Способ и система для определения биологического ответа мишени на растворимое вещество-кандидат

Группа изобретений относится к обнаружению мишень-ориентированных лекарственных средств. Способ определения биологического ответа мишени на растворимое исследуемое вещество содержит следующие этапы: - в ламинарный поток буферной жидкости, текущей через дисперсионный канал, вводят растворимое исследуемое вещество с образованием растворенного исследуемого вещества в буферной жидкости, имеющего начальный концентрационный профиль; ламинарным потоком буферной жидкости через дисперсионный канал вышеуказанное растворенное исследуемое вещество диспергируется так, чтобы в буферной жидкости содержался диспергированный концентрационный профиль; направляют ламинарный поток буферной жидкости, содержащей раствор исследуемого вещества, имеющий вышеуказанный профиль, в канал обнаружения так, что в этом канале растворенное исследуемое вещество образует конечный симметричный концентрационный профиль растворенного исследуемого вещества в буферной жидкости; вводят мишень в канал обнаружения для смешения с растворенным исследуемым веществом, имеющим конечный симметричный концентрационный профиль в буферной жидкости таким образом, чтобы получить в буферной жидкости смесь, имеющую объединенный концентрационный профиль, причем указанный профиль содержит мишень, имеющую постоянный концентрационный профиль мишени, смешанную с растворенным исследуемым веществом, имеющим конечный симметричный концентрационный профиль в буферной жидкости; удерживают смесь мишени и растворенное исследуемое вещество в буферной жидкости в канале обнаружения так, чтобы по меньшей мере одна половина объединенного концентрационного профиля удерживалась в этом канале; и производят оптическое сканирование смеси мишени и растворенного исследуемого вещества, содержащейся в буферной жидкости, удержанной в канале обнаружения и содержащей по меньшей мере, одну половину объединенного концентрационного профиля, для обнаружения при различных концентрациях раствора исследуемого вещества, содержащегося в объединенном концентрационном профиле, оптического сигнала, представляющего биологический ответ мишени на растворимое исследуемое вещество. Также представлена система для определения биологического ответа мишени на растворимое исследуемое вещество. Достигается повышение эффективности и надежности определения биологического ответа мишени. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 ил.

 

Настоящее изобретение относится к способу определения биологического ответа мишени на растворимое вещество-кандидат и соответствующей системе согласно соответственному независимому пункту.

Обнаружение мишень - ориентированных лекарственных средств, в общем, состоит из рационального дизайна лекарственного средства, химического синтеза, биологического анализа и анализа данных, которые осуществляют неоднократно до тех пор, пока не появится лидерная структура. Биологические анализы для определения активности, селективности, и эффективности недавно синтезированного лекарственного кандидата по отношению к представляющей интерес мишени, являются фундаментальной частью этого процесса.

Особым типом такого биологического анализа является метод разбавления. В принципе, метод разбавления предоставляет растворенное вещество-кандидат с различными концентрациями и направлен на установление взаимосвязи между биологическим ответом мишени и различными концентрациями растворенного вещества-кандидата.

Заявка WO 2011/042509 раскрывает способ создания множества микрокапель с различными концентрациями растворенного вещества (растворенного вещества-кандидата) в растворителе (буферная жидкость). Микрокапли также содержат мишень, имеющую постоянную концентрацию. Микрокапли создают введением растворимого вещества-кандидата в ламинарный поток растворителя, текущего через микрожидкостный канал для образования растворенного вещества-кандидата в растворителе. Сразу после введения в растворитель, растворенное вещество имеет начальный концентрационный профиль импульсообразной формы. Ламинарный поток буферной жидкости вызывает изменение начального концентрационного профиля растворенного вещества импульсообразной формы в растворителе вследствие дисперсии Тейлора - Ариса на диспергированный концентрационный профиль, имеющий форму гауссовской кривой.

В этой связи следует отметить, что термин «диспергированный концентрационный профиль, имеющий форму гауссовской кривой» как он используется в данной заявке означает диспергированный профиль концентраций, который теоретически имеет форму гауссовской кривой, однако на практике фактическая форма диспергированного концентрационного профиля может немного отклоняться от профиля, имеющего форму правильной гауссовской кривой, в частности это касается точной симметрии профиля. Таким образом, всякий раз, когда такой профиль, имеющий форму гауссовской кривой описан как симметричный и фактический диспергированный концентрационный профиль немного отклоняется от профиля, имеющего форму правильной гауссовской кривой, форма фактического диспергированного концентрационного профиля может также отклоняться от абсолютно симметричной формы.

Возвращаясь к способу, описанному в WO 2011/042509, после введения мишени в растворитель, содержащий диспергированный концентрационный профиль, имеющий форму гауссовской кривой, непрерывный поток растворителя разделяется на множество дискретных микрокапель. Эти микрокапли создаются путем объединения непрерывного потока растворителя, содержащего диспергированный концентрационный профиль растворенного вещества, имеющий форму гауссовской кривой, и мишени, имеющей постоянную концентрацию, с масляной фазой в особый поток, фокусируя величину таким образом, чтобы обеспечить различные средние концентрации растворенного вещества в отдельных микрокаплях. Величина шага концентрации растворенного вещества задается разностью средней концентрации в соседних микрокаплях, которая зависит от скорости формирования капель: если скорость формирования капель уменьшается, величина шага средней концентрации уменьшается.

Некоторые недостатки связаны с описанным способом предоставления мишени и растворенного вещества в растворителе в серии микрокапель. Микрокапли разделяют концентрационный профиль внутри дискретных средних концентраций (средние концентрации в отдельных микрокаплях). Это ограничивает количество различных средних концентраций (величина шага концентрации) числом микрокапель, разделяющих концентрационный профиль, так, что «разрешение» (величина шага) в отношении различных концентраций ограничено. Кроме того, использование масла для образования микрокапель исключает возможность использования лиофильных веществ-кандидатов или меток, по причине их склонности к диффузии в масле.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в предоставлении способа определения биологического ответа мишени на растворимое вещество-кандидат, который позволяет устранить или по крайней мере существенно сократить недостатки, известные в уровне техники.

Настоящее изобретение предлагает способ определения биологического ответа мишени на растворимое вещество-кандидат, который содержит следующие этапы, на которых:

- вводят растворимое вещество-кандидат в ламинарный поток буферной жидкости, текущей через дисперсионный канал для образования растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости, имеющего начальный концентрационный профиль;

- ламинарным потоком буферной жидкости начальный концентрационный профиль растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости диспергируется через дисперсионный канал для образования диспергированного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости;

- направляют ламинарный поток буферной жидкости, содержащей растворенное вещество-кандидат, имеющее диспергированный концентрационный профиль в канал обнаружения для образования конечного симметричного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости в канале обнаружения;

- вводят мишень в канал обнаружения таким образом, чтобы получить в буферной жидкости объединенный концентрационный профиль, содержащий постоянный концентрационный профиль мишени, лежащий сверху конечного симметричного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата;

- удерживают в канале обнаружения, по меньшей мере, одну половину объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости; и

- производят оптическое сканирование, по меньшей мере, одной половину объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, удерживаемой в канале обнаружения, для обнаружения при различных концентрациях растворенного вещества-кандидата объединенного концентрационного профиля, оптического сигнала, представляющего биологический ответ мишени на растворимое вещество кандидат.

Соответственно, способ по изобретению предполагает, что, по крайней мере, одна половина объединенного концентрационного профиля удерживается в канале обнаружения в виде стационарного непрерывного профиля, так что в принципе для оптического сканирования по всему профилю может быть выбрано неограниченное количество мест обнаружения (ограничения связаны только с разрешением оптического сканера). Стационарный непрерывный профиль позволяет осуществлять оптическое сканирование объединенного концентрационного профиля в течение заданного промежутка времени, в течение которого объединенный концентрационный профиль стабилен в силу того, что (молекулярные) диффузионные процессы в течение этого заданного промежутка времени пренебрежимо малы. Объединенный концентрационный профиль растворенного вещества-кандидата содержится только в буферной жидкости (не в масляной фазе), для того чтобы липофильные вещества-кандидаты или мишени также могли использоваться в анализе.

Описанный способ в принципе применим для известных методов разбавления, в которых типично определяют активность, селективность и эффективность растворимого вещества-кандидата по отношению к мишени, представляющей интерес. «Биологический ответ мишени на растворимое вещество-кандидат» в значении, принятом в настоящей заявке, включает любой биологический, биохимический, фармацевтический и т.д. ответ, пригодный для создания кривой дозировка-ответ используя метод разбавления. Следующие таблицы, включающие примеры анализа классифицируются в соответствии с различными показаниями, которые соответствуют биологическому ответу мишени на растворимое вещество-кандидат.

Флуоресценция

Люминесценция

Другие показания

В качестве примера, мишень может относиться к группе, состоящей из белков (растворимые белки, мембранные белки), таких как ферменты (например, киназы, протеазы, пептидазы), транспортные белки (например, ионные каналы, альбумины), рецепторы, сопряженные с G-белком (например, гистаминовый рецептор, серотониновый рецептор), транскрипционные факторы и т.д.

Под растворимым веществом-кандидатом понимают вещество, на которое может отвечать мишень, представляющая интерес. Например, растворимое вещество-кандидат может быть активным ингредиентом, который растворим в буферной жидкости сам по себе, или же растворимое вещество-кандидат может быть активным ингредиентом (например, фармацевтически активное вещество), который уже растворен в растворителе (например, раствор, содержащий активный ингредиент) и раствор, содержащий активный ингредиент растворим в буферной жидкости. Термин «растворимый» относится к способности определенного растворимого вещества-кандидата растворяться в соответствующей буферной жидкости, используемой для конкретного анализа. Термин «буферная жидкость» относится к любой подходящей известной жидкости, которая, как правило, инертна по отношению к определяемому биологическому ответу. Термин «мишень», как он используется в данной заявке, включает отдельные вещества, а также «объединенные мишени» как описано далее.

Буферная жидкость может удерживаться в канале обнаружения применением любой подходящей для этого меры, в результате которой ламинарный поток буферной жидкости останавливается, так чтобы прекратить в канале обнаружения дисперсионные эффекты, связанные с дисперсией Тейлора - Ариса. В течение периода времени, необходимого для оптического сканирования, другими молекулярными (диффузионными) процессами можно пренебречь, и объединенный концентрационный профиль, содержащийся в буферной жидкости и стационарно удерживаемый в канале обнаружения можно рассматривать как стабильный.

Дисперсионный канал и канал обнаружения могут представлять собой микрожидкостный канал, имеющий внутренний диаметр менее 2 мм, более предпочтительно менее 1 мм, и наиболее предпочтительно менее 100 мкм. Необходимо чтобы и дисперсионный канал и канал обнаружения позволяли пропускать ламинарный поток буферной жидкости, который требует соответствующего числа Рейнольдса. Ламинарный поток буферной жидкости обуславливает начальный концентрационный профиль растворенного вещества-кандидата, который изменяется вследствие дисперсии Тейлора - Ариса (см. описание выше). Дисперсия Тейлора - Ариса обуславливает изменение концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата на концентрационный профиль, имеющий форму гауссовской кривой.

В одном варианте способа по изобретению, этап, на котором удерживают в канале обнаружения, по меньшей мере, одну половину объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, выполняют путем прекращения последующего введения буферной жидкости в дисперсионный канал, и мишени в канал обнаружения. В практическом примере, последующую подачу буферной жидкости прекращают путем отключения насоса для подачи, так чтобы прекратить движение потока ламинарной жидкости. Такой насос может быть управляемым во времени для того, чтобы он мог автоматически отключаться после заданного промежутка времени. Этот промежуток времени начинается с момента вхождения ламинарного потока буферной жидкости, содержащего диспергированный концентрационный профиль растворенного вещества-кандидата в канал обнаружения и заканчивается когда, по меньшей мере, одна половина объединенного концентрационного профиля полностью находится внутри канала детектирования. Подобные соображения применимы для прекращения подачи мишени в канал обнаружения, что может быть достигнуть путем отключения насоса для подачи мишени, который осуществляет ввод ламинарного потока мишени в канал обнаружения.

Согласно дополнительному варианту способа по изобретению, ламинарный поток буферной жидкости, содержащей растворенное вещество-кандидат, имеющее диспергированный концентрационный профиль, направляют в канал обнаружения при постоянной скорости потока. Также, мишень вводят в канал обнаружения при постоянной скорости потока, чтобы получить в буферной жидкости объединенный концентрационный профиль, содержащий постоянный концентрационный профиль мишени, лежащий сверху конечного симметричного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата. Это практический подход, который позволяет достичь в канале обнаружения очень однородного покрытия конечного симметричного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости постоянным концентрационным профилем мишени. С практической точки зрения, введение мишени при постоянной скорости потока начинается еще до того, как конечный концентрационный профиль растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости достигнет канала обнаружения, так, что ламинарный поток мишени вводится в момент времени, когда конечный концентрационный профиль растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости достигает канала обнаружения. Этот ламинарный поток мишени далее плавно ложится сверху конечного концентрационного профиля вещества-кандидата для образования в канале обнаружения объединенного концентрационного профиля.

Согласно дополнительному варианту способа по изобретению, этап на котором удерживают в канале обнаружения, по меньшей мере, одну половину объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, содержит удержание в канале обнаружения только одной половины объединенного концентрационного профиля. И хотя, в общем, весь объединенный концентрационный профиль или более чем одна половина объединенного концентрационного профиля может удерживаться в канале обнаружения и сканироваться, необходимо удержать в канале обнаружения только одну половину объединенного концентрационного профиля, поскольку одна половина объединенного концентрационного профиля содержит все концентрации, представляющие интерес. Таким образом, длина канала обнаружения может быть уменьшена, а также может быть уменьшено время сканирования объединенного концентрационного профиля в канале обнаружения (в заданном разрешении), поскольку необходимо подвергнуть оптическому сканированию только одну половину объединенного концентрационного профиля, а не весь объединенный концентрационный профиль. Это может иметь большое значение, в частности, ввиду большого числа анализов, выполняемых на ранней стадии поиска лекарственных средств, которые по возможности должны быть в значительной степени автоматизированы.

Согласно еще одному дополнительному варианту способа по изобретению, только одна половина объединенного концентрационного профиля содержит, по меньшей мере, пять (предпочтительно от пяти до шести) порядков величины концентрации растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости. Пять порядков величины концентраций растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости включает в себя диапазон от 1 до 100'000 нМ [нано Молярная], шесть порядков диапазон от 1 до 1'000'000 нМ. Это доказывает, что для обнаружения (если присутствует) любого существенного биологического ответа достаточно только одной половины объединенного симметричного концентрационного профиля.

Согласно дополнительному варианту способа по изобретению, этап, на котором производят оптическое сканирование в канале обнаружения, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, выполняют путем перемещения канала обнаружения относительно стационарно расположенного блока оптического обнаружения. Как правило, достаточно только относительного перемещения, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости в канале обнаружения, для сканирования, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля для получения сигнала, характерного для биологического ответа мишени на растворимое вещество-кандидат. Однако, поскольку оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью, как правило, очень чувствительны к любым изменениям, предпочтительно расположить блок оптического обнаружения стационарно при перемещении канала обнаружения (например, чип, содержащий канал обнаружения) относительно блока оптического обнаружения.

Согласно дополнительному варианту способа по изобретению, этап, на котором производят оптическое сканирование в канале обнаружения, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, выполняют путем многократного перемещения канала обнаружения в одном и том же диапазоне взаимных расположений канала обнаружения и блока оптического обнаружения, где соответствующие сигналы, представляющие различные биологические ответы, затем преобразовывают для образования среднего сигнала или изменения сигнала в зависимости от времени, которые характерны для биологического ответа мишени на растворимое вещество-кандидат. Получение множества отдельных сигналов для каждой концентрации объединенного концентрационного профиля и усреднение этих сигналов позволяет получить сигнал, который еще больше отражает биологический ответ.

Согласно еще одному дополнительному варианту способа по изобретению, этап, на котором производят оптическое сканирование в канале обнаружения, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, выполняют при различной чувствительности детектирования регулируя чувствительность блока оптического обнаружения к оптическому сигналу, который представляет биологический ответ мишени на растворимый кандидат и/или к оптическому сигналу, представляющему концентрацию растворимого вещества-кандидата.

В принципе, в качестве блока оптического обнаружения для считывания соответствующего характерного оптического сигнала может использоваться любое оптическое считывающее устройство. Например, блок оптического обнаружения может представлять собой CCD камеру, которая типично чувствительна к интенсивности света, соответствующей 2-3 порядкам величины концентрации растворенного вещества-кандидата, хотя диапазон сканируемых концентраций, как правило, охватывает 5-6 порядков величины концентрации растворенного вещества-кандидата. Таким образом, предпочтительно изменить чувствительность обнаружения для того, чтобы было возможным использовать одну и ту же CCD камеру для сканирования объединенного концентрационного профиля во всем диапазоне, где может ожидаться сигнал, характерный для биологического ответа мишени.

Согласно еще одному дополнительному варианту способа по изобретению, мишень, введенная в канал обнаружения, представляет собой объединенную мишень, содержащую, по меньшей мере, два компонента, которые по отдельности вводят в канал обнаружения. Например, в случае если вещество-кандидат представляет собой вещество, которое анализируют для определения его активности к ингибированию преобразующей активности фермента, то объединенная мишень должна содержать не только фермент, но и компонент, преобразованный ферментом в отсутствие ингибитора.

Соответственно, объединенная мишень содержит два компонента. В данном случае биологическим ответом будет активность одного компонента (преобразующего фермента) объединенной мишени к преобразованию другого компонента объединенной мишени. Оба компонента объединенной мишени могут вводиться в канал обнаружения по отдельности таким образом, чтобы создать объединенный концентрационный профиль в канале обнаружения. Этот вариант осуществления может использоваться, например, для определения концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для определения активности вещества-кандидата к ингибированию преобразующей активности фермента.

Согласно дополнительному варианту способа по изобретению, либо растворимое вещество-кандидат, которое образует растворенное вещество-кандидат, или мишень или оба содержат флуоресцентный маркер, который способен испускать оптически обнаруживаемый флуоресцентный сигнал. В случае, если флуоресцентный маркер присоединен к веществу-кандидату (например, если градиент концентрации не может быть легко обнаружен иначе), оптически обнаруживаемый флуоресцентный сигнал, испускаемый флуоресцентным маркером, позволяет обнаружить в канале обнаружения фактическую концентрацию растворимого вещества-кандидата в пределах, по меньшей мере, одной половины концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, таким образом, становится возможным определить в канале обнаружения локализацию отдельных концентраций в пределах, по меньшей мере, одной половины концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости. Калибровка (ex situ в другом эксперименте, или in situ в том же самом эксперименте) может быть выполнена таким образом. Если мишень содержит флуоресцентный маркер, после калибровки интенсивности сигнала, испускаемого флуоресцентным маркером он может использоваться как оптический сигнал, представляющий биологический ответ мишени на растворимый кандидат. Например, если компонент, который может быть преобразован ферментом, содержит флуоресцентный маркер, преобразование компонента может уменьшить люминесцентное излучение от субстрата. В том случае, если и растворенное вещество-кандидат, и мишень содержат флуоресцентный маркер, очевидно, что люминесцентное излучение маркера растворенного вещества-кандидата и люминесцентное излучение маркера мишени должны иметь различную длину волны, для того чтобы было возможно различить люминесцентное излучение, испускаемое маркером растворенного вещества-кандидата и люминесцентное излучение маркера мишени.

Еще один аспект настоящего изобретения касается системы для определения биологического ответа мишени на растворимое вещество-кандидат, содержащей:

- дисперсионный канал, имеющий

первый вход в дисперсионный канал для введения буферной жидкости в дисперсионный канал,

второй вход в дисперсионный канал, расположенный дальше первого входа в дисперсионный канал, для введения растворимого вещества-кандидата в буферную жидкость, текущую через дисперсионный канал для образования растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости, и

выход из дисперсионного канала, расположенный дальше первого и второго входов в дисперсионный канал, позволяющий буферной жидкости, содержащей растворенное вещество-кандидат выйти из дисперсионного канала,

- насос для создания ламинарного потока буферной жидкости через дисперсионный канал,

- инжектор вещества-кандидата для введения растворимого вещества-кандидата в ламинарный поток буферной жидкости через дисперсионный канал, для образования растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости, имеющего начальный концентрационный профиль, который затем диспергируется ламинарным потоком буферной жидкости через дисперсионный канал с формированием диспергированного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости,

- канал обнаружения, имеющий:

первый вход в канал обнаружения, который расположен с возможностью сообщаться по текучей среде с выходом из дисперсионного канала так, чтобы ламинарный поток буферной жидкости, выходящей из дисперсионного канала через выход из дисперсионного канала и содержащей диспергированный концентрационный профиль растворенного вещества-кандидата направлялся через первый вход канала обнаружения в канал обнаружения для образования конечного симметричного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости, в канале обнаружения, и

по меньшей мере, один дополнительный вход в канал обнаружения для введения мишени в канал обнаружения,

- по меньшей мере, один инжектор мишени для введения мишени в канал обнаружения через, по меньшей мере, один дополнительный вход в канал обнаружения таким образом, чтобы получить объединенный концентрационный профиль, содержащий постоянный концентрационный профиль мишени, лежащий сверху конечного симметричного концентрационного профиля растворенного вещества-кандидата в буферной жидкости,

- средства для удержания в канале обнаружения, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости, и

- блок оптического обнаружения способный и расположенный для оптического сканирования, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости в канале обнаружения для обнаружения при различных концентрациях растворенного вещества-кандидата объединенного концентрационного профиля, оптического сигнала, представляющего биологический ответ мишени на растворимое вещество-кандидат,

в которой выход из дисперсионного канала и первый вход в канал обнаружения соединены друг с другом таким образом, что ламинарный поток поддерживается у соединения данных каналов и в канале обнаружения.

Согласно одному варианту системы по изобретению, внутренняя стенка дисперсионного канала у выхода из дисперсионного канала и внутренняя стенка канала обнаружения у входа в канал обнаружения имеют одинаковую форму и размер для обеспечения непрерывного контура внутренней стенки канала у соединения дисперсионного канала и канала обнаружения.

Согласно еще одному варианту системы по изобретению, внутренняя стенка дисперсионного канала у выхода из дисперсионного канала и внутренняя стенка канала обнаружения у входа в канал обнаружения выполнены как единое целое так, чтобы образовать общую непрерывную внутреннюю стенку.

Дополнительные предпочтительные варианты изобретения становятся очевидными из следующего описания изобретения со ссылкой на сопровождающие чертежи, в которых:

Фиг. 1 показывает вид в разрезе дисперсионного канала и канала обнаружения, которые выполнены как одно целое при осуществлении способа по изобретению; и

Фиг. 2 показывает вид в перспективе варианта выполнения системы по изобретению, в котором канал обнаружения расположен на чипе, подвижном относительно блока оптического обнаружения, и

Фиг. 3 показывает увеличенное изображение элемента III, изображенного на Фиг. 2

Фиг. 1 показывает дисперсионный канал 11 и канал 12 обнаружения, которые выполнены как единое целое. Дисперсионный канал 11 имеет первый вход 111 в дисперсионный канал, и второй вход 112 в дисперсионный канал, и выход 113 из дисперсионного канала. Второй вход 112 в дисперсионный канал расположен дальше первого входа 111 в дисперсионный канал, и выход 113 из дисперсионного канала расположен дальше первого и второго входов 111, 112 в дисперсионный канал. Канал 12 обнаружения имеет вход 121 в канал обнаружения, который идентичен выходу 113 из дисперсионного канала, и два дополнительных входа 122, 123.

В действии, буферную жидкость 2 с помощью насоса 1 (см. Фиг. 2) вводят в дисперсионный канал 11 через первый вход 111 в дисперсионный канал, и параболический профиль скорости ламинарного потока буферной жидкости 2, текущей через дисперсионный канал 11 показан стрелками. Инжектор 7 вещества-кандидата расположен у второго входа 112 в дисперсионный канал для введения растворимого вещества-кандидата в ламинарный поток буферной жидкости 2, текущей через дисперсионный канал 11. В показанном варианте выполнения, растворимое вещество-кандидат представляет собой растворимое вещество-кандидат, способное ингибировать активность превращающего фермента. Сразу после введения в ламинарный поток буферной жидкости, растворимое вещество-кандидат растворяется в буферной жидкости 2 для образования растворенного вещества-кандидата 3 в буферной жидкости 2, имеющего начальный концентрационный профиль, схематично показанный в виде прямоугольного профиля 31, изображенного выше второго входа в дисперсионный канал, хотя фактический концентрационный профиль не является прямоугольным как показано.

Как уже описывалось выше, начальный концентрационный профиль 31 затем диспергируется вследствие дисперсии Тейлора - Ариса, под действием ламинарного потока буферной жидкости 2 в дисперсионном канале 11 так, что начальный концентрационный профиль 31 меняется на диспергированный концентрационный профиль, показанный в виде гауссовской кривой 32, изображенной выше выхода 113 из дисперсионного канала 11. Буферная жидкость 2, содержащая диспергированный концентрационный профиль 32, далее направляется в канал 12 обнаружения через вход 121 в канал 12 обнаружения, который в показанном варианте выполнения идентичен выходу 113 из дисперсионного канала 11, поскольку дисперсионный канал 11 и канал 12 обнаружения выполнены как единое целое так, что внутренняя стенка 13 дисперсионного канала 11 у выхода 113 из дисперсионного канала и внутренняя стенка 14 канала 12 обнаружения у первого входа 121 в канал обнаружения имеют одинаковую форму и размер для обеспечения непрерывной внутренней стенки канала у соединения дисперсионного канала 11 и канала 12 обнаружения. Это позволяет перемещать буферную жидкость 2 из дисперсионного канала 11 в канал 12 обнаружения, сохраняя ламинарный поток так, чтобы диспергированный концентрационный профиль 32 далее диспергировался в канале 12 обнаружения для образования конечного симметричного концентрационного профиля, представленного гауссовской кривой 33, изображенной выше канала 12 обнаружения.

Канал 12 обнаружения содержит два дополнительных входа 122, 123 в канал обнаружения, которые расположены у соединения дисперсионного канала 11 к каналу 12 обнаружения. Два компонента 41, 42 мишени по отдельности вводят в канал обнаружения через два дополнительных входа 122, 123 с помощью двух инжекторов 8, 9 мишени (см. Фиг. 2). На практике, поток буерной жидкости 2, так же как и потоки объединенной мишени, содержащей два компонента 41, 42 мишени (например, два отдельных раствора жидкой мишени) непрерывно подают до введения растворимого вещества-кандидата в дисперсионный канал 11. Это обеспечивает постоянную концентрацию объединенной мишени, содержащей два компонента 41, 42 в канале 12 обнаружения. Этот постоянный профиль объединенной мишени лежит сверху конечного симметричного концентрационного профиля 33 растворенного вещества-кандидата 3 в канале 12 обнаружения, для образования объединенного концентрационного профиля, содержащего постоянный концентрационный профиль мишени, лежащий сверху конечного симметричного концентрационного профиля 33 растворенного вещества-кандидата.

Как уже также обсуждалось выше, введение объединенной мишени, содержащей два компонента 41, 42 позволяет выполнить специальные биологические анализы с объединенными мишенями. Так, объединенная мишень может содержать, например, фермент 41 и компонент 42, который может превращаться под действием фермента. Ферментативная активность как биологический ответ, может быть определена обнаружением скорости превращения компонента 42. Если вещество-кандидат представляет собой ингибитор фермента, ингибирующий активность фермента 41 к превращению, снижение ферментативной активности должно быть биологическим ответом.

Как только по меньшей мере одна половина объединенного концентрационного профиля, содержащая постоянный концентрационный профиль мишени, лежащий сверху конечного симметричного концентрационного профиля 33 растворенного вещества-кандидата 3, попадает в канал 12 обнаружения, она удерживается в нем. Как уже объяснялось выше, одной половины объединенного концентрационного профиля достаточно в силу симметрии объединенного концентрационного профиля. Конечно, возможно удерживать весь объединенный концентрационный профиль в канале 12 обнаружения. Буферную жидкость 2, содержащую по меньшей мере одну половину объединенного концентрационного профиля, удерживают в канале обнаружения путем прекращения последующей подачи буферной жидкости 12, а также подачи компонентов 41, 42 мишени в канал 12 обнаружения. Прекращение ламинарного течения приводит к прекращению дисперсии Тейлора - Ариса, тогда как другими (молекулярными) диффузионными процессами можно пренебречь в течение промежутка времени, необходимого для выполнения этапа оптического сканирования, по меньшей мере одной половины объединенного концентрационного профиля, удерживаемого в канале обнаружения. В настоящем примере биологический ответ может быть детектирован оптическим обнаружением флуоресцентного сигнала, испускаемого флуоресцентным маркером, содержащемся в компоненте 42. Превращение компонента 42 под действием фермента приводит к уменьшению интенсивности обнаруживаемого флуоресцентного сигнала (уменьшение может быть обнаружено в методах анализа, основанных на гасящих эффектах). Это уменьшение в обнаружимом флуоресцентном сигнале является следствием ферментативной активности. Соответственно, если вещество-кандидат представляет собой ингибитор фермента, ингибирующий активность фермента к превращению компонента 42, обнаруживаемый флуоресцентный сигнал от компонента 42 либо вообще не будет уменьшаться, либо будет уменьшаться в незначительной степени. Соответственно, в данном примере оптически обнаружимый сигнал, представляющий биологический ответ, является изменением интенсивности люминесцентного излучения, испускаемого флуоресцентным маркером, содержащимся в компоненте 42.

Это уменьшенное снижение интенсивности может быть определено в пределах, по меньшей мере, одной половины объединенного концентрационного профиля, удерживаемого в канале 12 обнаружения. Поскольку по меньшей мере одна половина объединенного концентрационного профиля содержит непрерывные «разбавления» в по меньшей мере одной половине объединенного концентрационного профиля (различные концентрации растворенного вещества-кандидата 3 в буферной жидкости, в идеале охватывающие весь диапазон концентраций от нуля до начальной концентрации, однако, по меньшей мере от пяти до шести порядков величины), метод разбавления позволяет определять биологический ответ во всем интервале практически всех концентраций растворенного вещества-кандидата 3, содержащихся в объединенном концентрационном профиле.

Люминесцентное излучение может быть обнаружено вдоль канала с помощью CCD камеры 6 (см. Фиг. 2), используемой в качестве блока оптического обнаружения. CCD камера обнаруживает интенсивность люминесцентного излучения в различных местоположениях канала 12 обнаружения относительно CCD камеры.

Вариант выполнения системы по изобретению показан на Фиг. 2. Система может использоваться, например, для осуществления способа, описанного выше в связи с Фиг. 1. В данном варианте выполнения системы по изобретению участки дисперсионного канала 11 и канала 12 обнаружения расположены на чипе 5. Чип 5 расположен с возможностью перемещения, что позволяет изменять расположение различных частей канала 12 обнаружения относительно CCD камеры 6, используемой в качестве блока оптического обнаружения. Только участок дисперсионного канала 11 расположен на чипе 5, тогда как дисперсионный канал 11 также содержит капилляр 114, предназначенный для увеличения длины дисперсионного канала, чтобы обеспечить достаточную дисперсию начального концентрационного профиля 31 вследствие дисперсии Тэйлора - Ариса. Насос 1 расположен у входа 111 в дисперсионный канал для нагнетания буферной жидкости в дисперсионный канал 11 и для вызывания ламинарного потока через него. Второй вход 112 в дисперсионный канал расположен дальше от первого входа 111 в дисперсионный канал, где растворимое вещество-кандидат вводят в буферную жидкость с помощью инжектора 7 вещества-кандидата. При помощи насоса 1 ламинарный поток генерируется через капилляр 114 и через участок дисперсионного канала 11, расположенный на чипе так, как было описано выше, диспергирование начального профиля растворенного вещества-кандидата представлено прямоугольной кривой 31, образование диспергированного профиля, обусловленного дисперсией Тейлора – Ариса, представлено в виде гауссовской кривой 32 (см. Фиг. 1). Выход 113 из дисперсионного канала, так же как и два дополнительных входа 122, 123 в канал обнаружения, расположены на чипе 5. Два дополнительных входа 122, 123 в канал обнаружения объединяются с первым входом 121 в канал обнаружения, который идентичен выходу 113 из дисперсионного канала (см. Фиг. 3). Канал 12 обнаружения содержит участок изгибающейся формы, расположенный на чипе 5. Выход 125 из канала обнаружения расположен на конце канала 12 обнаружения для вытекания буферной жидкости из канала 12 обнаружения.

Варианты выполнения изобретения были описаны с помощью чертежей. Однако возможны различные модификации и изменения описанных вариантов выполнения, без отступления от общей идеи, лежащей в основе настоящего изобретения. Поэтому не следует понимать, что изобретение ограничено описанными вариантами выполнения изобретения, но скорее объемом притязаний, определяемым формулой изобретения.

1. Способ определения биологического ответа мишени (41; 41, 42) на растворимое исследуемое вещество, содержащий следующие этапы:

- в ламинарный поток буферной жидкости (2), текущей через дисперсионный канал (11), вводят растворимое исследуемое вещество с образованием растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2), имеющего начальный концентрационный профиль (31);

- ламинарным потоком буферной жидкости (2) через дисперсионный канал (11) растворенное исследуемое вещество (3), имеющее начальный концентрационный профиль (31) в буферной жидкости (2), диспергируется так, чтобы в буферной жидкости (2) содержался диспергированный концентрационный профиль (32);

- направляют ламинарный поток буферной жидкости (2), содержащей раствор (3) исследуемого вещества, имеющий диспергированный концентрационный профиль (32), в канал (12) обнаружения так, что в канале (12) обнаружения растворенное исследуемое вещество (3) образует конечный симметричный концентрационный профиль (33) растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2);

- вводят мишень (41; 41, 42) в канал (12) обнаружения для смешения с растворенным исследуемым веществом (3), имеющим конечный симметричный концентрационный профиль (33) в буферной жидкости (2) таким образом, чтобы получить в буферной жидкости (2) смесь, имеющую объединенный концентрационный профиль, причем объединенный концентрационный профиль содержит мишень (41; 41, 42), имеющую постоянный концентрационный профиль мишени, смешанную с растворенным исследуемым веществом (3), имеющим конечный симметричный концентрационный профиль (33) в буферной жидкости (2);

- удерживают смесь мишени (41; 41, 42) и растворенное исследуемое вещество (3) в буферной жидкости (2) в канале (12) обнаружения так, чтобы по меньшей мере одна половина объединенного концентрационного профиля удерживалась в канале (12) обнаружения; и

- производят оптическое сканирование смеси мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3), содержащейся в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей по меньшей мере, одну половину объединенного концентрационного профиля, для обнаружения при различных концентрациях раствора (3) исследуемого вещества, содержащегося в объединенном концентрационном профиле, оптического сигнала, представляющего биологический ответ мишени (41; 41, 42) на растворимое исследуемое вещество.

2. Способ по п. 1, в котором этап, на котором удерживают в канале (12) обнаружения смесь мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей по меньшей мере одну половину объединенного концентрационного профиля, выполняют путем прекращения последующего введения буферной жидкости (2) в дисперсионный канал (11) и мишени в канал обнаружения.

3. Способ по п. 1, в котором ламинарный поток буферной жидкости (2), содержащей растворенное исследуемое вещество (3), имеющее диспергированный концентрационный профиль (32), направляют в канал (12) обнаружения при постоянной скорости потока, и в котором мишень (41; 41, 42) вводят в канал (12) обнаружения при постоянной скорости потока для получения смеси, имеющей объединенный концентрационный профиль, содержащий мишень (41; 41, 42), имеющую постоянный концентрационный профиль мишени (41; 41, 42), смешанную с растворенным исследуемым веществом (3), имеющим конечный симметричный концентрационный профиль (33) раствора (3) исследуемого вещества в буферной жидкости (2).

4. Способ по п. 2, в котором ламинарный поток буферной жидкости (2), содержащей растворенное исследуемое вещество (3), имеющее диспергированный концентрационный профиль (32), направляют в канал (12) обнаружения при постоянной скорости потока, и в котором мишень (41; 41, 42) вводят в канал (12) обнаружения при постоянной скорости потока для получения смеси, имеющей объединенный концентрационный профиль, содержащий мишень (41; 41, 42), имеющий постоянный концентрационный профиль мишени (41; 41, 42), смешанную с растворенным исследуемым веществом (3), имеющим конечный симметричный концентрационный профиль раствора (3) исследуемого вещества.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где этап, на котором удерживают в канале (12) обнаружения смесь мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2) таким образом, чтобы по меньшей мере одна половина объединенного концентрационного профиля удерживалась в канале (12) детектирования, содержит удержание только одной половины объединенного концентрационного профиля (33) в канале (12) обнаружения.

6. Способ по п. 5, в котором смесь мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей только одну половину объединенного концентрационного профиля (33), содержит по меньшей мере пять порядков величины концентрации растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2).

7. Способ по любому из пп. 1-4, в котором этап, на котором производят оптическое сканирование в канале (12) обнаружения смеси мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3), содержащегося в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей по меньшей мере одну половину объединенного концентрационного профиля, выполняют путем перемещения канала (12) обнаружения относительно стационарно расположенного блока (6) оптического обнаружения.

8. Способ по п. 7, в котором этап, на котором производят оптическое сканирование в канале (12) обнаружения смеси мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3), содержащегося в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей по меньшей мере одну половину объединенного концентрационного профиля, выполняют путем многократного перемещения канала (12) обнаружения в одном и том же диапазоне взаимных расположений канала (12) обнаружения и блока (6) оптического обнаружения, и в котором соответствующие сигналы, представляющие различные биологические ответы, затем преобразовывают для образования среднего сигнала или изменения сигнала в зависимости от времени, которые представляют биологический ответ мишени на растворимое исследуемое вещество.

9. Способ по п. 7, в котором этап, на котором в канале обнаружения производят оптическое сканирование смеси мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3), содержащегося в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей по меньшей мере одну половину объединенного концентрационного профиля, выполняют при различной чувствительности обнаружения путем регулирования чувствительности обнаружения блока (6) оптического обнаружения к оптическому сигналу, представляющему биологический ответ мишени (41; 41, 42) на растворимое исследуемое вещество, и/или оптическому сигналу, представляющему концентрацию растворимого исследуемого вещества.

10. Способ по п. 8, в котором этап, на котором в канале обнаружения производят оптическое сканирование смеси мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3), содержащегося в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей по меньшей мере одну половину объединенного концентрационного профиля, выполняют при различной чувствительности обнаружения путем регулирования чувствительности обнаружения блока (6) оптического обнаружения к оптическому сигналу, представляющему биологический ответ мишени (41; 41, 42) на растворимое исследуемое вещество, и/или оптическому сигналу, представляющему концентрацию растворимого исследуемого вещества.

11. Способ по любому из пп. 1-4, в котором мишень, введенная в канал (12) обнаружения, представляет собой объединенную мишень, содержащую по меньшей мере два компонента (41, 42), которые по отдельности вводят в канал (12) обнаружения.

12. Способ по любому из пп. 1-4, в котором либо растворимое исследуемое вещество, образующее растворенное исследуемое вещество (3), либо мишень (41; 41, 42), либо оба, содержат флуоресцентный маркер, способный испускать оптически обнаружимый флуоресцентный сигнал.

13. Система для определения биологического ответа мишени (41; 41, 42) на растворимое исследуемое вещество, содержащая:

- дисперсионный канал (11), имеющий:

первый вход (111) в дисперсионный канал для введения буферной жидкости (2) в дисперсионный канал (11),

второй вход (112) в дисперсионный канал, расположенный дальше первого входа (111) в дисперсионный канал, для введения растворимого исследуемого вещества в буферную жидкость (2), текущую через дисперсионный канал (11) для образования растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2), и

выход (113) из дисперсионного канала, расположенный дальше первого и второго входов (111, 112) в дисперсионный канал, позволяющий буферной жидкости (2), содержащей растворенное исследуемое вещество (3), выйти из дисперсионного канала (11),

- насос (1) для создания ламинарного потока буферной жидкости через дисперсионный канал (11),

- инжектор (7) исследуемого вещества для введения растворимого исследуемого вещества в ламинарный поток буферной жидкости через дисперсионный канал (11) для образования растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2), имеющего начальный концентрационный профиль, который затем диспергируется ламинарным потоком буферной жидкости (2) через дисперсионный канал (11) таким образом, чтобы в буферной жидкости (2) содержался диспергированный концентрационный профиль,

- канал (12) обнаружения, имеющий:

первый вход (121) в канал обнаружения, который расположен с возможностью сообщаться по текучей среде с выходом (113) из дисперсионного канала так, чтобы ламинарный поток буферной жидкости (2), выходящей из дисперсионного канала (11) через выход (113) из дисперсионного канала и содержащей растворенное исследуемое вещество (3), имеющее диспергированный концентрационный профиль, направлялся через первый вход (121) канала обнаружения в канал (12) обнаружения таким образом, что в канале (12) обнаружения растворенное исследуемое вещество (3) образует конечный симметричный концентрационный профиль растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости, и

по меньшей мере один дополнительный вход (122, 123) в канал обнаружения для введения мишени (41; 41, 42) в канал (12) обнаружения,

по меньшей мере один инжектор (8, 9) мишени для введения мишени в канал (12) обнаружения через по меньшей мере один дополнительный вход (122, 123) в канал обнаружения для смешения с растворенным исследуемым веществом (3), имеющим конечный симметричный концентрационный профиль (33) в буферной жидкости (2) таким образом, чтобы получить смесь, имеющую объединенный концентрационный профиль, содержащий мишень (41; 41, 42), имеющую постоянный концентрационный профиль мишени, смешанную с растворенным исследуемым веществом (3), имеющим конечный симметричный концентрационный профиль растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2),

- средства для удержания в канале (12) обнаружения смеси мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3) в буферной жидкости (2) таким образом, чтобы в канале (12) обнаружения удерживалась по меньшей мере одна половина объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости (2), и

- блок (6) оптического обнаружения, выполненный с возможностью и расположенный для оптического сканирования в канале (12) обнаружения смеси мишени (41; 41, 42) и растворенного исследуемого вещества (3), содержащегося в буферной жидкости (2), удержанной в канале (12) обнаружения и содержащей по меньшей мере одну половину объединенного концентрационного профиля, содержащегося в буферной жидкости (2), для обнаружения при различных концентрациях растворенного исследуемого вещества (3), содержащегося в объединенном концентрационном профиле, оптического сигнала, представляющего биологический ответ мишени на растворимое исследуемое вещество,

в которой выход (113) из дисперсионного канала и первый вход (121) в канал обнаружения соединены друг с другом таким образом, что ламинарный поток поддерживается у соединения данных каналов и в канале обнаружения.

14. Система по п. 13, в которой внутренняя стенка (13) дисперсионного канала (11) у выхода (113) из дисперсионного канала и внутренняя стенка (14) канала (12) обнаружения у первого входа (121) в канал обнаружения имеют одинаковую форму и размер для обеспечения непрерывного контура внутренней стенки канала у соединения дисперсионного канала (11) и канала (12) обнаружения.

15. Система по п. 14, в которой внутренняя стенка (13) дисперсионного канала (11) у выхода (113) из дисперсионного канала и внутренняя стенка (14) канала (12) обнаружения у входа (121) в канал обнаружения выполнены как единое целое так, чтобы образовать общую непрерывную внутреннюю стенку (13, 14).