Термочувствительные аттенуированные штаммы вируса ящура (fmdv), способ их конструирования и применение

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам получения термочувствительных аттенуированных штаммов вируса ящура (FMDV), и может быть использовано в медицине. Полученные штаммы rC351G, FMDV(R4) и rdK вируса ящура могут быть использованы для получения эффективных вакцин против FMDV. 11 н.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 12 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к созданию сайт-направленных мутантов, химер генома вируса ящура (FMDV) по внутреннему участку посадки рибосомы (IRES) для получения термочувствительных аттенуированных штаммов FMDV и дополнительно относится к применению сконструированного термочувствительного аттенуированного штамма FMDV в качестве аттенуированного вакцинного штамма для предупреждения и борьбы с ящуром (FMD) или в качестве безопасного вирусного посевного материала для получения инактивированной вакцины против FMD. Настоящее изобретение относится к области предупреждения и лечения FMD.

Технологические предпосылки изобретения

FMD представляет собой острое, лихорадочное и чрезвычайно заразное заболевание, вызываемое FMDV, который в основном инфицирует парнокопытных животных, таких как свиньи, крупный рогатый скот и овцы. (Grubman And Baxt. 2004. Clinical Micro. Rev. 17:465-493). Как только возникает вспышка заболевания, оно оказывает серьезное влияние на международную торговлю и социальную экономику. Поэтому FMD во всем мире известен как политическое и экономическое заболевание, и правительства всегда уделяли ему особое и приоритетное внимание.

FMDV является членом рода Aphthovirus из семейства Picornaviridae, который существует в виде семи различных серотипов: A, O, C, Asia1 и South African Territories типа 1 (SAT1), SAT2 и SAT3. Не существует перекрестной иммунной защиты между различными серотипами штаммов. Геном FMDV представляет собой одноцепочечную положительно-смысловую РНК с длиной приблизительно 8,5 т.о. и состоит из 5'-нетранслируемой области (5'-UTR), открытой рамки считывания (ORF) и 3'-UTR. В 5'-UTR FMDV отсутствует структура кэпа, и инициация трансляции белка зависит от внутреннего участка посадки рибосомы (IRES), являющегося цис-действующим элементом РНК, который инициирует синтез вирусных белков путем привлечения эукариотических факторов инициации трансляции и рибосом. Длина IRES FMDV составляет приблизительно 450 нуклеотидов, включая четыре домена, и является важным элементом для инициации трансляции вирусных белков.

Иммунная вакцинация является важным средством контроля распространенности FMD. Однако запущенная в серийное производство инактивированная вакцина против FMD, используемая в Китае и за рубежом, имеет следующие недостатки: 1) применение вирулентных штаммов в качестве вирусного посевного материала для получения вакцины имеет риск распространения вируса из-за неполной инактивации или утечки вируса во время заводского производства; 2) инактивированный антиген FMDV характеризуется слабой иммуногенностью и коротким периодом иммунной защиты, при этом иммунизированные животные склонны к персистирующим инфекциям FMDV при повторном инфицировании FMDV, и персистентно инфицированные животные могут стать источником повторного появления инфекции, что окажет серьезное влияние на реализацию Программы иммунизации против FMD и его ликвидации; 3) антигены FMDV склонны к изменчивости, и обновление вирусного посевного материала для получения вакцины не может поспевать за скоростью мутации вируса, что окажет большое влияние на иммунный эффект инактивированной вакцины. История исследований вакцин для человека и животных показывает, что только аттенуированные вакцины могут вызывать быстрый, сильный и длительный иммунный ответ и могут полностью преодолеть недостатки и недоработки инактивированных вакцин. При применении аттенуированных вакцин в мире были успешно ликвидированы натуральная оспа и чума крупного рогатого скота, а некоторые вирусные заболевания, такие как полиомиелит, находятся под контролем. Хотя FMD распространен во многих странах и регионах мира и иногда вспыхивает в неэпидемических странах, широко используемой вакциной до сих пор все еще остается инактивированная вакцина с коротким периодом иммунизации и высокой стоимостью, а безопасные и эффективные живые аттенуированные вакцины против FMDV не были успешно разработаны.

В последние 100 лет исследователи пытались разработать живую аттенуированную вакцину для предупреждения и борьбы с FMD. Однако, поскольку фенотип с аттенуированной вирулентностью вируса не стабилен, то аттенуированный штамм не может вызывать эффективный защитный иммунный ответ, при этом степень аттенуирования у аттенуированного штамма различна для разных видов и родов животных, и существует риск возврата к вирулентности, аттенуированные вакцины против FMDV не были успешно разработаны. В последние годы с развитием технологии молекулярной вирусологии и обширными исследованиями по FMDV, особенно с применением инфекционных клонов кДНК FMDV, можно определить детерминанты вирулентности вируса в дополнительных исследованиях. Затем в геном FMDV вносят конкретные изменения, и его аттенуированный фенотип оценивают in vitro и in vivo, что позволяет разработать живую аттенуированную вакцину против FMDV, которая обладает хорошей иммуногенностью и успешно аттенуируется у всех природных хозяев. Разработка применяемой на практике живой аттенуированной вакцины против FMDV требует соблюдения следующих условий, при которых вакцина: 1) аттенуирована для всех восприимчивых животных и не вызывает клинических симптомов; 2) вызывает сильный иммунный ответ после иммунизации и обеспечивает противоинфекционную защиту для иммунизированных животных; 3) вакцинированные животные не выделяют вирусы, и аттенуированный вакцинный штамм не распространяется между вакцинированными животными и здоровыми животными и не может вернуться к вирулентности. Эти обязательные показатели чрезвычайно сложны, но они являются предпосылкой для успешного исследования и применения живой аттенуированной вакцины против FMD.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способ конструирования термочувствительных аттенуированных штаммов FMDV, включающий: конструирование полноразмерного инфекционного клона кДНК FMDV, получение вирусной РНК путем транскрипции in vivo, трансфицирование вирусной РНК в клетки и «спасение» вирусов; где цитозин (C) в положении 351 в области K-петли (³⁵¹CUUUAA³⁵⁶) домена 4 IRES из геномной РНК FMDV, полученной путем транскрипции in vitro, мутируют в гуанин (G) или аденин (A), нуклеотидная последовательность области K-петли после мутации представляет собой ³⁵¹GUUUAA³⁵⁶ или ³⁵¹AUUUAA³⁵⁶.

В частности, настоящее изобретение предусматривает термочувствительный аттенуированный штамм FMDV, полученный с помощью вышеупомянутого способа конструирования, который назван rC351G. rC351G обладает высокой генетической стабильностью и термочувствительным фенотипом, который является аттенуированным для всех восприимчивых парнокопытных животных (при температуре тела 38,5-40°C) и отвечает требованиям безопасности для живых аттенуированных вакцин. Свиней инокулировали термочувствительным аттенуированным штаммом FMDV rC351G, и при этом вакцинированные животные не проявляли каких-либо клинических симптомов, однако были способны индуцировать высокие уровни нейтрализующих антител к FMDV типа О, которые могут полностью защитить животных от заражения гетерологичными штаммами различных генотипов FMDV типа О, распространенных в настоящее время в Китае. Термочувствительный аттенуированный штамм FMDV rC351G обладает хорошей безопасностью, и при этом не происходит горизонтальной передачи между вакцинированными свиньями и здоровыми свиньями, и аттенуированный штамм rC351G не возвращается к вирулентности после непрерывных пассажей у свиней. Следовательно, rC351G может быть получен в виде живой аттенуированной вакцины для предупреждения и лечения FMD в соответствии с традиционным способом получения живой аттенуированной вакцины или может применяться в качестве безопасного вирусного посевного материала инактивированной вакцины для профилактики FMD.

В настоящем изобретении E. coli-хозяин, содержащая плазмиду для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК FMDV, предоставлена в лицензированное учреждение для сохранения, при этом плазмиды для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК используются для «спасения» термочувствительного аттенуированного штамма FMDV rC351G. Номер в депозитарии микроорганизмов: CGMCC NO.13148; научное название: Escherichia Coli (E. coli); время депонирования: 26 октября 2016 года; учреждение депозитария: Главный центр коллекций микробиологических культур Китая (China General Microbiological Culture Collection Center); адрес депонирования: Институт микробиологии, Китайская академия наук, №°1-3, West Beichen Road, Chaoyang District, Пекин, Китай.

Настоящее изобретение предусматривает мутанта IRES для конструирования термочувствительного аттенуированного штамма FMDV, полноразмерная нуклеотидная последовательность которого представлена под SEQ ID No.1. Мутант IRES может применяться для конструирования термочувствительного аттенуированного штамма FMDV с помощью системы обратной генетики FMDV. Кроме того, сконструированный термочувствительный аттенуированный штамм FMDV может быть получен в виде живой аттенуированной вакцины для предупреждения и лечения FMD в соответствии с традиционным способом получения живой аттенуированной вакцины. Полноразмерный инфекционный клон кДНК сконструированного термочувствительного аттенуированного штамма FMDV может быть «спасен» для функционирования в качестве безопасного вирусного посевного материала инактивированной вакцины, или использован для конструирования РНК-вакцины против FMD.

Настоящее изобретение предусматривает способ конструирования другого термочувствительного аттенуированного штамма FMDV, включающий: конструирование полноразмерного инфекционного клона кДНК FMDV, получение вирусной РНК путем транскрипции in vivo, трансфицирование вирусной РНК в клетки и «спасение» вируса; где домен 4 IRES из геномной РНК FMDV, полученной путем транскрипции in vitro, заменен доменом 4 IRES из геномной РНК вируса бычьего ринита B (BRBV).

Настоящее изобретение предусматривает еще один термочувствительный аттенуированный штамм FMDV, полученный с помощью вышеупомянутого способа конструирования, который назван FMDV(R4). FMDV(R4) обладает высокой генетической стабильностью и термочувствительным фенотипом, причем его термочувствительные свойства указывают на то, что FMDV(R4) является аттенуированным для всех восприимчивых парнокопытных животных (при температуре тела 38,5-40°С), что отвечает требованиям безопасности для аттенуированного штамма. Свиней инокулировали термочувствительным аттенуированным штаммом FMDV FMDV(R4), и при этом у вакцинированных животных не наблюдались какие-либо клинические симптомы и не происходила горизонтальная передача между вакцинированными свиньями и здоровыми свиньями. Что еще более важно, вакцинированные свиньи не продуцируют антитела против FMDV, что указывает на то, что FMDV(R4), сконструированный с помощью настоящего изобретения в качестве вирусного посевного материала для инактивированной вакцины против FMD, характеризуется лучшей безопасностью, а полноразмерный инфекционный клон кДНК FMDV(R4) также может быть «спасен» в качестве вирусного посевного материала для инактивированной вакцины против FMD.

В настоящем изобретении E. coli-хозяин, содержащая плазмиду для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК FMDV, предоставлена в лицензированное учреждение для сохранения, при этом плазмиды для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК используются для «спасения» термочувствительного аттенуированного штамма FMDV(R4). Номер в депозитарии микроорганизмов: CGMCC NO.13149; научное название: Escherichia Coli (E. coli); время депонирования: 26 октября 2016 года; учреждение депозитария: Главный центр коллекций микробиологических культур Китая; адрес депонирования: Институт микробиологии, Китайская академия наук, №1-3, West Beichen Road, Chaoyang District, Пекин, Китай.

Настоящее изобретение также предусматривает химерный IRES, полученный путем замены домена 4 IRES из FMDV доменом из бычьего риновируса, полноразмерная последовательность которого представлена под SEQ ID No. 2. Химерный IRES может применяться для конструирования термочувствительного аттенуированного штамма FMDV с помощью системы обратной генетики FMDV. Кроме того, сконструированный термочувствительный аттенуированный штамм FMDV может быть получен в виде инактивированной вакцины для предупреждения и лечения FMD в соответствии с традиционным способом получения инактивированной вакцины. Полноразмерный инфекционный клон кДНК сконструированного термочувствительного аттенуированного штамма FMDV может быть «спасен» в качестве безопасного вирусного посевного материала для инактивированной вакцины против FMD.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ конструирования термочувствительного аттенуированного штамма FMDV, включающий: конструирование полноразмерного инфекционного клона кДНК FMDV, получение вирусной РНК путем транскрипции in vivo, трансфицирование вирусной РНК в клетки и «спасение» вируса, где K-область домена 4 IRES из FMDV, полученного путем транскрипции in vitro, заменена К-областью домена 4 IRES из вируса бычьего ринита B (BRBV).

Термочувствительный аттенуированный штамм FMDV, полученный с помощью вышеупомянутого способа конструирования, назван rdK. Термочувствительный аттенуированный штамм FMDV rdK, предусмотренный в настоящем изобретении, обладает термочувствительным фенотипом и высокой генетической стабильностью, его термочувствительные свойства указывают на то, что rdK является аттенуированным для всех восприимчивых парнокопытных животных (при температуре тела 38,5-40°С), что отвечает требованиям безопасности для аттенуированного штамма. В настоящем изобретении свиньям инокулировали термочувствительный аттенуированный штамм FMDV rdK, и при этом у вакцинированных животных не наблюдалось каких-либо клинических симптомов, и не происходила горизонтальная передача между вакцинированной свиньей и здоровой свиньей. Что еще более важно, вакцинированные свиньи не продуцируют антитела против FMDV, что указывает на то, что rdK, сконструированный с помощью настоящего изобретения, характеризуется лучшей безопасностью в качестве вирусного посевного материала для инактивированной вакцины против FMD. Следовательно, полноразмерный инфекционный клон кДНК штамма rdK может быть «спасен» в качестве безопасного вирусного посевного материала для инактивированной вакцины против FMD.

В настоящем изобретении E. coli-хозяин, содержащая плазмиду для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК FMDV, предоставлена в лицензированное учреждение для сохранения, при этом плазмиды для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК используются для «спасения» термочувствительного аттенуированного штамма FMDV rdK. Номер в депозитарии микроорганизмов: CGMCC NO.13150; научное название: Escherichia Coli (E. coli); время депонирования: 26 октября 2016 года; учреждение депозитария: Главный центр коллекций микробиологических культур Китая; адрес депонирования: Институт микробиологии, Китайская академия наук, №1-3, West Beichen Road, Chaoyang District, Пекин, Китай.

Настоящее изобретение предусматривает химерный IRES, полученный путем замены К-области домена 4 IRES из геномной РНК FMDV К-областью из геномной РНК вируса бычьего ринита В (BRBV), полноразмерная последовательность которого представлена под SEQ ID No. 3. Химерный IRES может применяться для конструирования термочувствительного аттенуированного штамма FMDV с помощью обычных технических средств для обратной генетики FMDV, известных в данной области.

Подробное описание технического решения настоящего изобретения

В настоящем изобретении применяют систему обратной генетики FMDV типа O для замены домена 4 IRES из FMDV соответствующим доменом IRES из BRBV, при этом успешно конструируют и «спасают» химерного по IRES мутанта FMDV(R4). Вирулентность химерного по IRES вируса FMDV(R4) определяли с использованием 3-дневных мышей-сосунков в качестве моделей, и вирулентность снижалась приблизительно в 100 раз по сравнению с вирулентностью исходного вируса FMDV(WT), что демонстрирует то, что домен 4 IRES является определяющим элементом вирулентности FMDV.

Чтобы определить, является ли репликация FMDV(R4) термочувствительной, построили одноступенчатые кривые роста FMDV(R4) при различных температурах на двух типах клеток, - BHK-21, полученных из хомяка, и IBRS-2, полученных из свиньи. Результаты эксперимента подтвердили, что химерный по IRES аттенуированный штамм FMDV(R4) является термочувствительным мутантом, и это свойство термочувствительности особенно очевидно в полученных из свиньи клетках IBRS-2 из восприимчивых животных-хозяев.

Для того, чтобы дополнительно проанализировать молекулярные детерминанты термочувствительного аттенуированного фенотипа химерного по IRES вируса FMDV(R4), в настоящем изобретении применяли операционную систему обратной генетики FMDV типа О для замены субдоменов J, K или N в домене 4 IRES из FMDV соответствующими субдоменами из IRES BRBV. Мутантные штаммы FMDV, химерные по субдоменам J, K или N IRES, были успешно сконструированы, и «спасены», и названы rdJ, rdK или rdN. Определили и проанализировали динамику репликации трех химерных вирусов при различных температурах и построили одноступенчатые кривые роста. Результаты показали, что как в клетках BHK-21, так и в клетках IBRS-2, или при различных температурах 33°C, 37°C и 41°C, химерные вирусы rdJ, rdN и исходный вирус FMDV(WT) имели сходные пролиферативные свойства. Однако химерный вирус rdK обладал способностью к репликации, аналогичной способности исходного вируса FMDV(WT), только при 33°C и 37°C в клетках BHK-21, однако его способность к репликации значительно снижалась при 41°C, что составляло снижение приблизительно в 100 раз по сравнению со способностью исходного вируса FMDV(WT). В клетках IBRS-2 способность химерного вируса rdK к репликации значительно снижалась даже при 37°C, что составляло снижение в 1000 раз по сравнению со способностью исходного вируса, и способность к репликации rdK практически утрачивалась при 41°C. Репликативные свойства химерного вируса rdK (а не rdJ и rdN) согласуются с репликативными свойствами химерного вируса FMDV(R4), что указывает на то, что K-область домена 4 IRES определяет термочувствительные свойства химерного вируса FMDV(R4). В то же время результаты теста на вирулентность у мышей-сосунков показали, что вирулентность rdK снижалась приблизительно в 10⁶ раз по сравнению с вирулентностью FMDV(WT). Подводя итог, эти результаты показали, что K-область домена 4 IRES определяет термочувствительный аттенуированный фенотип химерного по IRES вируса FMDV(R4).

K-области домена 4 IRES из FMDV и BRBV соответственно состоят из структуры стебель-петля. Для определения области в структуре стебель-петля K-области, ассоциированной с термочувствительным аттенуированным фенотипом FMDV, в настоящем изобретении применяется операционный метод обратной генетики для замены стебли и петли K-области IRES FMDV соответственно стеблем и петлей K-области IRES BRBV. Два спасенных химерных вируса назвали соответственно rK(стебель) и rK(петля), и определили динамику их репликации при различных температурах и в разных клетках. Как в клетках BHK-21, так и в клетках IBRS-2, или при различных температурах 33°C, 37°C и 41°C, химерный вирус rK(стебель) характеризуется аналогичными исходному вирусу FMDV(WT) пролиферативными свойствами. Однако способность к репликации химерного вируса rK(петля) в двух типах клеток постепенно снижалась с повышением температуры, и его репликативные свойства были чрезвычайно похожи на таковые у rdK. Вышеупомянутые результаты указывают на то, что структура петли K-области домена 4 IRES определяет термочувствительность химерного вируса FMDV(R4). При тестировании вирулентности rK(петля) выявлено, что вирус был нестабилен у мышей-сосунков. Имела место обратная мутация T351C в положении 351 IRES, что согласуется с обратной мутацией, произошедшей в положении 351 IRES после того, как вирус прошел через множественные пассажи in vitro в клетках BHK-21. Эта обратная мутация приводит к тому, что структура петли K-области rK(петля) оказывается похожей на структуру петли K-области исходного вирулентного штамма, и поэтому вирулентность мутанта rK(петля) у мыши-сосунка восстанавливается до уровня исходного вируса.

Петля (-³⁵¹CUUUAA³⁵⁶-) К-области IRES из FMDV имеет структуру, аналогичную петле (-UUUAC-) К-области IRES из BRBV, и их основные отличия заключаются в следующем: в положении 351 сайта инициации структуры петли в K-области IRES FMDV имеется дополнительный нуклеотид C; и в положении 356 структуры петли в K-области IRES FMDV имеется нуклеотид A, тогда как в положении 356 структуры петли в K-области IRES BRBV присутствует нуклеотид C. Для точного определения молекулярных факторов, которые определяют термочувствительный фенотип FMDV, в настоящем изобретении сначала мутировали нуклеотид A в положении 356 IRES FMDV в нуклеотид C в положении 356 IRES BRBV, и сконструированный и «спасенный» мутантный вирус был назван rA356C. Динамика репликации мутанта при различных температурах показала, что способности rA356C к репликации в клетках двух типов, BHK-21 и IBRS-2, были аналогичны способностям исходного вируса FMDV(WT) при температуре 33°С, 37°C и 41°C, что указывает на то, что нуклеотид A356 IRES FMDV не имеет отношения к термочувствительному фенотипу FMDV.

Чтобы определить корреляцию между нуклеотидом C351 IRES и термочувствительным фенотипом FMDV, в настоящем изобретении провели четыре следующих мутации для нуклеотида C в положении 351:

(1) делецию нуклеотида C351; (2) нуклеотид C351 мутировали в нуклеотид A; (3) нуклеотид C351 мутировали в нуклеотид G; (4) нуклеотид C351 мутировали в нуклеотид U.

Окончательные результаты испытаний показали, что схемы мутаций (1) и (4) не позволили «спасти» вирус из-за разрушения структуры петли IRES, тогда как схемы мутаций (2) и (3) могут «спасти» вирус из-за инвариантности структуры петли IRES, и «спасенные» IRES-мутированные вирусы были названы соответственно rC351A и rC351G. Динамику репликации двух вирусных мутантов с точечной мутацией IRES C351A или C351G измеряли при различных температурах. Результаты показали, что репликативные свойства двух вирусов, мутированных в сайте C351 IRES, аналогичны свойствам химерного по IRES вируса rK(петля), что указывает на то, что этот сайт является молекулярной детерминантой термочувствительного фенотипа химерного по IRES FMDV. В настоящем изобретении также выявлено, что вирулентность вирусов, мутированных в сайте C351 IRES, у мышей-сосунков значительно снижена. По сравнению с вирусом дикого типа вирулентность rC351G снижена приблизительно в 10000 раз, а вирулентность rC351A снижена в 1000 раз. Вышеприведенные результаты в конечном итоге указывают на то, что нуклеотид С в сайте 351 на петле К-области домена 4 IRES определяет термочувствительный аттенуированный фенотип FMDV.

Чтобы определить генетическую стабильность термочувствительных аттенуированных штаммов FMDV, в настоящем изобретении непрерывно пассировали 20 раз химерные по IRES или рекомбинантные с сайт-направленным мутагенезом вирусы FMDV(R4), rdK, rK(петля), rC351G, rC351A и исходный вирус FMDV(WT) в клетках BHK-21, и определяли последовательности IRES вирусов 20-го пассажа. Результаты показали, что химерные по IRES или с сайт-направленным мутагенезом термочувствительные аттенуированные штаммы FMDV FMDV(R4), rdK, rC351G и rC351A обладали высокой генетической стабильностью; в то время как химерный по петле К-области IRES термочувствительный аттенуированный штамм FMDV rK(петля) был нестабилен, при прохождении до 20^-го пассажа в некоторых вирусах произошла обратная мутация, а при прохождении до 25^-го пассажа обратная мутация произошла во всей группе вирусов.

Чтобы убедиться в том, что мутация C351G в IRES также определяет термочувствительный аттенуированный фенотип других серотипов штаммов FMDV, в настоящем изобретении дополнительно используется полноразмерный инфекционный клон кДНК FMDV типа A и типа Asia1 для создания и «спасения» мутантных штаммов с нуклеотидной заменой C351G, имеющей место в IRES, которые назвали соответственно A-rC351G и Asia1-rC351G. Определяли термочувствительность вышеуказанных мутантных по IRES штаммов и результаты показали, что способности к репликации как A-rC351G, так и Asia1-rC351G в клетках BHK-21 и IBRS-2 снижались с повышением температуры, что указывает на то, что мутация C351G в IRES дала возможность и другим серотипам штаммов FMDV получить термочувствительный фенотип. Кроме того, результаты теста на вирулентность A-rC351G и Asia1-rC351G у мышей-сосунков показали, что мутация C351G в IRES также могла снизить вирулентность FMDV типа A и типа Asia1 для мышей-сосунков по меньшей мере в 10000 раз, что указывает на то, что термочувствительные аттенуированные фенотипы штаммов FMDV трех распространенных в Китае серотипов, типа О, типа А и типа Asia1, определялись C351 IRES. Поскольку сайт C351 в IRES является консервативным во всех штаммах FMDV, то было установлено, что C351 IRES является молекулярной детерминантой термочувствительного аттенуированного фенотипа всех серотипов штаммов FMDV.

Настоящее изобретение, посредством структурных и функциональных исследований и анализа выравнивания последовательностей, в конечном итоге подтверждает, что нуклеотид C351 в петле K-области домена 4 IRES FMDV определяет термочувствительный аттенуированный фенотип всех семи серотипов штаммов FMDV. Аттенуированные мутанты FMDV, мутированные с заменой C351G, имеющей место в IRES, показывают высокую генетическую стабильность при непрерывном пассировании в клетках, и все эти мутанты вируса имеют термочувствительный фенотип и, таким образом, аттенуированы для всех восприимчивых парнокопытных животных (при температуре тела 38,5-40°C), что отвечает требованиям безопасности для живых аттенуированных вакцин.

Термочувствительные аттенуированные мутантные штаммы FMDV, предусмотренные настоящим изобретением, демонстрируют безопасность и эффективность после инокуляции в восприимчивых животных и заражения и имеют значительное преимущество в плане безопасности, они могут применяться в качестве вирусного посевного материала для живой аттенуированной вакцины или инактивированной вакцины для предупреждения FMD. Последовательность мутантного IRES или химерного IRES и полноразмерный инфекционный клон кДНК термочувствительного аттенуированного штамма FMDV, предусмотренного настоящим изобретением, может применяться для получения живой аттенуированной вакцины против FMD, применяться в качестве вирусного посевного материала для получения инактивированной вакцины против FMD или применяться для получения РНК-вакцины против FMD.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлен график, показывающий результаты теста на вирулентность химерного по домену 4 IRES вируса FMDV(R4) у мышей-сосунков.

На фиг. 2 представлен график, показывающий одноступенчатые кривые роста количества химерного по IRES вируса FMDV(R4) и его исходного вируса при различных температурах.

На фиг. 3 представлен график, показывающий одноступенчатые кривые роста химерного по субдомену домена 4 IRES мутанта FMDV.

На фиг. 4 представлен график, показывающий одноступенчатые кривые роста количества химерных по IRES мутантов FMDV rK(стебель) и rK(петля).

На фиг. 5 представлен график, показывающий одноступенчатые кривые роста количества мутантов FMDV с сайт-направленным мутагенезом IRES rC351G и rC351A.

На фиг. 6 представлен график, показывающий генетическую стабильность (A) и термочувствительность (B) химерных по IRES и сайт-направленных мутантов FMDV в клетках BHK-21.

На фиг. 7 представлен график, показывающий вирулентность термочувствительного мутанта FMDV у мышей-сосунков.

На фиг. 8 представлен график, показывающий термочувствительность (A и B) в клетках и вирулентность (C и D) у мышей-сосунков мутантов C351G IRES FMDV типа A и типа Asia1.

На фиг. 9 представлен график, показывающий анализ опосредованной мутантом C351G IRES эффективности инициации трансляции: IRES-опосредованная эффективность трансляции (A) определена с использованием системы репликона; величина экспрессии белка VP2 и титры вируса определены в клетках BHK-21 (B) и клетках IBRS-2 (C), инфицированных вирусом.

На фиг. 10 представлен график, показывающий результаты теста на вирулентность нескольких термочувствительных аттенуированных штаммов и исходных вирусов дикого типа FMDV(WT) у инокулированных свиней.

Подробное описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение будет дополнительно описано ниже со ссылкой на конкретные варианты осуществления, и с описанием преимущества и признаки настоящего изобретения станут более понятны. Однако следует понимать, что варианты осуществления являются только иллюстративными, а не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что детали и формы настоящего изобретения могут быть изменены или заменены без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, однако такие модификации или замены попадают в объем настоящего изобретения.

1. Материалы и способы

1.1. Клетки, векторы и вирусы

Клетки BHK-21 и клетки IBRS-2 культивировали при 37°C в условиях содержания 5% CO₂, и при этом культуральной средой была DMEM, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Вектор pOK-12 был щедрым подарком от Messing (1991); штамм FMDV типа O O/YS/CHA/05 (номер доступа в GenBank: HM008917) и инфекционный клон кДНК pYS вируса могут быть получены с помощью способа, раскрытого в литературе (публикация патента Китая №CN101838658A (ZL201010160669.9)); инфекционный клон кДНК штамма FMDV типа Asia1 Asia1/YS/CHA/05 (номер доступа в GenBank: GU931682) может быть получен с помощью способа, раскрытого в литературе (публикация патента Китая №CN101724636A (ZL200810171258.2)); штамм FMDV типа А A/VN/03/2009 (номер доступа в GenBank: GQ406249) хранился в лаборатории авторов изобретения.

1.2. Праймеры

В соответствии с последовательностью гена IRES бычьего риновируса (номер доступа в GenBank: EU236594) и геномной последовательностью штамма FMDV O/YS/CHA/05 сконструировали праймеры (таб. 1), используемые для амплификации различных доменов в IRES двух вирусов, и праймеры для сайт-направленного мутагенеза (таб. 2) и синтезировали в Shanghai Yingjun Biotechnology Co., Ltd.

Табл. 1. Праймеры для создания химерного по IRES вируса и их последовательности

Табл. 2. Праймеры и последовательности для сайт-направленного мутагенеза

1.3. Конструирование плазмид инфекционного клона IRES-химерного FMDV

Полноразмерный инфекционный клон кДНК IRES-химерного FMDV, в котором субдомен N домена 4 IRES FMDV заменили субдоменом из BRBV, сконструировали с использованием способа ПЦР с перекрывающимися праймерами. Конкретный способ заключался в следующем: во-первых, использовали плазмиду pYS в качестве матрицы, 4N-1:U и 4N-1:L в качестве праймеров для амплификации фрагмента A; использовали синтетический ген IRES BRBV в качестве матрицы, 4N-2:U и 4N-2: L в качестве праймеров для амплификации фрагмента B; и использовали плазмиду pYS в качестве матрицы, 4N-3:U, 4N-3:L в качестве праймеров для амплификации фрагмента C. Использовали очищенные ПЦР-амплифицированные фрагменты A, B и C в качестве матриц и 4N-1:U и 4N-3:L в качестве праймеров для проведения ПЦР с перекрывающимися праймерами для амплификации 5'-фрагмента гена FMDV, содержащего частичную замену IRES BRBV, при этом размер фрагмента составлял приблизительно 1,9 т. о. Фрагмент извлекали из агарозного геля, дважды расщепляли с помощью Bgl II и Nhe I и клонировали в вектор pYS, правильный клон, идентифицированный секвенированием, назвали p(dN). Подобным образом конструировали плазмиды для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК FMDV, содержащие соответственно субдомены J и K домена 4 IRES BRBV с использованием праймеров из таб. 1, и назвали p(dJ) и p(dK).

1.4. Конструирование полноразмерного инфекционного клона кДНК FMDV типа А

По результатам полногеномного секвенирования штамма вируса ящура A/QSA/CHA/09 синтезировали полноразмерный геном способом искусственного синтеза генов и ввели последовательность промотора T7 и сайт рестрикции Spe I (5'act agt TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG 3') с 5'-конца полногеномной кДНК, с 3'-конца полногеномной кДНК ввели сайт рестрикции EcoR V (gat atc), который используется для линеаризации полногеномной кДНК. После рестрикции расщепленный рестрикционными эндонуклеазами Spe I и EcoR V полный геном клонировали в вектор с низким числом копий pOK12, при этом сконструированный инфекционный клон кДНК назвали pQSA.

1.5. Сайт-направленный мутагенез

В соответствии с инструкциями к набору по сайт-направленному мутагенезу Quik Change^® с помощью метода ПЦР в инфекционные клоны кДНК вводили сайты мутаций с использованием соответственно праймеров из таб. 2. Процедура ПЦР-амплификации: 94°C в течение 4 мин.; 94℃ в течение 30 с, 68°C в течение 9 мин., в течение 18 циклов; 72℃ в течение 10 мин. После завершения ПЦР-амплификации продукты ПЦР очищали. Расщепляли метилированную матрицу продуктов ПЦР с помощью Dpn I (при 37°C в течение 1 ч.), переносили обработанные продукты ПЦР в DH5α-компетентные клетки, отбирали бактериальные клоны, и правильные рекомбинантные плазмиды, идентифицированные посредством секвенирования, назвали pK(стебель), pK(стебель), pC351G, pC351A, pC351T, pΔC351, pIn-351C, pA-rC351G, pAsia1-rC351G.

1.6. «Спасение» вируса

После рестрикции расщепленные и линеаризованные рестрикционной эндонуклеазой EcoR V рекомбинантные плазмиды p(dN), p(dJ) и p(dK), pK(стебель), pK(стебель), pC351G, pC351A, pC351T, pΔ351, pIn-351C, pA-rC351G, pAsia1-rC351G подвергали транскрипции in vitro в соответствии с инструкцией к набору систем для крупномасштабного производства РНК T7 RiboMAX™. Реакционная смесь представляет собой: 6 мкл 25 ммоль/л rNTP, 4 мкл 5× буфера, 2 мкл РНК-полимеразы T7, 8 мкл (2 мкг) линеаризованной EcoRV рекомбинантной плазмиды, общий объем 20 мкл. После тщательного перемешивания реагенты инкубировали при 37°C в течение 2,5 ч., расщепляли ДНКазой без РНКаз в течение 15 мин. с удалением матрицы ДНК, и продукты транскрипта очищали способом экстракции фенолом и хлороформом. Когда клетки BHK-21 в 6-луночных планшетах выросли до 60%-90% монослоя, клетки PBS промывали дважды и добавляли 1,5 мл DMEM, содержащей 2% FBS. Трансфицировали РНК, полученную путем транскрипции in vitro, в клетки BHK-21 для «спасения» вируса в соответствии с инструкциями к набору для трансфекции Effectene^® Transfection Reagent (Qiagen). Культивировали трансфицированные клетки при 37°C в условиях 5% CO₂, наблюдая при этом цитопатический эффект (CPE), собирали вирус через приблизительно 3 дня, после 3-кратного повторного замораживания и оттаивания вирус инокулировали в свежие клетки BHK-21 до тех пор, пока вирус не производил стабильный CPE. Правильные мутантные штаммы рекомбинантного вируса, идентифицированные секвенированием полноразмерного генома, использовали для последующих экспериментов. «Спасенные» вирусы назвали rdN, rdJ, rdK, rK(стебель), rK(стебель), rC351G, rC351A, rIn-351C, A-rC351G и Asia1-rC351G, соответственно.

1.7. Одноступенчатая кривая роста

FMDV дикого типа, рекомбинантный химерный по IRES вирус и вирус с сайт-направленным мутантом IRES инокулировали в клетки BHK-21 и IBRS-2 при MOI 0,05 и адсорбировали в течение 1 ч. соответственно при 33°C, 37°C, 41°C, затем промывали PBS для удаления неадсорбированного вируса и добавляли DMEM, содержащую 2% FBS, для поддержания культуры, вирус собирали через 4 ч., 8 ч., 12 ч., 16 ч., 20 ч., 24 ч., 28 ч., 32 ч., 40 ч. после инокуляции, измеряли титры TCID₅₀ вируса, собранного в разные моменты времени, и рассчитывали среднее значение титров TCID₅₀ вируса после трехкратного повторения измерения в каждый момент времени. Одноступенчатую кривую роста репликации вируса при различной температуре строили с временем инфицирования клеток вирусом в качестве абсциссы и логарифмическим значением титров TCID₅₀ в разные моменты времени в качестве ординаты.

1.8. Пассаж вируса и тест на генетическую стабильность

FMDV дикого типа, IRES-химерный вирус rK(стебель), вирусы с точечной мутацией rC351A и rC351G инокулировали в клетки BHK-21 для реакции в течение 1 ч., дважды промывая PBS и добавляя DMEM, содержащую 2% FBS, для поддержания культуры. Собирают вирусы до появления CPE. Пассировали в непрерывных пассажах в течение 20 пассажей после повторного замораживания и оттаивания в течение 3 раз. Извлекали РНК вируса каждые 5 пассажей для RT-PCR-амплификации и секвенирования.

1.9. Репликоны FMDV с люциферазой и люциферазный анализ

96-луночные планшеты с клетками BHK-21 и клетками IBRS-2, трансфицированными репликонной РНК IRES-химерных вирусов, поддерживали при 33°C, 37°C или 41°C. Собирали и лизировали клетки через 12 ч. и измеряли активность Rluc на люминометре GloMax в соответствии с инструкциями к набору для люциферазного анализа Renilla системы люциферазного анализа Renilla-Glo™, реакционная система заключается в том, что на 10 мкл буфера клеточного лизата добавляли 50 мкл реакционного раствора, при этом параметры составляли: 2 с задержка с опережающим считыванием и 10 с время обнаружения.

1.10. Вестерн-блоттинг

Клетки BHK-21 или клетки IBRS-2, инокулированные 100 TCID₅₀ FMDV дикого типа и его рекомбинантного вируса, культивировали в течение 12 ч., а затем собирали, после обработки лизированием образцы белка разделяли с помощью SDS-PAGE, а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. После блокирования 5% обезжиренным молоком мембрану инкубировали с первичными антителами MAb 4B2 (разбавленными в соотношении 1:1000) при 37°C в течение 1 ч. После промывки PBST в качестве вторичного антитела добавляли меченое HRP антитело кролика к IgG мыши (разбавленное в соотношении 1:5000) и проводили реакцию при 37°C в течение 1 ч., добавляли раствор DAB для развития цвета после промывки. Кроме того, внутренним эталоном выбрали антитело к β-актину (разбавленное в соотношении 1:1000) в качестве первичного антитела, и меченое HRP антитело козы к IgG мыши (разбавленное в соотношении 1:10000) использовали в качестве вторичного антитела.

1.11. Тест на вирулентность на мышах-сосунках

Вирус градиентно серийно разбавляли в 10 раз стерилизованным PBS, отбирали 3-дневных мышей-сосунков BALB/c и случайным образом разделяли на группы по 5 мышей в каждой группе. Каждый штамм последовательно инокулировали с разбавлением вируса в 3 градиентах, каждой мыши-сосунку вводили цервикодорсально 200 мкл раствора вируса, и группе отрицательного контроля вводили равное количество PBS. После непрерывного наблюдения в течение 7 дней строили кривую выживаемости мышей-сосунков со временем гибели мышей-сосунков в качестве абсциссы и долей выживших мышей-сосунков в качестве ординаты.

1.12. Тест на вирулентность, тест на безопасность, вакцинация и тест на заражение у свиньи

Тест на вирулентность

Двадцать здоровых, отрицательных по сывороточным антителам к FMDV свиней весом 20-30 кг случайным образом разделяли на 4 группы по 5 в каждой группе. Трем свиньям в одной группе вводили внутримышечно в шейный отдел вирусный штамм FMDV дикого типа (WT) в дозе 10⁵ TCID₅₀/свинья, в остальных трех группах трем свиньям в каждой группе вводили внутримышечно в шейный отдел мутантные по IRES штаммы rC351G, FMDV (R4) или rdK в дозе 10⁶ TCID₅₀/свинья, через 1 день после инокуляции (dpi) по две свиньи помещали в каждую группу в качестве совместно проживающих животных. В течение 7 дней после инокуляции измеряли температуру тела каждой свиньи, наблюдали клинические симптомы и собирали мазки из носа, мазки из полости рта и кровь.

Тест на безопасность

Девять здоровых, отрицательных по сывороточным антителам к FMDV поросят на откорме весом 30-40 кг случайным образом разделяли на 3 группы по 3 свиньи в каждой группе. Свиньям первой группы вводили в заднюю ушную мышцу аттенуированный штамм rC351G в дозе 10⁶ TCID₅₀/свинья. Через пять дней после инокуляции забивали первую группу свиней, смешивали и гомогенизировали ткани миндалин, плазму крови, а также секрет из полости рта и носа, и вводили 2 мл смеси второй группе свиней. Аналогичным образом забивали вторую группу свиней через 5 дней после инокуляции, смешивали и гомогенизировали те же ткани и образцы и вводили 2 мл смеси третьей группе свиней. Измеряли температуру тела каждой группы свиней, наблюдали клинические симптомы и собирали мазки из носа, мазки из полости рта и кровь ежедневно после инокуляции. Также у третьей группы свиней брали образцы крови через 3, 7, 14 и 21 день после инокуляции.

Вакцинация и тест на заражение

Чтобы оценить иммунопротективный эффект аттенуированного штамма rC351G, 3 свиньям инокулировали этот мутант, 2 свиньи с инокулированием PBS использовали в качестве контроля заражения. Через 21 день после вакцинации штамм FMDV типа O, O/Mya-98/CHA/2010, который в настоящее время распространен в Китае, использовали для заражения свиней, чтобы оценить иммунопротективный эффект, при этом конкретный способ заключается в следующем.

Отбирали пять здоровых, отрицательных по сывороточным антителам к FMDV поросят на откорме весом 20-30 кг, 3 свиньям вводили внутримышечно в шейный отдел аттенуированный штамм rC351G в дозе 10⁶ TCID₅₀/свинья, 2 свиньям вводили внутримышечно в шейную часть 1 мл PBS в качестве контроля. Иммунизированную группу и контрольную группу заражали через 21 день после вакцинации, каждой свинье внутримышечно вводили в шейный отдел вирус O/Mya-98/CHA/2010 в дозе 1000 ID₅₀/свинья. В течение 7 дней после заражения измеряли температуру тела каждой свиньи, наблюдали клинические симптомы и собирали каждый день мазки из носа, мазки из полости рта и кровь.

1.121. Наблюдение клинических симптомов

Ежедневно тщательно наблюдали и регистрировали клиническую заболеваемость свиней и проводили клиническую оценку в баллах в соответствии со способом, описанным Pacheco and Mason et al. (Pacheco and Mason et al., J. Vet. Sci., 2010): Клиническая оценка в баллах основывалась на количестве участков, содержащих везикулярные поражения (три балла для каждого копыта, носа, языка или губ), с максимальной оценкой 20 баллов.

1.122. Обнаружение виремии и выделение вирусов

Общую РНК свежих мазков из носа, полости рта и образцов крови извлекали с применением способа TRIZOL и проводили обратную транскрипцию с использованием праймера Oligo (dT₁₅) для получения кДНК, используемой в качестве матрицы, и проводили флуоресцентную количественную ПЦР-детекцию с использованием специфических для FMDV праймеров (3DF: 5' GGA TGC CGT CTG GTT GTT 3'; 3DR: 5' CGT AGG AGA TCA TGG TGT AAG AGT 3'). Конкретный процесс флуоресцентной количественной ПЦР проводили в соответствии с инструкциями к набору Platinum^® SYBR^® Green qPCR Super Mix-UDG с ROX (Invitrogen), и содержание геномной РНК вируса в образцах рассчитывали по стандартной кривой. Фоновое значение РНК FMDV, амплифицированной с использованием образцов крови, мазков из полости рта и носа доклинически здоровых свиней с помощью ПЦР-амплификации составило 2,6 (x + SD = 2,26 + 0,34) log10, и если число копий вирусной РНК/мл (CN/мл вирусной РНК) было выше, чем данное значение, то его оценивали как FMDV-РНК-положительное.

1.123. Обнаружение FMDV-специфических антител

Цельную кровь свиньи собирали каждый день, отделенную сывороточную фракцию использовали для обнаружения антител к FMDV и действовали в соответствии с инструкциями к набору ELISA для блокирования антител к FMDV типа О в жидкой фазе, производимого в Экспертной лаборатории по ящуру Ветеринарного научно-исследовательского учреждения Ланьчжоу. Устанавливали по две лунки для каждого планшета для разбавления сыворотки в соотношении 1:2 и 1:4 в качестве отрицательного контроля, четыре лунки 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 в качестве положительного контроля, а вирусный антиген помещали в 4 лунки в качестве контроля. Тестируемую сыворотку последовательно разбавляли от 1:8 до 1:1024 с помощью способа серийных разбавлений. Каждую стадию проведения реакции выполняли в соответствии с инструкциями. После завершения реакции измеряли значения OD_450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

1.124. Обнаружение антител к неструктурному белку 3ABC из FMDV

Цельную кровь свиньи собирали каждый день, отделенную сывороточную фракцию использовали для обнаружения антител к неструктурному белку 3ABC из FMDV в соответствии с инструкциями к 3ABC-I-ELISA от Экспертной лаборатории по ящуру Ветеринарного научно-исследовательского учреждения Ланьчжоу. Разбавляли сыворотку в 96-луночных планшетах для ELISA и устанавливали две лунки соответственно для отрицательного и положительного контроля. Разбавляли 6 мкл сыворотки в 120 мкл сывороточного разбавителя с разбавлением 1:21, по одному повторению устанавливали на разбавленную сыворотку и разбавляли по 46 сывороток на планшет с добавлением по каплям разбавленной сыворотки в планшет с нанесенными реагентами для ELISA. После проведения реакции в течение определенного периода времени последовательно добавляли различные ферментные реагенты для мечения и субстраты и, наконец, с помощью считывающего устройства для микропланшетов измеряли значения поглощения (значение OD_450 нм) при длине волны 450 нм. Титр антител = (OD_450 нм образца - OD_450 нм отрицательного контроля) / (OD_450 нм положительного контроля - OD_450 нм отрицательного контроля), если это значение >0,2, то его оценивали как положительное.

1.125. Анализ микронейтрализации

Сначала определяли TCID₅₀ вируса FMDV O/YS/CHA/05 с использованием клеток BHK-21, а затем проводили тест на микронейтрализацию с использованием способа фиксации вируса в разбавленной сыворотке. Инактивировали сыворотку при 56°C в течение 30 мин. и выполняли серийные разбавления с использованием PBS. Смешивали 100 TCID₅₀ вируса с различными разбавлениями сыворотки в равном объеме и инкубировали в течение 1 ч. при 37°С; указанные выше сывороточно-вирусные смеси (100 мкл/лунка) инокулировали соответственно в клетки BHK-21, 8-луночные повторы на титр, культивировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂, ежедневно наблюдали CPE и окончательное определение проводили через 72 часа. Кроме того, устанавливали контроли с вирусом, положительной сывороткой и нормальными клетками. Титр нейтрализации вируса рассчитывали в соответствии с CPE с использованием способа Рида-Мюнха (Reed and Muench, 1938). Титром нейтрализации вируса была концентрация разбавления сыворотки, которая способна защитить 50% клеток BHK-21 от CPE.

1.126. Непрямой ELISA

Отрицательных по сывороточным антителам к FMDV свиней подвергали скринингу с использованием способов непрямого ELISA для выявления антител к FMDV трех серотипов (тип O, тип A и тип Asia1). Конкретные стадии осуществляли следующим образом: использовали инактивированный и очищенный цельный вирус FMDV в качестве антигена, покрывали 96-луночные планшеты для ELISA и добавляли 5% обезжиренное молоко для блокирования в течение ночи при 4°C; промывали 3 раза PBST, а затем добавляли сыворотку, подлежащую тестированию, 100 мкл на лунку, инкубировали при 37°C в течение 1 ч., промывали 3 раза PBST и добавляли 100 мкл HRP-меченого антитела козы к IgG свиньи (1:5000) на лунку в качестве вторичного антитела (Sigma), инкубировали при 37°C в течение 1 ч., промывали 3 раза PBST, добавляли 50 мкл/лунка раствора красителя для субстрата TMB, проводили реакцию с защитой от света при 37°C в течение 15 мин.; добавляли 50 мкл/лунка 2 M H₂SO₄ для остановки реакции и, наконец, определяли значение OD_450нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

2. Результаты

2.1 Химерный по IRES вирус FMDV(R4) является аттенуированным мутантом

В настоящем изобретении применяют операционную систему обратной генетики FMDV типа O для замены домена 4 IRES FMDV соответствующим доменом IRES BRBV и успешно конструируют и «спасают» химерного по IRES мутанта FMDV(R4). Мышь-сосунок является хорошо известной животной моделью для оценки вирулентности FMDV, поэтому в качестве модели использовали 3-дневных мышей-сосунков, и определяли и сравнивали вирулентность химерного по IRES вируса FMDV(R4) и вируса его дикого типа FMDV(WT), результаты теста показаны на фиг. 1. Для FMDV(WT) доза инокуляции вируса 1 TCID₅₀ вызывала гибель всех мышей-сосунков, доза инокуляции вируса 0,1 TCID₅₀ вызывала частичную (50%) гибель мышей-сосунков, тогда как доза инокуляции вируса 0,01 TCID₅₀ не вызывала гибели мышей-сосунков; для химерного по IRES штамма вируса FMDV(R4) доза инокуляции вируса 100 TCID₅₀ вызывала гибель всех мышей-сосунков, доза инокуляции вируса 10 TCID₅₀ вызывала частичную (80%) гибель мышей-сосунков, тогда как доза инокуляции вируса 1 TCID₅₀ не вызывала гибели мышей-сосунков. Вышеприведенные результаты демонстрируют, что вирулентность химерного по домену 4 IRES вируса FMDV(R4) для мышей-сосунков существенно снижена, и эта вирулентность снижалась приблизительно в 100 раз по сравнению с вирулентностью исходного вируса FMDV(WT), что демонстрирует то, что домен 4 IRES является определяющим фактором вирулентности FMDV.

2.2. FMDV(R4) является термочувствительным мутантом

Чтобы исследовать механизм ослабления вирулентности FMDV, вызванного заменой домена 4 IRES, авторы изобретения сначала проанализировали стабильность вторичной структуры химерного по домену 4 IRES по сравнению с IRES FMDV дикого типа, используя программное обеспечение M-fold (версия 3.2). Как рассчитано с помощью M-fold, значение ΔG IRES FMDV(R4) было выше (-185,40 ккал/моль), чем значение для FMDV(WT) (-196,60 ккал/моль), что указывает на то, что структура IRES FMDV(R4) была менее стабильной. Кроме того, репликация BRBV обычно ограничивается более холодным эпителием верхних дыхательных путей и, разумеется, является термочувствительной при выращивании при повышенных температурах. Обобщая, авторы изобретения имеют основания предполагать, что FMDV(R4), в котором домен 4 IRES заменен доменом из BRBV, является термочувствительным, а следовательно аттенуированным мутантом.

Чтобы исследовать, является ли репликация FMDV(R4) термочувствительной, построили одноступенчатые кривые роста FMDV(R4) при различных температурах в полученных из хомяка клетках BHK-21 и полученных из свиньи клетках IBRS-2. Результаты показаны на фиг. 2. В клетках BHK-21 способность FMDV(R4) к репликации была несколько выше, чем у FMDV(WT) при 33°C; и способность FMDV(R4) к репликации была несколько ниже, чем у FMDV(WT) при 37°C; в то время как способность химерного вируса FMDV(R4) к репликации значительно снижалась, она снижена приблизительно в 100 раз по сравнению со способностью исходного вируса FMDV(WT) при 41°C. В клетках IBRS-2 химерный вирус FMDV(R4) обладает аналогичными исходному FMDV(WT) пролиферативными свойствами при 33°C; и способность химерного вируса FMDV(R4) к репликации значительно снижалась, она снижена приблизительно в 100 раз по сравнению со способностью исходного вируса FMDV(WT) при 37°C; при 41°C способность химерного вируса FMDV(R4) к репликации практически утрачена, однако его исходный вирус FMDV(WT) все еще может достигать высокого титра репликации (10^6,25 TCID₅₀/мл). Вышеприведенные результаты подтверждают, что химерный по IRES аттенуированный штамм FMDV(R4) является термочувствительным мутантом, и эта термочувствительность очень значительна в полученных из свиньи клетках IBRS-2.

2.3. K-область домена 4 IRES определяет термочувствительный аттенуированный фенотип FMDV(R4)

Для того, чтобы дополнительно проанализировать молекулярные детерминанты термочувствительного аттенуированного фенотипа химерного по IRES вируса FMDV(R4) в настоящем изобретении применяли систему обратной генетики FMDV типа О для замены субдоменов J, K и N в домене 4 IRES FMDV соответствующими субдоменами из IRES BRBV. Три химерных по субдоменам IRES J, K и N мутанта FMDV были успешно сконструированы, и «спасены», и названы соответственно rdJ, rdK и rdN. Определили и проанализировали динамику репликации трех химерных вирусов при различных температурах и построили одноступенчатые кривые роста. Результаты теста показаны на фиг. 3. Как в клетках BHK-21, так и в клетках IBRS-2, или при различных температурах 33°C, 37°C и 41°C, химерные вирусы rdJ, rdN и исходный вирус FMDV(WT) характеризовались сходными пролиферативными свойствами. Однако в клетках BHK-21 химерный вирус rdK обладал аналогичной исходному вирусу FMDV(WT) способностью к репликации при 33°C и 37°C, однако способность к репликации значительно снижалась при 41°C, она снижалась приблизительно в 100 раз по сравнению со способностью исходного вируса FMDV(WT); в клетках IBRS-2 способность химерного вируса rdK к репликации значительно снижалась даже при 37°C, она снижалась в 100 раз по сравнению со способностью исходного вируса, и способность к репликации rdK практически утрачивалась при 41°C. Репликативные свойства химерного вируса rdK (а не rdJ и rdN) согласовались с репликативными свойствами химерного вируса FMDV(R4), что указывает на то, что K-область домена 4 IRES определяет термочувствительные свойства химерного вируса FMDV(R4). В то же время результаты теста на вирулентность у мышей-сосунков показали, что вирулентность rdK снижалась приблизительно в 10⁶ раз по сравнению с вирулентностью FMDV(WT) (фиг. 7). Подводя итог, вышеупомянутые результаты показали, что K-область домена 4 IRES определяет термочувствительный аттенуированный фенотип химерного по IRES вируса FMDV(R4).

2.4. Структура петли К-области домена 4 IRES определяет термочувствительный аттенуированный фенотип FMDV(R4)

K-области домена 4 IRES из FMDV и BRBV соответственно состоят из структуры стебель-петля. Для определения области в структуре стебель-петля K-области, ассоциированной с термочувствительным аттенуированным фенотипом FMDV, в настоящем изобретении применяется система обратной генетики для замены стебля или петли K-области IRES FMDV соответствующей областью из IRES BRBV. Два «спасенных» химерных вируса назвали соответственно rK(стебель) и rK(петля). Определили динамику репликации двух химерных вирусов в разных клетках при различных температурах, и одноступенчатые кривые роста показаны на фиг. 4. Как в клетках BHK-21, так и в клетках IBRS-2, или при различных температурах 33°C, 37°C и 41°C, химерный вирус rK(стебель) характеризовался аналогичными исходному вирусу FMDV(WT) пролиферативными свойствами; однако способность к репликации химерного вируса rK(петля) в двух типах клеток постепенно снижалась с повышением температуры, и его репликативные свойства были чрезвычайно похожи на свойства rdK. Вышеупомянутые результаты указывают на то, что структура петли K-области домена 4 IRES определяет термочувствительность химерного вируса FMDV(R4). Определяли вирулентность rK(петля), и при этом было выявлено, что вирус нестабилен у мышей-сосунков, произошла обратная мутация T351C в сайте 351 IRES, которая соответствовала обратной мутации, имевшей место в сайте 351 IRES после того, как вирус подвергали множественным пассажам в клетках in vitro (фиг. 6A); эта обратная мутация приводит к тому, что структура петли K-области rK(петля) становится похожа на структуру петли К-области исходного вирулентного штамма и, таким образом, восстанавливается вирулентность мутанта rK(петля) для мышей-сосунков до уровня исходного вируса (фиг. 7).

2.5. Нуклеотид С в сайте 351 на петле К-области домена 4 IRES определяет термочувствительный аттенуированный фенотип FMDV

Анализ выравнивания показал, что последовательность петли (³⁵¹CUUUAA³⁵⁶) в субдомене К IRES из FMDV отличается от последовательности из BRBV (UUUAC), включая еще один нуклеотид в положении 351 в IRES FMDV, и отличается по одному нуклеотиду в положении 356 (A для FMDV или C для BRBV) между IRES двух вирусов. Чтобы проверить, какой нуклеотид в петле субдомена K определил термочувствительные аттенуированные фенотипы FMDV, в инфекционных клонах кДНК FMDV выполнили точечную мутацию. Во-первых, авторы изобретения создали мутантный rA356C с однонуклеотидной заменой в положении 356 IRES. Динамика репликации (фиг. 5) мутантного вируса при различных температурах показала, что способности rA356C к репликации в клетках двух типов, BHK-21 и IBRS-2, были аналогичны способностям исходного вируса FMDV(WT) при 33°C, 37°C и 41°C, что указывает на то, что нуклеотид A356 IRES FMDV не имеет отношения к термочувствительному фенотипу FMDV.

Чтобы выяснить, определяет ли нуклеотид C351 IRES термочувствительный фенотип FMDV, в настоящем изобретении осуществили четыре следующих мутации для нуклеотида C в положении 351:

(1) делецию нуклеотида C351; (2) нуклеотид C351 мутировали в нуклеотид A; (3) нуклеотид C351 мутировали в нуклеотид G; (4) нуклеотид C351 мутировали в нуклеотид U.

Окончательные результаты испытаний показали, что схемы мутаций (1) и (4) не позволили «спасти» вирус из-за разрушения структуры петли IRES (фиг. 5A), тогда как схемы мутаций (2) и (3) могут «спасти» вирус из-за инвариантности структуры петли IRES (фиг. 5A), и при этом «спасенные» мутанты были названы соответственно rC351A и rC351G. Измерили динамику репликации этих двух вирусов с точечной мутацией IRES при различных температурах, и результаты показаны на фиг. 5. В клетках BHK-21 rC351G, rC351A и исходный вирус FMDV(WT) характеризовались сходными пролиферативными свойствами при 33° и 37°C, в случае если температура поднималась до 41°C, - способность к репликации rC351G и rC351A снижалась в 100 раз по сравнению со способностью исходного вируса. В полученных из свиньи клетках IBRS-2 способность rC351G и rC351A к репликации постепенно снижалась с увеличением температуры по сравнению со способностью исходного вируса, и уровни репликации rC351G и rC351A значительно снижались в 10000 раз по сравнению с уровнями исходного вируса при 41°C. Вышеприведенные результаты показали, что репликативные свойства двух вирусов с точечной мутацией нуклеотида С в сайте 351 IRES были сходны со свойствами химерного по IRES вируса rK(петля), что указывает на то, что этот сайт является молекулярной детерминантой термочувствительного фенотипа химерного по IRES FMDV. В то же время было также выявлено, что вирулентность термочувствительных мутантов FMDV, мутировавших в сайте С351 IRES, значительно снижена для мышей-сосунков. По сравнению с вирусом дикого типа вирулентность rC351G снижена приблизительно в 10000 раз, и вирулентность rC351A снижена приблизительно в 1000 раз. Подводя итог, вышеприведенные результаты в конечном итоге указывают на то, что нуклеотид С в положении 351 на петле К-области домена 4 IRES определяет термочувствительный аттенуированный фенотип FMDV.

2.6. Генетическая стабильность термочувствительных аттенуированных штаммов в ходе непрерывных пассажей in vitro

Чтобы определить генетическую стабильность термочувствительных аттенуированных штаммов FMDV, в настоящем изобретении непрерывно пассировали химерные по IRES или с сайт-направленным мутагенезом вирусы FMDV(R4), rdK, rK(петля), rC351G, rC351A и исходный вирус FMDV(WT) 20 раз в клетках BHK-21, и определяли последовательности IRES вирусов 20^-го пассажа. В течение 20 пассажей в клетках BHK-21 последовательности IRES из FMDV(R4), rdK, rC351G и rC351A не мутировали; более того, мутантные вирусы все еще сохраняли свои первоначальные термочувствительные свойства в клетках (фиг. 6B) и аттенуированные фенотипы у мышей-сосунков (фиг. 7). Однако, хотя у rK(петля) не было случаев каких-либо мутаций до 15^-го пассажа, в 20-м пассаже у некоторых вирусов содержалась мутация T351C в положении 351 IRES. Вирусы rK(петля) продолжали пассировать в течение 5 раз, и мутантные вирусы T351C стали доминирующими клонами (фиг. 6A); между тем, вирусы rK(петля) 25^-го пассажа утратили термочувствительные свойства (фиг. 6B), и их вирулентность для мышей-сосунков вернулась к уровню, аналогичному уровню у вируса дикого типа (фиг. 7). Вышеприведенные результаты показали, что химерные по IRES или мутанты FMDV с сайт-направленным мутагенезом FMDV(R4), rdK, rC351G и rC351A обладали высокой генетической стабильностью; тогда как химерный по петле К-области IRES FMDV, rK(петля), являлся нестабильным. Когда его пассировали до 20^-го пассажа, в некоторых вирусах произошла обратная мутация, а когда его пассировали до 25^-го пассажа, – обратная мутация произошла во всей вирусной группе.

2.7. C351 IRES является определяющим сайтом для термочувствительного аттенуированного фенотипа, общего для штаммов FMDV

Хотя и rC351G, и rC351A обладали высокой генетической стабильностью, аттенуирующий эффект rC351G был более очевидным, чем эффект rC351A. Поэтому rC351G и мутант C351G IRES выбрали в качестве объектов для изучения в последующих исследованиях. Приведенные выше результаты исследований получили с использованием штаммов FMDV типа О. Чтобы убедиться в том, что мутация C351G в IRES также определяет термочувствительный аттенуированный фенотип других серотипов штаммов FMDV, в настоящем изобретении дополнительно используется полноразмерный инфекционный клон кДНК FMDV типа A и типа Asia1 для создания и «спасения» вирусных мутантов с нуклеотидной заменой C351G в IRES, которые были названы соответственно A-rC351G и Asia1-rC351G. Термочувствительность вышеупомянутых мутантов IRES была определена, и результаты показаны на фиг. 8A и 8B: способности к репликации как A-rC351G, так и Asia1-rC351G в клетках BHK-21 и IBRS-2 снижались с повышением температуры, что указывает на то, что мутация C351G в IRES дала возможность и другим серотипам штаммов FMDV получить термочувствительный фенотип. Кроме того, результаты теста на вирулентность A-rC351G и Asia1-rC351G на мышах-сосунках показали, что мутация C351G в IRES также могла снижать вирулентность FMDV типа A и типа Asia1 для мышей-сосунков по меньшей мере в 10000 раз (фиг. 8C и 8D), что указывает на то, что термочувствительные аттенуированные фенотипы штаммов FMDV трех серотипов, распространенных в Китае, типа O, типа A и типа Asia1, определялись C351 IRES. Поскольку сайт C351 в IRES и функциональная структура стебель-петля, окружающая этот сайт, являются консервативными во всех семи серотипах штаммов FMDV, то был сделан вывод, что C351 IRES является молекулярной детерминантой термочувствительного аттенуированного фенотипа всех серотипов штаммов FMDV.

2.8. Способность инициации трансляции, опосредованной мутантом C351G IRES, регулироваться температурой

Чтобы исследовать молекулярный механизм, обусловливающий термочувствительные аттенуированные фенотипы rC351G, авторы изобретения исследовали критическую раннюю стадию репликации вируса, инициацию IRES-направленной трансляции вирусного белка кэп-независимым способом. Чтобы достичь этого, авторы изобретения сконструировали два репликона с люциферазой rC351G-luc и FMDV(WT)-luc, которые содержали соответствующие элементы IRES в том же окружении, что и в их исходных вирусах – rC351G и FMDV(WT). Способность этих репликонов с люциферазой к IRES-опосредованной трансляции оценивали путем трансфекции клеток BHK-21 и IBRS-2 транскрибированной in vitro репликонной РНК соответственно при 33°C, 37°C и 41°C. Чтобы дифференцировать сигнал люциферазы при трансляции вводимой вирусной РНК от трансляции вновь реплицированной РНК, одна часть трансфицированных клеток получила 2 мМ GnHCl, мощный ингибитор репликации РНК FMDV, который не оказывает токсического воздействия на клеточные процессы или вирусную трансляцию. Результаты показаны на фиг. 9A, хотя эффективность трансляции IRES с мутацией C351G в клетках BHK-21 была аналогична эффективности трансляции IRES дикого типа при 33°C и 37°C, при этом его эффективность трансляции значительно снижалась при 41°C; в клетках IBRS-2 эффективность инициации трансляции, опосредованная IRES с мутацией C351G, снижалась с повышением температуры, при этом снижение было наиболее очевидным при 41°C, и способность к трансляции C351G-мутированного IRES при данной температуре была почти утрачена. Это изменение эффективности инициации трансляции C351G-мутированного IRES согласуется с динамикой роста вирусного мутанта rC351G в клетках BHK-21 и IBRS-2 при различных температурах, обе из которых проявляют термочувствительные свойства, и эти термочувствительные свойства проявляются более очевидно в полученных из свиньи клетках IBRS-2. Приведенные выше результаты показывают, что эффективность инициации трансляции rC351G IRES значительно ингибируется при повышенной температуре, влияя на способность к репликации и вирулентность вируса термочувствительным образом.

Чтобы дополнительно подтвердить термочувствительный эффект в отношении инициации трансляции, опосредованный C351G-мутированным IRES, проанализировали динамику экспрессии структурного белка VP2 мутантного по IRES rC351G и его исходного вируса FMDV(WT). Результаты показаны на фиг. 9B и 9C, величина экспрессии белка VP2 из rC351G в клетках BHK-21 и IBRS-2 снижалась с повышением температуры, особенно в полученных из свиньи клетках IBRS-2, экспрессия белка VP2 вируса была практически утрачена при 41°C. Этот термочувствительный эффект в отношении уровня трансляции белка VP2, опосредованный мутацией C351G, согласовался с изменениями титра репликации инфекционных вирионов rC351G в полученных из свиньи клетках IBRS-2 при различных температурах, что указывает на то, что способность к инициации трансляции мутанта C351G IRES регулируется температурой.

2.9. Тест на вирулентность мутантного rC351G для мышей-сосунков и свиней

Результаты теста на вирулентность для мышей-сосунков показали, что вирулентность rC351G снизилась приблизительно в 10000 раз по сравнению с вирулентностью FMDV(WT) (фиг. 7).

Результаты теста на возвращение к вирулентному состоянию штамма rC351G у свиней показаны на фиг. 10. Трех свиней (№15, №46, №18) инокулировали дозой 10⁵ TCID₅₀ вируса дикого типа FMDV(WT), и температура их тела достигла 41°C в течение 48 часов после инокуляции, и появились типичные симптомы FMD, особенно выраженные в снижении аппетита, депрессии, поражениях копыт, рта и носа; у инокулированных свиней виремия развилась только через 1 день после вакцинации. Количество вирусной РНК в крови, мазках из ротовой полости и носа было значительно выше, чем уровень у здоровых свиней 2,6 log₁₀ CN/мл вирусной РНК, и виремия достигала пика, составлявшего 8,7 log₁₀ копий РНК/мл на 4 dpi. Инфекция и заболеваемость двух совместно проживающих свиней (№10, №35) отставали от таковых у свиней, инокулированных WT, и температура их тела достигала 41°C на 4 dpi (через 3 дня после совместного проживания), и поражения появились на всех четырех копытах. Вирусная РНК в крови, мазках из ротовой полости и носа совместно проживающих свиней была положительной на 3 dpi и достигала пика, составлявшего 7,1 log₁₀ CN/мл вирусной РНК на 5 dpi. В то же время аттенуированный мутантный rC351G (10⁶ TCID₅₀ на свинью) в эквиваленте 10-кратной инокулированной дозы вышеуказанного вируса дикого типа инокулировали в 3 свиней (№36, №49, №59), и при этом 2 свиньи (№57, №28) использовали в качестве контроля совместного проживания, и в течение 7 dpi не наблюдалось каких-либо клинических симптомов или повышения температуры тела; вирусная РНК в крови, мазках из ротовой полости и носа инокулированных свиней и совместно проживающих свиней вся была отрицательной. Несмотря на то, что у инокулированных rC351G свиней виремия не развивалась, все инокулированные свиньи продуцировали антитела против неструктурного белка 3ABC из FMDV через 21 день после инокуляции, тогда как антитела к 3ABC у всех совместно проживающих свиней тестировали как отрицательные в течение 21 дня после инокуляции, что указывает на то, что аттенуированный штамм rC351G демонстрировал частичную репликацию на низком уровне у вакцинированных свиней, но не развивал виремию, не выделял вирус и горизонтальной передачи не происходило. Приведенные выше результаты теста показали, что вирулентность вируса rC351G для мышей-сосунков значительно снизилась, а вирулентность для природных хозяев-свиней была утрачена.

2.10. Результаты теста стабильности и оценка безопасности аттенуированного штамма rC351G

1) Пассаж клеток in vitro

Чтобы протестировать генетическую стабильность аттенуированного штамма rC351G, проводили непрерывный пассаж в клетках BHK-21 в течение 20 пассажей, и определяли полную последовательность генома вируса 20-го пассажа. Результаты показали, что штамм rC351G обладал высокой генетической стабильностью и подвергался непрерывному пассажу в течение 20 пассажей in vitro, его C351G IRES не подвергался обратной мутации, и его аттенуированный фенотип не изменялся.

2) Совместно проживающие животные не инфицируются

Результаты теста на совместное проживание показаны на фиг. 1. Здоровые свиньи (№57, №28) не проявляли каких-либо клинических симптомов после совместного проживания с вакцинированными rC351G свиньями (№36, №49, №59). Обнаружение вирусной РНК в образцах крови, мазках из ротовой полости и носа, собранных в течение 7 дней, было отрицательным, и антитело против неструктурного белка 3ABC из FMDV в сыворотке также было отрицательным на 21-й день, что указывает на то, что у совместно проживающих свиней не возникало инфекции rC351G FMDV. Приведенные выше результаты теста на совместное проживание показали, что у свиней не вырабатывалась виремия и не выделялся вирус после инокуляции аттенуированного мутантного штамма rC351G, при этом аттенуированный мутантный штамм rC351G утрачивал вирулентность в отношении восприимчивых животных, был неспособным к горизонтальной передаче. Следовательно, rC351G обладает превосходной безопасностью.

3) Вирулентность не возвращается к вирулентному состоянию после непрерывных пассажей в природных животных-хозяевах

Чтобы дополнительно оценить безопасность аттенуированного штамма rC351G, для штамма проводили непрерывный пассаж в поросятах. Результаты показали, что аттенуированный штамм rC351G подвергался непрерывному пассажу в течение 3 пассажей в организме свиней с инокулированием 3 свиней за пассаж. У всех свиней была нормальная температура тела в течение 5-дневного периода наблюдения, и клинические симптомы отсутствовали. Были протестированы сывороточные антитела вакцинированных свиней третьего пассажа, собранные на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день после инокуляции. Результаты показали, что антитело к структурному белку FMDV было отрицательным (значение LPBE составляло менее чем 1:8), и антитело к неструктурному белку 3ABC из FMDV было также отрицательным (значение OD <0,2), и вирусная РНК в крови, мазках из полости рта и носа также была отрицательной на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день после инокуляции. Приведенные выше результаты теста показали, что аттенуированный штамм rC351G не возвращался к вирулентному состоянию после непрерывного пассажа у свиней, на основании предыдущих доказательств того, что совместное проживание не распространяло вирус, это дополнительно доказывало, что искусственная инокуляция и пассаж аттенуированного штамма rC351G характеризуются хорошей безопасностью in vivo.

2.11. Результаты теста на иммунопротективный эффект у свиней, иммунизированных аттенуированным штаммом rC351G

Результаты теста на иммунопротективный эффект у иммунизированных rC351G свиней показан в таб. 3.

Таб. 3. Защита инокулированных rC351G свиней против заражения штаммами FMDV O/Mya-98/CHA/2010

Согласно результатам теста, через 2 дня после заражения температура тела двух контрольных свиней (№65, №73) повысилась до 41°C, аппетит снизился и настроение было подавленным, а через 3 дня после заражения появились повреждения на четырех копытах двух свиней; через 48 ч. после заражения у контрольных свиней развилась виремия, и выявления РНК FMDV в крови, мазках из полости рта и носа были положительными, виремия достигла пика, составлявшего 8,7 log₁₀ CN/мл вирусной РНК через 3 дня после заражения, в это время вирус можно было выделить из крови и мазков из полости рта и носа. В то же время у 3 свиней (№60, №66, №68), инокулированных аттенуированным штаммом rC351G, не было каких-либо клинических симптомов или явления повышения температуры тела в течение 7 дней после заражения, и тесты на РНК FMDV в крови и мазках из полости рта и носа иммунизированных свиней были отрицательными, и выделение вируса также было отрицательным; при этом результаты теста на антитела к FMDV после заражения показали, что титр нейтрализующих антител к FMDV O слегка увеличен с 1:128 до 1:512, и титр антитела LPBE увеличен с 1:180 до 1:720 на 7 dpc у группы, иммунизированной rC351G. В контрольной группе с PBS уровень нейтрализующего антитела к FMDV быстро увеличивался от менее 1:8 до 1:128, и уровень антитела LPBE также быстро увеличивался от 1:8 до 1:180. Результаты теста на заражение показали, что свиньи, иммунизированные аттенуированным штаммом rC351G, смогли получить полную противоинфекционную защиту от заражения популярными в настоящее время штаммами FMDV различных генотипов типа О.

2.12. Вирулентность FMDV(R4) и rdK у свиней

Трех свиней инокулировали аттенуированными мутантами FMDV(R4) или rdK (10⁶ TCID₅₀ на свинью), и через 24 часа по две нативных свиньи помещали в каждую группу для совместного проживания. Результаты показаны на фиг. 10, ни у одной из свиней не проявилось каких-либо клинических симптомов или повышения температуры тела в течение всего экспериментального периода; не было обнаружено какой-либо вирусной РНК в крови, мазках из полости рта и носа инокулированных свиней и непосредственно контактировавших свиней. Через 21 день после инокуляции результаты теста на антитела к FMDV показали, что нейтрализующие антитела к FMDV у всех вакцинированных свиней и совместно проживающих свиней были отрицательными (<1:8). Эти результаты показали, что мутантные FMDV(R4) и rdK утратили инфекционность по отношению к природному хозяину, а также показали отсутствие виремии, выделения вируса, горизонтальной передачи и образования антител. Следовательно, в качестве вирусного посевного материала для инактивированной вакцины аттенуированные мутанты FMDV(R4) и rdK обладают лучшей безопасностью.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ХАРБИН ВЕТЕРИНАРИ РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТЈ¬CAAS

Термочувствительный аттенуированный штамм вируса ящура,

способ его конструирования и применение

<130> HLJ-2016-166780

<160> 3

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 438

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность мутанта IRES

<220>

<221> прочий_признак

<222> (351)..(351)

<223> n представляет собой g или a

<400> 1

gtgcaacttg gaactccgcc tggtctttcc aggtctagag gggtgacatt ttgtactgtg 60

cttgactcca cgctcggtcc actggcgagt gctagtaaca gcactgttgc ttcgtagcgg 120

agcatggtgg ccgcgggaac tcctccttgg taacagggac ccgcggggcc gaaagccacg 180

tcctcacgga cccaccatgt gtgcaacccc agcacggcaa ctttattgtg aaaaccactt 240

taaggtgaca ctgatactgg tactcaacca ctggtgacag gctaaggatg cccttcaggt 300

accccgaggt aacacgcgac actcgggatc tgagaagggg actggggctt ntttaaaagc 360

gcctggttta aaaagcttct acgcctgaat aggtgaccgg aggccggcac ctttccttcg 420

aacaactgtc tttaaatg 438

<210> 2

<211> 425

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность химерной последовательности IRES

<220>

<221> химерный ген

<222> (1)..(277)

<223> ген вируса ящура

<220>

<221> химерный ген

<222> (278)..(374)

<223> ген бычьего риновируса

<220>

<221> химерный ген

<222> (375)..(425)

<223> ген вируса ящура

<400> 2

gtgcaacttg gaactccgcc tggtctttcc aggtctagag gggtgacatt ttgtactgtg 60

cttgactcca cgctcggtcc actggcgagt gctagtaaca gcactgttgc ttcgtagcgg 120

agcatggtgg ccgcgggaac tcctccttgg taacagggac ccgcggggcc gaaagccacg 180

tcctcacgga cccaccatgt gtgcaacccc agcacggcaa ctttattgtg aaaaccactt 240

taaggtgaca ctgatactgg tactcaacca ctggtgacag cctaaggatg ccctccaggt 300

accccggggt aacaagtgac acccgggatc tgaggagggg actactttac gtagtttaaa 360

aaacgtctaa gctgaatagg tgaccggagg ccggcacctt tccttcgaac aactgtcttt 420

aaatg 425

<210> 3

<211> 426

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность химерной последовательности IRES

<220>

<221> химерный ген

<222> (1)..(339)

<223> ген вируса ящура

<220>

<221> химерный ген

<222> (340)..(356)

<223> ген бычьего риновируса

<220>

<221> химерный ген

<222> (357)..(426)

<223> ген вируса ящура

<400> 3

gtgcaacttg gaactccgcc tggtctttcc aggtctagag gggtgacatt ttgtactgtg 60

cttgactcca cgctcggtcc actggcgagt gctagtaaca gcactgttgc ttcgtagcgg 120

agcatggtgg ccgcgggaac tcctccttgg taacagggac ccgcggggcc gaaagccacg 180

tcctcacgga cccaccatgt gtgcaacccc agcacggcaa ctttattgtg aaaaccactt 240

taaggtgaca ctgatactgg tactcaacca ctggtgacag gctaaggatg cccttcaggt 300

accccgaggt aacacgcgac actcgggatc tgagaagggg actactttac gtagtttaaa 360

aagcttctac gcctgaatag gtgaccggag gccggcacct ttccttcgaa caactgtctt 420

taaatg 426

<---

1. Способ конструирования термочувствительного аттенуированного штамма вируса ящура (FMDV) rC351G, включающий: конструирование плазмиды для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК FMDV rC351G с использованием способа полимеразной цепной реакции (ПЦР) с перекрывающимися праймерами, получение геномной РНК FMDV rC351G путем транскрипции in vitro и трансфицирование геномной РНК FMDV rC351G в клетки BHK-21 и IBRS-2 для «спасения» FMDV rC351G, где цитозин в сайте 351 на петле K-области домена 4 внутреннего участка посадки рибосомы (IRES) из геномной РНК FMDV rC351G, полученной путем транскрипции in vitro, мутирован в гуанин или аденин путем точечной мутации, последовательность оснований петли К-области после мутации представляет собой ³⁵¹GUUUAA³⁵⁶ или ³⁵¹AUUUAA³⁵⁶.

2. Термочувствительный аттенуированный штамм FMDV rC351G для предупреждения и борьбы с ящуром (FMD), полученный с помощью способа конструирования по п. 1, где плазмиде для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК, используемой для «спасения» термочувствительного аттенуированного штамма вируса ящура, соответствует номер депонирования микроорганизма CGMCC NO.13148 и научное название Escherichia coli (E. coli).

3. Способ конструирования термочувствительного аттенуированного штамма вируса ящура (FMDV) FMDV(R4), включающий: конструирование плазмиды для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК FMDV(R4) с использованием способа полимеразной цепной реакции (ПЦР) с перекрывающимися праймерами, получение геномной РНК FMDV(R4) путем транскрипции in vitro и трансфицирование геномной РНК FMDV(R4) в клетки BHK-21 и IBRS-2 для «спасения» FMDV(R4), где домен 4 внутреннего участка посадки рибосомы (IRES) из геномной РНК FMDV(R4), полученной путем транскрипции in vitro, заменен доменом 4 IRES из геномной РНК бычьего риновируса, полноразмерная последовательность которого представлена под SEQ ID No. 2.

4. Термочувствительный аттенуированный штамм FMDV(R4) для предупреждения и борьбы с ящуром (FMD), полученный с помощью способа конструирования по п. 3, где плазмиде для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК, используемой для «спасения» термочувствительного аттенуированного штамма FMDV(R4), соответствует номер депонирования микроорганизма CGMCC NO.13149 и научное название Escherichia coli (E. coli).

5. Способ конструирования термочувствительного аттенуированного штамма вируса ящура (FMDV) rdK, включающий: конструирование плазмиды для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК FMDV rdK с использованием способа полимеразной цепной реакции (ПЦР) с перекрывающимися праймерами, получение геномной РНК FMDV rdK путем транскрипции in vitro и трансфицирование геномной РНК FMDV rdK в клетки BHK-21 и IBRS-2 для «спасения» FMDV rdK, где K-область домена 4 внутреннего участка посадки рибосомы (IRES) из геномной РНК FMDV rdK, полученной путем транскрипции in vitro, заменена К-областью домена 4 IRES из геномной РНК бычьего риновируса, полноразмерная последовательность которого представлена под SEQ ID No. 3.

6. Термочувствительный аттенуированный штамм FMDV rdK для предупреждения и борьбы с ящуром (FMD), полученный с помощью способа конструирования по п. 5, где плазмиде для клонирования полноразмерной инфекционной кДНК, используемой для «спасения» термочувствительного аттенуированного штамма FMDV rdK, соответствует номер депонирования микроорганизма CGMCC NO.13150 и научное название Escherichia coli (E. coli).

7. Применение полноразмерного инфекционного клона кДНК термочувствительного аттенуированного штамма FMDV по любому из пп. 2, 4 или 6 для конструирования РНК-вакцины против ящура.

8. Применение полноразмерного инфекционного клона кДНК термочувствительного аттенуированного штамма FMDV по любому из пп. 2, 4 или 6 для получения живой аттенуированной вакцины против FMD после «спасения».

9. Применение полноразмерного инфекционного клона кДНК термочувствительного аттенуированного штамма FMDV по любому из пп. 2, 4 или 6 после «спасения» для получения вирусного посевного материала, используемого для получения инактивированной вакцины против FMD.

10. Применение термочувствительного аттенуированного штамма FMDV по любому из пп. 2, 4 или 6 для получения живой аттенуированной вакцины против FMD.

11. Применение термочувствительного аттенуированного штамма FMDV по любому из пп. 2, 4 или 6 для получения вирусного посевного материала, используемого для получения инактивированной вакцины против FMD.