и абсорбирующий и/или адсорбирующий элемент для абсорбирования и/или адсорбирования образца.

Способ определения динамики измерения скорости оседания эритроцитов // 2655523

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной клинической диагностике, и может быть использовано для проведения лабораторных анализов динамики изменения скорости оседания эритроцитов, а также в исследовательских целях.

Способ прогнозирования эффективности антикоагулянтной терапии у больных с фибрилляцией предсердий, перенесших инсульт // 2655302

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки эффективности антикоагулянтной терапии у больных с фибрилляцией предсердий (ФП), перенесших инсульт, отличающийся тем, что перед назначением антикоагулянтной терапии новыми пероральными антикоагулянтами (НПОАК) у пациента проводят взятие крови из периферической вены, 10 мкл которой помещают в камеру Горяева с зеркальным напылением и анализируют с помощью лазерного фазово-интерференционного микроскопа, измеряя фазовую высоту 40-50 эритроцитов в пробе; определяют среднюю максимальную dY1 и среднюю минимальную dY2 фазовую высоту эритроцитов, рассчитывают коэффициент оксигенации эритроцитов dY2/dY1; значения dY2/dY1 от 0,085 до 0,2 считают нормальными; значения dY2/dY1<0,085 и значения dY2/dY1>0,2 свидетельствуют о нарушении реологических свойств крови; через 17 недель после начала терапии НПОАК исследование повторяют; достижение или сохранение значений dY2/dY1 от 0,085 до 0,2 считают признаком эффективности терапии, а значения dY2/dY1<0,085 и значения dY2/dY1>0,2 свидетельствуют о ее неэффективности.

Способ определения концентраций гемоглобина и его производных в крови // 2663572

Изобретение относится к медицине, а именно к определению гемоглобина и его производных в крови для применения в лабораторной практике. Для этого с помощью цифрового спектрофотометра в диапазоне длин волн λ=500-700 нм, с точностью 0,5-1 нм измеряют спектр поглощения суспенции эритроцитов в буфере PBS при рН 7,4. Далее проводят аппроксимацию эмпирической и теоретической кривой стандартным методом нелинейной регрессии. При аппроксимации учитывают поглощение света производными гемоглобина, а также величины рэлеевского рассеяния света и рассеяния на клетках крови. Изобретение позволяет повысить точность оценки содержания производных гемоглобина в крови здорового и больного человека при диагностике заболеваний. 5 ил., 5 табл., 2 пр.