Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80 oc с раствором гекмолит

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови с криоконсервантом Гекмолит. Замораживание клеток-предшественников периферической крови (КППК) проводят поэтапно: производят смешивание его с концентратом КППК в равных пропорциях в одноразовом пластиковом контейнере, затем его герметизируют, паспортизируют, помещают в металлический пенал-холдер, после чего осуществляют поэтапное замораживание клеточной взвеси от плюс 4°С до минус 80°С в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры холодовой адаптации клеток, размораживание в водяной бане до температуры плюс 2÷4°С в клеточной взвеси, при этом на первом этапе замораживания контейнеры с суспензией КППК выдерживают 10 минут в электрическом морозильнике, с установленной температурой плюс 4°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник с температурой минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего биообъект переносят в морозильник-хранилище с температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК. Изобретение повышает технологический уровень и эффективность криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток за счет использования современного промышленного оборудования и минимизации рисков посттрансфузионных осложнений, доступно лечебным учреждениям, испытывающих проблемы в обеспечении жидкого азота, и безопасно для здоровья технического персонала. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) до температуры минус 80°С без контроля скорости охлаждения с криоконсервантом Гекмолит. Гекмолит содержит гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (ГМБТОЭМ) и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при следующих соотношениях компонентов, мас.%: ГМБТОЭМ 30,0-50; ЭДТА 0,08-0,18, Бидистиллированная вода - Остальное. Коррегируют рН раствора до 7,0-7,2 с помощью 2 н. раствора х.ч. соляной кислоты (см. патент РФ №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995).

Способ замораживания КППК с криоконсервантом Гекмолит включает смешивание раствора Гекмолит с нативной стабилизированной миеловзвесью (НСМ) в соотношении 1:1 в пластиковом криопакете, его герметизацию, маркировку, эквилибрацию взвеси ядросодержащих клеток (ЯК) с криоконсервантом при температуре плюс 4°С в течение 20÷30 мин, укладку в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры изотермической холодовой адаптации клеток (ТА) по ступенчатой программе, причем на первом этапе криопакет с миеловзвесью помещают на 10 мин в электрический холодильник с температурой плюс 4°С, на втором этапе переносят в электроморозильник с ТА минус 28±2°С, выдерживают их в этих условиях в течение 10÷25 мин, после чего переносят в морозильник-хранилище с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной криоконсервации, после чего проводят отогревание криопакета в водной среде до температуры клеточной взвеси плюс 2÷4°С. Присутствие в растворе криоконсерванта Гекмолит базового криопротектора ГМБТОЭМ со среднелетальной дозой - ЛД50, равной 15,5±0,6 г/кг массы мыши, минимизирует токсичность рабочего раствора криоконсерванта на клеточном и организменном уровнях, не требует отмывания перед трансплантацией криоконсервированных КППК, способствует сохранности ЯК.

Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С с раствором Гекмолит относится к медицине, в частности к трансфузиологии.

Важными составляющими в повышении эффективности клеточных технологий на основе применения криоконсервиованных КППК с ГСК для клинических целей являются обеспечение морфофункциональной сохранности большого процента ГСК, доступности лечебным учреждениям, простота выполнения, безопасность и экономичность.

В технологии замораживания КППК известны способы их длительной консервации, которые включают добавление криоконсерванта на основе ГМБТОЭМ в НСМ, поэтапное замораживание смеси в жидкоазотном программном замораживателе, длительное хранение при температуре минус 80÷ минус 196°С и последующее отогревание. Подбор значений температур и скоростей охлаждения произведены эмпирически лабораторным способом (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. - Киев, Наук. Думка, - 1994. - С. 68-69; Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - С. 44-45 (Коми научный центр УрО РАН).

Недостатками такого решения способа замораживания КППК являются: высокая затратность, потребность в дефицитном жидком азоте, сложности при работе с криогенной техникой и риск посттрансфузионных осложнений.

В качестве прототипа нами использован способ замораживания ЯК костного мозга с криоконсервантом на основе ГМБТОЭМ, включающего смешивание ГМБТОЭМ с НСМ в равных пропорциях, замораживание в жидком азоте в аппарате УОП 000 000 по двух- и трехэтапной программам. В образцах ЯК, замороженных с раствором Гекмолит по описанному методу, после отогревания сохраняется в среднем 86,4±1,5% миелокариоцитов, 70,7±3,7% мононуклеаров, 73,2±3,1% эозинорезистентных и 83,3±2,7% стволовых кроветворных клеток (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - С. 44-45 (Коми научный центр УрО РАН), патент 2049391 «Средство для криоконсервирования костного мозга».

Недостатками прототипа являются высокая затратность, потребность в запасах дефицитного жидкого азота, опасность инфекционных, простудных заболеваний и ожоговых травм, потребность в высококвалифицированном обслуживающем персонале и негативный человеческий фактор.

Поэтому поставленной задачей было устранение указанных недостатков, а также разработать доступный для широкой сети лечебных учреждений безазотный способ эффективного замораживания КППК.

Цель изобретения - повысить сохраннность ЯК и экономичность их криоконсервирования.

Поставленная цель достигается тем, что в вышеописанном способе при замораживании КППК в качестве хладоагента используют холод рефрижераторов.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - заготовка концентрата НСМ с ГСК; Б - смешивание криоконсерванта Гекмолит с НСМ в равных пропорциях; В - эквилибрацию НСМ с криоконсервантом Гекмолит при температуре плюс 4°С в течение 20-30 мин, герметизацию, маркировку и укладку пластикового криопакета с ЯК в металлический пенал-холдер; Г - замораживание клеточной взвеси от температуры плюс 4°С до минус 80±2°С в режиме многоступенчатой программы; Д - размораживание биообъекта в водной среде с температурой плюс 39°С до температуры плюс 2÷4°С в клеточной взвеси.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа замораживания КППК с криоконсервантом Гекмолит являются: Е - в известном способе взвесь ЯК в растворе Гекмолит замораживали по 3-х ступенчатой программе с помощью жидкоазотного программного замораживателя клеточных суспензий УОП 000 000, требующего постоянного обеспечения жидким азотом, высококвалифицированного технического обслуживания, несущего риск человеческого фактора и микробной контаминации биообъекта при контакте с инфицированным жидким азотом; И - в предлагаемом изобретении замораживание клеточной взвеси осуществляют от плюс 4°С до минус 80°С в экономичных, простых в обслуживании и доступных широкой сети лечебных учреждений электрических рефрижераторах, например, марки Sanyo, с заранее установленной ТА.

Предлагаемый способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности ЯК после замораживания-отогревания. В том числе: количество морфологически сохранных клеток в пределах 90,71±6,79%, количество эозинорезистентных клеток - 85,7±1,47%, количество мононуклеаров -75,57±16,0%, количество CD34+ клеток - 77,63±16,70%.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Пример выполнения

Криоконсервант Гекмолит готовят заблаговременно согласно рецепта по патенту РФ №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995. Фасуют в полимерные криопакеты и длительно охлаждают в электрическом холодильнике при температуре плюс 4°С.

Производят смешивание раствора Гекмолит с нативной стабилизированной миеловзвесью и концентратом ядросодержащих клеток (ЯК) в соотношении 1:1 в пластиковом криопакете, его герметизацию, маркировку, эквилибрацию взвеси ядросодержащих клеток (ЯК) с криоконсервантом при температуре плюс 4°С в течение 20÷30 мин, укладку в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры изотермической холодовой адаптации клеток (ТА) по ступенчатой программе, на первом этапе биообъект помещают на 10 мин в электрический холодильник марки Sanyo MDF-U5411 с температурой плюс 4±1°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник марки Sanyo MDF-U333 с ТА минус 22±1°С и выдерживают в этих условиях 10 мин, на третьем этапе контейнер с ЯК переносят в электроморозильник марки Sanyo MDF-U5411 с установленной температурой минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего на четвертом этапе биообъект быстро переносят в морозильник-хранилище марки Sanyo MDF-U53 с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной (до 7 мес) криоконсервации ядерных клеток. Замороженные КППК с ГСК отогревают интенсивным покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 39°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 ÷ плюс 4°С. Берут пробу размороженного клеточного материала одноразовым шприцем для контрольных морфологических и функциональных тестов.

Сравнительный анализ результатов криоконсервирования КППК, замороженных известным и заявляемым способами предоставлен в табл. 1.

Результаты исследований, представленные в табл. 1, показывают, с одной стороны, высокий уровень контрольных морфологических и функциональных тестов известного и заявляемого способов замораживания КППК с раствором Гекмолит, с другой стороны, отмечают повышенный класс опасности для жизни человека, осуществляющего замораживание КППК известным способом.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа замораживания КППК.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови с криоконсервантом Гекмолит, отличающийся тем, что осуществляют смешивание раствора криоконсерванта Гекмолит с нативной стабилизированной миеловзвесью в соотношении 1:1 в пластиковом криопакете, его герметизацию, маркировку, эквилибрацию взвеси ядросодержащих клеток (ЯК) с криоконсервантом при температуре плюс 4°С в течение 20-30 мин, укладку в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры изотермической холодовой адаптации клеток (ТА) по ступенчатой программе, причем на первом этапе криопакет с миеловзвесью помещают на 10 мин в холодильник с температурой плюс 4°С±1°С, на втором этапе переносят в электроморозильник с ТА минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 10-25 мин, после чего переносят в морозильник-хранилище с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной криоконсервации, после чего проводят отогревание криопакета в водной среде до температуры взвеси ЯК плюс 2-4°С.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к питательной среде для транспортировки клеток для дальнейшего цитологического и иммуноцитохимического исследования.

Изобретение относится к медицине. Средство для гипотермической консервации трансплантата роговицы включает ингредиенты при следующем их соотношении, мас.%: Среда 199 с солями Хэнкса 41,15 Среда F-12 с Hepes 25,00 Среда DMEM с Hepes 25,00 L-глутамин 0,145 Хондроидина сульфат А 1,00 Декстран-40 5,70 Антибиотик-антимикотик (Пенициллин- Стрептомицин- Амфотерицин В) 2,00 Триметазидина дигидрохлорид 0,005 Изобретение позволяет осуществить фармакологическую защиту клеточных мембран кератоцитов и эндотелия роговицы в процессе холодового хранения, содействовать восстановлению поврежденных структур, защите трансплантата роговицы от гипоксического и гипотермического стрессов, и как следствие, предупреждить развитие энергодефицитного состояния в результате снижения внутриклеточной концентрации аденозинтрифосфата, а также пролонгировать сроки консервации без существенного снижения плотности эндотелиальных клеток.

Изобретение относится к способу получения костного имплантата и может быть использовано в медицине. Предложен способ получения костного имплантата на основе стерильного деорганифицированного костного матрикса, включающий механическую обработку кости фрезерованием с учетом направления остеонных структур кости в среде охлажденного до 4°С стерильного раствора, удаление органической фазы из костной заготовки, инкубацию деминерализованного костного матрикса в растворе сангвиритрина для его иммобилизации с последующей 2-этапной комбинированной стерилизацией озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6-8 мг/л, продолжительностью 10-20 мин в проточном режиме на первом этапе и радиационным облучением потоком быстрых электронов с величиной поглощенной дозы 11-15 кГр герметично упакованных образцов на втором этапе.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к нерегламентирорванному замораживанию клеток-предшественников периферической крови. Способ включает приготовление раствора криоконсерванта, для чего берут раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с ПП 0,200-0,220, в условиях гипотермии добавляют его в раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10% и производят смешивание его с концентратом аферезных клеток-предшественников периферической крови в равных пропорциях, замораживание от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной контрольной температурой изотермической холодовой адаптации на каждом этапе замораживания.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к безопасному хранению и транспортировке трансплантируемого охлажденного сердца животных под давлением консервирующей газовой среды и мобильному устройству для этого.

Изобретение относится к области биотехнологии. Данный способ витрификации ооцитов млекопитающих может быть успешно применён к сельскохозяйственным животным, в частности для крупного рогатого скота (КРС).

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения гамма-глобулиновой и альбуминовой фракций плазмы крови с помощью химических дезинфектантов.

Изобретение относится к устройству для транспортировки и консервации вне организма биологического образца и соответствующему способу. Устройство (1) включает в себя камеру (2) для содержания биологического образца (100), ограниченную стенками (4), выполненными из теплоизоляционного материала.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Гербицидная композиция для борьбы с сорными двудольными и злаковыми растениями в посевах кукурузы содержит в качестве активных ингредиентов (А) тербутилазин, (В) никосульфурон и (С) 2,4-Д или ее производные при отношении в смеси (А):(В):(С), равном (1-15):1:(0.5-7).

Изобретения относятся к сельскому хозяйству. Корректоры питания растений состоят из полифункционального высокомолекулярного соединения - матрицы, содержащего в боковой цепи не менее двух типов функциональных групп, выбранных из следующего ряда: амидная, аминная, гидроксильная, карбонильная, лактамная, нитрильная, сульфоновая, фосфоновая, причем в качестве действующих компонентов содержит как минимум один из макроэлементов в следующих количествах: азот - не менее 10 г/л, калий в пересчете на K2O - не менее 10 г/л, фосфор в пересчете на Р2О5 - не менее 10 г/л или как минимум один из микроэлементов в следующих количествах: сера в пересчете на SO42- - не менее 55 г/л, цинк - не менее 15 г/л, бор - не менее 25 г/л, молибден - не менее 15 г/л, кальций - не менее 10 г/л, железо - не менее 15,5 г/л, магний - не менее 55 г/л, а в качестве консерванта вещество, выбранное из группы: глутаровый альдегид, 3-иодо-2-пропинилбутилкарбамат, 1,3-диметилол-5,5-диметилгидантоин, 4,4-диметилоксазолидин, 2-бром-2-нитропропан-1,3-диол, метилпарабен или его соли, пропилпарабен или его соли.

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови с криоконсервантом Гекмолит. Замораживание клеток-предшественников периферической крови проводят поэтапно: производят смешивание его с концентратом КППК в равных пропорциях в одноразовом пластиковом контейнере, затем его герметизируют, паспортизируют, помещают в металлический пенал-холдер, после чего осуществляют поэтапное замораживание клеточной взвеси от плюс 4°С до минус 80°С в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры холодовой адаптации клеток, размораживание в водяной бане до температуры плюс 2÷4°С в клеточной взвеси, при этом на первом этапе замораживания контейнеры с суспензией КППК выдерживают 10 минут в электрическом морозильнике, с установленной температурой плюс 4°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник с температурой минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего биообъект переносят в морозильник-хранилище с температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК. Изобретение повышает технологический уровень и эффективность криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток за счет использования современного промышленного оборудования и минимизации рисков посттрансфузионных осложнений, доступно лечебным учреждениям, испытывающих проблемы в обеспечении жидкого азота, и безопасно для здоровья технического персонала. 1 табл., 1 пр.

Наверх