Способ клонального микроразмножения кодонопсиса ланцетного (codonopsis lanceolata (siebold.&zucc.) benth. & hook. fil.)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil., включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 10 минут), высаживание на питательные среды MS (Murashige and Skoog) с добавлением 0,5 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л IAA, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и IAA в концентрации 0,5-1 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч. Изобретение позволяет получить высокий коэффициент размножения и, как следствие, необходимое количество саженцев. 9 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения редких и исчезающих растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала лекарственного и декоративного растения кодонопсиса ланцетного (Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil.), трудно размножаемого генеративным и вегетативным способами. Полученные растения могут использоваться для реинтродукции кодонопсиса ланцетного в естественные места произрастания, в качестве ценного ресурса для медицинской промышленности, в ландшафтном дизайне.

Предлагаемое изобретение является новым, так как в патентной и научно-технической литературе не найдено решения с заявленной совокупностью отличительных признаков, то есть оно не известно из уровня техники, значит, соответствует критерию ʺновизнаʺ.

Codonopsis lanceolata широко используется в традиционной медицине, так как характеризуется широким спектром лекарственных свойств. Хотя в традиционной медицине имеется информация о применении многих видов Codonopsis, наиболее часто сообщалось о биологической активности С. pilosula Franch. и С. lanceolata, что подтвердило их ценность в качестве лекарственных растений [1, 2].

Известен семенной и вегетативный способы размножения данного растения. Семена кодонопсиса характеризуются низкой энергией прорастания из-за плотной семенной оболочки. В исследованиях В.К. Ghimire, С.М. Shin, С.Н. Li и др. [3] отмечено, что всхожесть семян С. Lanceolata в условиях in vivo составила около 49,5%, а в условиях in vitro может достигать 76,0%. Семенное размножение затруднено из-за медленного развития и низкой жизнеспособности сеянцев. В Китае кодонопсис ланцетный выращивают, используя стимуляцию роста корня, в условиях, имитирующих естественную среду произрастания растения [4]. В ООО «ССХП «Женьшень» Унечского района Брянской области создана крупная плантация С. Lanceolata, и отработана технология его возделывания. Вегетативное размножение кодонопсиса так же затруднено вследствие медленного развития саженцев, трудоемкости процесса производства и недостаточного количества получаемых растений.

Альтернативой семенному и вегетативному размножению является метод клонального микроразмножения через культуру меристем. Однако до настоящего времени так и не определен оптимальный состав питательной среды, обеспечивающий интенсивное формирование микропобегов кодонопсиса из изолированных меристем и регенерацию путем прямого органогенеза. Редкие растения, в частности Codonopsis lanceolata (кодонопсис ланцетный), представляют особый интерес для клонального микроразмножения. Вид С. lanceolata включен в "Красную книгу Сахалинской области". Имеет статус Е(2) - угрожаемый вид и охраняется в природном заповеднике "Курильский". Лимитирующими факторами являются малая численность островной популяции и нарушение среды обитания [5]. Имеются сообщения о культивировании клеток и тканей некоторых представителей рода Codonopsis in vitro. В работе В.К. Ghimire и др. [6] отмечается, что для получения микропобегов С. lanceolata чаще всего использовали адвентивное побегообразование и соматический эмбриогенез. Была показана возможность размножения С. lanceolata микроклубнями in vitro, которую целесообразно использовать для воспроизводства элитных клонов и сохранения гермоплазмы вида ввиду длительности культивирования (более 4 месяцев) [7]. Однако, молекулярные маркеры выявили значительную генетическую нестабильность в растениях кодонопсиса ланцетного, регенерированных из каллуса [8].

Изобретение представляет собой способ размножения растений Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil. методом культуры in vitro, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию, высаживание на питательные среды, получение микропобегов через прямой органогенез, минуя стадию каллусообразования, их последующее размножение и укоренение, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и доращивания получают стандартные саженцы кодонопсиса ланцетного с закрытой корневой системой. Преимущества предлагаемой нами технологии и использование заявленного способа позволяет получить более 170 тысяч саженцев в год от одного экспланта.

Ход работы

В ходе исследований разработана методика клонального микроразмножения Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil..

В качестве первичных эксплантов использовали апикальные и пазушные меристемы побегов. Для предварительной стерилизации эксплантов использовали раствор фунгицида системного действия «Фундазол» в концентрации 2% (5-7 мин.) и 70%-ный этанол (С2Н6О) в течение 20 мин. Дальнейшую стерилизацию проводили с помощью хлорсодержащего (гипохлорит натрия) стерилизующего агента в 7% концентрации. Оптимальная экспозиция составила 7-10 мин.

Исходя из полученных данных сравнительного анализа влияния различных минеральных основ на морфометрические показатели микропобегов, в последующих экспериментах в качестве минеральной основы питательной среды использовали MS (Murashige and Skoog) [9]. На этой среде наблюдали наибольшую высоту (27,1±1,9 мм), максимальный коэффициент размножения (3,1±0,4) и лучшее развитие микропобегов, по сравнению с другими питательными средами (QL (Quoirin and Lepoivre) [10], WPM (Woody Plant Medium) [11] и B5 [12]) (фиг. 1-2). На фигуре 2 представлены микропобеги на различных по минеральному составу питательных средах: 1 - MS; 2 - QL; 3 - В5; 4 -WPM.

В качестве регулятора роста растений использовали 6-ВАР (6-бензиламинопурин) в концентрации 0,5-1,5 мг/л. Были выявлены наиболее оптимальные концентрации 6-ВАР (фиг. 3). Таким образом, оптимальной средой для культивирования является среда с добавлением 0,5 мг/л 6-ВАР, на которой отмечаются наиболее высокие морфометрические показатели: высота микропобегов (26,9±2,4 мм), число микропобегов (1,9±0,1 шт.), коэффициент размножения (3,7±0,3).

При культивировании на питательных средах, сочетающих ауксины и цитокинины, для многих видов растений было установлено увеличение регенерационного потенциала [9], поэтому дополнительно были испытаны среды, содержащие регуляторы роста как цитокининовой природы - 6-ВАР (0,5; 1; 1,5 мг/л), так и ауксиновой природы - IAA (индолил-3-уксусная кислота) в концентрации 0,05 мг/л (фиг. 4-6). Оптимальной средой для культивирования является среда с добавлением 6-ВАР в концентрации 0,5 мг/л и IAA (0,05 мг/л). На этой среде были отмечены максимальные морфометрические показатели: коэффициент размножения (4,3±0,3); высота микропобега (29,5±0,5 мм); число микропобегов (2,9±0,1 шт.)

Укореняют побеги на агаризированной среде 1/2 MS, содержащей 20 мг/л сахарозы. На данном этапе были испытаны два регулятора роста: IAA и IBA (индолил-масляная кислота) в концентрации 0,5-1 мг/л. Наилучшие результаты были достигнуты на среде с добавлением IAA; разница между сравниваемыми концентрациями (0,5 и 1 мг/л) оказалась недостоверной (фиг. 7).

В условиях лаборатории микропобеги Codonopsis lanceolata выращивают при искусственном освещении (3000 лк) и фотопериоде 16/8 ч., температуре 23-25°С и влажности 70%.

Затем растения-регенеранты высаживают на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.

Различные стадии клонального микроразмножения кодонопсиса ланцетного показаны на фиг. 8-9.

Источники информации

1. Ториков В.Е., Мешков И.И. Особенности выращивания и элементный состав корней кодонопсиса ланцетного {Codonopsis lanceolata) // Дальневосточный аграрный вестник. - 2017. -№2(42). - С.41-45.

2. Не J.Y., Ma N., Zhu S., Komatsu К., Li Z.Y., Fu W.M. The genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control // Journal of Natural Medicines. - 2015. - Vol.69. - P. 1-21.

3. Ghimire B.K., Shin С.М., Li C.H., Ching I.M., Lee D.W., Kim H.Y., Kim N.Y., Lim J.D., Kim J.K., Kim M.J., Cho D.H., Lee S.J., Yu C.Y. Effect of Gibberlin and light on germination of seeds of Codonopsis lanceolata Benth. // Korean Journal of Medicinal Crop Science. - 2006. - Vol.14. - P. 303-306.

4. Пат.101444166 А КНР. Easy and quick propagating method for lance asiabell root / Feng Hailong; заявитель и патентообладатель Feng Hailong. - №200810189833, заявл. 30.12.2008; опубл. 03.06.2009.

5. Баркалов. В.Ю. (составитель) Красная книга Сахалинской области: Растения. - Южно-Сахалинск: Сахалинское книжное издательство, 2005. - 348 с.

6. Ghimire В.К., Shin С.М., Li С.Н., Kim N.Y., Chung I.М., Lim J.D., Kim J K., Kim M.J., Cho D.H., Yu C.Y. High frequency plant regeneration from leaf, petiole and internode explants of Codonopsis lanceolata Benth. // Korean Journal of Medicinal Crop Science. - 2007. - Vol.15.- P. 73-81.

7. Kim J.A., Moon H.K., Choi Y.E. Microtuber formation from in vitro Codonopsis lanceolata plantlets by sugar // Journal of Plant Biotechnology. - 2013. - Vol.40. - P. 147-155.

8. Slupski W., Tubek В., Matkowski A. Micropropagation of Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. by axillary shoot multiplication // Acta biologica Cracoviensia. Series: Botanica. - 2011. - Vol. 53/2. - P. 87-93.

9. Murashige Т., Skoog F. Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol.15. - №43. - P. 473-497.

10. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp.// ActaHortic. - 1977. - Vol.78. - P. 437-442.

11. McCown, B.H. and Lloyd, G. Woody Plant Medium (WPM) - a mineral nutrient formulation for microculture of woody plant species // HortScience. - 1981. - Vol.16. - P. 453-453.

12. Gamborg O.L., Evelegh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - Vol. 46. - №5. - P. 417-421.

Способ клонального микроразмножения Codonopsis lanceolata (Siebold.&Zucc.) Benth. & Hook. Fil., включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 10 минут), высаживание на питательные среды MS (Murashige and Skoog) с добавлением 0,5 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л IAA, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и IAA в концентрации 0,5-1 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения культуры чая (Camellia sinensis L.), включающий выращивание каллусов на питательной среде, содержащей макро- и микросоли, витамины, аденин, дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), агар, при 26°С, перенос их в жидкую питательную среду того же состава и воздействие L-фенилаланина в концентрации 3 мМ, причем неизмельченный каллус помещают в жидкую питательную среду Хеллера, содержащую макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезоинозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, выращивают при относительной влажности воздуха 70%, на качалке с частотой 90 об/мин в условиях темноты 14 дней, а в качестве растворителя для L-фенилаланина используют воду.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8÷10 междоузлиями на фрагменты длиной 10÷12 мм с глазком и листом, посадку и их культивирование на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга, в которую добавляют антибиотик гентамицин в концентрации 0,005-0,9 мл/л, что позволяет продлить срок беспересадочного хранения, при снижении энергозатрат и упрощении технологического процесса.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения тополя корейского, включает: заготовку 1-2 летних побегов, использование в качестве экспланта среднюю часть зеленого побега плюсового дерева тополя корейского (Populus koreana Render) мужского генотипа с пазушной почкой листа, выгонку в лабораторных условиях молодых побегов, их стерилизацию, получение стерильной культуры in vitro, индукцию побегообразования, доращивание побегов, их отделение с последующим корнеобразованием и адаптацией сначала к стерильным почвенным условиям, а затем к обычной почве.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования in vitro земляники садовой на жидкой среде.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Для микроклонального размножения картофеля проводят размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании безгормональной питательной среды с рН 5,7-5,8, содержащей микросоли и макросоли по Мурасиге и Скуга, Fe2SO4, CaCl2, мезо-инозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, сахарозу, глюкозу, агар, биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii при следующем соотношении компонентов:Макросоли - 50 мг/л,Микросоли - 1 мг/л,Fe2SO4⋅7H2O - 5,0 мг/л,CaCl2⋅2H2O - 440 мг/л,мезо-инозит - 100 мг/л,тиамин - 1,0 мг/л,пиридоксин - 1,0 мг/л,никотиновая кислота - 0,5 мг/л,сахароза - 25 г/л,глюкоза - 25 г/л,агар - 6 г/л,биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii - 0,5 мг/л.Изобретение позволяет повысить эффективность размножения здоровых пробирочных растений картофеля.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению Cucumis melo, способному производить более чем 12 плодов, где указанные плоды являются бессемянными, к части вышеуказанного растения, а также к пищевому продукту, содержащему вышеуказанное растение или его часть.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению Eustoma, имеющему цитоплазматическую мужскую стерильность, а также к его части, семени, каллусу, митохондрии.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ ранней диагностики деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости, основанный на использовании каллусных культур in vitro, культивируемых в условиях моделируемой засухи (1% NaCl) на питательной среде MS с добавлением 3% сахарозы, уменьшенным содержанием витаминов (В1 - 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота - 0,4 мг/л, пиридоксин и РР исключены), гормонов 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (2 мг/л), с дифференциацией культур через 10-15 суток культивирования по признаку жизнеспособности: отсутствие некротической ткани - засухоустойчивое исходное дерево, 100% некротизация - неустойчивое к засухе.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет себе способ ограничения доли семян самооплодотворяемых мужских растений, получаемых с поля, содержащего насаждение более низкорослых женских опыленных растений (с мужской стерильностью) и насаждение более высокорослых растений с мужской фертильностью, где способ включает пропускание инструмента, проходящего выше высоты более низкорослых женских растений, между периодом цветения и сбором урожая, при этом инструмент применяет химическое вещество в отношении более высокорослых растений с мужской фертильностью, при этом происходит предотвращение или ослабление нормального развития растений с мужской фертильностью, превышающих эту высоту, и разделение семян по плотности для удаления нежелательных самоопылившихся семян мужских растений после сбора семян.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro, включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения Codonopsis lanceolata Benth. & Hook. Fil., включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию гипохлоритом натрия, высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,5 мгл 6-ВАР и 0,05 мгл IAA, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мгл сахарозы и IAA в концентрации 0,5-1 мгл, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч. Изобретение позволяет получить высокий коэффициент размножения и, как следствие, необходимое количество саженцев. 9 ил.

Наверх