Способ получения культуры корня растения одуванчик кок-сагыз (taraxacum kok-saghyz rodin)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения культуры корня растения одуванчик кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin), включающий использование в качестве эксплантов в суспензии Agrobacterium rhizogenes штамм 15834, помещение обработанных эксплантов на агаризованную среду В5 с добавлением 500 мг/л цефотаксима, высаживание в колбы эксплантов, из которых образовались корни, в колбы на 100 мл, содержащие - 20 мл среды для наращивания, разделение через месяц выросших корней на инокулюмы массой 1 г и помещение их в среду В5 в колбы на 100 мл, но с содержанием среды - 40 мл и культивирование в течение 14 дней, перенесение подросших корней в колбы, объемом 300 мл, содержащие 100 мл среды, и культивирование в течение 21 суток, при этом общее время культивирования составляет 35 суток при 23°С, в темноте, на качалке 90 об/мин. Изобретение позволяет стабилизировать ростовые параметры и морфологические характеристики корней. 4 ил.

 

Область применения

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой, косметологической, фармацевтической промышленности, генной инженерии и для различных биотехнологических исследований.

Уровень техники

Растение одуванчик кок-сагыз - многолетнее растение из семейства сложноцветных, в корнях которого накапливаются метаболиты, имеющие большое практическое значение. Кок-сагыз относится к роду Taraxacum (одуванчик), который включает более двух тысяч видов, среди которых изучаются около 70 видов. В России чаще всего востребован одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale), однако, одуванчик кок-сагыз является более перспективным, поскольку, кроме инулина содержит и стратегическое сырье - каучук (Ramirez-Cadavid D. A., Cornish К., Michel Jr. F.С. Taraxacum kok-saghyz (TK): compositional analysis of a feedstock for natural rubber and other bioproducts // Industrial crops and products. 2017. http://dx.doi.org/10.1016/j.indcrop.2017.05.043).

Для пищевой и фармацевтической промышленности имеет значение инулин, содержания которого может составлять от 25-45% (Eggert М., Schiemann J., Thiele К. Yield performance of Russian dandelion transplants (Taraxacum kok-saghyz L. Rodin) in flat bed and ridge cultivation with different planting densities // European journal of agronomy. 2018. V.93. P. 126-134). В пищевой промышленности он применяется для замены жиросодержащих веществ и может служить исходным материалом для образования фруктозы (Rodriguez-Garcia J., Isabel Hernando A.S. Replacing fat and sugar with inulin in cakes: bubble size distribution, physical and sensory properties // Food bioprocess technol. 2014. V. 7. P. 964-974). В медицине используется как компонент БАД (Mensink М.А., Frijlink H.W., van der Voort Maarschalk K., Hinrichs W.L.J. Inulin, a flexible oligosaccharide I: review of its physiochemical characteristics // Carbohydr. Polym. 2015. V. 130. P. 405-419). Растительный инулин модифицирует микрофлору кишечника, содействуя развитию бифидобактерий (Mensink М.А., Frijlink H.W., van der Voort Maarschalk K., Hinrichs W.L.J. Inulin, a flexible oligosaccharide I: review of its physiochemical characteristics // Carbohydr. Polym. 2015. V. 130. P. 405-419); снижает уровень глюкозы в крови у диабетиков (Gargari В.Р., Dehghan P., Aliasgharzadeh A., Asghari Jafar-abadi M. Effects of high performance inulin supplementation on glycemic control and antioxidant status in women with type 2 diabetes // Diabetes Metab. J. 2013. V. 37(2). P. 140-148); улучшает обмен липидов, чем предотвращает возникновение осложнений сахарного диабета; снижает уровень холестерина, триглицеридов и фосфолипидов крови; снижает факторы риска сердечнососудистых заболеваний (Кутузова С.Н., Брач Н.Б., Конькова Н.Г., Гаврилова В.А. Кок-сагыз - Taraxacum kok-saghyz (Asteraceae, Compositae) - источник ценного растительного сырья для резиновой, пищевой и фармацевтической промышленности // Биосфера. 2015. Т. 7(4). С. 392-402). Инулин может быть использован и для получения биотоплива - биоэтанола и бутанола (Buranov A.U., 2010. Russian dandelion seeds and extraction processes. In: October 14-15, 2010 Meeting: The Future of Natural Rubber, Montpellier, France).

Несмотря на то, что основным продуцентом инулина являются корни цикория и топинамбура (Flamm G., Glinsmann W., Kritschevsky D., Prosky L., Roberfroid M.. Inulin and oligofructose as dietary fiber: a review of the evidence. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2001. V. 41(5). P. 353-362), в корнях одуванчика кок-сагыз содержание инулина не меньше, а по некоторым источникам и больше, поэтому он в последнее время рассматривается, как перспективное в этом отношении растение (Arias М., М., Ritter Е. How does water supply affect Taraxacum koksaghyz Rod. rubber,inulin and biomass production? // Industrial crops and products. 2016. V. 91. P. 310-314).

Однако содержание инулина в традиционно выращенном сырье может сильно варьировать в зависимости от стадии вегетации и погодных условий (Kreuzberger М., Hahn Т., Zibek S., Schiemann J., Thiele К. Seasonal pattern of biomass and rubber and inulin of wild Russian dandelion (Taraxacum kok-saghyz L. Rodin) under experimental field conditions //European journal of agronomy. 2016. V. 80. P. 66-77). Для умеренных широт важное влияние имеет и сезонность - сбор урожая можно осуществить только раз в году. Кроме этого, выращивание, например, одуванчика кок-сагыз в почве сопряжено с рядом трудностей, связанных с медленным развитием растения (до стадии 5-6 листьев), чувствительностью проростков к сорнякам, загрязнением полей выращивания одуванчиком обыкновенным. Поэтому для получения растительного сырья предлагаются биотехнологические подходы, т.е. выращивание в условиях in vitro. Поскольку синтез инулина происходит в подземной части растения, то целесообразнее получение корневой культуры. Инулин может откладываться либо в быстрорастущих корнях или в многолетних подземных образованиях (корнеплодах, корневищах и т.д.) Корневая культура представляет собой быстрорастущие первичные корни, поэтому важно, чтобы накопление инулина происходило именно в быстрорастущих корнях, а не в многолетних одревесневших образованиях (корнеплодах, корневищах и т.д.). Из трех вышеперечисленных растений накопление инулина в первичных корнях (без одревеснения) происходит только в одуванчике кок-сагыз, поэтому, как продуцент инулина, для получения корневой культуры предпочтительнее использовать одуванчик кок-сагыз.

В связи с этим перед исследователями стоит задача получения высокопродуктивных культур, что может быть выполнено с помощью молекулярно-биотехнологических подходов.

Известен штамм культуры корня одуванчика кок-сагыз. Этот штамм продуцирует каучук, но нет информации по поводу содержания инулина (патент РФ №2016103054 приоритет от 29.01.2016, дата публикации 03.08.17 БИ. №22).

Задача изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание нового штамма культуры корня растения одуванчик кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin.) - продуцента инулина со стабильными ростовыми параметрами, устойчивым синтезом инулина и отсутствием сезонной зависимости его получения.

Решение задачи.

Поставленная задача решается созданием нового штамма культуры корня растения одуванчик кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin.), депонированного в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений Российской академии наук, под обозначением Tks-hrc-1 - продуцент инулина.

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые получен штамм культуры корня растения кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin.) - продуцент инулина со стабильными ростовыми параметрами, устойчивым синтезом инулина и отсутствием сезонной зависимости его получения.

Техническим результатом настоящего изобретения является то, что в результате проведенной генетической трансформации получена новая растительная система - штамм культуры корня растения одуванчик кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin.), способный к стабильному круглогодичному росту в условиях in vitro и к синтезу значительно большего количества инулина, чем содержание этих веществ в медленно растущих и трудно возобновляемых корнях целого растения одуванчик кок-сагыз. Перечень иллюстративных материалов.

Фиг. 1. - Характеристика культуры корня заявляемого штамма Tks-hrc -1.

А - Динамика роста заявляемого штамма Tks-hrc -1

Б - Изменение содержания инулина заявляемого штамма Tks-hrc -1

Фиг. 2. Образование корневой культуры на каллусах одуванчика кок-сагыз.

Фиг. 3. Наращивание первичных корней.

Фиг. 4. - Корневая культура одуванчика кок-сагыз в течение цикла культивирования.

А - начальная точка

Б - 7 дней

В - 14 дней

Г - 21 день

Д - 28 дней

Е - 35 дней

Заявляемый штамм Tks-hrc-1 получают следующим образом.

Для получения культуры корней в качестве эксплантов используют листовые пластинки, каллусы с небольшими побегами стерильно выращенных проростков одуванчика кок-сагыз. Трансформацию проводят путем инкубации эксплантов в суспензии Agrobacterium rhizogenes штамм 15834 (депонированного в 2018 году в КГТК при ИФР РАН). Суспензию агробактерии перед трансформацией наращивают в течение 24 ч на качалке (90 об/мин) в среде В₅ (по Гамборгу) при 23°С, после чего в суспензию помещают экспланты. Инкубацию проводят в течение 12 ч. Затем обработанные экспланты помещают на агаризованную среду В5 с добавлением 500 мг/л цефотаксима ("Клафоран", Турция). Было использовано 143 экспланта, на 39 из которых наблюдалось образование корней, которые высаживают в колбы на 100 мл (содержание среды - 20 мл) для наращивания.

Через месяц выросшие корни разделяют на инокулюмы массой 1 г и помещают в среду В₅ в колбы на 100 мл, но с содержанием среды - 40 мл и культивируют в течение 14 дней. После чего подросшие корни переносят в колбы, объемом 300 мл (объем среды - 100 мл) и культивируют следующие 21 сут. Всего культивируют 35 суток при 23°С, в темноте, на качалке (90 об/мин).

Отбор проб для получения инулина осуществляют каждую неделю в течение всего цикла культивирования. Для ферментативного определения инулина, высушенную при температуре 40-50°С биомассу корней измельчают в блендере до примерного размера частиц - от 0,25-0,30 мм и отбирают навеску - 100 мг. Навеску измельченных корней помещают в дистиллированную воду и выдерживают на водяной бане при температуре 85-90°С в течение 60 мин. Затем полученную суспензию центрифугируют при 14500 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отделяют и проводят ферментативный гидролиз инулина с 1,2% ФП (ферментативного препарата), вкл. 1:2 эндоинулиназу (с инулиназой 2750 Ед/г и ксиланазой 2800 Ед/г) и экзоинулиназу (с инулиназой 45400Ед/г и ксиланазой 7600 Ед/г) в течение 60 мин на водяной бане при 50-55°С. Сумму редуцирующих Сахаров в корнях растений, как растворимых, то есть до гидролиза, так и новообразовавшихся после деструкции инулина гидролизом, определяют методом Шомоди-Нельсона (Somogyi М. Notes on sugar determination // Journal of Biological Chemistry. 1952.V. 195(1). P. 19-23). В градуированную пробирку объемом 5-25 мл вносят 0,5 мл аликвоты и 0,5 мл реактива Шомоди. Пробирку помещают в кипящую баню на 40 минут, затем охлаждают и добавляют 0,5 мл реактива Нельсона, пробирку встряхивают и доводят объем до 5 мл дистиллированной водой (Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // Journal of Biological Chemistry. 1944. V. 153(2). P. 375-380). Определяют оптическую плотность в 1 см кювете объемом 3 мл при длине волны 610 нм против раствора сравнения (контроля), приготовленного таким же образом, но не содержащем моносахаридов. Количество образовавшихся моносахаридов рассчитывают по предварительно составленному калибровочному графику в диапазоне концентраций 5*10^-5-1.2*10^-3 М, используя раствор глюкозы или ксилозы.

Содержание инулина в корнях одуванчика кок-сагыз (и калибровочном растворе чистого инулина из корней цикория) рассчитывают по формуле:

И=(РС₂ - РС₁) * 0,9,

где: И - масса инулина, мг на 1 г сухого вещества корней;

PC₁ и РС₂ - сумма редуцирующих веществ, содержащихся в водной вытяжке до и после процесса гидролиза, соответственно, мг на 1 г сухого вещества корней;

0,9 - коэффициент пересчета редуцирующих веществ на инулин.

Статистическую обработку данных проводят с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. В тексте приведены средние арифметические величины параметров. Бары на диаграмме соответствуют максимальным величинам доверительных интервалов при 95%-ном уровне вероятности по t-критерию Стьюдента. Все эксперименты проводят не менее, чем в трехкратной повторности.

Результаты изобретения

Как следует из анализа полученных иллюстративных материалов, содержание инулина увеличивается в течение первых четырех недель - 28 суток. К концу цикла культивирования содержание инулина составляет 5,4%, Таким образом, достигнута поставленная задача настоящего изобретения - создание нового штамма культуры корня растений одуванчика кок-сагыз Tks-hrc-1 - продуцента инулина со стабильными ростовыми параметрами (индекс роста - 31), устойчивым синтезом инулина и отсутствием сезонной зависимости их получения.

Способ получения культуры корня растения одуванчик кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin), включающий использование в качестве эксплантов в суспензии Agrobacterium rhizogenes штамм 15834, помещение обработанных эксплантов на агаризованную среду В5 с добавлением 500 мг/л цефотаксима, высаживание в колбы эксплантов, из которых образовались корни, в колбы на 100 мл, содержащие - 20 мл среды для наращивания, разделение через месяц выросших корней на инокулюмы массой 1 г и помещение их в среду В5 в колбы на 100 мл, но с содержанием среды - 40 мл и культивирование в течение 14 дней, перенесение подросших корней в колбы, объемом 300 мл, содержащие 100 мл среды, и культивирование в течение 21 суток, при этом общее время культивирования составляет 35 суток при 23°С, в темноте, на качалке 90 об/мин.