Бактериальная композиция для применения в уменьшении ухудшения показателей после физической нагрузки

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к нетерапевтическому применению композиции для уменьшения, или снижения, или устранения ухудшения показателей после физической нагрузки и к применению композиции для лечения и/или предупреждения заболеваний, вызванных физической нагрузкой, выбранных из: мышечной боли, мышечной болезненности, воспаления мышц, мышечной усталости и/или мышечной дегенерации, для увеличения количества мышечной энергии и улучшения митохондриальных функций у субъекта, у которого имеется их дефицит, путем перорального введения субъекту композиции, содержащей смесь: штамма бактерий Bifidobacterium breve BR03 DSM 16604 и штамма бактерий Streptococcus thermophilus FP4 DSM 18616 или как альтернатива состоящей из них, где штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 DSM 16604 и Streptococcus thermophilus FP4 DSM 18616 присутствуют в весовом соотношении, составляющем 1:1, и в количестве, составляющем 5×10⁹ КОЕ/г каждого штамма в композиции. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил.

 

Настоящее изобретение относится к бактериальной композиции, которая эффективно применяется в области спортивного питания, поскольку она способна уменьшать ухудшение спортивных показателей субъекта после физической нагрузки. Известно, что интенсивная и продолжительная спортивная активность приводит к напряжению, которое способно даже вызвать в той или иной степени выраженное повреждение волокон мышц, подвергнутых указанному усилию, в зависимости от его интенсивности. Кроме того, интенсивное и продолжительное занятие спортом приводит в результате к общему воспалительному ответу иммунной системы, которая реагирует на причиненные повреждения мышц. В связи с этим спортивные показатели снижаются с неизбежным спадом эффективности.

Напряженная и нечастая физическая нагрузка, особенно с выраженным эксцентрическим компонентом, может привести к повреждению мышц, вызванному физической нагрузкой (EIMD). Исследования показали, что эксцентрическая физическая нагрузка вызывает EIMD из-за того, что мышца подвергается чрезмерному принудительному растягиванию и сокращению, что усугубляет механическую избыточную нагрузку, вызывая таким образом травму мышцы в виде микротравмы. Симптомы EIMD включают в себя синдром отсроченной мышечной болезненности (DOMS), уменьшенную сопротивляемость, отек, повышенные концентрации креатинкиназы вследствие разрушения клеточной мембраны, ослабленную функцию сосудов и уменьшенное снабжение глюкозой. Эти симптомы возникают в любой момент времени от 24 часов до 7 дней после физической нагрузки и связаны с повышением уровня как воспаления, так и циркулирующих лейкоцитов. Травмированная мышца привлекает лейкоциты в данный участок, и таким образом нейтрофилы и макрофаги высвобождают ROS и провоспалительные цитокины с целью восстановления поврежденного участка. TNF-a отвечает за протеолиз мышц, и его экспрессия повышается под действием IL-6. Другие цитокины, такие как NF-κβ, также активируются с помощью ROS. Поврежденная ткань таким образом восстанавливается и адаптируется, становясь более устойчивой по отношению к последующим прилагаемым эксцентрическим нагрузкам.

Таким образом, под «повреждением мышц» подразумевают потерю функциональности одной или более мышц, которая может быть временной, т. е. с возможностью полного восстановления в течение более или менее длительного периода времени посредством обычных физиологических процессов для восстановления тканей мышц, или она может характеризоваться постоянными эффектами в виде сниженной, даже частичной, функциональности.

Под «физической нагрузкой» подразумеваются занятия спортом, оздоровительная, игровая, рабочая, двигательная или другая активность, которая включает мышечные движения и по меньшей мере потенциально способна вызвать травму мышц, как определено выше, у субъектов, выполняющих ее, в частности, без ограничения у субъектов без специальной подготовки в отношении таких мышечных движений.

Следовательно, было бы очень целесообразно иметь натуральное эффективное легко принимаемое средство без побочных эффектов для здоровья, предназначенное для всех субъектов, выполняющих напряженные и нечастые занятия спортом или физическую нагрузку.

Заявитель, после интенсивной и продолжительной деятельности в области научных исследований и разработок, подходящим образом удовлетворил вышеуказанные потребности.

Объект настоящего изобретения представляет собой композицию для применения в занятиях спортом, имеющую характеристиками, изложенные в прилагаемой формуле изобретения.

Объектом настоящего изобретения является нетерапевтическое применение композиции, содержащей смесь, которая содержит по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, и по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, или, как альтернатива, состоит из них, для уменьшения, или снижения, или устранения ухудшения показателей после физической нагрузки, где указанное применение предусматривает пероральное введение указанной композиции субъекту, который подвергается указанной физической нагрузке. Объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая смесь, которая содержит по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, и по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, или, как альтернатива, состоит из них, при этом указанная композиция предназначена для применения в лечении, направленном на излечение и/или предупреждение мышечной боли, мышечной болезненности, воспаления мышц, мышечной усталости и/или мышечной дегенерации, для увеличения количества мышечной энергии и улучшения митохондриальных функций у субъекта, у которого имеется их дефицит.

Объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая смесь, которая содержит штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) и Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616) или, как альтернатива, состоит из них, предпочтительно в весовом соотношении, составляющем 1:1, и предпочтительно в количестве, составляющем 5 x 10⁹ КОЕ/г, каждого штамма.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения далее подробно описаны в данном документе в качестве примера, а следовательно не ограничивают его объем.

В контексте настоящего изобретения подразумевается, что композиция(-и) по настоящему изобретению охватывают фармацевтические композиции, композиции для медицинских устройств, композиции для добавочных продуктов, а также пищевые, нутрицевтические и функциональные композиции.

Заявителем разработана композиция, содержащая смесь, которая содержит по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, и по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, или, как альтернатива, состоит из них, при этом указанная композиция предназначена для применения в уменьшении, или снижении, или устранении ухудшения спортивных показателей после физической нагрузки, которое может привести к повреждению мышц.

Штаммы бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, являющиеся объектом настоящего изобретения, выбраны из-за их способности индуцировать синтез интерлейкина 10 (IL-10), который оказывает противовоспалительный pro-Th2 эффект с целью обеспечения действия и повторного установления надлежащего соотношения Th1/Th2 (равновесия).

Штаммы бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, являющиеся объектом настоящего изобретения, вместе со штаммами бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, выбраны из-за их способности индуцировать снижение/уменьшение уровня интерлейкина 6 (IL-6), который оказывает провоспалительный pro-Th1 эффект с целью обеспечения действия и повторного установления надлежащего соотношения Th1/Th2 (равновесия).

Заявителем осуществлен точный выбор из некоторых видов бактерий, принадлежащих к родам Lactobacilli и Bifidobacteria, и после нескольких попыток ему удалось выявить вид Bifidobacterium breve и вид Streptococcus thermophilus.

Преимущественно, среди многих штаммов бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604), депонированный 20/07/2004 Anidral Srl (в настоящее время Probiotical SpA), показал себя как очень интересный в отношении индуцирования увеличения уровня IL-10, противовоспалительного цитокина. Выбранные штаммы бактерий B. breve, являющиеся объектом настоящего изобретения, среди которых штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03, индуцируют заметное увеличение количества T-хелперных лимфоцитов и секрецию цитокинов Th2 (IL-10 и IL-4), а также обладают удивительной противовоспалительной способностью вследствие смещения баланса Th1/Th2 в сторону Th2-ответа.

Преимущественно, среди многих штаммов бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616), депонированный 13/09/2006 Mofin Sri, проявил себя как очень интересный в отношении индуцирования уменьшения уровня IL-6, провоспалительного цитокина. Выбранные штаммы бактерий S. thermophilus, являющиеся объектом настоящего изобретения, среди которых штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616), индуцируют заметное уменьшение секреции цитокинов Th1 (IL-6), что смещает баланс Th1/Th2 в сторону Th1-ответа.

Преимущественно, дополнение рациона композицией по настоящему изобретению, которая содержит смесь, содержащую штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) и штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616), или, как альтернатива, состоящую из них, способно уменьшить воспаление путем снижения воспалительного ответа и уменьшения ухудшения показателей после физической нагрузки. Два штамма бактерий присутствуют в смеси в весовом соотношении, составляющем 1:1, или 2: 1, или 3:1, или 4:1, или 1:2, или 1:3, или 1:4.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать добавки, ароматизаторы, стабилизаторы pH и вспомогательные средства или ингредиенты, пригодные для применения в области фармакологии или пищевых продуктов.

Штаммы бактерий можно покрыть, инкапсулировать или покрыть пленкой с помощью слоя липидов, например с помощью слоя растительных липидов, с целью способствования как поступлению, так и поглощению, например на уровне кишечника. Штаммы бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve и виду Streptococcus thermophilus, присутствуют при концентрации, составляющей от 1 x 10⁶ до 1 x 10¹¹, предпочтительно от 1 x 10⁷ до 1 x 10¹⁰, еще более предпочтительно от 1 x 10⁸ до 1 x 10⁹ КОЕ/г в пересчете на общий вес композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая смесь, которая содержит штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) и Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616) или, как альтернатива, состоит из них в весовом соотношении, составляющем 1:1.

Преимущественно, композицию по настоящему изобретению эффективно применяют в случае продолжительной физической нагрузки, которая повреждает мышечные волокна.

Преимущественно, указанная композиция может быть предназначена для терапевтического применения, а именно, у субъектов, которые перенесли травму мышц или подверженных риску ее возникновения, или, как альтернатива, для нетерапевтического применения, т. е. в отношении субъектов, которые не страдают от конкретного патологического состояния и не подвержены конкретному риску его развития.

Объектом настоящего изобретения является нетерапевтическое применение композиции, содержащей смесь, которая содержит по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, и по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, или, как альтернатива, состоит из них, для уменьшения, или снижения, или устранения ухудшения показателей после физической нагрузки, которая способна даже вызвать травму мышцы, при этом указанное применение предусматривает пероральное введение указанной композиции субъекту, который подвергается указанной физической нагрузке, которая также способна вызвать повреждения мышц.

Преимущественно, указанное применение предназначено для нетерапевтических целей, т. е. не относится к терапевтическому или направленному на предупреждение лечению заболеваний или нарушений, в частности вовлекающих мускулатуру, у субъектов, страдающих от данных заболеваний или нарушений и/или подверженных риску их развития.

В предпочтительном варианте осуществления, при применении в соответствии с настоящим изобретением, композиция содержит штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, который представляет собой штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03, депонированный в институте DSMZ под № DSM 16604, и/или штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, который представляет собой штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4, депонированный в институте DSMZ под № DSM 18616.

В предпочтительном варианте осуществления, при применении в соответствии с настоящим изобретением, композиция содержит штаммы бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, такие как штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03, депонированный в институте DSMZ под № DSM 16604, и штаммы бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, такие как штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4, депонированный в институте DSMZ под № DSM 18616, которые присутствуют при концентрации, составляющей от 1 x 10⁶ до 1 x 10¹¹, предпочтительно от 1 x 10⁷ до 1 x 10¹⁰, еще более предпочтительно от 1 x 10⁸ до 1 x 10⁹ КОЕ/г.

В предпочтительном варианте осуществления, при применении в соответствии с настоящим изобретением, композиция содержит штаммы бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, такие как штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03, депонированный в институте DSMZ под № DSM 16604, и штаммы бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, такие как штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4, депонированный в институте DSMZ под № DSM 18616, которые присутствуют в весовом соотношении, составляющем 1:1, или 2: 1, или 3:1, или 4:1, или 1:2, или 1:3, или 1:4; предпочтительно 1:1.

В предпочтительном варианте осуществления указанные штаммы бактерий находятся в инкапсулированной форме, т. е. покрыты по меньшей мере слоем липидов. В качестве неограничивающего примера указанный слой липидов может иметь растительное происхождение и/или характеризоваться точкой плавления в диапазоне от 40 до 60°C.

В предпочтительном варианте осуществления, при применении в соответствии с настоящим изобретением, композиция содержит штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) и Streptococcus thermophilus FP4 (DSM

18616), более предпочтительно, где указанные штаммы присутствуют в весовом соотношении, составляющем 1:1, более предпочтительно они покрыты слоем липидов, как описано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, при применении в соответствии с настоящим изобретением, композиция преимущественно повышает эффективность физической нагрузки во время тренировки и занятий спортом.

В предпочтительном варианте осуществления, при применении в соответствии с настоящим изобретением, физическая нагрузка представляет собой интенсивную и продолжительную спортивную активность, которая приводит в результате к усилию, повреждающему мышечные волокна и/или мускулатуру в целом.

В качестве альтернативы, композиция может быть предназначена для терапевтического применения, а именно, для уменьшения или предупреждения повреждений мышц у субъектов, которые достигали усилий, которые потенциально способны повредить ткани мышц.

Объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая смесь, которая содержит по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, и по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, или, как альтернатива, состоит из них, при этом указанная композиция предназначена для применения в лечении, направленном на излечение и/или предупреждение мышечной боли, мышечной болезненности, воспаления мышц, мышечной усталости и/или мышечной дегенерации, для увеличения количества мышечной энергии или улучшения митохондриальных функций у субъекта, у которого имеется их дефицит.

В предпочтительном варианте осуществления в композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, представляет собой штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03, депонированный в институте DSMZ под № DSM 16604, и/или где указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, представляет собой штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4, депонированный в институте DSMZ под № DSM 18616.

В предпочтительном варианте осуществления в композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением указанные штаммы бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve и виду Streptococcus thermophilus, присутствуют при концентрации, составляющей от 1 x 10⁶ до 1 x 10¹¹, предпочтительно от 1 x 10⁷ до 1 x 10¹⁰, еще более предпочтительно от 1 x 10⁸ до 1 x 10⁹ КОЕ/г.

В предпочтительном варианте осуществления в композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением указанные штаммы бактерий Bifidobacterium breve и Streptococcus thermophilus присутствуют в весовом соотношении, составляющем 1:1, или 2:1, или 3:1, или 4:1, или 1:2, или 1:3, или 1:4.

В предпочтительном варианте осуществления указанные штаммы бактерий находятся в инкапсулированной форме, а именно, покрыты по меньшей мере слоем липидов. В качестве неограничивающего примера указанный слой липидов может иметь растительное происхождение и/или характеризоваться точкой плавления в диапазоне от 40 до 60°C.

В предпочтительном варианте осуществления в композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением указанные штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) и Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616) предпочтительно находятся в весовом соотношении, составляющем 1:1, более предпочтительно они покрыты слоем липидов, как описано выше.

В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением усиливает общий иммунный ответ иммунной системы.

В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением уменьшает общий воспалительный ответ иммунной системы.

В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением способна сместить баланс Th1/Th2 в сторону Th2-ответа.

Объектом настоящего изобретения являются следующие предпочтительные варианты осуществления (PE 1-10).

PE 1. Композиция, содержащая смесь, которая содержит по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, и по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, или, как альтернатива, состоит из них; при этом указанная композиция предназначена для применения в уменьшении, или снижении, или устранении ухудшения показателей после физической нагрузки, повреждающей мышцы.

PE 2. Композиция для применения по PE 1, где указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, представляет собой штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03, депонированный в институте DSMZ под № DSM 16604.

PE 3. Композиция для применения по PE 1 или PE 2, где указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophiles, представляет собой штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4, депонированный в институте DSMZ под № DSM 18616.

PE 4. Композиция для применения по любому из PE 1-3, где физическая нагрузка представляет собой интенсивную и продолжительную спортивную активность, которая приводит в результате к усилию, повреждающему мышечные волокна и/или мускулатуру в целом.

PE 5. Композиция для применения по любому из PE 1-4, где штаммы бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve и виду Streptococcus thermophilus, присутствуют при концентрации, составляющей от 1 x 10⁶ до 1 x 10¹¹, предпочтительно от 1 x 10⁷ до 1 x 10¹⁰, еще более предпочтительно от 1 x 10⁸ до 1 x 10⁹ КОЕ/г.

PE 6. Композиция для применения по любому из PE 1-5, где штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) и Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616) присутствуют в весовом соотношении, составляющем 1:1, или 2: 1, или 3:1, или 4:1, или 1:2, или 1:3, или 1:4.

PE 7. Композиция для применения по любому из PE 1-6, где указанная композиция обеспечивает усиление общего иммунного ответа иммунной системы.

PE 8. Композиция для применения по любому из PE 1-6, где указанная композиция обеспечивает уменьшение общего воспалительного ответа иммунной системы.

PE 9. Композиция для применения по любому из PE 1-6, где указанная композиция обеспечивает улучшение переносимости физической нагрузки во время тренировки и занятий спортом.

PE 10. Композиция для применения по любому из PE 1-6, где указанная композиция способна сместить баланс Th1/Th2 в сторону Th2-ответа.

Следующие примеры представлены с целью иллюстрации практических вариантов осуществления настоящего изобретения, без намерения ограничить его цель.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Краткое описание

С целью определения эффекта композиции по настоящему изобретению, содержащей смесь на основе штамма бактерий Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) и штамма бактерий Streptococcus thermophilus FP4 (DSM 18616), в отношении воспалительного ответа и следующих показателей после периода выполнения интенсивной физической нагрузки, повреждающей мышцы, использовали рандомизированные двойные слепые плацебо-контролируемые двухфакторные измерения. Композиция в соответствии с настоящим изобретением уменьшала воспаление и обеспечивала большую адаптацию к тренировке, а следовательно повышала спортивные показатели. Изучали эффект приема указанной композиции в отношении воспаления и мышечной деятельности после периода выполнения интенсивной физической нагрузки, повреждающей мышцы.

Применяли рандомизированный двойной слепой плацебо-контролируемый перекрестный способ в отношении шестнадцати здоровых мужчин, выполнявших тренировки с отягощениями (25 ± 4 года; 177,9 ± 8,5 см; 81,1 ± 10,3 кг), которые каждый день принимали композицию со штаммами бактерий в инкапсулированной форме, при этом указанная композиция содержала 5 x 10⁹ КОЕ/г B. breve BR03 (DSMZ 16604) и 5 x 10⁹ КОЕ/г S. thermophilus FP4 (DSMZ 18616) (PRO), или плацебо (PLA) перед выполнением (21 день) физической нагрузки, которая повреждала сгибатели локтевого сустава.

Показатели сгибателей локтевого сустава и маркер воспаления (интерлейкин-6) измеряли перед и после физической нагрузки, повреждающей мышцы. "Отмывочный" период исследования, составлявший 21 день, разделял условия. Для определения результатов применяли стандартизированный анализ на основе абсолютного значения.

Оценивали эффект как лечения, так и времени в отношении зависимых переменных, представляющих интерес, с помощью модели ANOVA смешанного типа с применением SPSS V.22 (IBM Corporation; Армонк, штат Нью-Йорк). Применяли подход, заключавшийся в анализе на основе абсолютного значения. Данный подход обеспечивал решение задач, касающихся оценок величины эффекта большой выборки в отношении точности (ширина доверительного интервала) относительно минимального значимого изменения для рассматриваемого результата.

Результаты преимущественно показывают, что прием композиции, являющейся объектом настоящего изобретения, со штаммами бактерий в инкапсулированной форме (штаммы покрыты одним липидным покрытием растительного происхождения, характеризующимся точкой плавления в диапазоне от 40°C до 60°C), содержащей 5 x 10⁹ КОЕ/г B. breve BR03 (DSMZ 16604) и 5 x 10⁹ КОЕ/г S. thermophilus FP4 (DSMZ 18616), уменьшал ухудшение показателей через 24 (величина эффекта [ES] = 0,3), 48 (ES=0,5) и 72 часа (ES=0,3) после физической нагрузки, как измерено с помощью среднего пикового вращающего момента. Указанная композиция проявляла общий противовоспалительный эффект (ES=0,5).

Преимущественно, дополнение рациона указанной тестируемой композицией уменьшало ухудшение показателей и последующее воспаление после периода выполнения интенсивной физической нагрузки, повреждающей мышцы. Композиция по настоящему изобретению способна уменьшать, или снижать, или устранять ухудшение показателей после физической нагрузки, обычно наблюдаемое после периода осуществления интенсивной физической нагрузки, повреждающей мышцы, и уменьшать связанный воспалительный ответ, как измерено с помощью интерлейкина-6 (IL-6).

2. Субъекты

Критерии включения в исследование включали: (1) участие в структурированной тренировке с отягощениями в течение 1 года перед тестом; (2) воздержание от продуктов, содержащих пищевые добавки, или эргогенических добавок на протяжении 6 недель перед тестом и (3) воздержание от противовоспалительных лекарственных средств на протяжении предыдущего месяца.

Исследование проводили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и регистрировали на ClinicalTrials.gov: NCT02520583).

Все процедуры, связанные с субъектами-людьми, были одобрены экспертным советом медицинского учреждения при Техасском христианском университете для применения в исследованиях в отношении субъектов-людей (№ протокола 1501-009-1502). Все субъекты предоставили письменное согласие.

3. Экспериментальный протокол

Применяли рандомизированную двойную слепую плацебо-контролируемую перекрестную схему исследования для определения эффекта первого введения пробиотических штаммов B. breve BR03 и S. thermophilus FP4 в отношении последующих показателей и острого воспалительного ответа после тренировочной сессии с повреждением мышц. Перед экспериментальными тестами у воздерживающихся от приема пищи субъектов отбирали базовый образец крови, перед тем как им произвольным образом установили пероральный прием в течение 21 дня в качестве добавочного продукта либо пробиотической композиции, содержащей смесь из 5 миллиардов живых клеток (AFU) S. thermophilus FP4 (DSMZ 18616) и 5 миллиардов живых клеток (AFU) B. breve BR03 (DSMZ 16604) (Probiotical S.p.A., Новара, Италия; Probiotic), исходя из предыдущего исследования в отношении режима дозирования, либо плацебо.

Материалы исследования анализировали в Biolab Research S.r.l., Новара, Италия, посредством проточной цитометрии (способ исследования Biolab 612-04, стандартизированный согласно ISO 19344: 2015 IDF 232: 2015 и аккредитованный Accredia, Рим, Италия, >10 миллиардов живых клеток) и чашечного способа подсчета (способ исследования Biolab 031-08, >10 миллиардов КОЕ), подтверждающих подсчет целевых клеток.

По меньшей мере за 72 часа перед экспериментальным тестом субъектов ознакомляли с процедурой экспериментальной оценки (изометрическая сила).

Первый экспериментальный тест начинали по меньшей мере на 21-й день после начала введения пробиотика или плацебо. Субъектов инструктировали воздерживаться от любой не повседневной активности в течение 72 ч. перед тестом.

Кроме того, субъектов инструктировали воздерживаться от любой пищи, которая могла влиять на процедуры исследования. В день экспериментального теста субъектов, воздерживающихся от приема пищи в течение по меньшей мере 8 ч., помещали в положение лежа для введения катетера с целью обеспечения многократных отборов крови. После отбора базового образца крови оценивали окружность плеча, диапазон движений и уровень боли у субъектов перед разминкой с последующим определением изометрической силы.

Затем субъекты выполняли сессию с эксцентрическими физическими нагрузками на сгибатели локтевого сустава, которые, как известно, вызывают повреждения мышц. Изначальную конечность выбирали случайным образом. Сразу после эксцентрической физической нагрузки отбирали второй образец крови, и снова определяли изометрическую силу. Таким образом, субъектов помещали в положение лежа в течение 60 мин. Образцы крови получали через 30 мин. и 60 мин. после сессии эксцентрической физической нагрузки. Через один час после физической нагрузки снова оценивали окружность плеча, диапазон движений и уровень боли.

Субъектов повторно осматривали через 24, 48 и 72 часа после сессии эксцентрической физической нагрузки для отбора крови и оценки окружности плеча, диапазона движений и уровня боли с последующим определением изометрической силы. После 21-дневного отмывания субъекты повторяли экспериментальный протокол с введением добавочного продукта, альтернативного ранее принятому (а именно, субъекты, ранее получавшие плацебо, применяли пробиотик на второй сессии, и наоборот), и при этом использовали контралатеральную конечность.

3.1. Изометрический пик

Максимальный произвольный изометрический пиковый вращательный момент сгибателей локтевого сустава измеряли под суставным углом, составлявшим 90°, на изокинетическом динамометре (Biodex System 3, Ширли, Нью-Йорк, США). Перед определением максимального изометрического вращательного момента субъекты выполняли разминку из 2 подходов 3 повторений, от 60° до 180° при двух различных скоростях (90°⋅с^-1 и 60°⋅с^-1, соответственно), отдыхая в течение 30  с между подходами. Затем субъекты выполняли два теста на максимальный изометрический вращательный момент сгибателей локтевого сустава, при этом каждые 4 с были отделены 30 с отдыха между тестами. Получали словесное стимулирование, а также демонстрацию силы в режиме реального времени на протяжении выполнения физической нагрузки для стимулирования достижения максимальных усилий.

3.2. Протокол осуществления эксцентрической физической нагрузки

После разминки и определения изометрической силы субъекты выполняли 5 подходов по 10 максимальных эксцентрических сокращений (принудительное растягивание) со скоростью 30⋅с^-1. После каждого принудительного эксцентрического сокращения от 60° до 180°, научный персонал возвращал руку в исходное положение со скоростью 10°⋅с^-1 (12 с) с тем, чтобы субъект не выполнял концентрического сокращения. Подходы были разделены во времени на одну минуту, и субъектов стимулировали на протяжении выполнения физической нагрузки. Для всех исследований, в которых был задействован тот же субъект, был назначен один и тот же старший лаборант.

3.3. Анализ крови

В день сессии эксцентрической физической нагрузки субъектов помещали в положение лежа для введения катетера. Участок стерилизовали в соответствии со стандартным процедурами отбора, и вводили катетер (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния, США) в латеральную подкожную вену руки и закрывали колпачком для многократных отборов крови. Катетер поддерживали в проходимом состоянии с помощью вливания 2-3 мл 0,9% хлорида натрия (G-Biosciences, Сент-Луис, штат Миссури, США), вводимого в место отбора.

Перед каждым отбором крови из катетера применяли 3 мл Vacutainer (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния, США) для отбора образца, подлежащего удалению. Образец крови получали перед началом

введения тестируемой композиции и через 21 день перед выполнением сессии эксцентрической физической нагрузки. С этого момента времени кровь отбирали непосредственно после физической нагрузки и на 30 мин. и 60 мин позже. Образцы крови также отбирали через 24, 48 и 72 ч. после физической нагрузки. Образцы крови собирали в 10 мл EDTA пробирки (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния, США).

Образцы крови центрифугировали через 30 мин. после сбора в течение 20 мин. при 2000x g в центрифуге с охлаждением (4°C). Затем аликвоты плазмы крови немедленно переносили и замораживали при -80°C до дальнейшего анализа. Образцы плазмы крови анализировали в отношении концентраций IL-6 путем применения высокочувствительного в отношении IL-6 человека набора для ELISA Kit (R&D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота, США). Диапазон детектирования для этого теста составлял от 0,156 пг⋅мл^-1 до 10 пг⋅мл^-1. Коэффициенты вариации в пределах одного анализа и в пределах разных анализов для каждого теста составляли менее 10%.

3.4. Представление и преобразование данных

Первоначальные данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Все данные, за исключением данных на визуальной аналоговой шкале, были перед анализом логарифмически преобразованы для регулирования неоднородности погрешности. Эффекты лечения и лечения x время в отношении результатов оценивали с помощью анализа дисперсии с моделью смешанного типа (Proc Mixed, SAS 9.4, Кэри, штат Северная Каролина, США) с термином для субъекта в виде случайного эффекта. Оценки анализа с логарифмическим преобразованием были представлены в виде обратно логарифмически преобразованных среднеквадратичных средних значений или скорректированных средних геометрических значений с неопределенностью (90% доверительный интервал, CI).

3.5. Статистический анализ

В отношении анализа применяли подход на основе абсолютного значения. Численное преобразование показателей в экспериментальной модели в фактическую мощность показателей с изометрическим вращательным моментом в схеме исследования для изучения подтверждения принципа действия является неизвестным. Таким образом, наименьшую стандартизованную разность считали наименьшим основным изменением для основных и связанных с ними механистических результатов. В данном случае абсолютное значение порогового значения для наименьшего изменения представляло собой стандартизованную разность по Глассу d (0,2x исходной SD для контрольного условия).

Вероятность, что отличие являлось по меньшей мере большим, чем относительные пороговые значения, составляла 25% - 75% для низкой вероятности, 75% - 95% вероятно, 95% - 99,5% очень вероятно, >99,5% почти достоверно. Если большая часть (>50%) доверительного интервала (IC) попадала между пороговыми значениями для положительной и отрицательной значимости, то эффект оценивали как тривиальный (незначительный). Термины «полезный, тривиальный и вредный» относятся к наиболее вероятно направленному результату относительно порогового значения минимального эффекта. Термин «неясный» относится к результатам, где вероятность как для пользы, так и для ущерба составляет более 5%.

3.6. Изометрический пиковый вращательный момент

Через 21 день дополнения рациона средний пиковый вращательный момент был значительно меньшим (13,8%; 90% CI 25,4, 3,3%) после пробиотиков по сравнению с плацебо (фигура 5A). Ухудшение показателей наблюдали после физической нагрузки при обоих условиях, что доказывает эффективность протокола, вызывающего повреждение.

Введение композиции в соответствии с настоящим изобретением значительно усиливало генерирование максимального среднего изометрического вращательного момента через 24 и 72 часа после причиняющей вред физической активности по сравнению с состоянием перед физической нагрузкой (фигура 5B, эффект пробиотика-плацебо и 90% CI, вероятность % полезный/тривиальный/вредный:

24 ч., 11% 90% CI 17,4%, 92,5/7,4/048;

48 ч., 12% 90% CI 19,55%, 96,5/3,5/0;

72 ч., 8% 90% CI 15,0%, 77,3/22,4/0,3).

На фигуре 5a показан эффект от 21-дневного введения пробиотиков и плацебо в отношении среднего изометрического пикового вращательного момента перед и во время 72 часов после эксцентрической физической нагрузки. На фигуре 5b показана разность для пробиотика-плацебо со скорректированным баллом в отношении базового значения (до эксцентрической физической нагрузки). Данные на фигуре 5a представляют собой первоначальные средние значения и SD. Данные на фигуре 5b представляют эффект пробиотика-плацебо в виде процентного значения плацебо и 90% доверительных интервалов, полученных из модели со смешанными эффектами анализа дисперсии.

Горизонтальные пунктирные линии представляют собой наименьшие пороговые значения стандартизованной разности (+4,5%), тогда как вероятность значительного изменения включена выше, при этом отличие представлено с помощью ** = вероятно; *** = очень вероятно; результаты без звездочек являются незаключительными или неясными.

4. Обсуждение

Основное открытие настоящего исследования заключалось в том, что 21-дневное введение пробиотиков в соответствии с настоящим изобретением уменьшало ухудшение показателей после сессии физической нагрузки, которая вызывает или может вызвать повреждение мышц.

Введение пробиотиков в соответствии с настоящим изобретением приводит к большему углу руки в состоянии покоя по сравнению с плацебо. Было доказано, что введение пребиотиков по настоящему изобретению фактически увеличивает угол руки в состоянии покоя по сравнению с плацебо через 24 и 48 часов.

Концентрация IL-6 уменьшалась после 21-дневного введения пробиотиков по настоящему изобретению, тогда как для плацебо увеличение не наблюдалось.

Данные настоящего исследования показывают, что введение пребиотиков без одновременного введения белков уменьшает ухудшение мышечной деятельности, поскольку по сравнению с плацебо наблюдался больший изометрический пиковый вращательный момент на протяжении нескольких дней восстановления после эксцентрических сокращений при растягивании. Из этого следует, что с помощью композиции в соответствии с настоящим изобретением было впервые показано, что введение только пребиотиков уменьшает ухудшение мышечной деятельности.

Сделана конкретная ссылка на фигуры 1, 2, 3 и 4.

Процентное изменение пикового вращательного момента (фигура 1), среднего пикового вращательного момента (фигура 2) и среднего пикового вращательного момента относительно веса тела (фигура 3) во время изометрического сгибания локтя показаны ниже. Пороговое значение для минимального значительного изменения было рассчитано как 0,2-кратное исходному SDbetween. Вероятность показана с помощью повышенного количества символов (+) по сравнению с плацебо (PLA): + возможно, ++ вероятно, +++ очень вероятно, ++++ наибольшая вероятность. Все данные представляют собой средние значения.

Уменьшение на приблизительно 30% способности генерировать энергию подчеркивает эффективность протокола, повреждающего мышцы, в стимулировании необходимого ответа. Дополнение рациона тестируемой композицией (p=0,199) уменьшало ухудшение показателей, наблюдаемое после физической нагрузки, повреждающей мышцы, в течение 24 часов после периода выполнения интенсивной физической нагрузки (фигура 1). В отношении среднего пикового вращательного момента польза наблюдалась через 24 часа (p=0,111), 48 часов (p=0,046) и 72 часа (p=0,194). Аналогично, средний пиковый вращательный момент относительно веса тела продемонстрировал пользу от дополнения рациона тестируемой композицией через 24 часа (p=0,117), 48 часов (p=0,050) и 72 часа (p=0,198).

Воспаление оценивали с помощью изменений уровня IL-6 после периода интенсивной физической нагрузки, повреждающей мышцы. Однако, поскольку эффект тестируемой композиции заключался в уменьшении общего воспалительного ответа, то оценивали уровень IL-6 на исходном уровне перед периодом дополнения рациона. Действительно, дополнение рациона штаммами бактерий B. breve BR03 (DSMZ 16604) и S. thermophilus FP4 (DSMZ 18616) обеспечило эффект, заключающийся в уменьшении уровня IL-6, как показано с помощью уменьшения процентного изменения от исходного уровня у субъектов, рацион которых был дополнен указанными штаммами пробиотических бактерий (-10%), по сравнению с увеличением после плацебо (24%). Кроме того, разность (отличие) процентного изменения уровня IL-6 между плацебо и пробиотиком была вероятной через 30 минут (p=0,054), 60 минут (p=0,056) и 48 часов (p=0,124) после физической нагрузки, повреждающей мышцы, тогда как она вероятно была ниже (p=0,015) через 24 часа.

5. Заключение

Введение пробиотиков по настоящему изобретению в течение 21 дня здоровым и прошедшим тренировки с отягощениями субъектам уменьшает ухудшение показателей и диапазона движений после сессии физической нагрузки, повреждающей мышцы. Эти данные свидетельствуют о том, что пероральное введение пробиотиков по настоящему изобретению может способствовать восстановлению показателей после интенсивного физического усилия даже у нетренированных или недостаточно тренированных субъектов.

Исходя из вышеизложенного, это приводит в результате к тому, что композиция по настоящему изобретению, содержащая смесь, которая содержит по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium breve, и по меньшей мере штамм бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus thermophilus, или, как альтернатива, состоит из них, уменьшает ухудшение показателей, наблюдаемое после физической нагрузки, повреждающей мышцы. Этот эффект обусловлен уменьшением общего уровня воспаления, как подтверждено с помощью сниженного уровня IL-6 после дополнения рациона.

С точки зрения показателей, известно, что у спортсменов, участвующих в периодах высокоинтенсивных тренировок, снижена способность их иммунной системы противодействовать инфекции. Дополнение рациона композицией по настоящему изобретению может преимущественно привести к: 1) улучшению общего иммунного ответа, таким образом 2) усиливая показатели во время тренировки, за счет чего обеспечивается получение 3) лучших показателей во время соревнования. Кроме того, полученные результаты включают дополнительные эффекты в отношении здоровья и положительные эффекты, поскольку дополнение рациона выбранными штаммами бактерий, являющихся объектом настоящего изобретения, способно снизить общий воспалительный ответ, как показано в данном пилотном исследовании. Высокий уровень IL-6 обнаружен в условиях хронического воспаления, которые, как известно, также встречаются при заболеваниях, связанных с ожирением.

1. Нетерапевтическое применение композиции для уменьшения, или снижения, или устранения ухудшения показателей после физической нагрузки, где указанное применение предусматривает пероральное введение указанной композиции субъекту, который подвергается указанной физической нагрузке, при этом указанная композиция содержит смесь, которая содержит штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03 DSM 16604 и штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4 DSM 18616 или как альтернатива состоит из них, где штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 DSM 16604 и Streptococcus thermophilus FP4 DSM 18616 присутствуют в весовом соотношении, составляющем 1:1, и в количестве, составляющем 5×10⁹ КОЕ/г каждого штамма в композиции.

2. Применение композиции по п. 1, где указанная композиция обеспечивает улучшение переносимости физической нагрузки во время тренировки и занятий спортом.

3. Применение композиции по любому из предыдущих пунктов, где физическая нагрузка представляет собой равномерно интенсивную и продолжительную активность, предпочтительно спортивную активность, которая приводит к усилию, потенциально способному повредить мышечные волокна и/или вызвать повреждение мышцы в целом.

4. Применение композиции для лечения и/или предупреждения заболеваний, вызванных физической нагрузкой, выбранных из мышечной боли, мышечной болезненности, воспаления мышц, мышечной усталости и/или мышечной дегенерации, для увеличения количества мышечной энергии и улучшения митохондриальных функций у субъекта, у которого имеется их дефицит, где указанная композиция содержит смесь, которая содержит штамм бактерий Bifidobacterium breve BR03 DSM 16604 и штамм бактерий Streptococcus thermophilus FP4 DSM 18616 или как альтернатива состоит из них, где штаммы бактерий Bifidobacterium breve BR03 DSM 16604 и Streptococcus thermophilus FP4 DSM 18616 присутствуют в весовом соотношении, составляющем 1:1, и в количестве, составляющем 5×10⁹ КОЕ/г каждого штамма.