Композиция среды для получения ботулинического токсина

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к композиции среды для производства ботулинического токсина и, более конкретно, к композиции среды для культивирования Clostridium sp., способного вырабатывать ботулинический токсин. Составы среды по настоящему изобретению включают свиной пептон и по меньшей мере один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата пшеничного глютена. Когда среду согласно настоящему изобретению, которая содержит пептоны растительного происхождения, свиные пептоны и минеральное вещество, используют для культивирования Clostridium botulinum, скорость роста бактерии в среде выше, чем в среде, используемой в настоящее время, и среде, включающей только пептоны растительного происхождения. Изобретение позволяет получить высокую концентрацию ботулинического токсина. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 16 табл., 10 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции среды для производства ботулинического токсина, а более конкретно, к составу среды для культивирования штаммов Clostridium способных продуцировать ботулинический токсин. Составы среды по настоящему изобретению включают свиной пептон и, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата пшеничной клейковины.

Предшествующий уровень техники

Множество штаммов Clostridium, которые выделяют нейротоксические токсины, было обнаружено начиная с 1890 - х годов, и описание характеристик токсинов, которые секретируются этими бактериями, была проведена в течение последних 70 лет (Schant,E. J. et al., Microbiol.Rev., 56:80, 1992).

Нейротоксические токсины, полученные из Clostridium sp., т.е. ботулинические токсины, подразделяются на семь типов (типы А-G) в зависимости от их серологических свойств. Каждый из токсинов имеет белок токсина размером около 150 кДа, и в природе содержит комплекс нескольких нетоксичных белков, связанных с ним. Средний комплекс (300 кДа) состоит из белка токсина и нетоксичного белка не гемагглютинина, а большой комплекс (450 кДа) и очень большой комплекс (900 кДа) состоит из средних размеров комплексов, связанных с гемагглютинином (Sugiyama H., Microbiol. Rev., 44:419, 1980). Такие нетоксичные гемагглютининовые белки, как известно, действуют, выполняя роль защиты токсина от низкого рН и различных протеаз в кишечнике.

Токсин синтезируется в клетках в виде одиночного полипептида, имеющего молекулярную массу около 150 кДа, а затем расщепляется в положении 1/3, начиная от N-конца под действием внутриклеточной протеазы или обработки искусственным ферментом, таким как трипсин, на две единицы: легкую цепь (L, молекулярная масса: 50 кДа) и тяжелую цепь (Н; молекулярная масса: 100 кДа). Расщепленный токсин имеет значимо увеличенную токсичность по сравнению с одиночным полипептидом. Два блока соединяются друг с другом дисульфидной связью и имеют различные функции. Тяжелая цепь связывается с рецептором клетки-мишени (Park. M.K. et al., FEMS Microbiol. Lett., 72:243, 1990) и выполняет функцию взаимодействия с биомембраной при низком рН (рН 4), образуя канал (Mantecucco, C. et al., TIBS., 18:324, 1993), а легкая цепь имеет фармакологическую активность нарушения секреции нейротрансмиттеров, когда проникает в клетки с помощью детергентов или вводится путем электропорации или т.п. (Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:4090, 1988).

Токсин синтезируется в клетках в виде одиночного полипептида, имеющего молекулярную массу около 150 кДа, а затем расщепляется в положении 1/3, начиная от N-конца под действием внутриклеточной протеазы или обработки искусственным ферментом, таким как трипсин, на две единицы: легкую цепь (L, молекулярная масса: 50 кДа) и тяжелую цепь (Н; молекулярная масса: 100 кДа). Расщепленный токсин имеет значимо увеличенную токсичность по сравнению с одиночным полипептидом. Два блока соединяются друг с другом дисульфидной связью и имеют различные функции. Тяжелая цепь связывается с рецептором клетки-мишени (Park. M.K. et al., FEMS Microbiol. Lett., 72:243, 1990) и выполняет функцию взаимодействия с биомембраной при низком рН (рН 4), образуя канал (Mantecucco, C. et al., TIBS., 18:324, 1993), а легкая цепь имеет фармакологическую активность нарушения секреции нейротрансмиттеров, когда проникает в клетки или вводится путем электропорации или т.п. (Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:4090, 1988).

Токсин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе нервно-мышечного соединения, чтобы вызывает астению. Считается, что токсичность демонстрирует обработка очень небольшим количеством токсина, что позволяет предположить, что токсин имеет некую ферментативную активность (Simpson, L. L. et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26:427, 1986).

Согласно недавнему отчету, токсин обладает активностью металлопептидазы и его субстраты включают синаптобревин, синтаксин, cинаптосомально-ассоциированный белок, 25 кДа (SNAP-25) и т.д., которые являются единичными белками комплекса машинерии экзоцитоза. Каждый тип токсина использует один из описанных выше трех белков в качестве своего субстрата, и известно, что токсины типа B, D, F и G, расщепляют синаптобревин в конкретном участке, токсины типа А и Е расщепляют SNAP - 25 в конкретном участке, а типа C расщепляет синтаксин в конкретном участке (Binz, T.et al., J. Biol. Chem., 265:9153, 1994).

В частности, ботулинический токсин типа А, как известно, растворим в разбавленном водном растворе при рН 4,0-6,8. Известно, что стабильный нетоксичный белок отделяют от нейротоксина при рН около 7 или выше, и, как следствие, токсичность постепенно теряется. В частности, известно, что токсичность уменьшается по мере роста рН и температуры.

Ботулинический токсин является смертельным для человеческого организма даже в небольших количествах и легко производится в больших количествах. Таким образом, этот токсин представляет собой один из четырех основных боевых средств биотеррора вместе с Bacillus anthracis, Yersinia pestis и вирусом натуральной оспы. Тем не менее, было обнаружено, что, когда ботулинический токсин типа А вводят в дозе, которая систематически не влияет на человеческий организм, токсин может парализовать локальную мышцу в инъецируемом участке. На основании этой характеристики, ботулинический токсин типа А может быть использован в широком диапазоне применений, включая агенты для удаления морщин, агенты для лечения спастической гемиплегии и церебрального паралича и т.д. Таким образом, спрос на ботулинический токсин типа А растет и активно проводятся исследования способов получения ботулинического токсина для удовлетворения спроса.

Текущий типичный коммерческий продукт BOTOX® (очищенный нейротоксиновый комплекс ботулинического токсина типа А) коммерчески доступен у Allergan, Inc., США. Флакон BOTOX® на 100 единиц состоит из примерно 5 нг очищенного нейротоксинового комплекса ботулинического токсина типа А, 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина и 0,9 мг хлорида натрия и восстанавливается с помощью стерильного физиологического раствора без консерванта (инъекция 0,9 % хлорид натрия). Другие коммерческие продукты включают Dysport® (комплекс ботунилинического токсина А типа из Clostridium и гемагглютинин, который имеет лактозу и человеческий сывороточный альбумин в фармацевтической композиции, включающей ботулинический токсин и восстанавливается 0,9% хлоридом натрия перед использованием), который является коммерчески доступным у Ipsen Ltd., Великобритания, Myobloc® (инъекционный раствор (рН около 5,6), содержащий ботулинический токсин типа В, человеческий сывороточный альбумин, сукцинат натрия и хлорид натрия), который является коммерчески доступным у Solstice Neurosciences, Inc.

Среда для культивирования Clostridium botulinum, которая обычно используется в способе получения ботулинического токсина, как описано в патенте Кореи 10-1339349, содержит компоненты животного происхождения. Таким образом, если аномальный прион животного, известный как агент, который вызывает трансмиссивную губчатую энцефалопатию, содержится в компонентах животных из-за загрязнения, то это создает проблемы в процессе получения ботулинического токсина.

Трансмиссивная губчатая энцефалопатия (TSE) известна как нейродегенеративное расстройство, вызывающее серьезную дегенерацию нейронов, и ее примеры включают коровью губчатую энцефалопатию (BSE), почесуху, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, куру, трансмиссивную энцефалопатию норок, хроническую изнуряющую болезнь, кошачью губчатую энцефалопатию и т.д., которые влияют на людей и животных. Сообщалось, что BSE пересекает видовой барьер и поражает даже людей.

У агента, который вызывает трансмиссивную губчатую энцефалопатию (TSE), есть особенности, которые заключаются в том, что он не имеет иммуногенности и инкубационный период является длинным. Из гистопатологического анализа BSE-пораженной ткани головного мозга крупного рогатого скота, можно видеть, что специальные губчатые вакуоли сформировались в головном мозге из-за повреждения нейронов и отложения аномальных белковых волокон.

Причиной TSE является белковые инфекционные частицы, известные как аномальный прион. В отличие от обычных вирусов, которые требуют нуклеиновой кислоты, аномальный прион представляет собой инфекционную частицу, состоящую только из белка, без нуклеиновой кислоты. Что касается TSE, то известно, что, когда аномальный прион (PrPsc), который представляет собой инфекционную частицу связываются с аномальным прионом (PrPc), то он превращается в патогенный прион, который затем накапливается в головном мозге (Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc Disord., 3:52-78, 1989).

Болезнь Крейтцфельдта-Якоба является редким нейродегенеративным расстройством человеческой трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), при которой трансмиссивный агент представляет собой, по-видимому аномальную форму прионного белка. У индивидуума с болезнью Крейтцфельдта-Якоба кажущееся совершенное здоровье может ухудшиться в акинетический мутизм в течение шести месяцев. Таким образом, может иметь место потенциальный риск приобретения прион-опосредованного заболевания, такого как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, из-за введения фармацевтической композиции, которая содержит биологический агент, такой как ботулинический токсин, полученный с использованием продуктов животного происхождения. Таким образом, если фармацевтическую композицию получают с помощью лекарственного вещества, полученного с использованием компонентов животного происхождения, она может подвергнуть пациента потенциальному риску получения различных патогенов или инфекционных агентов.

В соответствии с этим предшествующим уровнем техники, авторы настоящего изобретения обнаружили, что, когда для культивирования Clostridium botulinum используют среду, содержащую пептон растительного происхождения без трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), минеральное вещество и свиной пептон без TSE (например, TSE-сертифицированный свиной пептон) для того, чтобы предотвратить риск развития описанного выше прионного заболевания, риск развития прион-опосредованного заболевания, который может иметь место в среде, используемой в настоящее время (исходная среда), может быть исключен, и скорость роста Clostridium botulinum в среде может быть увеличена по сравнению со скоростью в среде, используемой в настоящее время, и среде, включающей пептон, полученный из растительного продукта, в результате чего выполняется настоящее изобретение.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема

Задача настоящего изобретения заключается в создании композиции среды, включающей пептон растительного происхождения, не имеющего никакого риска инфекции трансмиссивной губчатой энцефалопатией (TSE), и свиного пептона, не имеющего никакого риска инфекции TSE, а также в способе производства ботулинического токсина, который улучшает выработку ботулинического токсина путем культивирования Clostridium botulinum в композиции среды.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение обеспечивает композицию среды для культивирования Clostridium botulinum, включающей: по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы; и свиной пептон.

Настоящее изобретение также относится к способу получения ботулинического токсина, включающему следующие стадии: (а) культивирование Clostridium botulinum, с использованием композиции среды для получения ботулинического токсина; и (b) выделение полученного ботулинического токсина.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует рост Clostridium botulinum в среде (APF-среде), включающей пептон растительного происхождения.

Фиг. 2 демонстрирует рост Clostridium botulinum в среде, включающей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.

Фиг. 3 демонстрирует результаты изучения образования осадка после стерилизации среды, включающей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины после стерилизации.

Фиг. 4 демонстрирует результаты изучения образования осадка после стерилизации среды, включающей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества.

Фиг. 5 демонстрирует рост Clostridium botulinum в средах, полученных путем дополнительного добавления витаминов, аминокислот и «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» к среде для культивирования бактерии, которая содержит пептон растительного происхождения и минеральное вещество.

Фиг. 6 демонстрирует рост Clostridium botulinum в средах для культивирования бактерии, которые содержат различные виды пептонов растительного происхождения.

Фиг. 7 демонстрирует контурные диаграммы FFD для минерального скрининга и оптимизации отклика. Фиг. 7а (А) контурная диаграмма для высоких настроек; фиг. 7b (В) контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 7c (С) контурная диаграмма для низких настроек; а фиг. 7d (D) Оптимизация ответа для максимального OD.

Фиг. 8 демонстрирует контурные диаграммы FFD для минерального скрининга и оптимизации ответа. Фиг. 8а контурная диаграмма для высоких настроек; фиг. 8b контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 8c контурная диаграмма для низких настроек; а также фиг. 8d оптимизация ответа для максимальной оптической плотности.

Фиг. 9 демонстрирует контурные диаграммы для скрининга растительного пептона и оптимизации ответа. Фиг. 9а контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 9b контурная диаграмма для низких настроек; и фиг. 9c оптимизация ответа для максимального OD.

Фиг. 10 демонстрирует кривую роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде, и изменение концентрации токсина.

Фиг. 11а демонстрирует график поверхности реакции (А) и оптимизацию ответа, а фиг. 11b (В) скрининг свиного пептона Primatone P37 или протеозопептона Bacto No.3.

Фиг. 12 графически демонстрирует зависящие от времени значения OD, сравнивающие рост Clostridium botulinum в среде, которая используется в настоящее время, в среде, состоящей из пептонов растительного происхождения (APF-среда), и в конечной среде, состоящей из пептонов растительного происхождения и пептонов свиньи (APF + свиной).

Наилучшее воплощение изобретения

В настоящем изобретении композиция среды без животных белков (APF) продемонстрировала повышенную скорость роста Clostridium botulinum по сравнению со средой, используемой в настоящее время (исходная среда), но было принято во внимание дополнительное добавление компонентов, которые дополнительно повышают скорость роста бактерии и не имеют риска инфицирования TSE и т.п. Таким образом, в APF-среду добавляли свиной пептон (например, сертифицированный по TSE свиной пептон), который, как сообщалось, не вызывает инфекцию TSE, и исследовали рост бактерий в APF-среде. В результате APF-среда демонстрировала увеличенную скорость роста бактерии по сравнению со средой, используемой по настоящее время, и средой, включающей только пептоны растительного происхождения. Таким образом, если использовать указанную среду, можно получить высокую концентрацию ботулинического токсина путем культивирования бактерии безопасным образом в условиях без TSE.

Сообщалось, что TSE поражает людей и различных животных, включая коз, овец, норок и оленей, но вспышка TSE у свиней еще не регистрировалась (Jahns H et al., Vet Rec., 159 (5): 137-142, 2006, Kofler M et al ., Schweeiz Arch Tierheild, 148 (7): 341-342, 344-348, 2006). Таким образом, в настоящем изобретении свиной пептон добавляли к композиции среды для культивирования Clostridium botulinum, получая, таким образом, композицию среды, демонстрирующую увеличенную скорость роста бактерии, по сравнению со средой, которая используется в настоящее время, и средой, включающей пептон растительного происхождения в процессе получения биологического агента, такого как ботулинический токсин без риска вызвать прион-опосредованное заболевание, такое как болезнь Крейтцфельдта-Якоба.

При использовании в данном описании, термин «среда, используемая в настоящее время или исходная среда» означает среду, содержащую гидролизат казеина, дрожжевой экстракт и тиогликолевую среду, которые являются компонентами среды животного происхождения. Термин «APF-среда (среда без животного белка)» означает среду, которая содержит неживотный белок, и которая содержит пептоны растительного происхождения, минеральные вещества и глюкозу.

В одном из примеров настоящего изобретения, для того чтобы произвести ботулинический токсин путем культивирования Clostridium botulinum в условиях, свободных от трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), APF-среду, содержащую пептон растительного происхождения, свободный от TSE, готовили и сравнивали со средой, используется в настоящее время (содержащей животный компонент). В результате, можно увидеть, что оптимальная композиция среды для культивирования Clostridium botulinum является композицией, содержащей пептон растительного происхождения, по меньшей мере, одно минеральное вещество, выбранное из группы, состоящей из KH2PO4, K2HPO4 и Na2HPO4, и источник углерода (например, глюкозу), и в этой среде был обнаружен оптимальный рост бактерий. В результате, как показано в таблице 13, было установлено, что оптимальное содержание пептонов растительного происхождения в окончательно подобранной композиции среды для культивирования Clostridium botulinum представляет собой 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton и 5 г/л HyPep™ 4601N, а оптимальные содержание минеральных веществ в композиции среды представляет собой 5,5 г/л К2HPO4 и 3 г/л Na2HPO4.

В другом примере настоящего изобретения, измеряли паттерн роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, и концентрацию токсина. В результате, как показано в таблице 12 и на фиг. 10, значение OD начало расти после 12 часов культивирования Clostridium botulinum, а через 24 часов культивирования, культуральная среда продемонстрировала OD540нм равное 3,5465 и OD600нм равное 3,0695. Затем, значение OD постепенно уменьшалось, а через 48 часов культивирования, культуральная среда продемонстрировала OD540нм равное 0,792 и OD600нм равное 0,7224. Концентрация токсина в надосадочной жидкости культуральной среды Clostridium botulinum начала расти после 5 часов культивирования и показала конечное значение 31,41 мкг/мл. Когда концентрацию токсина измеряли после разрушения бактерии, токсин начал вырабатываться после 5 часов культивирования, и концентрация токсина продолжала расти, поддерживалась на одном уровне после 28 часов культивирования, и показала конечное значение 38,39 мкг/мл.

В другом примере настоящего изобретения был исследован рост Clostridium botulinum в среде, включающей пептоны растительного происхождения и свиные пептоны. В результате, как показано в таблице 14, когда бактерию культивировали в среде, дополнительно включающей свиной пептон, то данная среда показала значение OD выше, чем среда, содержащая только пептон растительного происхождения. В частности, среда, демонстрировавшая наивысшую скорость роста бактерии, которая показала значение OD540нм, равное 4,951, была средой, включающей 10 г/л Primatone P37 и 10 г/л протеозопептона Bacto № 3.

В другом примере настоящего изобретения была исследована модель роста Clostridium botulinum в среде, включающей пептоны растительного происхождения и свиные пептоны. В результате, как показано в таблице 15, через 20 часов культивирования штамма, рост бактерии в среде, включающей пептоны растительного происхождения и свиные пептоны, был активным, и среда продемонстрировала значение OD, которое было в около 11 раз выше, чем в коммерческой среде, и в около 2,2 раза выше, чем в среде, включающей только пептон растительного происхождения. Через 29 часов культивирования бактерии пиковое значение OD для среды, включающей пептоны растительного происхождения и свиные пептоны, было, по меньшей мере, в два раза выше, чем у среды, которая используется в настоящее время, и среды, включающей только пептоны растительного происхождения. Таким образом, можно видеть, что скорость роста бактерии в среде, включающей растительные пептоны и свиные пептоны, была самой высокой среди скоростей роста сред трех типов.

В результате, как показано в таблице 16, было определено, что оптимальное содержание пептонов растительного происхождения в окончательно подобранной композиции среды для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит свиной пептон без трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), составляет 5 г/л Hy-Pea ™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton и 5 г/л HyPep ™ 4601N, а оптимальное содержание минеральное веществ в композиции среды составляет 5,5 г/л К2HPO4 и 3 г/л Na2HPO4, содержание глюкозы составляет 10 г/л, а содержание свиного пептона составляет 13 г/л Primatone P37 и 13 г/л протеозопептона Bacto № 3.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции среды для культивирования Clostridium botulinum, причем композиция среды содержит: по меньшей мере, один пептид растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопка и гидролизата клейковины пшеницы; и свиной пептон.

При использовании в данном описании, термин «пептон растительного происхождения» означает пептон, извлеченный из садового гороха, семян хлопчатника или клейковины пшеницы. Предпочтительно, пептон растительного происхождения может представлять собой коммерчески доступный Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 или HyPep™ 4601N, без ограничения указанным. Термин «свиной пептон» означает компонент, выделенный из свиной ткани. Предпочтительно свиной пептон может представлять собой свиной пептон, содержащий около 54,91-60,69 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее или свиной пептон, содержащий около 38,48-42,53 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее. Более предпочтительно, гидролизат казеина может быть коммерчески доступным Primatone P37 или протеозопептоном Bacto No.3, но не ограничивается ими.

При использовании в данном описании, термин «пептон растительного происхождения» или «гидролизат растительного происхождения» означает продукт, полученный путем деградации белка, выделенного из растения. Например, пептон садового гороха (гидролизат садового гороха) означает продукт, полученный путем деградации общего белка, выделенного из садового гороха. Кроме того, термин «свиной пептон» или «свиной гидролизат» означает продукт, полученный деградацией свиного белка.

Деградация белка растительного происхождения или белка свиной ткани предпочтительно осуществляется частичным гидролизом. Деградацию белка предпочтительно осуществляют путем обработки кислотой, обработки основанием, ферментативной обработкой, обработкой под высоким давлением, термической обработкой или физической обработкой. Более предпочтительно, свиной пептон может быть пептоном, полученным ферментативной обработкой. Физическая обработка представляет собой, например, дробление.

Пептон растительного происхождения или свиной пептон, который используется в настоящем изобретении, представляет собой частичный продукт деградации белка, представляет собой смесь, содержащую не только аминокислоты, которые являются отдельными молекулами, но также и пептиды, состоящие из от нескольких до нескольких десятков аминокислот, и интактные молекулы белка.

В настоящем изобретении содержание пептона растительного происхождения в композиции среды может составлять 0,1-10 масс./об. % (1-100 г/л), предпочтительно 0,2-5 масс./об.% (2-50 г/л), более предпочтительно 0,5-2 масс./об.% (5-20 г/л).

В настоящее изобретении композиция среды содержит весь гидролизат горохового сада, гидролизат семян хлопка и гидролизат пшеничной клейковины, и относительное содержание гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы в композиции среды может составлять 1: 0,24-43,62: 0,01-50,57 по массе, предпочтительно от 1: 0,68-14,46: 0,09-9,87 по массе, более предпочтительно от 1: 1,6-2,4: 0,6-1,4 по массе.

В настоящем изобретении содержание свиного пептона в композиции среды может составлять 0,2-10 масс./об.% (2-100 г/л), предпочтительно 0,4-5 масс./об.% (4-50 г/л), более предпочтительно 1-2 масс./об.% (10-20 г/л).

В настоящем изобретении свиной пептон может представлять собой гидролизат, содержащий около 54,91-60,69 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее и/или гидролизат, содержащий около 38,48-42,53 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее.

В настоящем изобретении, если свиной пептон включает как гидролизат, содержащий около 54,91-60,69 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да, так и гидролизат, содержащий около 38,48-42,53 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее, содержание (по массе) свиного пептона может быть рассчитано с использованием следующего уравнения 1 и отношение содержания гидролизата, содержащего около 54,91-60,69 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее, и гидролизата, содержащего около 38,48-42,53 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее, может предпочтительно составлять 1: 0,8-1,2 по массе.

Уравнение 1

B≥-0,625*A+12,5, B≤-1,019*A+53,

где

А: содержание (0-5,2 масс./об.% (0-52 г/л)) гидролизата, содержащего приблизительно 54,91-60,69 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее;

В: содержание (0-5,3 масс./об.% (0-53 г/л)) гидролизата, содержащего около 38,48-42,53 масс.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее.

В настоящем изобретении композиция среды для культивирования Clostridium botulinum может дополнительно включать источник углерода и, по меньшей мере, одно минеральное вещество, выбранное из группы, состоящей из K2HPO4 (дикалийфосфат), Na2HPO4 (динатрийфосфат) и KH2PO4 (монокалийфосфат).

В данном случае примеры источника углерода включают, без ограничения указанным, моносахариды (например, глюкозу, фруктозу и т.д.), дисахариды (например, мальтозу, сахарозу и т.д.), олигосахариды, полисахариды (например, декстрин, циклодекстрин, крахмал и т.д.), сахарные спирты (например, ксилит, сорбит, эритрит, и т.д.).

В настоящем изобретении содержание минерала в композиции среды может составлять 0,05-3,5 масс./об.% (0,5-35 г/л), предпочтительно 0,1-1,75 масс./об.% (1-17,5 г/л), и более предпочтительно 0,25-0,7 масс./об.% (2,5-7 г/л).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ботулинического токсина, включающему следующие стадии: (а) культивирование Clostridium botulinum, с использованием описанной выше композиции среды для получения ботулинического токсина; и (b) выделение полученного ботулинического токсина.

В настоящем изобретении, культивирование можно проводить в анаэробных условиях, и ботулинический токсин может быть выбран из группы, состоящей из ботулинического токсина типов A, B, C, D, E, F и G.

Примеры

В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Для специалиста, имеющего обычный опыт в данной области техники, будет очевидно, что эти примеры представлены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен приложенной формулой изобретения и ее эквивалентами.

Пример 1. Культивирование Clostridium botulinum в среде с пептоном растительного происхождения

1-1. Композиция среды, используемой в настоящее время при культивировании

Реагенты и компоненты среды, используемые в настоящем изобретении, были приобретены у Sigma (США), Kerry Inc. (США), BD Biosciences (США), Gibco Life Technologies (США) и Quest (США).

Среда, используемая в настоящее время, имеет композицию, включающую 2% гидролизата казеина (20 г/л), 1% дрожжевого экстракта (10 г/л), 1% глюкозы (10 г/л) и 0,5% тиогликолевой среды (5 г/л), использовалась для посевной культуры и основной культуры Clostridium botulinum для выработки ботулинического токсина. 5 г тиогликолевой среды на литр среды, используемой в настоящее время, которая состоит из 2,52 г ферментативного гидролизата казеина, 0,84 г дрожжевого экстракта, 0,925 г декстрозы, 0,085 г тиогликолята натрия, 0,42 г NaCl, 0,085 г L-цистеина, 0,00014 г ресазурина и 0,125 г бактериологического агара.

1-2. Композиция APF-среды, используемой при культивировании

Среду отрицательного контроля получали путем удаления гидролизата казеина, дрожжевого экстракта и тиогликолевой среды из среды, используемой в настоящее время (оригинальная среда), для культивирования Clostridium botulinum, и среду, которая не содержит белки животного происхождения (APF), получали путем добавления четырех кандидатов пептонов растительного происхождения (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 и HyPep™ 4601N) к среде отрицательного контроля (таблица 1).

В таблице 1 показаны компоненты APF-среды, содержащей пептон растительного происхождения для культивирования Clostridium botulinum, в сравнении со средой, которая используется в настоящее время.

Таблица 1

Компоненты среды Концентрация (г/л) Среда, которая
используется в настоящее время
Отрицательный
контроль
APF-среда
глюкоза 10 10 10 10
Хлорид натрия (NaCl) 0,42 0,42 0,42 0,42
Гидролизат казеина 20 20 - -
Экстракт дрожжей 10 10 - -
Тиогликолевая среда 5 5 - -
Hv-Pea™ 7404 20 - - 20
UltraPep™ Cotton 10 - - 10
HyPep™ 7504 10 - - 10
HyPep™ 4601N 10 - - 10

1-3. Посевная культура Clostridium botulinum

20 мкл Clostridium botulinum (Корейские центры по контролю и профилактике заболеваний, Учетный номер: 4-029-CBB-IS-001) высевали в культуральную пробирку, содержащую 10 мл стерильной среды, имеющей каждую из композиций, описанных в примерах 1 -1 и 1-2 и подвергали первичному посевному культивированию (стационарные культуры) при 35°C в течение 22-30 часов в анаэробных условиях. Когда рост бактерий в первичной посевной культуре был подтвержден, 8 мл первичной посевной культуры инокулировали в 1-литровую культуральную бутыль, содержащую 800 мл стерильной среды, имеющей такую же композицию среды, и подвергали второму посевному культивированию (стационарная культура) при 35°C в течение 8-15 часов в анаэробных условиях.

1-4. Основная культура Clostridium botulinum

Для того чтобы получить ботулинический токсин путем культивирования Clostridium botulinum, была получена основная культура бактерий. В частности, 9,3 литра среды, имеющей каждую из композиций, описанных в Примерах 1-1 и 1-2, получали и помещали в 10 литровый инкубатор после стерилизации среды. Подавали азот для создания анаэробных условий и рост бактерий проводили при температуре 35°C и скорости перемешивания 50 оборотов в минуту.

Вторичную посевную культуру в 1-литровой культуральной бутыли в примере 1-3, вносили в 10-литровый инкубатор через инокуляционную линию, подключенную к порту для инокуляции 10-литрового инкубатора. Clostridium botulinum в 10-литровом инкубаторе культивировали в условиях 35°C при 50 оборотах в минуту и набор условий культивирования контролировали и записали. Когда бактерии культивировали в течение 100 часов или более, основную культуру завершали.

Рост Clostridium botulinum в среде без животных белков (AFP), полученной путем добавления четырех пептонов-кандидатов растительного происхождения (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 и HyPep™ 4601N) к среде отрицательного контроля сравнивали с ростом бактерии в среде отрицательного контроля, полученной путем удаления гидролизат казеина, дрожжевого экстракта и тиогликолевой среды из среды, которая используется в настоящее время (исходная среда) (таблица 1).

В результате, как показано в таблице 1 и на фиг. 1, Clostridium botulinum не росли в среде отрицательного контроля, но начали расти в исходной среде (среде, которая используется в настоящее время) в течение 24 часов после инокуляции бактерий и начали расти в среде содержащей пептон растительного происхождения через 30 часов после инокуляции бактерии.

Пример 2. Культура Clostridium botulinum в среде, включающей пептон растительного происхождения, минеральное вещество, аминокислоту и витамин

Поскольку рост Clostridium botulinum в среде, приготовленной путем добавления четырех пептонов растительного происхождения в Примере 1, был медленнее, чем в исходной среде, к ней были добавлены растворы, как указано далее.

1) Для того чтобы изучить эффект функционирования тиогликолята для получения анаэробных условий, тиогликолят удаляли из исходной среды (среды, используемой в настоящее время), и анализировали изменение скорости роста бактерий в среде без тиогликолята.

2) Поскольку замедленная скорость роста может быть результатом отсутствия источника азота, концентрация пептона в среде, используемой для культивирования бактерий, была увеличена в два раза.

3) Рост Clostridium botulinum в среде, полученной добавлением минерального вещества, аминокислоты и витамина в среду, содержащую пептон растительного происхождения, сравнивали с ростом Clostridium botulinum в AFP-среде, раскрытой в патенте США № 8 012 716 (Allergan) (таблица 2).

В таблице 2 показаны компоненты среды для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.

Таблица 2

1 2 3 4 APF
Компоненты среды г/л Среда, которая используется в настоящее время (Кандидат APF-среды) (Кандидат APF-среды) (Кандидат APF-среды) (Кандидат APF-среды) Среда Allergan Company
Глюкоза 10 10 10 10 10 10 15
Хлорид натрия (NaCl) 0,42 0,42 0,42 0,42 0,42 0,42 -
Гидролизат казеина 20 20 20 - - - -
Экстракт дрожжей 10 10 10 - - - 12
Тиогликолевая среда 5 5 - - - - -
Hy-Pea™ 7404 20 - - 20 40 20 -
UltraPep™ Cotton 10 - - 10 20 10 -
HyPep™ 7504 10 - - 10 20 10 -
HyPep™ 4601N 10 - - 10 20 10 -
KH2PO4 7 - - - - 4 -
K2HPO4 5,5 - - - - 5,5
Na2HPO4 5 - - - - 5 -
MgSO4 7H2O 10 - - - - 10 -
Витаминный набор 100X - - - - 1X -
Аминокислотная смесь 50X - - - - 1X -
Соевый пептон 32,5 - - - - - 32,5

В результате, как показано в таблице 2 и на фиг. 2, когда бактерию культивировали в среде, используемой в настоящее время, без тиогликолята, скорость роста бактерий в среде была медленнее, чем в тиогликолят-содержащей среде, что говорит о том, что тиогликолят влияет на скорость роста бактерии. Когда концентрация пептона в среде выросла в два раза, бактерия в среде не росла. В случае, когда минеральные компоненты, аминокислоты и витамины были добавлены к пептон-содержащей среде, скорость роста бактерии была похожа на скорость в среде, которая используется в настоящее время, но после стерилизации среды образовался осадок. Кроме того, было видно, что скорость роста бактерий в APF-среде Allergan’s была похожа на скорость в среде, которая используется в настоящее время.

Пример 3. Получение осадка путем стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоту и витамин

В примере 2 было обнаружено, что скорость роста Clostridium botulinum в среде, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины, из числа кандидатов APF-среды 2-4, представленных в таблице 2, были похожими на среду, используемую в настоящее время. Однако после стерилизации среды имело место образование осадка, и была исследована причина этого (таблица 3).

В таблице 3 показаны компоненты среды для культивирования Clostridium botulinum, которая была использована для стерилизации, включающие пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.

Таблица 3

Компоненты среды г/л Среда, которая используется в настоящее время 1
(Кандидат APF-среды)
2
(Кандидат APF-среды)
3
(Кандидат APF-среды)
4
(Кандидат APF-среды)
Глюкоза 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия (NaCl) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Гидролизат казеина 20 20 - - - -
Экстракт дрожжей 10 10 - - - -
Тиогликолевая среда 5 5 - - - -
Hv-Pea™ 7404 20 - 20 20 20 20
UltraPep™ Cotton 10 - 10 10 10 10
HyPep™ 7504 10 - 10 10 10 10
HyPep™ 4601N 10 - 10 10 10 10
KH2PO4 7 - - 7 - -
K2HPO4 5,5 - 5,5 5,5 - -
Na2HPO4 5 - 5 5 - -
MgSO4 7H2O 10 - 10 10 - -
Витаминный набор
100x
- 1X - 1X 1X (добавление после стерилизации)
Аминокислотная смесь 50 х - 1X - 1X 1X (добавление после стерилизации)

В результате, как показано в таблице 3 и на фиг. 3, осадок после стерилизации среды образовывался только в том случае, когда минеральные вещества были добавлены к среде, содержащей пептон растительного происхождения, что свидетельствует о том, что основной причиной образования осадка являлись минеральные вещества. Это, как предполагается, происходило потому, что минеральные компоненты взаимодействуют друг с другом в условиях высокой температуры и высокого давления во время стерилизации среды.

Пример 4. Образование осадка при стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества

Для того чтобы определить минеральные компоненты, участвующие в формировании осадка, вызванного стерилизацией, подтвержденного в примере 3, добавляли различные комбинации различных компонентов в среды с последующей стерилизацией (таблица 4).

В таблице 4 показаны компоненты сред для культивирования Clostridium botulinum, которые содержат пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, а также результаты стерилизации этих сред.

Таблица 4

Компоненты среды г/л Среда, которая используется в настоящее время 1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
10
(кандидат APF- Среды)
11
(кандидат APF- Среды)
12
(кандидат APF- Среды)
глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия
(NaCl)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Гидролизат казеина 20 20 - - - - - - - - - - - -
Экстракт дрожжей 10 10 - - - - - - - - - - - -
Тиогликолевая среда 5 5 - - - - - - - - - - - -
Hv-Pea™ 7404 20 - 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
UltraPep™ Cotton 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
HyPep™ 7504 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
HyPep™ 4601N 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
KH2PO4 7 - - 7 - 7 7 7 - 7 7 - - 10
K2HPO4 5,5 - - 5,5 5,5 - 5,5 5,5 - - 5,5 5,5 5,5 -
Na2HPO4 5 - - 5 5 5 - 5 5 - - 5 - 5
MgSO4 7H2O 10 - - 10 10 10 10 - 10 10 - - 10 -
осадок, агрегация x 0 0 0 0 x 0 x x x 0 x

В результате, как показано в таблице 4 и на фиг. 4, среди сред, содержащих пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, среда, содержащая MgSO4 7H2O и K2HPO4 и среда, содержащая MgSO4 7H2O и Na2HPO4, образовали осадок после стерилизации.

Пример 5. Культивирование Clostridium botulinum в условиях, в которых не образуется осадок в APF-среде

Эксперимент был проведен для того, чтобы определить, возможно ли культивирование Clostridium botulinum, когда в APF-среду Примера 4, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, дополнительно добавлены витамины и аминокислоты. Кроме того, был проведен эксперимент для исследования возможности культивировании бактерии в среде, которая не содержит пептон растительного происхождения и минеральные вещества и содержит витамины, аминокислоты и/или «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» (каталожный № 670002, BD Bioscience) (компонент среды на основе дрожжевого экстракта без глюкозы и L-глутамина) (таблица 5).

В таблице 5 показаны компоненты сред, полученных путем дополнительного добавления витаминов, аминокислот и «BD Recharge™ без глюкозы и L-глутамин» к среде для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, и темпы роста бактерии в средах.

Таблица 5

Компоненты среды г/л Среда, которая используется
в настоящее время
1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
10
(кандидат APF- Среды)
11
(кандидат APF- Среды)
12
(кандидат APF- Среды)
глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия
(NaCl)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Гидролизат Казеина 20 20 - - - - - - - - - - - -
Экстракт дрожжей 10 10 - - - - - - - - - - - -
Тиогликолевая среда 5 5 - - - - - - - - - - - -
Тиогликолят натрия 1 - - - - - - - - - 1 - - -
Hy-Pea™ 7404 20 - 20 20 20 20 20 20 20 20 2d 20 - -
UltraPep™ Cotton 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 - -
HyPep™ 7504 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 - -
НуPep™ 460IN 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 - -
KH2PO4 7 - - 7 7 7 - 7 - - - - - -
K2HPO4 5,5 - - 5,5 - 5,5 5,5 - - - - - - -
Na2HPO4 5 - - 5 - - - 5 - - - - - -
MgSO4 7H2O 10 - - - 10 - - - - - - - - -
Витаминный набор, 100X - - 1X 1X 1X 1X 1X 1X - - 1X - 1X
Аминокислотная смесь, 50X - - 1X 1X 1X 1X 1X 1X - - 1X - 1X
Без глюкозы и L-глютамина 45,42 - - - - - - - - 45,42 - 45,42 45,42 45,42
Рост X 0 X 0 0 0 X X X X Х 0
Подробности Рост в тече-ние 24 ч Рост в тече-ние 24 ч Рост в течение 24 ч Рост в течение 24 ч Рост в тече-ние 24 ч

В результате, как показано в таблице 5 и на фиг. 5, только в том случае, когда среда содержала пептоны растительного происхождения и комбинацию двух или более минералов KH2PO4, K2HPO4 и Na2HPO4 и дополнительно содержала витамин и аминокислоту, Clostridium botulinum росли в пределах 24 часов после инокуляции бактерий. Кроме того, в случае, когда среда не содержала пептона растительного происхождения и содержала минеральные вещества и витамины, аминокислоты и «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine», бактерия росла в пределах 48 часов после инокуляции бактерии. В заключение необходимо отметить, что наиболее подходящая композиция среды для культивирования Clostridium botulinum включает пептоны растительного происхождения, KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, аминокислоты и витамины.

Пример 6. Культивирование Clostridium botulinum в среде, содержащей различные пептоны растительного происхождения

Эксперимент проводили с целью изучения возможности культивирования Clostridium botulinum при добавлении различных комбинаций пептонов растительного происхождения к APF-среде примера 5.

В таблице 6 показаны компоненты сред для культивирования Clostridium botulinum, которые содержат различные пептоны растительные происхождения, и результаты изучения роста бактерии в средах.

Таблица 6

Компоненты среды г/л Среда, которая используется в настоящее время 1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
10
(кандидат APF- Среды)
11
(кандидат APF- Среды)
12
(кандидат APF- Среды)
13
(кандидат APF- Среды)
Глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия (NaCl) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Гидролизат казеина 20 20 - - - - - - - - - - - - -
Дрожжевой экстракт 10 10 - - - - - - - - - - - - -
Тиогликолевая среда 5 5 - - - - - - - - - - - - -
Тиогликолят натрия 0,1 - - - - - - - - - - - - 0,1 -
Hy-Pea™ 7404 10 - 10 10 - - - - - - 10 10 10 - -
UltraPep™ Cotton 10 - 10 - 10 - - - 10 10 - - 10 - -
Ну Pep™ 7504 10 - 10 - - 10 - 10 - 10 - 10 - - -
HyPep™ 4601N 10 - 10 - - - 10 10 10 - 10 - - - -
KH2PO4 - 7 - 7 7 7 7 7 7 7 7 7 - 7
K2HPO4 5,5 - 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 - 5,5
Na2HPO4 5 - 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 - 5
MgSO4 7H2O 10 - - - - - - - - - - - - - -
Витаминный набор 100X - - 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X
Аминокислотная смесь 50 X - - 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X
Без глюкозы и L-глютамина 45,42 - - - - - - - - - - - - 45,42 45,42
Рост 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x x

В результате, как показано в таблице 6 и на фиг. 6, даже тогда, когда только или два из четырех пептонов растительного происхождения были добавлены к среде, культивирование Clostridium botulinum было возможно.

Принимая в расчет результаты примеров 5 и 6, можно увидеть, что, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения должен содержаться в среде и что пептон растительного происхождения не может быть замещен «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» (кат. № 670002, BD Bioscience) (компонент среды на основе дрожжевого экстракта без глюкозы и L-глутамина).

Пример 7. Эксперимент по отбору двух из трех минеральных веществ, содержащихся в среде

В примерах с 1 по 7, было установлено, что композиция APF-среды, используемой для культивирования Clostridium botulinum, включает глюкозу, хлорид натрия (NaCl), четыре пептона растительного происхождения, три минеральных вещества, аминокислоты и витамины. Из числа этих компонентов среды, компоненты среды, не оказывающие существенного влияния на рост бактерии, были удалены для того, чтобы уменьшить количество компонентов среды. Таким образом, был сделан вывод, что аминокислоты и витамины не оказывают существенного влияния на рост Clostridium botulinum, и согласно этому суждению, аминокислоты и витамины были удалены из компонентов среды. Кроме того, для того чтобы выбрать два из трех минеральных веществ, бактерию культивировали с использованием композиций среды, приведенной в таблице 7, и значения OD (540 нм и 600 нм) через 24 и 48 часов после инокуляции бактерии измеряли и сравнивали.

В таблице 7 представлены композиции сред, полученные в результате отбора минеральных веществ первой стадии, и рост Clostridium botulinum в этих средах.

Таблица 7

Компоненты среды г/л Среда, которая используется в настоящее время 1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
10
(кандидат APF- Среды)
11
(кандидат APF- Среды)
глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия
(NaCl)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Гидролизат казеина 20 20 - - - - - - - - - - -
Экстракт дрожжей 10 10 - - - - - - - - - - -
Тиогликолевая кислота 5 5 - - - - - - - - - - -
Hv-Pep™ 7404 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
UltraPep™ Cotton 10 _ 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
HyPep™ 7504 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Ну Pep™ 460 IN 10 - 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
KH2PO4 7 - - 7 - 7 - 7 - 7 3,5 3,5 3,5
K2HPO4 5,5 - - - 5,5 5,5 - - 5,5 5,5 2,75 2,75 2,75
Na2HPO4 5 - - - - - - - 5 5 2,5 2,5 2,5
OD 24 ч
культуры
540 нм 0,942 -0,017 -0,024 4,396 3,226 4,218 3,214 4,964 3,991 3,951 3,938 3,594
600 нм 0,780 -0,016 -0,020 3,832 2,691 3,593 2,680 4,304 3,351 3,341 3,335 3,036
OD 48 ч
культуры
540 нм 2,459 -0,014 -0,019 4,716 5,220 3,502 5,460 2,056 2,603 5,726 5,682 5,434
600 нм 2,057 -0,015 -0,018 3,852 4,288 2,989 4,480 1,587 2,020 4,688 4,647 4,459

В результате, как показано в таблице 7, через 24 часа инокуляции бактерии, среда, которая используется в настоящее время, продемонстрировала значение OD (540 нм) 0,942, а APF-среда, содержащая K2HPO4 и Na2HPO4, показала самое высокое значение OD (540 нм), равное 4,964, среди AFP-сред. Кроме того, через 48 часов после инокуляции бактерий, APF-среда, содержащая KH2PO4 и Na2HPO4 показала самое высокое значение OD и активный бактериальный рост.

Тем временем, как показано на фиг. 7, были созданы контурные диаграммы K2HPO4 и Na2HPO4, имеющие высокие основные эффекты. В результате, поскольку концентрации K2HPO4 и Na2HPO4 увеличились, увеличилось и значение OD. И Clostridium botulinum показали самый высокий рост, когда к среде были добавлены минеральные вещества в концентрации КН2РО4 = 0 г/л, K2HPO4 = 5,5 г/л, и Na2HPO4 = 5 г/л.

Тем временем, для того чтобы подтвердить результаты бактериальной культуры в соответствии с более точным добавлением минералов, провели вторую стадию эксперимента с использованием методологии поверхности отклика. Так как композиция среды не может иметь отрицательное значение, был запланирован эксперимент с использованием центрального композиционного плана (CCF, central composite faced) и было проведено культивирование бактерии в композициях среды, показанных в таблице 8. Затем, экспериментальные результаты были объединены с результатами ранее выполненного FFD и подвергнуты статистическому анализу.

В таблице 8 представлены композиции сред, полученные в результате отбора минеральных веществ второй стадии, и рост Clostridium botulinum в этих средах.

Таблица 8

Компоненты среды г/л 1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
Среда, которая используется в настоящее время
Глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия (NaCl) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
Гидролизат казеина 20 - - - - - - - - - 20
Экстракт дрожжей 10 - - - - - - - - - 10
Тиогликолевая среда 5 - - - - - - - - - 5
Hy-Pea™ 7404 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 -
UltraPep™ Cotton 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 -
Ну Pep™ 7504 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 -
Ну Pep™ 4601N 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 -
KH2PO4 7 - 7 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 -
К2НРО4 5,5 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 -
Na2HPO4 5 2,5 2,5 2,5 2,5 - 5 2,5 2,5 2,5 -
OD 24 ч 540 нм 4,408 3,587 2,233 4,639 1,778 4,332 3,904 3,907 4,046 1,556
600 нм 3,836 3,086 1,896 4,068 1,503 3,777 3,366 3,368 3,505 1,307
OD 48 ч 540 нм 5,021 5,760 4,359 3,594 4,529 4,054 6,492 5,621 5,473 3,622
600 нм 4,284 4,925 3,695 3,049 3,832 3,457 5,603 4,830 4,677 3,062

Контурные диаграммы были составлены и использованы для сравнения. Как показано на фиг. 8, значение OD увеличивается по мере уменьшения концентрации КН2РО4. При сравнении оптимальных условий, результаты отличались от результатов FFD из-за эффекта кривизны, а величина K2HPO4 была такой же, но величина Na2HPO4 изменяется от 5 г/л до 3,1313 г/л. Таким образом, путем статистического анализа было подтверждено, что оптимальные минеральные условия среды представляют собой 5,5 г/л К2HPO4 и 3 г/л Na2HPO4.

Пример 8. Эксперимент по отбору пептонов растительного происхождения, содержащихся в среде

Как показано в таблицах 9 и 10, пептоны растительного происхождения были объединены в соответствии с дизайном смеси, и был исследован рост Clostridium botulinum в среде, содержащей комбинацию пептонов растительного происхождения.

В таблице 9 представлены композиции сред, полученных отбором первой стадии из пептонов растительного происхождения и рост Clostridium botulinum с использованием данных сред.

Таблица 9

Компоненты среды г/л 1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
10
(кандидат APF- Среды)
11
(кандидат APF- Среды)
Среда, которая используется в настоящее время
Глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия
(NaCl)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
Гидролизат казеина 20 - - - - - - - - - - - 20
Экстракт дрожжей 10 - - - - - - - - - - - 10
Тиогликолевая среда 5 - - - - - - - - - - - 5
Hy-Pea™ 7404 10 5 10 5 5 - - 6,667 6,667 - - 10 -
UltraPep™ Cotton 10 5 - 5 5 10 - 6,667 6,667 20 - 10 -
HyPep™ 7504 10 5 10 5 5 - 10 - 6 667 - 20 10 -
HyPep™ 4601N 10 5 - 5 5 10 10 6,667 - - - 10 -
K2HPO4 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 -
NA2HPO4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 -
OD 24 ч 540 нм 3,541 2,440 3,345 3,305 3,317 2,852 3,695 2,772 2,353 1,688 4,842 2,239
600 нм 3,058 2,066 2,868 2,831 2,853 2,445 3,183 2,376 2,014 1,419 4,245 1,893
OD 48 ч 540 нм 0,811 0,935 0,731 0,799 1,400 0,777 1,660 1,090 1,810 1,402 2,093 3,341
600 нм 0,714 0,795 0,647 0,694 1,199 0,680 1,403 0,929 1,548 1,210 1,764 2,812

В таблице 10 представлены композиции сред, полученные отбором второй стадии из пептонов растительного происхождения и рост Clostridium botulinum с использованием данных сред.

Таблица 10

Компоненты среды г/л 1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
10
(кандидат APF- Среды)
11
(кандидат APF- Среды)
12
(кандидат APF- Среды)
13
(кандидат APF- Среды)
Среда, которая используется в настоящее время
глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия
(NaCl)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
Гидролизат казеина 20 - - - - - - - - - - - - - 20
Экстракт дрожжей 10 - - - - - - - - - - - - - 10
Тиогликолевая среда 5 - - - - - - - - - - - - - 5
Hy-Pea™ 7404 10 5 5 10 10 5 20 6,667 10 10 10 -
UltraPep™ Cotton 10 5 5 10 6,667 10 - 5 - - - 10 10 10 -
HyPep™ 7504 10 5 5 10 6,667 - - 5 - - 6,667 10 10 10 -
Ну Pep™ 4601N 10 5 5 - 6,667 - 10 5 - 20 6,667 10 10 10 -
K2HPO4 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 -
Na2HPO4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 -
OD 24 ч 540 нм 3,425 3,640 2,349 2,581 3,272 1,289 3,514 0,776 1,257 3,457 5,376 5,235 4,809 2,208
600 нм 2,969 3,159 2,029 2,244 1,096 1,096 3,032 0,649 1,098 2,950 4,689 4,534 4,246 1,863
OD 48 ч 540 нм 0,769 0,836 1,633 0,961 1,501 1,148 0,803 0,880 1,278 0,962 1,986 1,994 2,010 3,185
600 нм 0,675 0,732 1,420 0,854 1,270 0,982 0,698 0,744 1,124 0,818 1,708 1,710 1,717 2,708

В результате, как показано на фиг. 9, были получены контурные диаграммы, которые использовались для анализа. Было установлено, что HyPep™ 7504, соответствующий компоненту С, оказывает самое слабое влияние на рост Clostridium botulinum. Исходя из этого определения, HyPep™ 7504 был исключен из компонентов среды. В заключение, было установлено, что композиция окончательно подобранных пептонов растительного происхождения, которые содержатся в среде, включает 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton и 5 г/л HyPep™ 4601N.

Пример 9. Культивирование Clostridium botulinum в среде, содержащей или не содержащей NaCl

Композиции сред, используемых в примерах 1-8, содержат небольшое количество (0,5 г/л) NaCl. Для того чтобы исследовать рост Clostridium botulinum в соответствии с изменением концентрации NaCl, содержание NaCl в среде доводили до диапазона от 0 до 1 г/л, с последующим культивированием бактерии в среде.

В таблице 11 показаны компоненты NaCl-содержащей среды для культивирования Clostridium botulinum и рост Clostridium botulinum в средах.

Таблица 11

Компоненты среды г/л 1
(кандидат APF- Среды)
2
(кандидат APF- Среды)
3
(кандидат APF- Среды)
4
(кандидат APF- Среды)
5
(кандидат APF- Среды)
6
(кандидат APF- Среды)
7
(кандидат APF- Среды)
8
(кандидат APF- Среды)
9
(кандидат APF- Среды)
Глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Хлорид натрия
(NaCl)
0,5 - - - 0,5 0,5 0,5 1 1 1
Hy-Pea™ 7404 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
UltraPep™ Cotton 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
HyPep™ 4601N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
K2HPO4 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5
Na2HPO4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
OD 24 ч 540 нм 2,166 2,154 2,151 2,148 2,115 2,120 2,145 2,147 2,140
600 нм 1,940 1,923 1,922 1,922 1,892 1,896 1,919 1,922 1,917

В результате, как показано на фиг. 11а и 11b, не было никакой разницы в росте бактерий, из-за наличия или отсутствия в среде NaCl. Таким образом, NaCl, был исключен из конечных компонентов APF-среды.

Пример 10. Измерение паттерна роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде и концентрации токсина

Clostridium botulinum высевали в окончательно подобранную среду для культивирования Clostridium botulinum (10 г/л глюкозы, 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton, 5 г/л HyPep™ 4601N, 5,5 г/л К2HPO4, и 3 г/л Na2HPO4), определенной на основании результатов примеров 1-9, а затем измеряли паттерн роста бактерий и концентрацию токсина.

Таблица 12 показывает времязависимое значение OD и концентрации токсина Clostridium botulinum, выращенной в окончательно подобранной AFP-среде.

Таблица 12

Время Культивирования (час) OD Концентрация токсина в надосадочной жидкости (мкг/мл) Общая концентрация токсина после разрыва штамма (мкг/мл)
540 нм 600 нм
0 0 0 0 0
6 0,0953 0,0393 0,00 0,00
9 0,0648 0,0525 0,00 0,00
12 0,5003 0,4411 0,00 0,00
14 1,1328 0,9958 2,18 2,04
16 1,6252 1,4484 4,64 10,22
18 2,3435 2,0215 6,77 18,15
20 2,777 2,4015 8,47 29,26
22 3,3485 2,896 9,46 31,86
24 3,5465 3,0695 - 31,73
28 3,452 2,982 - 37,31
36 2,5955 2,242 21,20 38,00
48 0,792 0,7224 31,41 38,39

В результате, как показано в таблице 12 и на фиг. 10, значение OD начало расти через 12 часов культивирования Clostridium botulinum, а через 24 часа культивирования культуральная среда показала OD540нм 3,5465 и OD600нм 3,0695. Затем, значение OD постепенно уменьшалось, а через 48 часов культивирования, культуральная среда показала OD540нм 0,792 и OD600нм 0,7224. Концентрация токсина в надосадочной жидкости Clostridium botulinum начала расти после 14 часов культивирования и показала конечное значение 31,41 мкг/мл. Когда концентрацию токсина измеряли после разрушения бактерии, токсин начал продуцироваться после 5 часов культивирования, и концентрация токсина продолжала расти, поддерживалась на одном уровне через 28 часов культивирования, и показала конечное значение 38,39 мкг/мл.

В заключении следует отметить, что, окончательно подобранная APF-композиция (среда без животных белков) была определена на основании результатов примеров 1-10, резюмированных в таблице 13.

Таблица 13

Компоненты среды г/л
Источник углерода глюкоза 10
Источник азота (растительный пептон) Hy-Pea™ 7404 5
UltraPep™ Cotton 10
HyPep™ 4601N 5
Минерал K2HPO4 5,5
Na2HPO4 3

Пример 11. Рост Clostridium botulinum в среде, включающей растительный пептон и свиной пептон

Хотя состав APF-среды, определенный на основании результатов примеров 1-10, показал увеличенную скорость роста бактерий по сравнению со средой, используемой по настоящее время, но было взято в расчет добавление компонента среды, который дополнительно увеличивает скорость роста бактерий, но без риска инфекции TSE или подобного. В результате к APF-среде добавляли свиной пептон, о котором не было сообщений как о вызывающем инфекцию TSE и исследовали рост бактерии в среде.

Один или два свиных пептона без TSE добавляли в APF-среду, определенную на основании результатов примеров 1-10. В частности, Clostridium botulinum культивировали в среде, включающей пептон растительного происхождения и свиной пептон Primatone P37 и/или протеозопептон Bacto No.3 в течение 24 часов и 48 часов, и рост бактерии исследовали путем измерения OD (540 нм, 600 нм) в ходе культивирования (таблица 14). Кроме того, результаты измерения подвергались статистическому анализу с использованием статистической программы, таким образом, выбирался состав среды, показывающий самый высокий рост в течение 24 часов культивирования бактерии.

В таблице 14 показаны компоненты среды для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит растительные пептоны, минеральное вещество и свиные пептоны.

Таблица 14

матрас № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Компоненты среды
Глюкоза 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Гидролизат казеина 10 - - - - - - - - - - - 10
Дрожжевой экстракт 10 - - - - - - - - - 10
Тоигликолевая среда 5 - - - - - - - - - - - - 5
Hy-Pea™ 7404 5 5 5 5 5 5 5 5 -
UtraPep™ Cotton 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 -
HyPep™ 4601N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 -
K2HPO4 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 _
Na2HPO4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 -
Primatone P37 10 10 10 10 - 10 - - 10 10 10 10 10 10 -
Протеозо-пептон
Васto
№3
10 10 10 :o - - 10 10 10 - 10 10 10 10 -
OD 24 ч 540 нм 4,951 4,6:3 4,683 4,380 3,469 4,549 4,552 4,426 4,937 4,396 4,934 4,835 4,775 4,699 1,206
600 нм 4,436 4,1:9 4,175 3,972 3,011 4,083 4,022 3,934 4,396 3,888 4,394 4,319 4,255 4,207 1,011
OD 48 ч 540 нм 1,341 1,395 1,379 2,600 1,206 1,811 1,787 1,977 2,072 1,912 2,312 1,306 1,627 1,546 2,814
600 нм 1,246 1,317 1,328 2,266 1,042 1,562 1,558 1,697 l,798 1,643 2,023 1,282 1,545 1,496 2,373

В результате, как показано в таблице 14, когда бактерию культивировали в среде, дополнительно включающей свиные пептоны, среда показала значение OD выше, чем у среды, включающей только пептоны растительного происхождения. В частности, среда, показывающей максимальную скорость роста бактерии, которая продемонстрировала значение OD 540 нм, равное 4,951, представляла собой среду, содержащую 10 г/л Primatone P37 и 10 г/л протеозопептона Bacto.

Между тем для того, чтобы определить условия, в которых рост бактерии может быть максимизирован, эксперимент был расширен до метода поверхности отклика, и результаты метода поверхности отклика были подвергнуты статистическому анализу с использованием статистической программы. Кроме того, как показано на фиг. 11(А) был составлен контурный график отклика, и в результате в экспериментальном диапазоне были найдены условия, при которых рост бактерии может быть максимизирован. Кроме того, были рассчитаны условия, при которых рост бактерии может быть максимизирован. В результате, как показано на фиг. 11 (В) среда, содержащая 13,131 г/л Primatone Р37 и 12,727 г/л протеозопептона Bacto №3, показала значение OD540нм, равное 4,887, что соответствует самой высокой скорости роста бактерии. Для удобства композиции среды в последующих экспериментах использовали каждый из дополнительных компонентов среды в количестве 13 г/л.

Пример 12. Паттерн роста Clostridium botulinum в среде, включающей пептон растительного происхождения и свиной пептон

С помощью композиции среды, включающей пептоны растительного происхождения и свиные пептоны, определенной в примерах 1-11, культивировали Clostridium botulinum и исследовали модель роста бактерии в среде (см. таблицу 15).

В таблице 15 показаны зависящие от времени значения OD, сравнивающие рост Clostridium botulinum в среде, используемой в настоящее время, включающей растительный пептон (APF-среда), и конечной среде, включающей пептон растительного происхождения и свиной пептон (APF + свиной пептон).

Таблица 15

Среда, используемая в настоящее время APF-среда APF + свиной пептон
Время культивирования (ч) OD540нм OD600нм OD540нм OD600нм OD540нм OD600нм
0 0 0 0 0 0 0
9 0,0009 0,0014 0,1101 0,0964 0,2563 0,2319
12 0,0161 0,0132 0,5537 0,4880 1,3588 1,1892
15 0,1163 0,0975 1,4508 1,2508 3,5608 3,1432
18 0,3448 0,2911 2,0240 1,7572 5,2240 4,4720
20 0,5255 0,4468 2,8140 2 4210 6,1450 5,2850
22 1,5292 1,3104 2,9500 2,5345 6,0950 5,2040
24 2,0528 1,8084 3,1365 2,6970 - -
29 2,8350 2,4090 2,9415 2,5290 6,9880 6,0920
33 3,0535 2,6030 2,9130 2,5090 3,0902 2,6510
36 3,1755 2,7115 2,3710 2,0255 2,9205 2,5445
41 3,2015 2,7270 1,4830 1,2855 2,5010 2,1710
45 3,0450 2,5875 1,3145 1,1305 2,0910 1,8200
60 2,6696 2,2732 0,6276 0,5800 0,9991 0,9990

В результате, как показано в таблице 15 и фиг. 12, через 20 часов культивирования рост бактерии был активен в среде, включающей пептоны растительного происхождения и свиные пептоны, и среда показала значение OD, которое было в около 11 раз выше, чем в среде, которая используется в настоящее время и в около 2,2 раза выше, чем в среде, включающей только пептоны растительного происхождения. Через 29 часов культивирования бактерии пиковое значение OD среды, включающей пептоны растительного происхождения и свиные пептоны, было, по меньшей мере, в два раза выше, чем у среды, которая используется в настоящее время, и среды, включающей только пептоны растительного происхождения. Таким образом, можно видеть, что скорость роста бактерии в среде, включающей растительные пептоны и свиные пептоны, была самой высокой среди сред трех видов.

В заключение, в таблице 16 на основании результатов примеров 11 и 12, показана окончательно подобранная композиция, содержащая свиные пептоны в дополнение к среде, не включающей животные белки (APF).

Таблица 16

Композиция среды Компоненты среды г/л
Источник углерода Глюкоза 10
Источник азота (Растительный пептон) Hy-Pea™ 7404 5
UltraPep™ Cotton 10
HyPep™ 4601N 5
Минеральное вещество k2hpo4 5,5
Na2HP04 3
Источник азота Prima tone P37 13
(свиной пептон) протеозопептон Bacto No.3 13

Промышленная применимость

Как описано выше, когда среду согласно настоящему изобретению, которая содержит пептон растительного происхождения, свиные пептоны и минеральное вещество, используют для культивирования Clostridium botulinum, скорость роста бактерии в среде выше, чем в среде, используемой в настоящее время, и среде, содержащей только пептон растительного происхождения. Кроме того, при использовании среды по настоящему изобретению, можно получить высокую концентрацию ботулинического токсина путем культивирования бактерии безопасным образом.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на специфические признаки, специалистам в данной области техники будет очевидно, что это описание предназначено только для описания предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

1. Композиция среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащая 0,1-10 мас./об.% по меньшей мере одного пептона растительного происхождения, выбранного из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата пшеничного глютена, источника углерода, 0,05-3,5 мас./об.% по меньшей мере одного минерального вещества, выбранного из группы, включающей K2HPO4 (дикалийфосфат), Na2HPO4 (динатрийфосфат) и KH2PO4 (монокалийфосфат), и 0,2-10 мас./об.% свиного пептона.

2. Композиция среды по п. 1, отличающаяся тем, что содержание гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопка и гидролизата клейковины пшеницы в композиции среды имеет соотношение 1:0,24-43,62:0,01-50,57 по массе при условии, что композиция среды содержит гидролизат садового гороха, гидролизат семян хлопка и гидролизат клейковины пшеницы.

3. Композиция среды по п. 1, отличающаяся тем, что свиной пептон представляет собой гидролизат, содержащий около 54,91-60,69 мас.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее, и/или гидролизат, содержащий около 38,48-42,53 мас.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее.

4. Композиция среды по п. 3, отличающаяся тем, что содержание свиного пептона рассчитывают по массе с использованием следующего уравнения 1 при условии, что свиной пептон включает как гидролизат, содержащий около 54,91-60,69 мас.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее, так и гидролизат, содержащий около 38,48-42,53 мас.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее:

Уравнение 1

B≥-0,625*A+12,5, B≤-1,019*A+53,

где

А: содержание (0-5,2 мас./об.%) гидролизата, включающее около 54,91-60,69 мас.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее,

В: содержание (0-5,3 мас./об.%) гидролизата, включающее около 38,48-42,53 мас.% пептидов с молекулярной массой 500 Да или менее.

5. Композиция среды по п. 1, отличающаяся тем, что пептоны растительного происхождения или свиные пептоны подвергают ферментной обработке.

6. Способ получения ботулинического токсина, включающий стадии:

(а) культивирования Clostridium botulinum с использованием композиции среды по любому из пп. 1-6 для выработки ботулинического токсина и

(b) выделения полученного ботулинического токсина.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что культивирование осуществляется в анаэробных условиях.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ботулинический токсин выбран из группы, состоящей из серотипов ботулинического токсина A, B, C, D, E, F и G.



 

Похожие патенты:

Изобретения относятся к области биотехнологии, в частности к средствам для поддержания или стимуляции, косметическому продукту, фармацевтическому продукту, лечебно-профилактическому препарату, продукту питания и напитку недифференцированного состояния эмбриональных стволовых клеток или соматических стволовых клеток, средству для лечения раны и способу выращивания эмбриональных стволовых клеток, исключая эмбриональные стволовые клетки человека, или соматических стволовых клеток при поддержании недифференцированного состояния.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способу выделения мезенхимальных стволовых клеток шейки матки, не являющихся опухолевыми, которые экспрессируют клеточные маркеры CD29, CD44, CD73, CD105 и CD90 и не экспрессируют клеточные маркеры CD117, CD133, HLA-DR, TRA-81, CD45, CD34 и CD31, применению выделенной ткани шейки матки и способу получения кондиционированной среды.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения стволовых клеток (СК) из зуба. Способ включает заполнение внутренней полости отделенного зуба через апикальную часть его корневого канала 0,1-0,4% раствором коллагеназы и выдерживание в диапазоне от примерно 25°С до примерно 39°С в течение 20-120 минут.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу выделения клеток внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула (NBDS), и может быть использовано в медицине.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способам использования композиции сред клеточной культуры для выращивания клеток и/или белкового производства.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкогинекологии и репродуктивной медицине, и предназначено для сохранения репродуктивной функции женщин с онкологическими заболеваниями, желающих в дальнейшем иметь детей.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения злокачественных опухолей. Способы по изобретению включают получение и введение внутрь опухоли незрелых дендритных клеток, после этого введение внутрь опухоли цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток и антитела против TNF и/или антитела против IL-10.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ оценки антимикобактериального действия противотуберкулезных препаратов с использованием биологического материала пациентов, больных туберкулезом легких, включающий забор биологического материала, культивирование в питательной среде, ее замену на свежую питательную среду в контрольной культуре и на такую же питательную среду в опытной культуре, дополнительно содержащую противотуберкулезный препарат, сопоставление роста микобактерий туберкулеза в контрольной и опытной культурах, где в качестве биологического материала используют образцы ткани легкого из операционного материала; получают из него ex vivo культуру альвеолярных макрофагов; культивируют ее в течение 1 суток в питательной среде; заменяют питательную среду на свежую в контрольной культуре клеток и на такую же среду с добавлением противотуберкулезного препарата в опытных культурах клеток, различающихся концентрациями одного и того же противотуберкулезного препарата; продолжают культивирование в течение трех дней; фиксируют клетки на покровных стеклах; окрашивают по методу Циля-Нильсена; проводят цитологический анализ на наличие признаков цитотоксического воздействия противотуберкулезного препарата на альвеолярные макрофаги; определяют доли альвеолярных макрофагов, содержащих микобактерии туберкулеза, от общего числа альвеолярных макрофагов в контрольной и опытной культурах клеток; при отсутствии признаков цитотоксического воздействия противотуберкулезного препарата на альвеолярные макрофаги в опытной культуре, отсутствии микобактерий в альвеолярных макрофагах или снижении доли альвеолярных макрофагов, содержащих микобактерии туберкулеза, в 2 и более раз в опытной культуре относительно контрольной делают положительное заключение об антимикобактериальном действии противотуберкулезного препарата и его минимальной концентрации, достаточной для достижения антимикобактериального эффекта, и при проведении цитологического анализа на наличие признаков цитотоксического воздействия противотуберкулезного препарата на альвеолярные макрофаги учитывают наличие ядра с признаками конденсации хроматина, и/или отсутствие целостности плазматической мембраны, и/или образование апоптозных телец, и/или разрушение клеток до отдельных участков цитоплазмы, и/или появление клеток без ядер; при наличии по меньшей мере одного из них делают заключение о наличии признаков цитотоксического воздействия.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу выделения хондроцитов. Способ выделения хондроцитов включает забор материала, срезание хрящевой ткани с кости, нарезание хрящевой ткани на фрагменты, далее полученные фрагменты хрящевой ткани помещают в фильтрующее устройство, инкубируют в растворе трипсина, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, супернатант отбрасывают, а образовавшийся осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор первой фракции хондроцитов, затем нелизированные фрагменты хрящевой ткани, находящиеся в фильтрующем устройстве, инкубируют в растворе коллагеназы II типа, полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор второй фракции хондроцитов, затем первую и вторую фракцию хондроцитов объединяют, далее нелизированные фрагменты хрящевой ткани удаляют из фильтрующего устройства и инкубируют в культуральной среде DMEM/F12, содержащей FBS, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, затем вышеописанную культуральную среду отбрасывают и добавляют раствор коллагеназы II типа, полученный после осаждения хондроцитов центрифугированием на втором этапе, инкубируют, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, образовавшийся супернатант, содержащий коллагеназу II типа, отбрасывают, а полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор третьей фракции хондроцитов и соединяют ее с первой и второй фракциями хондроцитов, затем полученную суспензию хондроцитов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 содержащей FBS, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, получая первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточной нейротрансплантологии, и может быть использовано в медицине для лечения травм спинного мозга.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к применению Lys-C и способу протеолитического процессинга одноцепочечного ботулинического нейротоксина серотипа А (BoNT/A) для образования активного двухцепочечного ботулинического нейротоксина серотипа А (BoNT/A).

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum с содержанием одноцепочечной формы менее 2,00% по весу для лечения, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез заболевания или состояния, способ получения вышеуказанного высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина и фармацевтическая композиция для лечения, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез заболевания или состояния.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к одноцепочечному слитому белку для ингибирования клеточной секреции клетки-мишени, нуклеиновой кислоте, вектору экспрессии, способу получения слитого белка и трехцепочечного нецитотоксического белка при действии протеазы на слитый белок, а также применениям белков согласно изобретению для лечения патофизиологических состояний, связанных с клеточной гиперсекрецией.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено применение полипептида, соответствующего SEQ ID NO 1, в качестве компонента системы для экспонирования слитых белков на поверхности клеток молочнокислых бактерий.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к выделенному полипептиду, вызывающему образование нейтрализующих антител к токсинам Clostridium difficile.

Настоящее изобретение относится к медицине. Предложен способ получения ботулотоксина.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Экспрессируемый альфа-токсин и кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты представляют собой делеционный мутеин, который по сравнению со зрелым альфа-токсином штамма 13 Clostridium perfringens лишен, по меньшей мере, девяти последовательных аминокислотных остатков, включая His68, но сохраняет при этом значительную антигенность токсина и может быть использован в качестве вакцины против Clostridium perfringens.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению иммуногенных мутантных токсинов Clostridium difficile, и может быть использовано в медицине для лечения инфекции C.

Изобретение относится к областям биологии и генетической инженерии. Предложен выделенный пептид для терапевтических целей, содержащий последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную SEQ ID NO:4 (GG00444), или его фрагмент или вариант, способные связываться со слизью кишечника человека, а также содержащая его ворсинчатая структура, пищевой продукт, фармацевтическая композиция, полинуклеотид, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, кластер генов, антитело, способ лечения и способ скрининга пробиотических бактериальных штаммов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к полинуклеотиду, который кодирует полипептидный клостридиальный нейротоксин, а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанный полинуклеотид.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к композиции среды для производства ботулинического токсина и, более конкретно, к композиции среды для культивирования Clostridium sp., способного вырабатывать ботулинический токсин. Составы среды по настоящему изобретению включают свиной пептон и по меньшей мере один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата пшеничного глютена. Когда среду согласно настоящему изобретению, которая содержит пептоны растительного происхождения, свиные пептоны и минеральное вещество, используют для культивирования Clostridium botulinum, скорость роста бактерии в среде выше, чем в среде, используемой в настоящее время, и среде, включающей только пептоны растительного происхождения. Изобретение позволяет получить высокую концентрацию ботулинического токсина. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 16 табл., 10 пр.

Наверх