Способ фармакологической коррекции посттравматических нарушений иммунитета и репаративных процессов в эксперименте
Владельцы патента RU 2698801:
Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) (RU)
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, дерматологии, хирургии, и может быть использовано для лечения длительно незаживающих скальпированных инфицированных ран, требующих фармакологической коррекции (стимуляции) иммунитета и репаративных процессов. Способ достигается путем использования фармакологических средств, отличается тем, что назначают синтетический низкомолекулярный иммуномодулятор пептидной природы - препарат Моликсан® подкожно в дозе 30 мг/кг экспериментальным животным ежедневно однократно на протяжении всего периода антибактериальной терапии левофлокацином 21 мг/кг. Предложен способ фармакологической коррекции постравматических нарушений иммунитета и репаративных процессов у млекопитающих. Изобретение расширяет арсенал способов фармакологической коррекции иммунитета и репаративных процессов. 6 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, дерматологии, хирургии и может быть использовано для лечения длительно незаживающих скальпированных инфицированных ран, требующих фармакологической коррекции (стимуляции) иммунитета и репаративных процессов.
В настоящее время в лечении заболеваний, требующих стимуляции иммунитета и репаративных процессов, в частности, инфицированных скальпированных ран, большая роль отводится правильному подбору антибактериальной и иммунокоррегирующей терапии.
Существующие средства и схемы терапии не всегда оказываются эффективными и характеризуются большим количеством противопоказаний и побочных эффектов.
Известен способ лечения пиодермии аутогемотерапией, заключающийся в том, что кровь самого больного, взятую из вены, вводят ему же внутримышечно через два дня на третий последовательно в количестве 3, 4, 5 и 6 мл [Заболевания кожи / Гарибас // Медицинский вестник. - Linmed.ru, 09.06.2007. - 8 с.].
Недостатками данного способа являются необходимость в повторных пункциях вены и низкая эффективность при хроническом течении патологического процесса.
Известен Способ наружного применения препарата лейкоцитарной сыворотки, оказывающей иммуномодулирующее влияние на организм и стимулирующей регенерацию тканей [И.Г. Джитава, Э.И. Буеверова, Е.В. Бразина и др. ст. Применение лейкоцитарной сыворотки в лечении длительно незаживающих трофических язв голени // Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. - 1998. - №1. - С. 37-39].
Недостатком данного способа является относительная его сложность при невысокой эффективности лечения гнойных ран.
Известен способ лечения длительно незаживающих ран в эксперименте, включающий комбинацию озоно- и КВЧ-терапии, в котором ежедневно до полного заживления на раневую поверхность воздействуют газообразным озоном с концентрацией 5 мг/л на выходе из аппарата и скоростью потока газа 1 л/мин в течение 30 мин и локально облучают миллиметровыми волнами КВЧ-диапазона со спектром типа «белый шум» в диапазоне частот 53,57-78,33 ГГц в течение 20 мин (патент РФ №2349326, МПК A61K 33/00, A61N 5/02. Опубл. 20.03.2009 г.).
К недостаткам известного способа относятся узкий спектр воздействия озоно- и КВЧ-терапии, в основном, на грамположительные микроорганизмы (стафилококк, стрептококк); нестабильность молекул озона, особенно в присутствии большого количества органических компонентов некротического раневого детрита, токсичность озона при попадании в дыхательные пути; возможность лечения только поверхностных ран, т.к. глубокие раны и свищевые ходы не могут быть обработаны этим способом.
Известен способ лечения инфицированных ран у животных, включающих очищение кожи от загрязнения и нанесение на кожу спиртового раствора клея БФ-8, пленка снимается после заживления раны (патент №2383333, опубл. 10.03.2010 г.)
Недостатком данного способа является его применимость для лечения только мелких линейных парезов, неосложненных гнойно-воспалительными процессами
Для изучения скорости заживления ран вторичным натяжением использовали планиметрический метод Л.Н. Поповой, основанный на регистрации скорости уменьшения раневой поверхности во времени. Процент уменьшения площади раны за сутки определяли по формуле, где: S - площадь раны при предыдущем измерении; Sn - площадь раны при последующем измерении; t -число дней между предыдущим и последующим измерениями [патент РФ №2460553, 2012 г.].
Основной задачей, на решение которой направлено изобретение, является упрощение и удешевление способа лечения инфицированных рваных и скальпированных ран, с помощью использования препарата Моликсан® для фармакологической коррекции посттравматической иммунодепрессии и активации репаративных процессов в организме
Поставленная задача достигается способом лечения и/или/ ослабления иммунодепрессивного состояния, заключающемся в том, что ежедневно, однократно в течение 2 - недель на фоне антибактериальной терапии левофлоксацином вводится фармакологическое средство. Причем в качестве фармакологического средства используется препарат Моликсан® из группы химически чистых низкомолекулярных иммуномодуляторов пептидной природы. Моликсан® разрешен к клиническому применению в качестве иммуномодулирующего средства с гепатопротекторной активностью. Регистрационное удостоверение №001355/02 - от 14.07.2011 Моликсан®
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ, описанный в изобретении [«Способ лечения заболеваний, требующих стимуляции иммунитета и репаративных процессов (патент №2517060, опубликован 27.05.2014), и «в способе лечения инфицированных ран в эксперименте» (патент №2460553, опубликован 10.09.2012) включающем предварительный туалет раны, наложение повязки, содержащей наночастицы железа и меди, и ежедневную смену повязок, на рану накладывают повязку, содержащую в изотоническом растворе 0,9%-го хлорида натрия (NaCl) суспензию наночастиц железа в концентрации 0,1 мг/мл и наночастиц меди в концентрации 0,001 мг/мл, полученных при воздействии плазменным потоком с температурой 5000-6000 K. При этом дисперсность наночастиц меди составляет 30 нм, а наночастиц железа - 70 нм.
Недостатком данного изобретения является сложность предлагаемого способа и высокая токсичность наночастиц железа и меди при применении предлагаемых повязок.
Техническим результатом предлагаемого нами способа является решение задачи, заключающейся в создании способа фармакологической коррекции посттравматического нарушения иммунитета с помощью ежедневного подкожного введения экспериментальным животным фармакопейного иммуномодулятора - препарата Моликсан® на фоне 2-х недельной антибиотикотерапии левомоксацином.
Решение поставленной технической задачи достигается тем, что в способе фармакологической коррекции посттравматических нарушений иммунитета и репаративных процессов экспериментальным животным назначают синтетический низкомолекулярный иммуномодулятор - препарат Моликсан® подкожно в дозе 30 мг/кг ежедневно на протяжении всего периода антибактериальной терапии левофлоксацином в дозе 21 мг/кг.
Заявленный способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него таким существенным признаком как эффективность способа фармакологической коррекции оценена на более адекватной модели посттравматической иммунодепрессии с угнетением репаративных процессов. В качестве средства фармакологической коррекции применен синтетический низкомолекулярный пептидный фармакопейный препарат Моликсан®. В изобретении - прототипе рассмотрена иммуностимулирующая эффективность подкожного 3-х кратного введения лейкоцитарной сыворотки крови пациента.
Преимущества предлагаемого нами способа в том, что он экономически более выгоден из-за более низкой стоимости отечественного препарата Моликсан®. Кроме того заявленный способ отличается простотой исполнения и высокой эффективностью.
Заявителю не известны технические решения, обладающие указанным отличительным признаком, обеспечивающим заданный результат, поэтому он считает что заявленный способ соответствует критерию «изобретательский уровень»
Заявленный способ может найти широкое применение в медицине, а именно, в экспериментальной фармакологии, дерматологии, хирургии при разработке новых иммуностимулирующих препаратов, а потому соответствует критерию «промышленная применимость».
Заявляемый способ реализуют следующим образом: Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа лечения скальпированных инфицированных ран, требующих стимуляции иммунитета и репаративных процессов, который включает использование препарата Моликсан®. Суть предлагаемого способа заключается в том, что в качестве самостоятельного способа лечения или в виде дополнения к любому другому традиционному способу в случае затяжного или осложненного течения заболевания проводят подкожные инъекции препарата Моликсан® ежедневно 1 раз в сут в дозе 30 мг/кг на протяжении всего периода основной (базовой), в частности, антибиотикотерапии левофлоксацином в дозе 21 мг/кг.
Предлагаемый способ лечения посттравматических скальпированных инфицированных ран, требующих стимуляции иммунитета и репаративных процессов, включающий использование препарата Моликсан® осуществляют следующим образом.
Пример осуществления предлагаемого способа при лечении скальпированной инфицированной раны у экспериментальных животных.
Экспериментальное исследование выполнено на белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г из питомника «Рапполово» АН РФ. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе, со свободным доступом к воде.
Экспериментальных животных распределили на 4 группы по 10 особей в каждой.
1 группа - контроль раневого процесса скальпированной инфицированной раны;
2 группа - скальпированная инфицированная рана + лечение левофлоксацином внутрижелудочно 1 раз в день в течение 14 сут в дозе 21 мг/кг массы тела;
3 группа - животные со скальпированной инфицированной раной, получавшие Моликсан® в дозе 30 мг/кг подкожно ежедневно в течение 14 сут
4 группа - животные со скальпированной инфицированной раной, получавшие моликсан подкожно и левофлоксацин внутрижелудочно в дозах 30 мг/кг и 21 мг/кг, соответственно, слабо эффективных при раздельном их применении.
На первом этапе эксперимента сначала получили модель гнойной раны следующим образом по методике, описанной в изобретении (патент на изобретение №2510083, дата публикации: март 20, 2014). После предварительной обработки кожи в асептических условиях, под наркозом, на выбритом от шерсти участке кожи в межлопаточной области у крыс иссекали кожу с подкожной клетчаткой в виде квадрата 2×2 см (400 мм) по контуру. Края и дно раны раздавливали зажимом Кохера. В рану вносили марлевый тампон с взвесью суточной культуры полиантибиотикорезистентного клинического штамма золотистого стафилококка в дозе 2 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Рану у животных контрольной и опытной групп закрывали марлевой повязкой, смоченной изотоническим раствором, заклеивали пластырем во избежание подсыхания раны. У животных в межлопаточной области формировался абсцесс со всеми характерными признаками гнойного воспаления: отмечался отек и гиперемия кожи в области нанесения раны, припухлость, у некоторых животных выделялся гной. Учитывались следующие параметры течения раневого процесса: наличие и характер воспалительной реакции, состояние краев и дна раны, сроки очищения раны от некротических тканей и появления грануляций, характер грануляционной ткани, сроки начала эпителизации ран. Для изучения скорости заживления ран вторичным натяжением использовали планиметрический метод Л.Н. Поповой, основанный на регистрации скорости уменьшения раневой поверхности во времени. Процент уменьшения площади раны за сутки определяли по формуле, где: S - площадь раны при предыдущем измерении; Sn - площадь раны при последующем измерении; t - число дней между предыдущим и последующим измерениями [патент РФ №2460553, публикация 2012 г.].
Проведенные исследования показали, что применение моликсана совместно с антибиотиком левофлоксацином обеспечивало практически полное заживление инфицированных скальпированных ран уже к 10-12 сут наблюдения. Следует отметить, что в группах животных получавших антибиотик или иммунокорректор моликсан раздельно процессы очищения ран от некротических тканей и появления грануляций протекали значительно (в 1,5 раза медленнее), чем в условиях их совместного применения.
Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 - значимо по отношению к контрольной группе. 
Защитную эффективность исследуемых иммуномодулирующего (моликсана) и антибактериального (левофлоксацина) препаратов в условиях их изолированного и комплексного применения оценивали в экспериментах на белых беспородных мышах-самцах, зараженных Staphylococcus aureus в дозах 10 или 100 ЛД50. Численность каждой опытной и контрольных групп - 10 особей. Оцениваемые препараты или их смеси вводили животным per os, в объеме 0,5 мл. Антибактериальный препарат левофлоксацин, а также Моликсан использовали в дозах, эквивалентных разовым человеческим. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 3.
Исходя из представленных в таблице 3 данных, максимальный 100% уровень защиты наблюдали при лечении левофлоксацином животных, зараженных 10 ЛД50 возбудителя. С увеличением заражающей дозы до 100 ЛД50 данный показатель снижался до 50%. Моликсан в условиях изолирванного применения, как и следовало ожидать, оказался неэффективным в отношении Staphylococcus aureus. 
Физическая смесь левофлоксацина с моликсаном обеспечивала уровень защиты до 100% (10 ЛД50) и 80% (100 ЛД50), соответственно. Нельзя не отметить, что на более высокой заражающей дозе защитный эффект оказался на 30% выше, чем от применения только левофлоксацина.
Известно, что целостность кожных покровов и эпителия слизистой оболочки полости рта при воздействии механических, химических и физических (лучевых) раздражителей, во многом, определяется состоянием систем пролиферации и дифференцировки клеток эпителия. К определяющим, в первую очередь, следует отнести ростовые факторы, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) и интерлейкины. Учитывая тот факт, что в литературе практически отсутствуют данные о динамике уровня эпидермального фактора роста при воздействии на организм повреждающих факторов скальпированной инфицированной раны, одной из задач настоящего исследования явилось изучение влияния посттравматической инфицированной раны на содержание в крови животных эпидермального фактора роста (EGF), а также про- и противовоспалительных цитокинов IL-10 и IL-4.
Влияние моликсана на содержание цитокинов, состояние рецепторов к эпидермальному фактору роста и активность митогенактивируемой протеинкиназной системы в периферической крови белых беспородных крыс со скальпированной инфицированной раной
1. Как известно, особое место среди продуктов активированных фагоцитов занимают антимикробные пептиды (АМП), являющиеся, с одной стороны естественными эндогенными антибиотиками, а с другой - сигнальными молекулами, вовлеченными в процессы активации клеток иммунной системы и репарации тканей [Trotti, A. Mucositis incidence, seventy and associated outcomes in patients with head and neck cancer receiving radiotherapy with or without chemotherapy: a systemic literature review / A. Trotti, L.A. Bellm, J.B. Epstein [et al.] // Radiother. Oncol. - 2003. - Vol. 66, №3. - P. 253-263; Yang, D. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal / D. Yang, A. Biragyn, L.W. Kwak, J.J. Oppenheim // Trends Immunol. - 2002. - Vol. 23. - P. 291-296.]. Предположив, что нарушение синтеза АМП может быть одной из причин иммунной дисфункции при наличии скальпированных инфицированных ранах. На сегодняшний день пептиды LL37 (hCAP18), β-дефензин (hBD-3) и α-дефензин (HNP 1-3) являются единственными идентифицированными человеческими АМП, проявляющим иммунорегуляторное действие и антимикробную активность против грамм-отрицательных и грамм-положительных бактерий, а также кандид и вирусов. Учитывая вышеизложенное, основной задачей настоящего раздела явилось изучение в сыворотке крови животных катионных антимикробных пептидов α-дефензин (HNP 1-3) при поражении кожных покровов с развитием инфицированных ран, а также оценка возможности регуляции экспрессии АМП с помощью органической соли дисульфида глутатиона - препарата моликсан.
Результаты этого этапа исследований приведены в таблице 4.
Примечание: * р<0,05 - по сравнению с исходным уровнем (по критерию Стьюдента);
# р<0,05 - по сравнению с группой инфиц. рана (по критерию Стьюдента);
количество животных в каждой группе n=10.
Как видно из представленных в таблице 4 данных, формирование инфицированной раны у экспериментальных животных способствует снижению количества α-дефензина HNP 1-3 (в среднем на 30%) в крови крыс по сравнению с группой «интактные животные». Применение органической соли дисульфида глутатиона и инозина препарата моликсан способствовало восстановлению практически до исходного уровня концентрации изучаемого антимикробного пептида. По-видимому такого рода сдвиги в содержании α-дефензина HNP 1-3 способствовали повышению антибактериальной активности левофлоксацина.
Результаты исследования регуляторных цитокинов в крови животных с инфицированной скальпированной раной представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Влияние моликсана на содержание EGF, IL-lβ и IL-4 в сыворотке крови белых беспородных крыс с инфицированной раной, пг/мл
Примечание: Примечание: * р<0,05 - по сравнению с исходным уровнем (по критерию Стьюдента); # р<0,05 - по сравнению с группой инфиц. рана (по критерию Стьюдента); количество животных в каждой группе n=10.
Как видно из таблицы 5, инфицирование скальпированной раны у животных контрольной группы сопровождалось увеличением в крови содержания EGF и IL-lβ.
Казалось бы, повышение уровня регуляторных пептидов (EGF и IL-lβ) в крови животных, подвергшихся травматическому воздействию, является благом для организма и может свидетельствовать об активации репаративных процессов. Однако клинические наблюдения свидетельствуют об обратном: с ростом в крови животных концентрации исследуемых цитокинов не увеличилась выраженность проявлений активации репаративных процессов. Применение в качестве средства лечения раневой инфекции антибиотика левофлоксацина и препарата моликсан способствовало активации репартивных процессов и нормализации концентрации изучаемых пептидов.
Примечание: * р<0,05 - по сравнению с фоном (по критерию Стьюдента)
В исследованиях in vitro на клеточной культуре А431 установлено, что препарат моликсан, вносимый в инкубационную среду, вызывает стимуляцию рецептора EGF в течение 8 ч наблюдения (табл. 6). Характер активации рецептора выражался в небольшом (в среднем в 3 раза) повышении уровня фосфорилирования рецепторных белков в течение первых 5 мин с последующим снижением до контрольного значения к 30 мин (первая волна). Затем следовало возрастание активации (в среднем в 11 раз) через 1 ч с последующим снижением через 4 ч и достижением максимума через 8 ч (вторая волна).
Полученные экспериментальные данные (таблица 6) свидетельствуют о том, что применение моликсана способствовало восстановление чувствительности рецептора эпидермальному фактору роста с последующей активацией репаративных процессов в скальпрованной ране. Кроме того необходимо отметить, что согласно существующему в настоящее время мнению, повышение функционально активности вышеназванного ростового фактора является определяющими в преодолении антибиотикорезистентности.
По двум параметрам: скорости уменьшения площади раны и скорости элиминации контаминирующего возбудителя из раны можно сделать вывод об эффективности применения смеси моликсана и левофлоксацина указанных концентрациях для лечения гнойных ран, вызванных полиантибиотикорезистентными штаммами золотистого стафилококка.
Таким образом, заявленный способ значительно сокращает время элиминации контаминирующего возбудителя, обеспечивает ускорение регенерации и полного заживления ран.
Способ фармакологической коррекции посттравматических нарушений иммунитета и репаративных процессов в эксперименте путем использования фармакологических средств, отличающийся тем, что экспериментальным животным назначают синтетический низкомолекулярный иммуномодулятор - препарат Моликсан® подкожно в дозе 30 мг/кг ежедневно на протяжении всего периода антибактериальной терапии левофлоксацином в дозе 21 мг/кг.
