Способ культивирования каллусной культуры полыни обыкновенной (artemisia vulgaris l.)

Авторы патента:

C12N5/04 - клетки или ткани растений

Владельцы патента RU 2718254:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К.Аммосова" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры дикорастущего растения полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян полыни растворами перекиси водорода (3% раствор) в течение 10 минут, этилового спирта (70% раствор) в течение 1 минуты, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде в течение 5 минут, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 2500, вода – 1000 мл, агар – 7000, дальнейшее помещение листовых эксплантов, полученных из проростков, в питательную среду следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, гидролизат казеина – 500, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 30000, 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота – 1, 6-бензиламинопурин - 1, нафтилуксусная кислота – 1, вода - 1000 мл, агар – 12000; при этом культивирование растений проводят в темноте при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели. Изобретение позволяет получить каллусную культуру полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) в условиях in vitro. 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для пищевой и фармацевтической промышленности как источник сырья для пищевой добавки и биологически активных веществ.

Полынь обыкновенная, чернобыльник, Artemisia vulgaris L., относится к семейству сложноцветных. Строение корневища крепкое, немного ветвистое. Стебли прямостоячие, красно-бурые, наверху разветвленные, до 1,0-1,5 м высотой. Листья сверху голые или слегка пушистые, темно-зеленые, снизу сероватые, паутинисто-войлочные, перисто-рассеченные на удлиненные зубчатые доли. Цветки очень мелкие, собраны в яйцевидные корзинки 2-4 мм шириной, составляющие широкое, несколько поникающее, метельчатое соцветие; обертка каждой корзинки покрыта густым войлочком; цветки красноватые, реже желтые. Цветет в июле-августе. Места произрастания пустыри, огороды, сорные места, возле жилья, реже луга и берега рек.

Используемые органы полыни обыкновенной: верхушки цветущих растений. Для заготовки сырья собирают лиственные цветоносные верхушки в период цветения. Установлено, что в траве содержится эфирное масло (до 0,61%), аскорбиновая кислота (175 мг %), каротин, немного дубильных веществ. В состав эфирного масла входят туйон, цинеол, борнеол. Известно, что в условиях произрастания в Якутии листья полыни обыкновенной содержат на сырой вес до 130 мг% аскорбиновой кислоты и 11 мг% каротина, при этом в траве содержится 0,04-0,05% эфирного масла (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии и перспективы их освоения. - Новосибирск: Издательство СО РАН, 2002. - 264 с.). Масло характеризуется как жидкое, светло-желтое, со слабым запахом. Анализы образцов различного сбора на алкалоиды дали противоречивые показатели.

Растение широко применяется в народной медицине многих стран при различных заболеваниях женской половой сферы (аменорея, дисменорея), как обезболивающее и ускоряющее роды средство, а также в качестве успокаивающего, противосудорожного средства при эпилепсии, неврастении и других нервных заболеваниях. Помимо этого, отвар всего растения применяют при гастритах, как мочегонное; порошком из сухих веток засыпают раны. В китайской медицине листья применяют в качестве кровоостанавливающего, жаропонижающего, общеукрепляющего, а также антитоксического средства. Назначают при токсикозах, пиодермии, невралгиях. При бронхиальной астме назначают вдыхание дыма, получаемого от сжигания сухих стеблей и листьев. Наружно применяют ванны из отвара надземных частей растения при почечнокаменной болезни, при кожных заболеваниях. В якутской народной медицине отвар рекомендуют пить при головной боли, боли под лопаткой, при глистах, параличах и проказе. Известно, что трава входит в состав микстуры М.Н. Здренко (см. SU №115587, кл. А61К 35/78, опубл. 1958). Кроме того, растение употребляется в пищу: в дореволюционное время служило в иные периоды основным источником поддержания жизни.

Известны способы культивирования Artemisia annua L., например, по патенту CN №102487823 (кл. G01D 3/043, опубл 23.07.2008) молодые стебли растения дезинфицируют и поперечно режут на сегменты и культивируют в среде для укоренения. Далее пересаживают для укоренения в почву.

Ближайшим аналогом заявленного решения является разработка состава питательной среды для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. для ускорения роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы (см. RU №2393217, кл. С12N 5/04, опубл. 27.06.2010), при этом, питательная среда содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, фитогормоны, витамины, сахарозу, а в качестве гормона - бензиламинопурин (6-БАП).

При этом используется гормональный состав питательной среды, содержащий в качестве гормона роста только фитогормон 6-бензиламинопурин, что недостаточно для ускорения роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы.

Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) для использования в качестве источника биомассы для пищевой добавки и для получения биологически активных веществ.

Для решения поставленной задачи способ получения каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) включает стерилизацию семян интактных растений полыни раствором перекиси водорода (3 % раствор) в течение 10 мин и этилового спирта (70 % раствор) в течение 1 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 2500, вода – 1000 мл, агар – 7000, дальнейшее помещение листовых эксплантов растений, полученных в лабораторных условиях, в питательную среду следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, гидролизат казеина – 500, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 30000, 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота – 1, цитокинин (6-бензиламинопурин) – 1, нафтилуксусная кислота – 1, вода - 1000 мл, агар – 12000, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели, при пересеве используют ¼ живых каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 21 суток.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.).

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, культивируемые в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, фитомасса которого собрана на территории Амгинского района (с. Болугур) Республики Саха (Якутия) в фенофазах «конец цветения, начало плодоношения».

При этом семена стерилизовали раствором 3% перекиси водорода в течение 10 минут, затем 70% спиртовым раствором в течение 1 мин. После стерилизации материал трехкратно ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Стерильные семена помещали на твердую питательную среду без гормонов. Культивирование проростков проводили до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования свежих проростков растения содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Из полученного проростка получают листовые экспланты, которые помещали в питательную среду с дополнительным добавлением гидролизата казеина, 6-бензиламинопурина, нафтилуксусной кислоты. Наиболее интенсивное каллусообразование получили при концентрации фитогормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в 1 мг/л, 6-бензиламинопурина - 1 мг/л, α-нафтилуксусной кислоты - 1 мг/л. После образования каллусной ткани проводили его отделение и рассадку в культуральные сосуды (чашки Петри, конические колбы на 100 и 250 мл) со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусной ткани содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 2.

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 3 недели. При пересеве используют ¼ живой каллусной культуры. Полученные каллусные культуры пересаживали каждые 21 день, таким образом, сохраняя полученную ткань. В процессе культивирования определяют морфологические, цитологические характеристики, также отбирали для молекулярных исследований и химических анализов.

Технический результат - получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.).

Полученный каллус характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: каллусные культуры плотные, оформленные, имеют светло-серую окраску. Для определения веса сырой биомассы каллусные культуры отделяют от среды культивирования на бумажные фильтры и взвешивают. При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 18-ые сутки культивирования, что позволяет использовать 3 недельный цикл выращивания. Ростовые параметры рассчитывали по сырому весу биомассы. Результаты представлены в таблице 3 и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения каллусных культур полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) из листовых эксплантов проростков, полученных в лабораторных условиях. Таблица 1

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культивирования проростков к получению стерильных эксплантов, мг/л

Компоненты:	Содержание
NH₄NO₃	33000
KNO₃	38000
CaCl₂x2H₂O	8800
MgSO₄x7H₂O	7400
KH₂PO₄	3400
KI	166
H₃BO₃	1240
MnSO₄x4H₂O	4460
ZnSO₄x7H₂O	1720
Na₂MoO₄x2H₂O	50
CuSO₄x5H₂O	5
CoCl₂x6H₂O	5
FeSO₄x7H₂O	5560
Na-ЭДТА	7460
Мезоинозит	100
Тиамин	100
Пиридоксин	100
Никотиновая кислота	100
Сахароза	2500
Вода	1000
Агар	7000

Таблица 2

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для получения каллусной культуры, мг/л

Компоненты:	Содержание
NH₄NO₃	33000
KNO₃	38000
CaCl₂x2H₂O	8800
MgSO₄x7H₂O	7400
KH₂PO₄	3400
KI	166
H₃BO₃	1240
MnSO₄x4H₂O	4460
ZnSO₄x7H₂O	1720
Na₂MoO₄x2H₂O	50
CuSO₄x5H₂O	5
CoCl₂x6H₂O	5
FeSO₄x7H₂O	5560
Na-ЭДТА	7460
Мезоинозит	100
Гидролизат казеина	500
Тиамин	100
Пиридоксин	100
Никотиновая кислота	100
Сахароза	30000
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	1
6- бензиламинопурин	1
Нафтилуксусная кислота	1
Вода	1000 мл
Агар	12000

Таблица 3

Ростовые параметры каллусных культур полыни обыкновенной

Показатели	Значения, в г
Индексы роста по весу сырой биомассы	0,1678
Удельный рост по весу сырой биомассы, сут -1	0,0084

Способ получения каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.), включающий стерилизацию семян интактных растений полыни растворами перекиси водорода в течение 10 мин и этилового спирта в течение 1 мин, ополаскивание, отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава:

NH₄NO₃	33000 мг
KNO₃	38000 мг
CaCl₂x2H₂O	8800 мг
MgSO₄x7H₂O	7400 мг
KH₂PO₄	3400 мг
KI	166 мг
H₃BO₃	1240 мг
MnSO₄x4H₂O	4460 мг
ZnSO₄x7H₂O	1720 мг
Na₂MoO₄x2H₂O	50 мг
CuSO₄x5H₂O	5 мг
CoCl₂x6H₂O	5 мг
FeSO₄x7H₂O	5560 мг
Na-ЭДТА	7460 мг
Мезоинозит	100 мг
Тиамин	100 мг
Пиридоксин	100 мг
Никотиновая кислота	100 мг
Сахароза	2500 мг
Вода	1000 мл
Агар	7000 мг

дальнейшее помещение эксплантов растений, полученных в лабораторных условиях, в питательную среду следующего состава:

NH₄NO₃	33000 мг
KNO₃	38000 мг
CaCl₂x2H₂O	8800 мг
MgSO₄x7H₂O	7400 мг
KH₂PO₄	3400 мг
KI	166 мг
H₃BO₃	1240 мг
MnSO₄x4H₂O	4460 мг
ZnSO₄x7H₂O	1720 мг
Na₂MoO₄x2H₂O	50 мг
CuSO₄x5H₂O	5 мг
CoCl₂x6H₂O	5 мг
FeSO₄x7H₂O	5560 мг
Na-ЭДТА	7460 мг
Мезоинозит	100 мг
Гидролизат казеина	500 мг
Тиамин	100 мг
Пиридоксин	100 мг
Никотиновая кислота	100 мг
Сахароза	30000 мг
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	1 мг
6-бензиламинопурин	1 мг
Нафтилуксусная кислота	1 мг
Вода	1000 мл
Агар	12000 мг

при этом культивирование растений проводят в темноте при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели, при пересеве используют ¼ живых каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 21 сутки.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян змееголовника раствором 3% перекиси водорода в течение 5 минут, 80% этиловым спиртом в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, мг/л: NH4NO3 - 33000, KNO3 - 38000, CaCl2×2H2O - 8800, MgSO4×7H2O - 7400, KH2PO4 - 3400, KI - 166, Н3ВО3 - 1240, MnSO4×4H2O - 4460, ZnSO4×7H2O - 1720, Na2MoO4×2H2O - 50, CuSO4×5H2O - 5, CoCl2×6H2O - 5, FeSO4×7H2O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000.

Способ выделения суммы фурокумаринов из клеточной культуры болиголова пятнистого (conium maculatum l.) // 2713118

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выделения суммы фурокумаринов из клеточной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.), характеризующийся тем, что собранную биомассу высушивают при температуре 25°С в темном защищенном от действия света месте, затем 100 г каллусной культуры болиголова пятнистого обезжиривают последовательно тремя порциями по 250 мл петролейного эфира, настаивают с добавлением 500 мл 70%-ного водного раствора ацетона и поэтапно обрабатывают 30 мл 10%-ного спиртового раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ного водного раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ного раствора кислоты хлористоводородной, добавляют 150 мл хлороформа, хлороформный слой отделяют и высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре.

Способ культивирования каллусной ткани vaccinium myrtillus l. // 2709175

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования каллусной ткани Vaccinium myrtillus L.

Устройство для биопечати одиночными тканевыми сфероидами и используемая в нем печатающая головка // 2701330

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена печатающая головка и устройство печати тканевыми сфероидами.

Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека // 2698397

Изобретение относится к биотехнологии и решает задачу способа получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и его применения для профилактики нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и ее восстановления при токсических и стрессовых воздействиях, а также для его применения для профилактики нарушений иммунной системы организма, связанных с нарушениями микрофлоры кишечника и барьерной функции кишечника, и восстановления иммунной системы при ее нарушениях в качестве иммуностимулирующего средства.

Универсальная донорная система для направленного воздействия на гены // 2687369

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к области точной трансформации растений, направленной геномной интеграции и экспрессии белка у растений. Предложена полинуклеотидная донорная кассета для трансформации растения, которая содержит связывающий домен сайт-специфической нуклеазы, аналитический домен, включающий полинуклеотидную последовательность с по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 142, и плазмидный домен.

Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток // 2684215

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а именно к получению клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток и увеличению выхода β-клеток.

Трансформант для экспрессии цис-пренилтрансферазы и рецептора nogo-b // 2682047

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к трансформированной клетке для экспрессии цис-пренилтрансферазы и рецептора Nogo-B, полученной посредством введения в клетку кодирующего гена, кодирующего цис-пренилтрансферазу, и гена, кодирующего рецептор Nogo-B.

Носитель для культивирования клеток человека и животных // 2663131

Изобретение относится к области биохимии. Предложен носитель для культивирования клеток человека и животных.

Способ получения экстрактов из рода panax, включая дикий женьшень или женьшень, либо камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода panax, или их экстрактов, содержащих редкие гинсенозиды в большом количестве // 2662953

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение относится к способу повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, в камбиальных меристематических клетках (CMCs) из рода Panax, который включает тепловую обработку культивируемых камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax при температуре от 85°C до 160°C, камбиальным меристематическим клеткам (CMCs) из рода Panax, в которых содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, повышено по сравнению с их содержанием до тепловой обработки с помощью способа по п.