Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса



Владельцы патента RU 2717088:

Мелконян Карина Игоревна (RU)
Гилевич Ирина Валериевна (RU)
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница N 1 имени профессора С.В. Очаповского" Министерства здравоохранения Краснодарского края (ГБУЗ "НИИ-ККБ N 1 им. проф. С.В. Очаповского" Минздрава Краснодарского края) (RU)
Юцкевич Яна Андреевна (RU)
Порханов Владимир Алексеевич (RU)
Богданов Сергей Борисович (RU)
Сотниченко Александр Сергеевич (RU)
Каракулев Антон Владимирович (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в реконструктивной хирургии для создания технологии получения и использования в практических целях биоинженерного матрикса в качестве трансплантата. Для этого осуществляют забор свиной дермы толщиной 3 мм после предварительного снятия эпидермиса дерматомом, далее образцы замораживают до температуры -80°С, после разморозки образцы заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов; на втором этапе образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона X100 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5. После каждого детергента образцы промывают в деионизированной воде в течение 10 минут. На третьем этапе следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I (2000 ЕД растворяли в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов. Завершают децеллюляризацию воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов. После этого подтверждают качество децеллюляризации методами гистологического исследования, молекулярно-биологического анализа и культуральными методами. Способ позволяет сократить время экспозиции воздействия децеллюляризирующих растворов, снизить уровень остаточной ДНК в ткани до 60 нг/мг ткани во влажном образце.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, реконструктивной хирургии для создания технологии получения и использования в практических целях биоинженерного матрикса в качестве трансплантата.

Кожа является самым большим органом в организме, и выполняет ряд важных функций, прежде всего, барьерную, иммунную, сенсорную, обладает способностью к саморегуляции и рядом других особенностей [Suhail S. et al., 2019]. Потеря целостности кожных покровов из-за травм или болезней может привести к острому физиологическому дисбалансу и, в конечном итоге, к значительной инвалидности или даже смерти [Воусе ST. al., 2018].

Повреждения кожных покровов разнообразны и могут возникать из-за ожогов, травм, или быть обусловлены трофическими нарушениями вследствие венозной гипертензии, артериальной недостаточности, сахарным диабетом и другими причинами, приводящими к изъязвлениям кожи. Ряд наследственных заболеваний, связанных с нарушением структурных белков эпидермиса или дермы, также могут вызывать развитие обширных кожных ран и хронических эрозий [Petrof G. al., 2014].

Как правило, при повреждении кожи происходит ряд сложных биохимических процессов, направленных на заживление раны. В поверхностных ранах, где дефекты ограничены эпидермисом или верхним дермальным слоем, необходима регенерация только эпидермиса, что приводит к быстрому заживлению и минимальному риску образования рубцов. Тем не менее, в ранах, проникающих глубже дермального слоя, с отслоением кожи или подкожно-жировой клетчатки, осложнения, такие как инфекция, развиваются чаще, и рубцы, как правило, остаются даже после полного заживления раны. Длительность процесса заживления ран в действительности имеет тенденцию варьировать у разных людей и зависит от различной степени тяжести повреждения [You HJ. et al., 2014].

Терапевтические вмешательства по восстановлению кожных покровов и функций кожи являются важным долгосрочным направлением как традиционной, так и трансляционной медицины, в которой в последние годы было отмечено ряд ключевых достижений и клинических преимуществ [Petrof G. al., 2014]. Выбор подходящей стратегии заживления ран имеет решающее значение для успешного их закрытия. От данного выбора зависит скорость заживления раневой поверхности, вероятность наступления осложнений и образования рубцов. В настоящее время используются различные методы для закрытия раневых дефектов. В качестве покрытий раневых поверхностей применяют трупные аллотрансплантаты, ксенотрансплантаты, синтетические материалы. Золотым стандартом лечения большинства кожных ран остается аутодермопластика.

Благодаря интеграции инженерных дисциплин с биологическими науками в настоящее время активно развивается регенеративная медицина [Wu SC. al., 2010]. Рассматриваются возможности применения клеточных технологий, дополнительных биологических факторов, которые направлены на стимуляцию регенерации ткани. Проводятся экспериментальные работы по созданию тканеинженерной полноценной кожи [Chua AWC al., 2010]. Такие разработки интересны и, несомненно, могут оказаться полезными особенно в тех случаях, когда имеется значительный дефицит кожных покровов и невозможно выполнить аутодермопластику.

Тканеинженерный подход к созданию искусственных органов включает в себя использование матриксов, стволовых клеток и биологически активных веществ. Одним из методов получения матриксов является децеллюляризация нативной ткани или органа. Выбор оптимального способа получения матрикса является одной из главных задач в тканевой инженерии. С учетом высокой встречаемости ожоговых повреждений кожи, весьма актуальной является разработка способа подготовки материала для создания биоинженерной конструкции кожи.

Известен способ получения дермального матрикса из кожи человека и животных толщиной до 0,38 мм. На первом этапе проводят децеллюляризацию кожного лоскута путем замораживания-оттаивания. Затем кожу погружают в гипертонический раствор натрия хлорида (1М) и перемешивают. Этим достигается деэпителизация кожного лоскута. Второй этап представляет собой децеллюляризацию собственно дермы при помощи детергента додецилсульфата натрия (0,2%). После многократной отмывки физиологическим раствором полученный биоматериал упаковывают, хранят при -80°С в течение 1 года [Хватов В.Б. и соавт. Патент РФ на изобретение №2524619 С2 от 02.04.2013 г. «Способ изготовления дермального матрикса»].

Недостатками данного способа является источник исходного сырья -кожа человека, что требует проведения тщательных исследований с целью исключения потенциальных инфекций у доноров. Такой источник сырья ограничивает возможность получения больших по площади лоскутов. Также недостатком является использование в качестве детергента раствора додецилсульфата натрия, который оказывает повреждающее действие на структуры внеклеточного матрикса дермы.

За ближайший аналог принят способ проведения децеллюляризации кожи свиньи [Сарбаева Н.Н. и соавт. Патент РФ на изобретение RU 2694543 от 09.11.2018 «Способ получения дермального матрикса»], заключающийся в деэпителизации путем многократного замораживания, оттаивания лоскута кожи и обработки его гипертоническим раствором натрия хлорида с последующим помещением в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена. На втором этапе децеллюляризацию продолжали с использованием 2% раствора дезоксихолата натрия в течение 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов и обработкой 2% раствором дезоксихолата натрия в комбинации с панкреатической липазой в течение 9 часов со сменой раствора каждые 3 часа. Далее элиминировали из образцов ДНК при помощи раствора ДНК-азы 0,1 мг/мл, приготовленного с использованием трис-HCl буфера рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция (II) хлорида и инкубировали их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора, добиваясь содержания ДНК в контрольных образцах не выше 200 нг/мг. Качество образцов оценивали дополнительно с помощью морфологического исследования путем изготовления гистологических препаратов, окрашенных пикросириусом красным; препараты исследовали, применяя поляризационную микроскопию, и оценивали матрикс на предмет целостности коллагеновых волокон и сохранения их пространственной ориентации; качественный состав дермального матрикса исследовали с применением времяпролетной масспектрометрии с ионизацией электроспреем; достигаемым целевым параметром являлось удаление основного пула клеточных белков (тубулин, аннексии, виментин, кавеолин и т.д.) и идентификация в составе матрикса преимущественно матрисомных белков (декорин, дерматопонтин). При достижении целевых параметров дермальные матриксы подлежали химической стерилизации, упаковке и криоконсервации.

Основными недостатками данного способа является длительность проведения децеллюляризации и многократные циклы заморозки и разморозки, создающие угрозу бактериальной контаминации каркаса, а также высокие целевые количественные значения остаточной ДНК, превышающие принятые критерии в 4 раза.

Сущностью предложенного изобретения является то, что забор дермы свиней толщиной 3 мм для проведения децелюляризации осуществляют после предварительного снятия эпидермиса дерматомом, далее производят замораживание образцов в низкотемпературном морозильнике до температуры -80°С, после разморозки образцы заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов; на втором этапе образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона X100 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5, после воздействия каждого детергента следует промывка образцов в деионизированной воде в течение 10 минут; на третьем этапе следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I (2000 ЕД растворяли в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов, завершают децеллюляризацию воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов, причем качество децеллюляризации подтверждают путем гистологического окрашивания, определения количественного содержания ДНК, определения жизнеспособности клеток на полученном каркасе по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.

Техническим результатом способа является сокращение времени экспозиции перфузионных растворов. Ранее использовавшиеся протоколы повреждали матрикс дермы и несли высокий риск развития бактериальной контаминации, что крайне неблагоприятно сказывалось на качестве полученного каркаса и возможности последующего создания тканеинженерной конструкции. Применение тритона Х100 совместно с дезоксихолатом натрия, снижение времени воздействия децеллюляризирующих растворов полностью нивелирует негативные эффекты известных способов того же назначения. Также предложенный способ позволяет снизить уровень остаточной ДНК в ткани до 60 нг/мг ткани во влажном образце. Кроме того, способ предусматривает оценку биосовместимости и жизнеспособности клеток, засеянных на каркас, по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (МТТ-тест).

Способ получения свиного ацеллюлярного дермального матрикса осуществляют следующим образом: в условиях операционной под наркозом в положении животного на боку после стандартной обработки операционного поля электродерматомом производится деэпителизация, после чего следует забор фрагмента дермы толщиной 3 мм. Полученные образцы замораживают в низкотемпературном морозильнике до температуры -80°С. Размороженные образцы заливают раствором Трипсина-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов. Далее образцы помещают на вращающуюся платформу и децеллюляризируют путем последовательного воздействия растворами детергентов: 1% раствора Тритона XI00 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5, после воздействия каждого детергента следует промывка образцов в деионизированной воде в течение 10 минут. Удаление остаточной ДНК осуществляют путем обработки образцов раствором свиной панкреатической ДНКазой I (2000 ЕД растворяют в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов, затем завершают децеллюляризацию отмывкой от децеллюляризирующих растворов и дезинфекцией матрикса в 10% растворе хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов.

Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляют методами гистологического исследования (окрашивание гематоксилином и эозином, флуорофором DAPI), молекулярно-биологического анализа (анализ количественного содержания остаточной ДНК во влажной ткани), культуральными методами (определение жизнеспособности клеток на полученном каркасе по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде - МТТ-тест).

Способ апробирован в течение 2 лет на биологическом материале (дерма) экспериментальных животных (свиньи). Результаты полностью подтвердили решаемые задачи. Получен естественный матрикс дермы с сохранной гистологической структурой и отсутствием неповрежденных клеточных элементов и не являющийся цитотоксичным в условиях in vitro.

Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса, включающий забор дермального лоскута толщиной 3 мм, отличающийся тем, что перед забором образца снимают эпидермис дерматомом, далее выполняют 1 цикл заморозки при температуре -80°С, далее образец размораживают, заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов, затем образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона XI00 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5, после воздействия каждого детергента следует промывка образцов в деионизированной воде в течение 10 минут, далее следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I 2000 ЕД /200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов, завершают децеллюляризацию воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов, причем качество децеллюляризации подтверждают путем гистологического окрашивания, определения количественного содержания ДНК, определения жизнеспособности клеток на полученном каркасе по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения выделенной фракции сыворотки из обогащенного тромбоцитами фибрина (ОТФ).

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к порошкообразному полусинтетическому материалу для изготовления заменителей кости, инъекционных цементов или цементов для герметизации эндопротезов или для изготовления устройств для биоабсорбируемого остеосинтеза и формованных имплантатов, полученному из морского природного биоматериала, с добавками нерастворимых и растворимых биополимеров и карбоната кальция, преобразованного карбонатизацией, где природный морской биоматериал представляет собой арагонитовый внутренний слой раковины двустворчатых моллюсков, выбранный из группы, включающей Pinctadines и Tricdacnes, а также относится к способу получения порошкообразного полусинтетического материала; к применению материала в качестве костного заменителя с приготовлением непосредственно перед применением для заживления или восстановления потерь вещества, лечения ожогов, струпьев, язв, эритемных кожных повреждений или для изготовления устройств или литых имплантатов; к применению карбоната кальция после карбонатизации, используемого в порошкообразном полусинтетическом материале в виде пластичной, формируемой и липкой добавки в композициях с содержанием солей кальция, природных или синтетических полимеров, коллагена, минеральных поперечных нитей костных тканей животного или человеческого происхождения и к применению извлечённых нерастворимых или растворимых биополимеров, используемых в порошкообразном полусинтетическом материале в качестве добавок для порошкообразных композиций, содержащих соли кальция, природные или синтетические полимеры, коллаген, минеральные поперечные нити костных тканей животного или человеческого происхождения.

Группа изобретений относится к медицине. Описаны способы, связанные с регенеративной медициной, для лечения поражений хряща, остеоартрита и повреждения хряща, в частности.

Группа изобретений относится к медицине. Описаны способы, связанные с регенеративной медициной, для лечения поражений хряща, остеоартрита и повреждения хряща, в частности.

Группа изобретений относится к медицине, конкретно к способу обработки тканевой матрицы, такой как свиная кожная ткань. Способ включает выбор ткани; приведение ткани в контакт с первым водным раствором алкалазы, имеющей активность, обеспечивающую требуемое увеличение эластичности, измеренной с помощью испытания ткани на драпируемость, без значительного разрушения коллагена; и приведение обработанной алкалазой ткани в контакт со вторым раствором для удаления по меньшей мере некоторых клеток и клеточных компонентов из указанной ткани.

Группа изобретений относится к медицине, конкретно к способу получения костного регенеративного материала, который включает в себя: приведение костного материала, содержащего гидроксиапатит и органические вещества, в контакт с экстракционной жидкостью, что дает первую жидкую фазу, содержащую упомянутые органические вещества и, возможно, примеси, экстрагированные из упомянутого костного материала, и вторую твердую гидроксиапатитную фазу, содержащую упомянутый гидроксиапатит; и разделение упомянутой жидкой фазы и упомянутой твердой гидроксиапатитной фазы.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения полусинтетического гибридного материала из природного гибридного биоматериала.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ обработки коровьего ксеногенного имплантата сухожилия, включающий этапы извлечения ксеноантигена из сухожилия, усиления прочности сухожилия, включающего обработку сахарным раствором глюкозы, стерилизацию сухожилия и химическое ополаскивание сухожилия, где один или более указанных этапов состоят из введения в контакт указанного коровьего ксеногенного сухожилия с очищающими средствами, в то время как к сухожилию прикладывают натяжение, и при этом величина указанного натяжения составляет между 267 и 334 Ньютонов, и, дополнительно, где имплантат при обработке погружают внутрь указанных очищающих средств в камере для обработки.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способу получения материала для биопластических операций из костной ткани природного происхождения, включающему разделение кости на пластины толщиной от 1,0 до 25,0 мм; проведение ионной отмывки в ионном солевом растворе; промывание пластины деионизированной водой; обрабатывание раствором щелочи; отмывание проточной водой; обезжиривание, которое осуществляют органическим растворителем; проведение деминерализации в растворе кислоты; обрабатывание в стерильных условиях перекисью водорода; доведение с помощью механической обработки пластины до толщины 0,5-5,0 мм с приданием формы в виде мембран и блоков различной высоты и ширины; отмывание очищенной водой, затем этанолом; высушивание в вакуумном шкафу и нагревание в условиях, обеспечивающих стеклование материала.

Группа изобретений относится к медицине. Описан способ получения имеющих высокую оптическую плотность растворов наночастиц, таких как нанопластины, серебряные нанопластины или серебряные пластинчатые наночастицы.

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в реконструктивной хирургии для создания технологии получения и использования в практических целях биоинженерного матрикса в качестве трансплантата. Для этого осуществляют забор свиной дермы толщиной 3 мм после предварительного снятия эпидермиса дерматомом, далее образцы замораживают до температуры -80°С, после разморозки образцы заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 обмин при 37°С на 18 часов; на втором этапе образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 обмин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1 раствора Тритона X100 в течение 2 часов и 4 раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5. После каждого детергента образцы промывают в деионизированной воде в течение 10 минут. На третьем этапе следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I в шейкер-инкубаторе в режиме 100 обмин при 37°С в течение 4 часов. Завершают децеллюляризацию воздействием 10 раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов. После этого подтверждают качество децеллюляризации методами гистологического исследования, молекулярно-биологического анализа и культуральными методами. Способ позволяет сократить время экспозиции воздействия децеллюляризирующих растворов, снизить уровень остаточной ДНК в ткани до 60 нгмг ткани во влажном образце.

Наверх