Проводимый в воде способ получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты

Настоящее изобретение относится к фармацевтической или косметической промышленности. Способ получения бутирата гиалуроновой кислоты или его соли с щелочным металлом, приемлемой для фармацевтического и косметического использования или использования в медицинском устройстве, включающий взаимодействие гиалуроновой кислоты, возможно в виде соли с натрием или другим щелочным металлом, в водном растворе с бутирил-имидазолидом в присутствии карбоната натрия. Применение в качестве косметического средства композиции, содержащей бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для косметического использования, получаемые вышеописанным способом, и по меньшей мере один эксципиент и/или носитель, приемлемый для косметического использования. Применение медицинского устройства, содержащего бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для использования в медицинском устройстве, получаемые вышеописанным способом, в качестве адъюванта в лечении поражений кожи, таких как воспаления, язвы и поражения, вызываемые гипертермией, индуцированной излучением, например UV (ультрафиолетовым), рентгеновским или гамма-излучением. Изобретение позволяет получить бутират гиалуроновой кислоты, который не содержит остатки какого-либо растворителя или основного активатора. 3 н. и 9 з.п.ф-лы, 4 ил., 18 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты (НА) и к фармацевтическим композициям, косметическим композициям или медицинским устройствам, содержащим сложные эфиры масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты (НА), полученные указанным способом.

В настоящем изобретении описан способ получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты (НА) путем синтеза в водной среде, который неожиданно приводит к высоким степеням замещения (DS) в сложных эфирах масляной кислоты и защищает полисахаридную цепь нативной гиалуроновой кислоты от молекулярной деградации. Сложные эфиры масляной кислоты и гиалуроновой кислоты, полученные указанным способом, не содержат примесей, которые не допускаются и/или запрещены в косметической области, обладают противовоспалительными и противораздражающими свойствами, и, таким образом, могут благоприятно использоваться в фармацевтической области и дермокосметической области, а также в медицинских устройствах.

Предшествующий уровень техники

Известно, что бутират гиалуроновой кислоты (HABut), где гидроксильные группы гиалуроновой кислоты этерифицированы остатками масляной кислоты, имеющими различные степени замещения, обладает противовоспалительными, антипролиферативными и дерматопротекторными свойствами в качестве эластификатора и увлажнителя.

Гиалуроновая кислота и ее соли в высокой степени подвержены уменьшению молекулярной массы за счет гидролиза гликозидных связей полисахаридной цепи. В литературе известно, что на указанный гидролиз в значительной степени влияет рН, ионная сила и температурные условия.

Таким образом, условия дериватизации НА являются критическими для сохранения длины полисахаридной цепи. Идеальные условия представляют собой условия, которые минимизируют присутствие воды в реакционной среде и включают температуры, которые не являются очень высокими, и значение рН, близкое к нейтральному, составляющему от 5 до 8.

В ЕР 0941253 описано получение сложных эфиров масляной кислоты и гиалуроновой кислоты, имеющих низкую степень замещения (макс. DS составляет 0,25), с использованием ангидрида масляной кислоты в апротонных органических растворителях, таких как N,N-диметилформамид и диметилсульфоксид (DMF, DMSO) в присутствии основных активаторов, таких как пиридин и N,N-диметиламинопиридин (DMAP). Способ солюбилизации в органических растворителях включает получение коллидиновой соли гиалуроновой кислоты путем приготовления кислой формы полисахарида путем подкисления водного раствора полисахарида с использованием 2 н HCl и упаривания растворителя с использованием ротационного испарителя, причем этот способ приводит к уменьшению молекулярной массы НА.

В WO 2005/092929 описано получение сложных эфиров масляной кислоты и гиалуроновой кислоты с низкой степенью замещения (DS меньше или равно 0,1). Этот синтез в гомогенных условиях включает получение тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (ТВА), растворимой в апротонных органических растворителях, путем ее пропускания через ионообменную колонку с использованием сильной катионообменной смолы (Amberlite IR-120-plus), где указанное пропускание приводит к уменьшению молекулярной массы.

В WO 2009/068215 описано получение смешанных сложных эфиров масляной и муравьиной кислот с гиалуроновой кислотой и их применение в лечебно-косметических средствах для кожи, обладающих дерматопротекторным действием и противовоспалительным действием. Смешанные эфиры получают с использованием ангидрида масляной кислоты в формамиде (FA) с DMAP в качестве основного активатора.

В этих способах описано применение апротонных и протонных органических растворителей, таких как N,N-диметилформамид, формамид или диметилсульфоксид, которые перечислены среди веществ, запрещенных для применения в косметических композициях в соответствии с требованием (ЕС) №1223/2009. Также используются органические основания, такие как N,N-диметиламинопиридин, которые обладают характеристиками высокой токсичности (LD₅₀ (средняя летальная доза) составляет десятки м.д. (миллионных долей)). Остатки растворителей, реагентов и активаторов не могут быть количественно исключены в процессе очистки.

О реакциях в воде для дериватизации гиалуроновой кислоты сообщается в ЕР 0416250, в котором описывается образование N-ацилмочевины и О-изоацилмочевины на карбоксильной группе гиалуроновой кислоты вследствие реакции с карбодиимидами или бис-карбодиимидами. Эта реакция проходит в воде при контролируемом рН, при котором не происходит деградация полисахарида.

В US 5874417 описана функционализация карбоксильной группы гиалуроновой кислоты гидразидом в воде в мягких условиях.

А. Mero et al. (Polymer 2014, 6, 346-369) сообщает о том, что НА может быть дериватизирована в воде. Тем не менее, в водной фазе необходимо провести множество реакций в кислых или щелочных условиях, что влечет за собой значительную деградацию цепи НА. В статье описываются реакции в воде с карбодиимидами, приводящие к образованию амидных связей на карбоксильных группах.

В способе по настоящему изобретению также получают HABut с высокими степенями замещения при использовании только воды в качестве растворителя и карбонат натрия в качестве основного активатора. Полученный продукт не содержит остатки какого-либо растворителя или основного активатора, которые могли бы привести к определенным проблемам безопасности.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения бутирата гиалуроновой кислоты или его соли, приемлемой для фармацевтического или косметического использования, или в качестве медицинского устройства, включающему взаимодействие гиалуроновой кислоты, предпочтительно в виде соли, образованной с натрием или другим щелочным металлом, в водном растворе с бутирил-имидазолидом в присутствии карбоната натрия.

Способ по изобретению предпочтительно используют для получения натриевой соли бутирата гиалуроновой кислоты.

Используемая в способе натриевая соль гиалуроновой кислоты предпочтительно имеет средневесовую молекулярную массу (MW), находящуюся в диапазоне от 10³ до 10⁶ Дальтон.

Соль гиалуроновой кислоты растворяют в деминерализованной воде, и в получающийся в результате раствор добавляют карбонат натрия, а затем бутирил-имидазолид.

Реакционную смесь поддерживают при температуре, находящейся в диапазоне от 20°С до 30°С, в течение не меньше чем 60 минут.

Значение рН реакционной смеси находится в диапазоне от 11 до 9.

После завершения реакции смесь доводят до нейтрального рН, и продукт выделяют путем осаждения в подходящем растворителе. Полученный таким образом продукт затем очищают, например, путем последовательных промываний подходящими растворителями и фильтрованием.

Способ по изобретению позволяет получать бутират гиалуроновой кислоты с различными степенями замещения. Степень замещения (DS), определяемая как соотношение между количеством остатков масляной кислоты на дисахаридную единицу GlcNAc-GlcUA гиалуроновой кислоты, может находиться в диапазоне, например от 0,01 до 2,5.

Различные степени замещения достигают путем варьирования отношения между гиалуроновой кислотой и бутирил-имидазолидом.

Бутират гиалуроновой кислоты, полученный способом по изобретению, не содержит остатков растворителей или токсичные реагенты, и может быть использован в фармацевтических композициях, косметических композициях и медицинских устройствах.

Таким образом, объект настоящего изобретения включает фармацевтические и косметические композиции, содержащие бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для фармацевтического или косметического использования, полученный способом, описанным выше, и по меньшей мере один эксципиент и/или носитель, приемлемый для фармацевтического или косметического использования.

Бутират гиалуроновой кислоты, полученный описанным способом, вследствие отсутствия растворителей и реагентов, запрещенных законодательными актами по косметическим ингредиентам, может быть использован в области лечебно-косметических средств для кожи для местного применения, обладающих гидратирующей, придающей эластичность, тонизирующей, антивозрастной или противоугревой активностью в композициях, обладающих высоким профилем безопасности, которые подходят, например, для гипоаллергенных продуктов или чувствительной кожи.

Молекула также обладает значительными противораздражающей и противовоспалительной активностями больше чем активности гиалуроновой кислоты (НА) и бутирата натрия (NaBut), влияющими на острый воспалительный ответ, подтверждаемый на нейтрофильной модели in vitro (полиморфоядерные лейкоциты или PMN). Вследствие указанной характеристики бутират гиалуроновой кислоты, полученный описанным способом, применим в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях, косметических композициях или медицинских устройствах в качестве адъюванта при лечении поражений кожи, таких как воспаления, язвы и поражения, вызванные гипертермией, индуцированной излучением, таким как УФ (ультрафиолетовое) излучение, рентгеновское излучение и гамма-излучение.

ПРИМЕРЫ

Используемое оборудование:

• Спектрометр Bruker Avance 400 МГц, оснащенный 5 мм многоядерным обратным зондом с z градиентом для определения степени замещения (DS);

• Хроматограф Viscotek HP-SEC-TDA модель 270 max, оснащенный тройным детектором (рассеяние света 90°С и 7°С, коэффициент преломления и вискозиметр) для определения распределения молекулярных масс и средневесовой молекулярной массы (MW).

Определение степени замещения (DS)

Степень замещения в бутиратных эфирах производного гиалуроновой кислоты количественно определяли при помощи ЯМР (ядерный магнитный резонанс) спектроскопии. Спектры ¹Н ЯМР получали в D₂O при помощи спектрометра Bruker Avance 400 МГц, оборудованного 5 мм многоядерным обратным зондом с z градиентом. Тесты проводили путем термостатирования измерительного зонда до 300°K (26,85°С).

Этот тест включает анализ при помощи диффузно-упорядоченной спектроскопии (DOSY), который подтверждает присутствие ковалентной связи между полимером и масляной кислотой.

Количественное определение DS в сложном эфире масляной кислоты осуществляют после полного гидролиза с использованием NaOD непосредственно в пробирке для ЯМР.

Спектр ¹Н ЯМР гидролизата дает возможность для интеграции сигналов, относящихся к масляной кислоте (вицинальный метил и метиленовые протоны), и сигналов, относящихся к гиалуроновой кислоте (сахаридные протоны за исключением двух аномерных протонов); их отношение определяет степень замещения.

Методы

Определение распределения молекулярной массы и средневесовой молекулярной массы (MW) при помощи хроматографии HP-SEC-TDA

Образцы подвергали эксклюзионной хроматографии с использованием комбинации трех детекторов (рассеяние света при 90° и 7°, коэффициент преломления и вискозиметр). Обработка хроматограммы дает возможность для определения распределения молекулярных масс Mw (средневесовая молекулярная масса).

Хроматографические условия:

Оборудование Viscotek 270 max.

Колонки: А7000, A6000mx2, температура 35°С.

Подвижная фаза: PBS (фосфатный буферный солевой раствор).

Скорость потока: 0,750 мл/мин

Детектор: Viscotek TDA, оснащенный показателем преломления, капиллярным вискозиметром и рассеянием света с измерением при 90° и 7°, температура 35°С.

Инжектируемый объем: 100 мкл.

Оценка продукции супероксид-аниона

Продукцию ROS (реактивные формы кислорода), представляющих собой показатель метаболической активации PMN, оценивали в отношении количества супероксид-аниона (О₂^-), высвобождаемого в среду после активации нейтрофилов в лунках микротитровальных планшетов, покрытых фибриногеном (FBG), коллагеном IV (CIV), НА или HABut. Спектрофотометрический метод использовали для измерения количества цитохрома с, восстановленного супероксид-анионом, продуцированным клетками во время инкубации на планшете.

Оценка адгезии к биологическим поверхностям

Клеточную адгезию к поверхности во время метаболического анализа оценивали путем измерения активности фермента миелопероксидазы (МРО), представляющего собой ферментный маркер, содержащийся в азурофильных гранулах в PMN. Использовали протокол, описанный Menegazzi et al. (A new, one-step assay on whole cell suspensions for peroxidase secretion by human neutrophils and eosinophils. Menegazzi R, Zabucchi G, Knowles A, Cramer R, Patriarca P. J Leukoc Biol. 1992 Dec;52(6): 619-24). Миелопероксидазную активность измеряли при помощи количественного колориметрического ферментативного теста, в котором измеряют окисление 3,3',5,5'-тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрата ферментом МРО в присутствии Н₂О₂.

Пример 1: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,3 (BUT12103)

100 мл деминерализованной воды и затем 10,0 г гиалуроната натрия с MW 280 кДа вводят в реактор объемом 1 л. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре вплоть до полного растворения.

Далее добавляют двухнатриевый карбонат (Na₂CO₃ - 1,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (2,6 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне и последующего декантирования.

Раствор очищают путем последовательных промываний в ацетоне, и восстанавливают путем фильтрования при отрицательном давлении.

Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакуумной печи при температуре меньшей или равной 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл дейтерированной воды (D₂O) и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Спектры ЯМР приведены на Фиг. 1; нижний спектр (а) получен путем применения последовательности DOSY, которая сохраняет только сигналы, относящиеся к химическим группам, ковалентно связанным с полимером.

Два других спектра ¹Н ЯМР соответственно получены до (b) и после (с) гидролиза сложного эфира масляной кислоты путем добавления дейтерированного гидроксида натрия (NaOD). Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,30.

Пример 2: Определение распределения молекулярной массы и средневесовой молекулярной массы (MW)

Образец натриевой соли гиалуроновой кислоты, используемый для синтеза сложного эфира масляной кислоты, описанного в примере 1, сертифицированного с MW 280 кДа, анализировали при помощи хроматографии HP-SEC-TDA. Распределение экспериментальных молекулярных масс дает средневесовую молекулярную массу (MW), равную 300 кДа.

Образец сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, полученный как описано в примере 1, анализировали при помощи хроматографии HP-SEC-TDA. Распределение экспериментальных молекулярных масс дает средневесовую молекулярную массу (MW), равную 360 кДа.

Пример 3: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,3 (BUT14014)

1 л деминерализованной воды вливают в реактор объемом 15 л с последующим добавлением 100,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре вплоть до полного растворения.

Далее добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 15,9 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (25,9 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С; реакцию затем гасят путем добавления водного раствора, состоящего из соляной кислоты (HCl) и хлорида натрия (NaCl).

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле.

После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов; смесь переносят, и продукт выделяют путем фильтрования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакуумной печи при температуре меньшей или равной 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,30.

Пример 4: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,3 (HBint05012014)

2,5 л деминерализованной воды вводят в реактор объемом 15 л с последующим добавлением 250,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 39,8 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (64,8 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора, состоящего из HCl и NaCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне.

После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре меньшей или равной 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют величину DS, равную 0,30.

Пример 5: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,58 (BUT14017)

100 мл деминерализованной воды вводят в реактор объемом 1 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 2,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (9,2 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора, состоящего из HCl и NaCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,58.

Пример 6: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,85 (BUT14019)

100 мл деминерализованной воды вводят в реактор объемом 1 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 5,3 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (9,2 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl и NaCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,85.

Пример 7: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=1,30 (HBint04042014-BUT14023)

100 мл деминерализованной воды вводят в реактор объемом 1 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 13,2 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (23,1 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат в воздушном потоке при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 1,30.

Пример 8: Синтез высокомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,24 (HBint01042014-BUT14025)

1 л деминерализованной воды вливают в реактор объемом 5 л с последующим добавлением 50,0 г гиалуроната натрия с MW 1270 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 10,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (25,9 г) после перемешивания в течение 90 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления 360 мл водного раствора, состоящего из HCl и NaCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.

3 мг твердого вещества растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в пробирку для ЯМР.

10 мг твердого вещества растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,24.

Пример 9: Синтез высокомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,51 (HBint03042014-BUT14032)

0,72 л деминерализованной воды вводят в реактор объемом 5 л с последующим добавлением 30,0 г гиалуроната натрия с MW 1270 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 23,8 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (60,9 г) после перемешивания в течение 60 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.

3 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,51.

Пример 10: Синтез высокомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,97 (HBint02042014-BUT14031)

0,85 л деминерализованной воды вводят в реактор объемом 5 л с последующим добавлением 30,0 г гиалуроната натрия с MW 1270 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 47,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (138,3 г) после перемешивания в течение 60 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов, и продукт выделяют путем фильтрования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.

3 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,97.

Пример 11: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,46 (BUT14037)

35 мл деминерализованной воды выливают в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 5,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 0,8 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (1,3 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl и NaCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов; смесь переносят и продукт выделяют путем фильтрования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,46.

Пример 12: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=1,68 (BUT14039)

12,5 мл деминерализованной воды вводят в колбу объемом 0,25 л с последующим добавлением 5,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 6,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (11,9 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 1,68.

Пример 13: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=1,90 (BUT14042)

25,0 мл деминерализованной воды выливают в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 5 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 13,2 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (68,2 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 2 часов при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 1,90.

Пример 14: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,06 (BUT14043)

50,0 мл деминерализованной воды вводят в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 0,2 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (0,3 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 2 часов при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения продукт выделяют путем фильтрования при отрицательном давлении; продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 7 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,06.

Пример 15: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,02 (BUT14044)

50,0 мл деминерализованной воды вводят в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.

Затем добавляют динатрия карбонат (Na₂CO₃ - 0,1 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (0,1 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl и NaCl.

Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов; смесь затем переносят, и продукт выделяют путем фильтрования.

Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.

Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл D₂O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.

Путем интегрирования сигналов спектров ¹Н ЯМР определяют DS, равную 0,02.

Пример 16: Продукция супероксид-аниона PMN, активированными TNF (фактор некроза опухоли)

Продукцию супероксид-аниона PMN стимулировали в течение 45 мин провоспалительным цитокином TNF в лунках, покрытых FBG (фибриноген; поверхность, пермиссивная для адгезии PMN); CIV (коллаген IV типа - непермиссивная поверхность); НА: гиалуроновая кислота; HABut: бутират гиалуроната натрия DS=0,3 Пример №4).

Лунки, покрытые различными субстратами, заполняют 0,18 мМ раствором цитохрома с и 0,15 нг/мл TNF в буфере Hepes. Полученные таким образом модули нагревают в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе; клеточную суспензию 1,5×10⁶ PMN/мл в буфере Hepes добавляют в каждую лунку. С 15-минутными интервалами планшет извлекают из инкубатора и подвергают спектрофотометрическому анализу в микропланшетном ридере при длинах волн 550 нм и 540 нм, которые соответствуют пику поглощения восстановленного цитохрома с и изобестической точке спектров поглощения восстановленного и окисленного цитохрома с, соответственно. Разница между величинами поглощения, зарегистрированными при двух длинах волн, пропорциональна количеству восстановленного цитохрома с. Количество О₂^-, продуцированного 10⁶ клеток, рассчитывают следующим образом:

нмоль O₂^-/ 10⁶ PMN=OD × 10⁶/ 0,0037 × n,

где n представляет собой количество клеток, добавляемое в каждую лунку.

Гистограмма, приведенная на Фиг. 2, демонстрирует значительное уменьшение продукции супероксид-аниона (р<0,001, рассчитанное в соответствии с “t” тестом Стьюдента с n=4) в ответ на TNF в PMN, инкубируемых на поверхности, покрытой HABut, со степенью замещения 0,3, по сравнению с PMN, инкубируемых на поверхности, покрытой НА.

Пример 17: Тест адгезии PMN к биологическим поверхностям Адгезия PMN к поверхности, покрытой FBG (поверхность, пермиссивная для адгезии PMN); CIV (непермиссивная поверхность); НА: гиалуроновая кислота; HABut: бутират гиалуроната натрия DS=0,3 Пример №4. Остальное: PMN, не активированные TNF. TNF: PMN, активированные TNF; РМА: PMN, активированные форбола 12-миристата 13-ацетатом.

После проведения спектрофотометрических считываний для измерения продукции О₂^- лунки микропланшетов заполняют PBS и центрифугируют при 200 об./мин в течение 5 минут для удаления клеток, которые не прикрепились к поверхности. Миелопероксидазную активность определяют путем измерения окисления 3',5,5'-тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрата ферментом МРО (миелопероксидаза) в присутствии Н₂О₂. Ацетатный буфер, содержащий ТМВ, цетилтриметиламмоний (СТАВ) и 3-амино-1,2-4-триазол (АМТ), добавляют в каждую лунку, и планшет перемешивают в течение 5 мин для того, чтобы облегчить клеточный лизис и способствовать высвобождению МРО из гранул. Активность эозинофильной пероксидазы из эозинофилов, которая может загрязнять препарат PMN, ингибируют при помощи ATM. Через 2 минуты после добавления Н₂О₂ реакцию гасят H₂SO₄ и поглощение в каждой лунке измеряют при длине волны 405 нм. Процент прикрепившихся клеток рассчитывают относительно стандартной кривой, которую строят в каждом эксперименте на основе величин пероксидазной активности, рассчитанных для известных количеств клеток.

Гистограмма, приведенная на Фиг. 3, демонстрирует значительное уменьшение (р<0,001, рассчитанное в соответствии с Т тестом Стьюдента с n=4) количества активированных и не активированных PMN, прикрепившихся к поверхности, покрытой HABut, имеющим степень замещения 0,3, по сравнению с количеством PMN, прикрепившихся к поверхности, покрытой НА.

Пример 18: Влияние степени бутиратного замещения и молекулярной массы гиалуроновой кислоты на адгезию активированных и неактивированных PMN

Адгезия PMN, стимулированных TNF, к поверхности, покрытой НА и HABut. HABut: бутират гиалуроната натрия DS=0,3 Пример №4; образцы HABut №1: бутират гиалуроната натрия DS=1,3 Пример №7; образцы HABut №2: HMW (высокомолекулярный) бутират гиалуроната натрия DS=0,24 Пример №8; образцы HABut №3 HMW бутират гиалуроната натрия DS=0,97 Пример №10. Остальное: отрицательный контроль. РМА: положительный контроль.

Черная колонка: PMN, не активированные TNF. Белая колонка: PMN, активированные TNF.

Адгезию PMF к поверхностям оценивают в соответствии с описанным в примере 18.

Гистограмма, приведенная на Фиг. 4 демонстрирует то, что когда степень замещения бутиратом увеличивается, то HABut приводит к тому, что поверхность со все увеличивающейся степенью становится менее пермиссивной к адгезивному взаимодействию с PMN, причем его молекулярная масса, по видимому, не имеет значения.

1. Способ получения бутирата гиалуроновой кислоты или его соли с щелочным металлом, приемлемой для фармацевтического и косметического использования или использования в медицинском устройстве, включающий взаимодействие гиалуроновой кислоты, возможно в виде соли с натрием или другим щелочным металлом, в водном растворе с бутирил-имидазолидом в присутствии карбоната натрия.

2. Способ по п. 1, где получают натриевую соль бутирата гиалуроновой кислоты.

3. Способ по п. 1 или 2, где натриевая соль гиалуроновой кислоты имеет средневесовую молекулярную массу, находящуюся в диапазоне от 10³ до 10⁶ Дальтон.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где бутират гиалуроновой кислоты имеет степень замещения, находящуюся в диапазоне от 0,01 до 2,5.

5. Способ по п. 4, где бутират гиалуроновой кислоты имеет степень замещения, находящуюся в диапазоне от 0,1 до 2.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где взаимодействие осуществляют при температуре, находящейся в диапазоне от 20°С до 30°С.

7. Способ по п. 6, где взаимодействие осуществляют при 25°С.

8. Способ по п. 7, где взаимодействие осуществляют при значении рН, находящемся в диапазоне от 11 до 9.

9. Применение в качестве косметического средства композиции, содержащей бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для косметического использования, получаемые способом по любому из пп. 1-8, и по меньшей мере один эксципиент и/или носитель, приемлемый для косметического использования.

10. Применение медицинского устройства, содержащего бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для использования в медицинском устройстве, получаемые способом по любому из пп. 1-8, в качестве адъюванта в лечении поражений кожи, таких как воспаления, язвы и поражения, вызываемые гипертермией, индуцированной излучением, например UV (ультрафиолетовым), рентгеновским или гамма-излучением.

11. Применение в качестве косметического средства по п. 9, где такое применение является местным.

12. Применение по п. 10, где такое применение является местным.