Способ изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (рнга)
Владельцы патента RU 2714305:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан" (RU)
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Способ изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) включает формалинизацию эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным сенситином. При этом для изготовления эритроцитарного антигена трехсуточную культуру В. abortus 19, выращенную на плотной питательной среде, изготовленной на основе гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, смывают с поверхности питательной среды стерильным 12%-ным раствором хлористого натрия, доводят концентрацию бакмассы до 70-80 млрд м.к. в 1 мл, подвергают автоклавированию при 0,5-0,7 атм., рН 8,0-9,0 в течение 45 минут и используют для сенсибилизации эритроцитов, предварительно обработанных поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа». Изобретение обеспечивает получение специфичного высокоактивного эритроцитарного антигена, применение которого для исследования сывороток крови животных выявляет более широкий спектр специфических бруцеллезных антител, обладающих агглютинирующей, комплементсвязывающей и преципитирующей активностью. 4 табл.
Изобретение относится к области ветеринария, в частности, к приготовлению диагностических препаратов и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных в РНГА.
Известно несколько способов изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является «Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)», при котором выращивание Brucella abortus 19 для получения бактериальной массы бруцелл проводят на мясопептонном - печеночно-глюкозоглицериновом агаре (МППГГА) в матровых колбах, затем выросшую культуру бруцелл смывают с поверхности агара 12%-ным раствором хлористого натрия. Взвесь бруцелл этим же раствором доводят до концентрации 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности и для извлечения антигенных комплексов из микробных клеток и обезвреживания бруцелл автоклавируют при 1 атм, в течение 20-30 минут, после чего ее обрабатывают сочетанным применением растворов 4,0-4,5%-ного универсального концентрированного поверхностно активного моющего средства «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» и 0,25%-ного препарата додецилсульфата натрия. Смесь взвеси бруцелл с детергентами выдерживают в течение 45 мин в водяной бане при 45-50°, периодически перемешивая через каждые 5-10 мин, затем используют для сенсибилизации эритроцитов, формалинизированных по способу Вайнбаха в модификации Прикаспийского зонального НИВИ (патент на изобретение №2667121, 2019 г. «Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)», авторы Юсупов О.Ю., Микаилов М.М., Халиков А.А. и др.).
Недостатками этого способа являются:
- невысокая активность эритроцитарного антигена, получаемого по данному способу, вследствие чего при исследовании сывороток крови в реакции непрямой гемагглютинации с его применением не достигается полного выявления всех заболевших, что обусловливает необходимость многократных исследований, в связи с чем затягиваются сроки оздоровления неблагополучных по бруцеллезу стад (ферм);
- необходимость использования при изготовлении эритроцитарного диагностикума для РНГА бакмассы бруцелл, полученной путем выращивания В. abortus 19 на плотной питательной среде - мясопептонном печеночно-глюкозоглицериновом агаре (МППГГА), основой которой являются мясной и печеночный бульоны, изготовленные из высокоценных пищевых продуктов - говяжьего мяса и печени, что экономически не оправдано.
Целью изобретения является разработка способа изготовления специфичного и высокоактивного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), позволяющего повысить чувствительность этой реакции и выявить зараженных бруцеллезом животных, реагирующих во всех широко применяемых в практике при диагностике бруцеллеза серологических реакциях (РА, РСК, РБП, РИД с О-ПС антигеном) и заменить питательную среду, применяемую для получения бактериальной массы бруцелл из штамма В. abortus 19 при производстве антигена, питательной средой, основой которой является непищевое сырье - панкреатический гидролизат казеина и экстракт хлебных дрожжей.
Поставленная цель достигается автоклавированием взвеси бруцелл из штамма В. abortus 19, выращенных в течение 72 часов на указанной питательной среде, изготовленной на основе гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, обеспечивающей оптимальный рост и хорошее накопление бакмассы бруцелл, в гипертоническом 12%-ном растворе хлористого натрия при 0,5-0,7 атм., РН 8,0-9,0 в течение 45 минут, использованием этой взвеси в качестве сенситина для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов и обработкой их перед сенсибилизацией 4,0-4,5%-ным раствором поверхностно активного средства -концентрированного универсального моющего средства «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» (г. Лосино-Петровский Московской области) при 45-50°С в течение 45 минут.
Существенными отличиями изобретения являются следующие.
1. Высокая активность эритроцитарного антигена для РНГА, получаемого по данному способу, вследствие чего удается выявить в сыворотке крови исследуемых животных более широкий спектр специфических бруцеллезных агглютинирующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител и установить диагноз на бруцеллез у всех животных, реагирующих в широко применяемых в ветеринарной практике серологических реакциях (РА, РСК, РБП, РИД О-ПС антигеном).
2. Взвесь бруцелл из штамма В. abortus 19, в гипертоническом 12%-ном растворе хлористого натрия, имеющую концентрацию 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл, подвергают более длительному, по сравнению с прототипом, автоклавированию при щадящем оптимальном режиме - 0,5-0,7 атмосфер и РН - 8,0-9,0 в течение 45 минут, что позволяет улучшить экстрагирование из микробных клеток антигенных комплексов, расширить их антигенный спектр, избегая при этом сильной денатурации микробных белков, что повышает активность эритроцитарного антигена и чувствительность РНГА.
3. Для повышения адсорбированных свойств формалинизированных эритроцитов и лучшей сенсибилизации их, следовательно, повышения активности эритроцитарного антигена, формалинизированных эритроцитов перед сенсибилизацией обрабатывают при температуре 45-50°С в течение 45 минут, 4-4,5%-ным раствором поверхностно активного средства «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» (г. Лосино-Петровский Московской области), основным действующим веществом которого является композиция анионовых поверхностно активных веществ (АПАВ).
4. Способ позволяет заменить питательную среду, применяемую для выращивания В. abortus 19 при изготовлении эритроцитарного антигена для РНГА - МППГГА, на более дешевую питательную среду, основой которой является непищевое сырье - гидролизат казеина и экстракт хлебных дрожжей и обеспечивающую лучший рост В.abortus 19 и хорошее накопление бакмассы бруцелл.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Трехсуточную культуру бруцелл из штамма 19, выращенную на казеиново-дрожжевом агаре, смывают 12%-ным раствором хлорида натрия, фильтруют через четыре слоя марли, доводят концентрацию бруцелл 12%-ным раствором хлористого натрия до 70-80 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности, устанавливают РН 8,0-9,0 и для извлечения антигенных комплексов и обезвреживания бруцелл подвергают автоклавированию при 0,5-0,7 атм. в течение 45 минут.
После автоклавирования взвесь бруцелл остужают до температуры 45-50°С и в нее добавляют 4-4,5% к общему объему бакмассы детергента «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» (г. Лосино-Петровский Московской области). Взвесь бруцелл после добавления детергента в течение 45 мин. выдерживают в водяной бане при температуре 45-50°С, периодически перемешивая через каждые 5-10 минут, после чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов, предварительно обработанных для повышения адсорбционных свойств 4-4,5% раствором к объему эритроцитов, при температуре 45-50° в течение 30 минут детергентом «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» (г. Лосино-Петровский Московской области).
Формалинизацию эритроцитов барана проводят по способу Вайнбаха в модификации Прикаспийского зонального НИВИ, которая заключается в том, что формалинизацию эритроцитов проводят в течение 16-18 часов, вместо 24 ч, и встряхивают их в Шутель-аппарате непостоянно, как рекомендует автор, а через каждые 30 минут в течение 1,5-2 минут. Это дает возможность сократить время стабилизации эритроцитов и получить максимальный выход эритроцитов без признаков гемолиза и склеивания, которые наблюдаются иногда при постоянном встряхивании их в течение 24 часов.
Подготовленные таким способом эритроциты сохраняют свою стабильность и адсорбционные свойства в течение 2-х лет и более при условии хранения в темном месте при температуре 4-6°С.
Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов после обработки детергентом проводят взвесью бруцелл в 12%-ном растворе хлорида натрия, содержащей широкий спектр антигенных комплексов (сенситин) при температуре 45-50°С в течение 2-х часов.
После сенсибилизации эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором от избытка антигена путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10-15 минут. После последнего центрифугирования в пробирки вносят физиологический раствор с таким расчетом, чтобы получилась 2,5%-ная взвесь эритроцитов. Взвесь эритроцитов гомогенизируют путем встряхивания пробирок. Полученную взвесь сенсибилизированных эритроцитов 2,5%-ной концентрации используют в качестве антигена (диагностикума) для постановки РНГА. Реакцию ставят со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус в разведениях 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400 и негативной сывороткой крови в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Сыворотки разводят физиологическим раствором. Все разведения сыворотки прогревают в водяной бане при 60-62°С в течение 30 минут. После чего к 0,5 мл каждого разведения сыворотки вносят по 0,05 мл (по одной капле) взвеси эритроцитов, сенсибилизированных разными дозами антигена. Затем содержимое полистиролового планшета (разведения сыворотки + эритроцитарный антиген) тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 3-4 часа, после чего проводят учет реакции.
За оптимальную дозу антигена принимают ту, с которой в РНГА получена четкая положительная реакция со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус в разведении 1:3200 с оценкой четыре или три креста.
Пример. Результаты сравнительной проверки активности и специфичности 3-х эритроцитарных антигенов для РНГА, изготовленных тремя разными способами:
1. Эритроцитарного антигена для РНГА (антиген №1), изготовленного путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов, предварительно обработанных детергентом - универсальным концентрированным средством «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа», взвесью бруцелл из штамма В. abortus 19, выращенной на твердой питательной среде, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей и автоклавированной при щадящем режиме (0,5-0,7 атм, РН 8,0-9,0 в течение 45 мин) для лучшего, более полного извлечения из бруцелл антигенных комплексов с широким антигенным спектром (таблица 1);
2. Эритроцитарного антигена для РНГА (антиген №2), изготовленного таким же способом путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов, но не подвергавшихся предварительной обработке детергентом - универсальным концентрированным средством «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» (таблица 2);
3. Эритроцитарного антигена для РНГА (антиген №3), изготовленного по способу, взятому в качестве прототипа (патент на изобретение №2667121, 2018 г. ) путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов взвесью бруцелл в 12% -ном растворе хлористого натрия, имеющих концентрацию 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл, автоклавированных при 1 атм, в течение 30 минут и обработанных сочетанным применением детергентов -концентрированного универсального моющего средства «Прогресс» и 0,25%-ного раствора додецилсульфата натрия (таблица 3).
Как видно из приведенных в таблицах данных, способ изготовления эритроцитарного антигена для РНГА путем автоклавирования взвеси бруцелл, имеющей концентрацию 70-80 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности, в гипертоническом 12%-ном растворе хлористого натрия при оптимальном щадящем режиме (0,5-0,7 атм., РН 8,0-9,0, в течение 45 минут) и сенсибилизацией этой взвесью формалинизированных эритроцитов, предварительно обработанных детергентом - 4-4,5%-ным раствором универсального концентрированного средства «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» (г. Лосино-Петровский Московской области) позволяет получить специфичный и высоко активный эритроцитарный антиген для РНГА, имеющий в реакции непрямой гемагглютинации со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус титр 1:3200 с оценкой в четыре или три креста (таблица 1), тогда как титр РНГА с эритроцитарным антигеном, изготовленным по способу, взятому в качестве прототипа, со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус, без предварительной обработки детергентом формалинизированных эритроцитов не превышал 1:1600 (таблица 3).
Активность эритроцитарного антигена, полученного путем сенсибилизации той же взвесью бруцелл (сенситин) формалинизированных эритроцитов, предварительно необработанных детергентом - универсальным концентрированным средством «Прогресс», была значительно ниже. При исследовании с применением этого антигена на бруцеллез стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус получена положительная РНГА в титре 1:800 (таблица 2).
Таким образом при сенсибилизации формалинизированных, предварительно обработанных детергентом эритроцитов суспензией бруцелл в гипертоническом 12%-ном растворе хлористого натрия, содержащей более широкий спектр антигенных комплексов, извлеченных из микробных клеток путем автоклавирования бакмассы при оптимальном щадящем режиме, достигается повышение активности диагностикума. При исследовании с его применением в РНГА национального стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус, титр данного антигена составлял 1:3200 с оценкой в четыре или три креста, тогда как с эритроцитарным антигеном для РНГА, изготовленным по известному способу (прототип), титр не превышал 1:1600 с оценкой в три, реже - четыре креста.
При испытании этого высокоактивного эритроцитарного антигена для исследования в РНГА сывороток крови крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу хозяйств было установлено, что применение его позволяет выявить более широкий спектр специфических антител, обладающих агглютинирующей, комплементсвязывающей и преципитирующей активностью, т.е. установить бруцеллез у животных, реагирующих как в РА, РБП, так и в РСК и РИД.
Пример. Для испытания эритроцитарного антигена, изготовленного по новому, усовершенствованному способу, в РНГА, в сравнении с РА, РСК, пластинчатой РА с Розбенгал антигеном (РБП) и реакцией иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным (О-ПС) антигеном, были исследованы на бруцеллез сыворотки крови 52 коров неблагополучного по бруцеллезу хозяйства. Результаты испытания приведены в таблице 4.
Как видно из данных, приведенных в таблице 4, применение для исследования на бруцеллез сывороток крови крупного рогатого скота неблагополучного по бруцеллезу хозяйства высокоактивного эритроцитарного антигена для РНГА, изготовленного по усовершенствованному способу, позволяет выявить более широкий спектр специфических бруцеллезных антител и установить диагноз на бруцеллез у всех животных, реагирующих в широко применяемых в ветеринарной практике диагностических тестах (РА, РСК, РБП, РИД).
Способ изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), включающий формалинизацию эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным сенситином, отличающийся тем, что для изготовления эритроцитарного антигена трехсуточную культуру В. abortus 19, выращенную на плотной питательной среде, изготовленной на основе гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, смывают с поверхности питательной среды стерильным 12%-ным раствором хлористого натрия, доводят концентрацию бакмассы до 70-80 млрд м.к. в 1 мл, подвергают автоклавированию при 0,5-0,7 атм, рН 8,0-9,0 в течение 45 минут и используют для сенсибилизации эритроцитов, предварительно обработанных поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа».
