Антитела против белка-1 запрограммированной клеточной смерти (pd-1) и их применение

Данная группа изобретений относится к иммунологии. Представлены антитело против белка-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1) либо его антигенсвязывающий фрагмент, а также кодирующая нуклеиновая кислота, вектор, содержащий эту нуклеиновую кислоту, выделенная клетка, трансформированная этим вектором, способ получения указанного антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента и содержащая его композиция для профилактики или лечения рака. Антитело по данному изобретению способно связываться с PD-1 и ингибировать его активность, поэтому оно применимо для разработки иммунотерапевтических средств от различных заболеваний, связанных с PD-1. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 23 ил., 16 табл., 13 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается антител против белка-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1), либо их антигенсвязывающих фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, векторов, содержащих эти нуклеиновые кислоты, выделенных клеток, трансформированных этими векторами, способа получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов и содержащих их композиций для профилактики или лечения рака.

Уровень техники

Химиотерапевтические противораковые препараты первого поколения и целевые противораковые препараты второго поколения, которые широко применяются в настоящее время, имеют проблемы с побочными эффектами из-за токсичности противораковых средств, высокого риска лекарственной устойчивости и ограниченности в том, что их можно назначать только пациентам, имеющим специфические генные мутации. Иммунные противораковые препараты (иммуноонкологические средства), которые называют “противораковыми препаратами третьего поколения”, преодолевают эти проблемы, действуя на сигнальные пути иммунных клеток и активируя их, тем самым атакуя раковые клетки и обеспечивая при этом терапевтические эффекты. В отличие от традиционных противораковых препаратов, иммунные противораковые препараты могут применяться при различных заболеваниях, включая рак, с тем чтобы лечить заболевания с помощью иммунной системы человека, причем отмечается, что они вызывают меньше побочных эффектов, чем традиционные противораковые препараты.

PD-1 (также известный как “CD279”) представляет собой рецепторный белок в 55 кД, связанный с семейством костимулирующих/ингибирующих рецепторов CD28/CTLA4 (Blank et al., 2005 Cancer Immunol Immunother. 54: 307-314).

Его характеристики изучают на мышах и людях путем клонирования гена и кДНК, кодирующей PD-1 (Ishida et al., 1992 EMBO J. 11: 3887-3395; Shinohara et al., 1994 Genomics 23: 704-706). Полноразмерный PD-1 содержит 288 аминокислотных остатков (номер доступа в NCBI: NP_005009). Внеклеточный домен состоит из аминокислотных остатков 1-167, а цитоплазматический С-концевой участок содержит аминокислотные остатки 191-288, которые содержат два гипотетических иммунорегуляторных мотива, а именно ингибиторный мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM; Vivier et al. al., 1997 Immunol Today 18: 286-291) и мотив тирозинового переключателя иммунорецептора (ITSM; Chemnitz et al., 2004 J Immunol 173: 945-954).

К настоящему времени известно, что с PD-1 специфически взаимодействуют два родственных по последовательности лиганда, PD-L1 (B7-H1) и PD-L2 (B7-DC), вызывая внутриклеточную передачу сигналов и ингибируя опосредованную CD3 и CD28 активацию Т-клеток (Riley, 2009 Immunol Rev. 229: 114-125), которая в конечном счете регулирует активность Т-клеток, например, снижает секрецию других факторов роста и цитокинов, а также рост клеток и секрецию IL-2 и IFN-γ.

Экспрессия PD-1 часто встречается в таких иммунных клетках, как T-клетки, B-клетки, мононуклеары и клетки естественных киллеров (NK), но почти не экспрессируется в других тканях человека типа мышц, эпителия и нервной ткани. Кроме того, высокие уровни экспрессии PD-1 часто связаны с активностью иммунных клеток. Например, при активации T-клеточной линии Jurkat человека с помощью PHA (фитогемагглютинина) или TPA (12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата) усиливается экспрессия PD-1, как это видно при Вестерн-блоттинге. Такое же явление наблюдалось на стимулированных Т- и В-лимфоцитах мыши и первичных Т-клетках CD4+ человека при стимуляции антителом против CD3. Повышение экспрессии PD-1 вызывает стимуляцию эффекторных Т-клеток и ведет активированные эффекторные Т-клетки в направлении истощенной и пониженной иммунной активации. Таким образом, опосредованные PD-1 ингибиторные сигналы играют ключевую роль в иммунотолерантности.

Повышение экспрессии PD-1 в инфильтрирующих опухоли лимфоцитах (TILs) и экспрессии лигандов PD-1 в опухолевых клетках отмечалось при различных раковых заболеваниях и отмечалось и в других типах тканей и органов, включая легкие, печень, желудок, молочные железы, яичники, поджелудочную железу, меланоциты и пищевод. Чаще всего экспрессия PD-1 и PD-L1 при таких раковых заболеваниях связана с плохим прогнозом по выживаемости пациентов. Важность сигнального пути PD-1 по регуляции иммунной системы для устранения рака или толерантности к раку была более подробно описана на трансгенных мышах, у которых при нокауте генов PD-1 ингибируется рост клеток раковых ксенотрансплантатов.

Повышающая регуляция сигнализации PD-1 приводит к иммуннотолерантной пролиферации рака, а также к вирусным инфекциям и метастазированию у человека. Пандемический вирус гепатита B, HBV и HCV индуцируют гиперэкспрессию лигандов PD-1 в гепатоцитах и активируют сигнализацию PD-1 в эффекторных T-клетках, что ведет к истощению T-клеток и толерантности к вирусной инфекции. Точно так же ВИЧ-инфекция зачастую избегает иммунной системы человека по аналогичному механизму. Сигнализацию PD-1 можно терапевтически модулировать при помощи антагонистических молекул с тем, чтобы иммунные клетки могли излечиться от толерантности и реактивироваться для устранения рака и хронических вирусных инфекций.

Ниволумаб и пембролизумаб, которые являются моноклональными антителами, известны как лекарственные средства, нацеленные на PD-1, и применяются в качестве терапевтических средств при злокачественной меланоме и немелкоклеточном раке легких. Однако сообщалось, что эти препараты ложатся огромным финансовым бременем на пациентов из-за высокой стоимости, и требуется их точная проверка. Следовательно, существует острая потребность в разработке новых терапевтических средств, нацеленных на PD-1, которые могут преодолеть ограниченность традиционных препаратов.

На этом техническом фоне авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки антител для лечения рака, которые специфически связываются с PD-1. В результате они разработали антитела против PD-1, которые связываются с высоким сродством с PD-1, используя технологию фагового дисплея, и обнаружили, что такие антитела против PD-1 могут значительно ингибировать образование комплекса PD-1/PD-L1, и тем самым совершили настоящее изобретение.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Итак, одной из целей настоящего изобретения является получение новых антител к PD-1 либо их антигенсвязывающих фрагментов.

Другой целью настоящего изобретения является получение нуклеиновых кислот, кодирующих эти антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Другой целью настоящего изобретения является создание вектора, включающего нуклеиновую кислоту, рекомбинантной клетки, в которую вводится вектор, и способ ее получения.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение композиций для профилактики или лечения рака, содержащих эти антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Техническое решение

В соответствии с настоящим изобретением, вышеуказанные и другие цели могут быть достигнуты путем получения антител, связывающихся с PD-1, либо их антиген-связывающего фрагмента, содержащих: вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 1-30, CDR2 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 31-56, и CDR3 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 57-79; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 198-222, CDR2 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 223-241, и CDR3 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 242-269.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие данные антитела или антигенсвязывающие фрагменты.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены экспрессионные векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены клетки, трансформированные данным экспрессионный вектором.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен способ получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов, включающий (a) культивирование клеток и (b) извлечение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов из культивированной клетки.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены композиции для профилактики или лечения рака, содержащие в качестве активного ингредиента данные антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Краткое описание фигур

Вышеуказанные и другие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения станут более понятными из следующего подробного описания в сочетании с прилагаемыми чертежами.

На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма экспрессионного PD-1 вектора, содержащего Fc человека или Fc мыши, слитый с его карбоксильным концом.

На фиг. 2A-D представлены результаты по очистке белка PD-1, а именно:

на фиг. 2A представлены результаты по идентификации белка в отношении PD1-hFc в 10% геле SDS-PAGE в восстановительных (RE) и невосстановительных (NR) условиях;

на фиг. 2B представлены результаты по SEC-HPLC в G-3000 SWXL при скорости потока 1 мл/мин с использованием PBS в качестве рабочего растворителя;

на фиг. 2C представлены результаты по идентификации белка в отношении PD1-mFc в 10% геле SDS-PAGE в восстановительных (RE) и невосстановительных (NR) условиях;

на фиг. 2D представлены результаты по SEC-HPLC в G-3000 SWXL при скорости потока 1 мл/мин с использованием PBS в качестве рабочего растворителя.

На фиг. 3 представлена способность антител к связыванию с PD-1 в зависимости от количества раундов пэннинга.

На фиг. 4 представлены результаты по ELISA для измерения способности монофагов к связыванию с PD1-His.

На фиг. 5 представлены результаты анализа SDS-PAGE для определения чистоты антител к PD-1.

На фиг. 6 представлены результаты по оценке эффективности антител к PD-1 in vitro.

На фиг. 7 представлены результаты по оценке зависимой от концентрации эффективности антител к PD-1 in vitro.

На фиг. 8 представлена способность антител к зависимому от концентрации связыванию с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, на основании средней интенсивности флуоресценции (MFI).

На фиг. 9 представлены результаты по измерению кинетики связывания между PD1-hFc и антителами 45D6 и 49A2 к PD1.

На фиг. 10 представлены результаты скрининга при оптимизации моноклонов.

На фиг. 11 представлен сравнительный анализ степени экспрессии между антителами к PD1 и исходным антителом.

На фиг. 12 представлены результаты по оценке эффективности in vitro в отношении антител к PD1 по настоящему изобретению.

На фиг. 13 представлены результаты по оценке зависимой от концентрации эффективности in vitro антител к PD1 по настоящему изобретению.

На фиг. 14 представлены результаты по идентификации моноклональных антител в отношении связывания выбранных вариантов антител к PD1 с PD-1, экспрессированным на клеточной поверхности.

На фиг. 15 представлены результаты по измерению способности выбранных вариантов антител к PD1 к связыванию с PD-1, экспрессированным на клеточной поверхности.

На фиг. 16 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении ингибирующей активности выбранных антител по предотвращению образования комплекса PD-1/PD-L1 или PD-1/PD-L2.

На фиг. 17 представлены результаты по измерению кинетики связывания между белком PD1-hFc и антителами 45D6, 49A2 и 49A2 (2B9).

На фиг. 18 представлена схематическая диаграмма мутантов PD1.

На фиг. 19 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении способности выбранных фагов к связыванию с мутантами PD-1, причем при снижении способности к связыванию уменьшается и соответствующая величина.

На фиг. 20 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении способности выбранных антител к связыванию с мутантами PD-1.

На фиг. 21 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении специфичности связывания.

На фиг. 22 представлены результаты по сравнению продуктивности после краткосрочной экспрессии в клетках HEK293.

На фиг. 23 представлены результаты по идентификации в отношении повышения активности под действием моноклональных антител к PD1 при гетерогенной MLR (реакции смешанных лимфоцитов).

Раскрытие сущности изобретения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такие же значения, как те, которые известны специалистам в той области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, используемая здесь номенклатура хорошо известна в данной области, обычно она и применяется.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающий фрагмент, содержащее: вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 1-30, CDR2 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 31-56, и CDR3 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 57-79; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 198-222, CDR2 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 223-241, и CDR3 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 242-269.

Авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки антител для химиотерапии, связывающихся с PD-1, который, как известно, экспрессируется при различных формах рака. В результате авторы изобретения получили антитела против PD-1, которые связываются с PD-1 с высоким сродством, используя технологию фагового дисплея, и обнаружили, что такие антитела против PD-1 могут ингибировать активность PD-1.

В настоящем изобретении понятие “белок-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1)” означает сигнальный белок, который функционирует для регуляции активации и функций Т-клеток. При связывании PD-1 из Т-клеток со своим лигандом PD-L1, который экспрессируется в раковых клетках, в микроокружении опухоли активируется сигнальный путь PD-1, который затем индуцирует инактивацию Т-клеток. Это явление встречается при различных формах рака, как-то злокачественной меланоме, немелкоклеточном раке легких и раке почек.

В настоящем изобретении термин “антитело” означает антитело против PD-1, которое специфически связывается с PD-1. В рамки настоящего изобретения входят не только полные антитела, специфически связывающиеся с PD-1, но также и антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела.

Полное антитело означает структуру, содержащую две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, причем каждая легкая цепь связана с соответствующей тяжелой цепью дисульфидной связью. Константная область тяжелой цепи бывает типа гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε) и подразделяется на гамма-1 (γ1), гамма-2 (γ2), гамма-3 (γ3), гамма-4 (γ4), альфа-1 (α1) и альфа-2 (α2). Константная область легкой цепи бывает типа каппа (κ) и лямбда (λ).

Антигенсвязывающий фрагмент антитела или же фрагмент антитела означает такой фрагмент, который по меньшей мере обладает способностью к связыванию антигена, и охватывает Fab, F(ab′), F(ab′)₂ и Fv. Из всех фрагментов антител Fab означает структуру, включающую вариабельную область каждой из тяжелых и легких цепей, константный домен легкой цепи и первый константный домен (C_H1) тяжелой цепи, каждый из которых содержит один антигенсвязывающий сайт. Fab′ отличается от Fab тем, что он дополнительно включает шарнирный участок, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина на С-конце домена С_Н1 тяжелой цепи. F(ab′)₂ образуется по дисульфидной связи между остатками цистеина в шарнирном участке Fab′. Fv – минимальный фрагмент антитела, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, а рекомбинантная технология получения Fv изложена в таких международных публикациях PCT, как WO 88/01649, WO 88/06630, WO 88/07085, WO 88/07086 и WO 88/09344. Двухцепочечный Fv представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны нековалентной связью, а одноцепочечный Fv представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи обычно связаны ковалентной связью через пептидный линкер или непосредственно связаны на С-конце, образуя димероподобную структуру типа двухцепочечного Fv. Такие фрагменты антител могут быть получены с помощью протеаз (например, Fabs могут быть получены путем рестрикционного расщепления всего антитела папаином, а F(ab′)₂-фрагмент может быть получен путем рестрикционного расщепления всего антитела пепсином), а также могут быть получены методами генетической рекомбинации.

В одном воплощении антитело по настоящему изобретению представлено в виде Fv (к примеру, scFv), Fab или полного антитела. Кроме того, константная область тяжелой цепи может быть выбрана из изотипов, состоящих из гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε). Например, константная область может быть типа гамма-1 (IgG1), гамма-3 (IgG3) или гамма-4 (IgG4). Константная область легкой цепи может быть типа каппа или лямбда.

В настоящем изобретении термин “тяжелая цепь” охватывает как полноразмерную тяжелую цепь, которая включает вариабельный домен (V_H), аминокислотная последовательность которого содержит достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к антигену, и три константных домена (С_Н1, С_Н2 и С_Н3), так и её фрагмент. В настоящем изобретении термин “легкая цепь” охватывает как полноразмерную легкую цепь, которая включает вариабельный домен (V_L), содержащий аминокислотную последовательность, содержащую достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к антигену, и константный домен (C_L), так и её фрагменты.

Антитела по настоящему изобретению включают, без ограничения, моноклональные антитела, мультиспецифичные антитела, человеческие антитела, гуманизованные антитела, химерные антитела, короткоцепочечные Fv (scFv), короткоцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab′)-фрагменты, связанные дисульфидными связями Fv (sdFVs), антиидиотипические (анти-Id) антитела или же эпитоп-связывающие фрагменты таких антител и т.п.

Моноклональные антитела означают одинаковые антитела, исключая возможные природные мутации, причем антитела получены из популяции практически однородных антител, то есть каждое антитело, составляющее эту популяцию, может присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела очень специфичны и вырабатываются против одного антигенного сайта.

Нечеловеческие (например, мышиные) антитела “гуманизованной” формы представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, происходящую не из иммуноглобулина человека. В большинстве случаев гуманизованные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитела-реципиенты), у которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области другого вида, чем человек (донора), как-то мыши, крысы, кролика или приматов, отличных от человека, обладающие требуемой специфичностью, сродством и способностью.

Термин “человеческое антитело” обозначает молекулы, происходящие из иммуноглобулина человека, у которых все аминокислотные последовательности, составляющие антитело, включая определяющие комплементарность участки и структурные участки, состоят из иммуноглобулина человека.

Некоторые части тяжелой цепи и/или легкой цепи идентичны или гомологичны соответствующей последовательности у антител, происходящих из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальные части включают “химерные” антитела (иммуноглобулины), которые идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям у антител, происходящих из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, проявляющие требуемую биологическую активность.

В настоящем изобретении термин “вариабельный домен антитела” относится к областям легкой и тяжелой цепи молекул антител, включающим аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасной области (FR). V_H означает вариабельный домен тяжелой цепи. V_L означает вариабельный домен легкой цепи.

Термин “определяющий комплементарность участок” (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) относится к таким аминокислотным остаткам вариабельного домена антител, которые необходимы для связывания антигена. Каждый вариабельный домен обычно содержит три участка CDR, обозначаемые как CDR1, CDR2 и CDR3.

В настоящем изобретении антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую:

CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-30;

CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 31-56; и

CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 57-79;

а также вариабельную область легкой цепи, включающую:

CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 198-222;

CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 223-241; и

CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 242-269.

В частности, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 59;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 60;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 61;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 62;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 34 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 63;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 35 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 64;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 5, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 36 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 65;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 37 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 66;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 67;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 38 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 68;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 39 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 69;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 9, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 40 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 70;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 41 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 71;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 42 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 72;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 43 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 73;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 44 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 74;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 14, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 45 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 75;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 46 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 76;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 47 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 77;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 48 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 78;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 18, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 50 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 52 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 53 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 23, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 54 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 24, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 55 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 56 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 26, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 27, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 28, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 29, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 79; или

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57.

Кроме того, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 198, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 223 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 242;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 199, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 224 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 243;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 200, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 225 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 244;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 201, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 226 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 245;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 202, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 227 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 246;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 203, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 228 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 247;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 204, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 229 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 248;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 206, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 231 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 250;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 207, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 232 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 251;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 208, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 209, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 233 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 253;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 210, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 234 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 254;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 235 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 255;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 236 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 256;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 213, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 214, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 237 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 258;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 259;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 216, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 260;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 239 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 261;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 262;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 219, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 241 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 263;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 264;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 265;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 268; или

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 269.

А конкретно антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут содержать следующие вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 201, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 226 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 245;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 34 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 202, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 227 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 246;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 35 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 203, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 228 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 247;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 5, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 36 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 65, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 204, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 229 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 248;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 37 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 66, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 206, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 231 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 250;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 67, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 207, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 232 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 251;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 208, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 38 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 68, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 209, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 233 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 253;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 39 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 69, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 210, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 234 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 254;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 42 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 72, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 213, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 44 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 74, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 259;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 46 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 76, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 239 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 336; или

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 47 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 337.

В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, антитела далее подвергаются скринингу по процедуре оптимизации, причем антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут содержать следующие вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 18, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 50 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 337;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 52 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 264;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 265;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 53 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 23, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 54 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 24, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 55 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 56 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 26, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 27, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 28, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 29, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252; или

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267.

Термин “каркасный участок” (FR) относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно содержит четыре FR, обозначаемых как FR1, FR2, FR3 и FR4.

В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:

FR1 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 80-95;

FR2 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 96-113;

FR3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 114-134; и

FR4 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 135-145.

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать:

FR1 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 270-294;

FR2 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 295-315;

FR3 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 316-355; и

FR4 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 356-367.

Фрагмент “Fv” представляет собой фрагмент антитела, содержащий полные сайты распознавания и связывания антител. Такая область включает димер, к примеру, scFv, который состоит из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, весьма крепко связанных ковалентно друг с другом.

“Fab”-фрагмент содержит вариабельный и константный домены легкой цепи и вариабельный и первый константный домен (C_H1) тяжелой цепи. F(ab′)2-фрагмент антител обычно включает пару Fab-фрагментов, ковалентно связанных через шарнирный цистеин, расположенный между ними вблизи карбоксильного конца.

“Одноцепочечный Fv” или “scFv”-фрагмент антитела включает домены V_H и V_L антитела, причем эти домены присутствуют в виде одной полипептидной цепи. Полипептид Fv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменом V_H и доменом V_L для того, чтобы scFv образовывал структуру, необходимую для связывания антигена.

Антитела к PD-1 являются моновалентными или бивалентными и включают в себя короткие или двойные цепи. Функционально, сродство связывания антител к PD-1 составляет от 10^-5 M до 10^-12 M. К примеру, сродство связывания антител к PD-1 составляет от 10^-6 M до 10^-12 M, от 10^-7 M до 10^-12 M, от 10^-8 M до 10^-12 M, от 10^-9 M до 10^-12 M, от 10^-5 M до 10^-11 M, от 10^-6 M до 10^-11 M, от 10^-7 M до 10^-11 M, от 10^-8 M до 10^-11 M, от 10^-9 M до 10^-11 M, от 10^-10 M до 10^-11 M, от 10^-5 M до 10^-10 M, от 10^-6 M до 10^-10 M, от 10^-7 M до 10^-10 M, от 10^-8 M до 10^-10 M, от 10^-9 M to 10^-10 M, от 10^-5 M to 10^-9 M, от 10^-6 M до 10^-9 M, от 10^-7 M to 10^-9 M, 10^-8 M до 10^-9 M, 10^-5 M до 10^-8 M, 10^-6 M до 10^-8 M, от 10^-7 M до 10^-8 M, от 10^-5 M до 10^-7 M, от 10^-6 M до 10^-7 M или от 10^-5 M до 10^-6 M.

Антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность, которая на 90% или больше идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 146-193. Антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 146-193. В одном воплощении настоящего изобретения антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 163, 165, 166, 168, 169 или 171-188.

Кроме того, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность, которая на 90% или больше идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 368-420. Антитело, связывающееся с PD-1, либо его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 368-420. В одном воплощении настоящего изобретения антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 371-380, 383, 385, 386, 388, 389 или 391-415.

В одном конкретном воплощении настоящего изобретения антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 151 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 371;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 152 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 372;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 153 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 373;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 154 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 374;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 155 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 375;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 156 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 376;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 157 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 377;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 158 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 378;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 159 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 379;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 160 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 380;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 163 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 383;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 165 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 385;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 166 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 386;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 168 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 388;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 169 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 389;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 171 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 391;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 172 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 392;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 173 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 393;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 174 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 394;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 175 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 395;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 176 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 396;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 177 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 397;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 178 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 398;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 179 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 399;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 180 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 400;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 401;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 402;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 403;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 404;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 405;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 406;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 407;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 408;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 409;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 183 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 410;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 184 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 411;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 185 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 412;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 186 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 413;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 187 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 414; или

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 188 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 415.

В другом конкретном воплощении настоящего изобретения антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 155 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 375;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 158 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 378;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 165 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 385;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 171 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 391;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 175 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 395;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 176 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 396;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 178 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 398;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 401; или

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 405.

Часть, представленная X или Xaa в последовательности по настоящему изобретению, означает неопределенную аминокислоту и указывает, что здесь может находиться любая аминокислота.

“Фаговый дисплей” представляет собой метод выставления мутантных полипептидов в виде слитых белков с по меньшей мере частью белка оболочки, к примеру, на поверхности частиц фага, к примеру, филаментного фага. Полезность фагового дисплея состоит в быстрой и эффективной классификации тех последовательностей, которые связываются с целевыми антигенами с высоким сродством, в больших библиотеках рандомизованных мутантов белка. Выставление пептидов и библиотек белков на фагах применяется для скрининга миллионов полипептидов с тем, чтобы идентифицировать полипептиды с определенными свойствами связывания.

Технология фагового дисплея оказалась мощным инструментом для создания и скрининга новых белков, связывающихся с определенными лигандами (например, антигенами). По технологии фагового дисплея можно создавать большие библиотеки мутантов белка и быстро классифицировать последовательности, связывающиеся с целевыми антигенами с высоким сродством. Нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантные полипептиды, сливают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белки оболочки вируса, например, белки гена III или белки гена VIII. Разработана монофазная система фагового дисплея, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или полипептид, сливается с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. В монофазной системе дисплея слитый ген экспрессируется на низком уровне, также экспрессируется белок гена III дикого типа, при этом сохраняется инфекционность частиц.

При разработке библиотек антител типа фагового дисплея важно продемонстрировать экспрессию пептидов на поверхности филаментного фага и экспрессию функциональных фрагментов антител в периферической цитоплазме E. coli. Библиотеки антител либо антигенсвязывающих полипептидов получают рядом методов, к примеру, путем модификации одного гена при вставке случайной последовательности ДНК или клонирования последовательности родственного гена. Библиотеки можно подвергать скринингу на экспрессию антител или антигенсвязывающих белков с требуемыми характеристиками.

Технология фагового дисплея имеет ряд преимуществ перед стандартными гибридомными и рекомбинантными методами получения антител с нужными характеристиками. Этот метод обеспечивает получение больших библиотек антител с разнообразными последовательностями за короткое время без использования животных. Для получения гибридом и получения гуманизованных антител может потребоваться время в несколько месяцев. Кроме того, поскольку иммунитет не требуется, то фаговые библиотеки антител могут вырабатывать антитела против антигенов, которые являются токсичными или обладают слабой антигенностью. Фаговые библиотеки антител также можно использовать для получения и идентификации новых терапевтических антител.

Можно использовать методы получения человеческих антител от неиммунизованных людей, из гаметных последовательностей или Ig-репертуаров наивных В-клеток, которых иммунизировали с помощью библиотек фагового дисплея. Можно использовать различные лимфатические ткани для получения библиотек нативных или неиммуногенных антигенсвязывающих полипептидов.

Для выделения новых терапевтических антител важны методы идентификации и выделения антител с высоким сродством из библиотек фагового дисплея. Выделение антител с высоким сродством из библиотек может зависеть от размера библиотеки, эффективности продукции в бактериальных клетках и разнообразия библиотек. Размер библиотек уменьшается при неэффективной укладке антител или антигенсвязывающих белков и неэффективной продукции из-за присутствия стоп-кодона. Экспрессия в бактериальных клетках может ингибироваться при неправильной укладке антител или антигенсвязывающего домена. Экспрессия может быть улучшена путем попеременного мутирования остатков на поверхности границ вариабельных/константных областей или выбранных остатков CDR. Последовательность каркасной области является тем элементом, который обеспечивает надлежащую укладку при получении фаговых библиотек антител в бактериальных клетках.

При выделении антител с высоким сродством важно создавать разнообразные библиотеки антител или антигенсвязывающих белков. Участки CDR3, как оказалось, зачастую участвуют в связывании антигена. Поскольку участки CDR3 в тяжелой цепи значительно различаются по размерам, последовательности и структурно-пространственной морфологии, то с их помощью можно получать разнообразные библиотеки.

Кроме того, можно создавать разнообразие путем рандомизации участков CDR у вариабельных тяжелых и легких цепей, используя все 20 аминокислот в каждом положении. Использование всех 20 аминокислот ведет к получению последовательностей антител с повышенным разнообразием и повышенной вероятностью выявления новых антител.

Антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению могут включать в себя описанные здесь последовательности антител против PD-1 по настоящему изобретению, а также их биологические эквиваленты, если только эти антитела или фрагменты антител могут специфически распознавать PD-1. Например, в аминокислотной последовательности антитела могут производиться дополнительные вариации с тем, чтобы еще больше улучшить сродство связывания и/или другие биологические свойства антитела. Такие вариации включают, к примеру, делеции, вставки и/или замены остатков в аминокислотной последовательности антитела. Такие вариации аминокислот проводятся на основании относительного сходства (идентичности) заместителей в боковой цепи аминокислот типа гидрофобности, гидрофильности, заряда или размера. Анализ размеров, формы и типа заместителей в боковой цепи аминокислот показывает, что аргинин, лизин и гистидин являются положительно заряженными остатками, аланин, глицин и серин имеют близкие размеры, а фенилаланин, триптофан и тирозин имеют близкие формы. Так, исходя из этих соображений, аргинин, лизин и гистидин; аланин, глицин и серин; фенилаланин, триптофан и тирозин считаются биологически функционально эквивалентными.

В другом аспекте настоящее изобретение касается нуклеиновых кислот, кодирующих антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены рекомбинантным способом путем выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Нуклеиновую кислоту выделяют и вставляют в реплицирующийся вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или дальнейшей экспрессии. Исходя из этого, в другом аспекте настоящее изобретение касается векторов, содержащих нуклеиновые кислоты.

Термин “нуклеиновая кислота” служит для обозначения молекул ДНК (гДНК и кДНК) и РНК, а нуклеотиды, которые являются основными составляющими единицами нуклеиновой кислоты, включают как нуклеотиды природного происхождения, так и их аналоги, у которых модифицированы молекулы сахаридов или оснований. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные области тяжелой и легкой цепи по настоящему изобретению, может варьироваться. Такие вариации включают добавление, делеции или неконсервативные либо консервативные замены нуклеотидов.

Аминокислотная последовательность антител или их антигенсвязывающих фрагмента либо кодирующей их нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также может включать в себя последовательности, проявляющие существенную идентичность с последовательностью, приведенной в соответствующем SEQ ID NO. Термин “последовательность, проявляющая существенную идентичность” означает такую последовательность, которая проявляет идентичность по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, 96% и более, 97% и более, 98% и более или 99% и более при совмещении последовательности по настоящему изобретению таким образом, чтобы она как можно больше соответствовала какой-либо другой последовательности, и анализе совмещенных последовательностей с помощью алгоритма, который обычно используется в данной области.

Исходя из этого, антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут проявлять идентичность последовательности на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и больше. Такая идентичность определяется путем сравнения и/или совмещения последовательностей методами, известными в данной области. Например, степень идентичности последовательности нуклеиновой кислоты или белка по настоящему изобретению можно определить с помощью алгоритма сравнения последовательностей (т.е. BLAST или BLAST 2.0), совмещения вручную или визуального осмотра.

ДНК, кодирующая антитело, может быть легко выделена или синтезирована по стандартной методике (например, с помощью олигонуклеотидного зонда, специфически связывающегося с ДНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела). Доступны различные векторы. Компоненты векторов обычно включают, без ограничения, один или несколько из следующих компонентов: сигнальные последовательности, точки начала репликации, один или несколько маркерных генов, элементы энхансеров, промоторы и последовательности терминации транскрипции.

В настоящем изобретении термин “вектор” означает средство для экспрессии целевых генов в клетках хозяина и включает: плазмидные векторы; космидные векторы; и вирусные векторы, как-то бактериофаговые векторы, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в векторе, оперативно связана с промотором.

Термин “оперативно связанный” означает функциональную связь между последовательностью, регулирующей экспрессию нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью или набором сайтов связывания регуляторов транскрипции), и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, которая регулируется при транскрипции и/или трансляции последовательности нуклеиновой кислоты.

При использовании в качестве хозяина прокариотических клеток вектор обычно содержит сильный промотор, способный осуществлять транскрипцию (как-то промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор lpp, промотор pLλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp или промотор T7), сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и последовательность терминации транскрипции/трансляции. Кроме того, к примеру, при использовании в качестве хозяина эукариотических клеток вектор содержит промотор (например, промотор металлотионеина, промотор β-актина, промотор гемоглобина человека или промотор мышечного креатина человека), полученный из генома клеток млекопитающих, промотор, происходящий из вируса животных, как-то поздний промотор аденовируса, промотор 7.5K вируса коровьей оспы, промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), tk-промотор HSV, промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор LTR ВИЧ, промотор вируса Молони, промотор вируса Эпштейна-Барра (EBV) и промотор вируса саркомы Рауса (RSV), а также обычно содержит последовательность полиаденилирования в качестве последовательности терминации транскрипции.

Необязательно вектор может быть слит с другой последовательностью для облегчения очистки экспрессируемых из него антител. Последовательности для слияния включают, к примеру, глутатион-S-трансферазу (Pharmacia, USA), мальтозосвязывающий белок (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6xHis (гексагистидин; Quiagen, USA) и др.

Векторы содержат гены устойчивости к антибиотикам, обычно используемые в данной области в качестве отборочных маркеров, примеры которых включают гены устойчивости к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину.

В другом аспекте настоящее изобретение касается клеток, трансформированных вышеупомянутыми векторами. Клетки, используемые для получения антител по настоящему изобретению, могут представлять собой прокариотические клетки, дрожжевые клетки или высшие эукариотические клетки, без ограничения.

Можно использовать штаммы из рода Bacillus типа Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus tuligensis, Streptomyces, Pseudomonas (к примеру, Pseudomonas putida) и такие прокариотические клетки хозяина, как Proteus mirabilis и Staphylococcus (к примеру, Staphylococcus carnosus).

Наибольший интерес представляют клетки животных, а примеры полезных линий клеток хозяина включают, без ограничения, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S или HT1080.

В другом аспекте настоящее изобретение касается способа получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов, включающего: (a) культивирование клетки; и (b) выделение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов из культивированной клетки.

Клетки можно культивировать в различных средах. В качестве культуральной среды можно использовать любые коммерчески доступные среды без ограничения. Все другие необходимые добавки, хорошо известные специалистам в данной области, могут быть включены в соответствующих концентрациях. Условия культивирования типа температуры и pH уже использовались с выбранными для экспрессии клетками хозяина и должны быть известны специалистам в данной области.

В настоящем изобретении термин “трансформация” означает введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок, в клетки хозяина с тем, чтобы кодируемый нуклеиновой кислотой белок мог экспрессироваться в клетках хозяина. Трансформирующая нуклеиновая кислота охватывает и трансформирующую нуклеиновую кислоту, вставленную и встроившуюся в хромосому клетки хозяина, так и трансформирующую нуклеиновую кислоту, расположенную вне хромосом, если только она может экспрессироваться в клетках хозяина. Кроме того, нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Нуклеиновая кислота может быть введена в любой форме, если только она может вводиться в клетки хозяина и экспрессироваться в них. Например, нуклеиновая кислота может быть введена в клетки хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, содержащую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно включает промотор, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции, которые функционально связаны с нуклеиновой кислотой. Экспрессионной кассета может иметь вид экспрессионного вектора, обеспечивающего саморепликацию. Нуклеиновая кислота также может быть введена в клетки хозяина в своем собственном виде и функционально связана с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетках хозяина.

Извлечение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов может проводиться, к примеру, путем центрифугирования или ультрафильтрации для удаления примесей и очистки полученного препарата, к примеру, методом аффинной хроматографии. Можно использовать и другие методы очистки типа анионообменной или катионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, хроматографии на гидроксиапатите и др.

В другом аспекте настоящее изобретение касается получение композиций для профилактики или лечения рака, содержащих антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты в качестве активного ингредиента.

Настоящим изобретением предусмотрены, к примеру, композиции для профилактики или лечения рака, содержащие: (a) фармацевтически эффективное количество антитела к PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению; и (b) фармацевтически приемлемый носитель. Настоящим изобретением также предусмотрен способ профилактики или лечения рака, включающий введение антител к PD-1 либо их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению в эффективном количестве, необходимом для пациента.

В настоящем изобретении рак предпочтительно выбирают из группы, состоящей из меланомы, рака легких, рака печени, глиоцитомы, рака яичников, рака толстой кишки, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака почек, рака желудка, рака молочной железы, метастатического рака, лимфомы Ходжкина, рака простаты и рака поджелудочной железы, не ограничиваясь этим.

В настоящем изобретении термин “лечение” означает подавление или облегчение рака либо вызванного им одного или нескольких симптомов, а также предотвращение прогрессирования рака или такое лечение рака, которое нормализирует симптомы заболевания, путем введения композиции, а термин “предотвращение” означает любое действие, которое тормозит или замедляет прогрессирование рака путем введения композиции. В настоящем изобретении профилактика или лечение рака происходит путем связывания между антителом, полученным по настоящему изобретению, и PD-1. Антитело, которое связывается с PD-1, значительно ингибирует активность PD-1, тем самым вызывая предотвращение или лечение рака.

Термин “фармацевтически приемлемый носитель” в настоящем изобретении означает такой носитель или разбавитель, который не нарушает биологическую активность или свойства вводимого соединения и не вызывает раздражения в организме. Для композиций, составленных в виде жидких растворов, приемлемыми фармацевтическими носителями являются стерилизованные и биосовместимые, а их примеры включают солевые растворы, стерильную воду, раствор Рингера, забуференные солевые растворы, растворы для инъекций с альбумином, растворы декстрозы, растворы мальтодекстрина, глицерин, этанол и смеси одного или нескольких из них. При необходимости можно добавлять и другие стандартные добавки типа антиоксидантов, буферов и бактериостатических средств. Кроме того, при составлении растворов для инъекций типа водных растворов, суспензий и эмульсий, пилюль, капсул, гранул или таблеток можно еще добавлять разбавители, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, связующие и смазывающие вещества.

Композиции для профилактики или лечения рака, содержащие антитела и фармацевтически приемлемый носитель, можно вносить в лекарственные формы, содержащие их в качестве активного ингредиента, в виде препаратов для перорального или парентерального введения. Фармацевтические формы могут включать препараты, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (в том числе защечного и подъязычного), подкожного, вагинального или парентерального (в том числе внутримышечного, подкожного и внутривенного) введения либо ингаляции или инсуффляции.

Примеры лекарственных форм для перорального введения, содержащих композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, включают таблетки, пастилки, леденцы, водные или масляные суспензии, готовые порошки или гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, сиропы или эликсиры. Для получения таких форм, как таблетки и капсулы, можно включать связующие вещества, такие как лактоза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, амилопектин, целлюлоза или желатин, эксципиенты типа дикальцийфосфата, разрыхлители типа кукурузного или картофельного крахмала, смазывающие вещества типа стеарата кальция, стеарилфумарата натрия или полиэтиленгликолевого воска, а капсульные формы могут дополнительно содержать жидкий носитель типа жирного масла, в дополнение к вышеупомянутым ингредиентам.

Примеры форм для парентерального введения, содержащих композиции настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, включают формы для инъекций типа подкожных инъекций, внутривенных инъекций или внутримышечных инъекций, свечи или формы для распыления типа аэрозолей, вдыхаемых через дыхательный аппарат. Для получения форм для инъекций можно смешивать композиции настоящего изобретения в воде со стабилизаторами или буферами для приготовления растворов или суспензий, а растворы или суспензии можно составлять для введения на основе ампул или флаконов. Для введения в виде свечей можно составлять композиции для ректального введения типа свечей или препаратов для клизмы, содержащих стандартную основу для свечей типа масла какао или других глицеридов. Для распылительных форм типа аэрозолей можно вводить добавки типа вытеснителей с тем, чтобы диспергировался воднодисперсный концентрат или влажный порошок.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способы профилактики или лечения рака, включающие введение композиций для предотвращения или лечения рака, содержащих антитела.

В настоящем изобретении термин “введение” означает введение пациентам фармацевтических композиций по настоящему изобретению любым подходящим способом. Способы введения композиций настоящего изобретения могут быть любыми, включая пероральное или парентеральное введение. В частности, фармацевтические композиции можно вводить стандартным способом типа перорального, ректального, местного, внутривенного, внутрибрюшинного, внутримышечного, внутриартериального, трансдермального, интраназального, ингаляционного, глазного или интрадермального введения.

Способ лечения по настоящему изобретению включает введение фармацевтически эффективного количества композиции для профилактики или лечения рака по настоящему изобретению. Специалистам в данной области должно быть известно, что подходящая общая суточная доза может быть определена по суждению медицинского специалиста. Конкретное терапевтически эффективное количество для определенного пациента предпочтительно зависит от многих факторов, включая тип и степень достигаемой реакции, а также от присутствия других используемых средств, конкретной композиции и возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты пациента, времени введения, способа введения и скорости выведения композиции, продолжительности лечения и препаратов, используемых в сочетании или одновременно с данной композицией, и других подобных факторов, хорошо известных в области фармацевтики. Поэтому эффективное количество композиции для профилактики или лечения рака, которое подходит для цели настоящего изобретения, предпочтительно определяется с учетом вышеприведенных факторов.

Кроме того, способ лечения по настоящему изобретению может применяться к любым животным, у которых могут возникать такие заболевания, как опухоли и неоваскуляризация вследствие чрезмерной активности PD-1, причем животные включают людей и приматов, а также домашний скот типа коров, свиней, овец, лошадей, собак и кошек.

В другом аспекте настоящее изобретение касается композиций для диагностики рака, содержащих антитела к PD-1 либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение касается способа диагностики рака путем обработки антителами к PD-1 либо их антигенсвязывающими фрагментами по настоящему изобретению.

Рак можно диагностировать путем измерения уровня экспрессии PD-1 в образцах с помощью антител к PD-1 по настоящему изобретению. Уровень экспрессии может быть измерен стандартным методом иммуноанализа, включая, без ограничения, методы радиоиммуноанализа, радиоиммунопреципитации, иммунопреципитации, иммуногистохимического окрашивания, иммуноферментного анализа (ELISA), ELISA с захватом, анализа ингибирования или конкуренции, сэндвич-анализа, проточной цитометрии, иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуноаффинной очистки с помощью антител к PD-1.

Рак можно диагностировать путем анализа интенсивности конечного сигнала в процессе иммуноанализа. А именно, рак диагностируется тогда, когда в биологическом образце сильно экспрессируется белок маркера по настоящему изобретению, при этом сигнал от биологического образца будет более сильным, чем у нормального биологического образца (к примеру, нормальной ткани желудка, крови, плазмы или сыворотки).

В другом аспекте настоящее изобретение касается наборов для диагностики рака, содержащих композиции для диагностики рака. Наборы по настоящему изобретению содержат антитела к PD-1 по настоящему изобретению, а рак диагностируется путем анализа сигнала, возникающего при реакции между образцом и антителом. Сигналы могут включать, без ограничения, конъюгированные с антителами ферменты типа щелочной фосфатазы, β-галактозидазы, пероксидазы хрена, люциферазы или цитохрома P450. В том случае, когда в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, в качестве субстрата для фермента используется хромогенный субстрат реакции, как-то бромхлориндолфосфат (BCIP), нитросиний тетразолий (NBT), нафтол-AS-B1-фосфат или ECF (для усиления хемифлуоресценции), а при использовании пероксидазы хрена используется такой субстрат, как хлорнафтол, аминоэтилкарбазол, диаминобензидин, D-люциферин, люцигенин (бис-N-метилакридиния нитрат), бензиловый эфир резоруфина, люминол, реагент Amplex Red (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин), HYR (п-фенилендиамин-HCl и пирокатехол), TMB (тетраметилбензидин), ABTS (2,2′-азин-ди[3-этилбензтиазолинсульфонат]), о-фенилендиамин (OPD) и нафтол/пиронин, глюкозооксидаза, t-NBT (нитросиний тетразолий) или m-PMS (феназин метосульфат), но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Кроме того, набор по настоящему изобретению также может включать метку для генерирования детектируемого сигнала, а метка может означать химическое вещество (например, биотин), фермент (щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза хрена или цитохром P450), радиоактивное вещество (типа ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P и ³⁵S), флуоресцентное вещество (типа флуоресцеина), люминесцентное вещество, хемилюминесцентное вещество и FRET (флуоресцентно-резонансный перенос энергии), без ограничения.

Измерение активности фермента, используемого для диагностики рака или измерения сигнала, может проводиться различными способами, известными в данной области. Таким образом, можно качественно или количественно анализировать экспрессию PD-1.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с привлечением примеров. Однако специалистам в данной области должно быть ясно, что эти примеры приводятся только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1. Экспрессия и очистка антигена PD-1

1. Получение векторов для экспрессии белка PD-1

Для клонирования PD-1 проводили амплификацию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью праймеров для PD1, содержащих сайты для рестрикционного фермента SfiI на 5′- и 3′-концах (таблица 1), с тем чтобы получить только внеклеточный домен, используя библиотеки кДНК в клетах Jurkat (Stratagene, USA). Амплифицированный продукт ПЦР получали путем слияния Fc человека (SEQ ID NO: 196) и Fc мыши (SEQ ID NO: 197) с карбоксильным концом с помощью вектора N293F (фиг. 1).

Таблица 1

Название	Последовательность 5′−>3′	SEQ ID NO:
PD1-F	CCAGGATGGTTCTTAGACTCCCC	194
PD1-R	CACCAGGGTTTGGAACTGGC	195

2. Экспрессия и очистка антигена PD-1

Для того, чтобы экспрессировать антиген в клетках животных, клетки HEK293F трансфецировали плазмидной ДНК. Готовили реакционный раствор полиплекса для трансфекции путем смешивания 25 мкг плазмидной ДНК с 3 мл экспрессионной среды Freestyle 293, а затем в полученную смесь добавляли 2 мг/мл PET (полиэтиленимин, PolyplusA-transfection, USA) и опять перемешивали. Реакционный раствор полиплекса инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем культивировали в 40 мл культуральной среды при концентрации 1×10⁶ клеток/мл в течение 24 часов при 37°C и 8% CO₂ при 120 об/мин. Через 24 часа после трансфекции добавляли Soytone (BD, USA) в качестве добавки до конечной концентрации 10 г/л. Антитела получали в системе краткосрочной экспрессии в клетках HEK293F в течение 7 дней. Для выделения антигена из культурального раствора проводили аффинную хроматографию. Получали супернатант центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин для удаления клеток и обломков клеток из культуральной среды, извлеченной на 7-й день. Супернатант подвергали реакции с промытой DPBS агарозной смолой с рекомбинантным белком A при 4°C в течение 16 часов.

При использовании агарозной смолы с рекомбинантным белком A для проведения первичной очистки белок элюировали 0,1 М глицином и нейтрализировали 500 мкл 1М трис-HCl. После первичной очистки белок подвергали вторичной очистке методом гель-фильтрационной хроматографии на Superdex 200 (1,5 см ×100 см).

Чистоту очищенного белка определяли методом SDS-PAGE и эксклюзионной хроматографии [TSK-GEL G-3000 SWXL для эксклюзионной хроматографии (SEC) (Tosoh)].

В результате было установлено, что очищенный белок PD1 имеет чистоту в 95% или больше, как видно из фиг. 2А–2D.

Пример 2. Скрининг человеческих антител против PD-1

1. Подготовка антигенов

В качестве белковых антигенов PD1-hFc и PD1-mFc, полученные в примере 1, и PD1-his (кат. № 10377-H08H), приобретенный у Sino Biological Inc., фиксировали в дозе 50 мкг на иммуносорбционных пробирках, а затем блокировали.

2. Биопэннинг (просеивание)

Получали фаговую библиотеку человеческих антител путем инфицирования бактерий библиотекой scFv человека с разнообразием в 2,7×10¹⁰, а затем культивирования при 30°C в течение 16 ч. Культуральный раствор после культивирования центрифугировали, а супернатант концентрировали с помощью PEG и затем растворяли в буфере PBS для получения библиотеки человеческих антител. Фаговую библиотеку человеческих антител вносили в иммунологическую пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После отмывки 1 раз PBS/T и 1 раз PBS элюировались только scFv-фаги, специфически связавшиеся с антигеном.

Элюированными фагами опять инфицировали E. coli и проводили амплификацию (процесс пэннинга), получая пул положительных фагов. Проводили второй и третий раунд пэннинга, используя фаги, амплифицированные в первом раунде пэннинга, таким же образом, как описано выше, за исключением того, что увеличилось только количество стадий промывки PBST.

В результате, как видно из таблицы 2, оказалось, что количество фагов, связавшихся с антигеном (на выходе) при третьем раунде пэннинга, намного повысилось по сравнению с количеством фагов на входе.

Таблица 2

Раунд пэннинга	Количество фагов на входе	Количество фагов на выходе
1	2,0×1013	3,6×107
2	1,2×1013	7,0×107
3	2,0×1013	2,0×109

3. Полифаговый ELISA

Проводили полифаговый ELISA (иммуноферментный анализ) для изучения специфичности к антигенам у пула положительных к поли-scFv-фагам антител, полученных при каждом раунде процесса пэннинга в Примере 2.

Исходные клетки, замороженные после каждого из трех раундов пэннинга, вносили в среду, содержащую 5 мл 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, до значения OD₆₀₀ = 0,1, а затем культивировали при 37°C в течение 2-3 часов (OD₆₀₀ = 0,5-0,7). Клетки инфицировали фагом-помощником M1 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 ч. Культивируемые клетки центрифугировали (4500 об/мин, 15 мин, 4°С), а супернатанты переносили в новые пробирки (поли-scFv-фаги от каждого из трех пэннингов). На 96-луночных иммунопланшетах (NUNC 439454) фиксировали по два вида антигенов при плотности 100 нг на лунку в буфере для покрытия при 4°C в течение 16 часов, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока.

Лунки промывали 0,2 мл PBS/T, в каждую лунку добавляли по 100 мкл поли-scFv-фагов от каждого из трех пэннингов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Каждую лунку снова промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP (Amersham, 27-9421-01) в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки PBS/T растворяли таблетки OPD (Sigma, 8787-TAB) в буфере PC и полученный раствор добавляли в лунки по 100 мкл на лунку, индуцируя развитие окраски в течение 10 мин. Затем измеряли поглощение при 490 нм на спектрофотометре (Molecular Devices).

Результаты представлены на фиг. 3. Как видно из фиг. 3, анализ по ELISA показал, что у третьих поли-scFv-фагов повышается способность к связыванию с двумя антигенами PD-1.

4. Скрининг положительных фагов

Колонии, полученные из группы поликлональных фаговых антител (из третьего пэннинга) с высокой способностью к связыванию, культивировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками на 1 мл (Bioneer, 90030) при 37°C в течение 16 часов. По 100-200 мкл выращенных при этом клеток вносили в среду, содержащую 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, до значения OD₆₀₀ = 0,1, и добавляли в среду, содержащую 1 мл 2 х YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl2, а затем культивировали в глубоком 96-луночном планшете при 37°C в течение 2-3 часов до OD₆₀₀ = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 часов.

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока. В каждую лунку вносили по 100 мкл моноклонального scFv-фага (100 scFv-фагов) после промывки 0,2 мл PBS/T и культивирования в течение 16 часов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате, как видно из фиг. 4, было получено в общей сложности несколько десятков одиночных фаговых клонов для PD1 в виде моноклонов с высокой способностью к связыванию с каждым антигеном.

5. Анализ нуклеотидных последовательностей положительных фаговых антител

Из отобранных одиночных клонов выделяли ДНК с помощью набора для очистки ДНК (Qiagen, Germany) и заказывали анализ последовательностей этих ДНК (Solgent). Исходя из результатов анализа последовательностей, идентифицировали участки CDR из V_H и V_L у выбранных антител и исследовали сходство (идентичность) между этими антителами и группами гаметных антител с помощью программы Ig BLAST на веб-сайте NCBI по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. В результате было получено 15 видов фаговых антител, специфичных к PD1, которые приведены ниже в таблице 3.

Таблица 3. Характеристики моноклонов PD1

Название клона	VH	Идентичность	VL	Идентичность	Группа
Ниволумаб	VH3-33	91,80%	L6	98,90%
Пембролизумаб	VH1-2	79,60%	L25	80,80%
PD1-29A2	VH3-9	91,80%	V2-17	86,50%	1
PD1-29H3	VH3-9	90,80%	V1-11	88,50%	2
PD1-31F3	VH1-69	92,90%	V1-13	93,90%	3
PD1-32A6	VH1-69	87,80%	L5	91,60%	4
PD1-41C9	VH3-30	95,80%	O1	92,10%	5
PD1-42G4	VH3-11	93,80%	O2	93,80%	6
PD1-44B5	VH3-30	99,00%	V1-16	85,60%	7
PD1-45D6	VH3-30	95,80%	O1	93,10%	8
PD1-45F1	VH1-46	91,80%	V2-13	93,80%	9
PD1-45F4	VH3-9	90,80%	V2-1	77,70%	10
PD1-48A9	VH1-69	79,60%	O1	96,00%	11
PD1-49B9	VH3-9	88,70%	V1-2	93,90%	12
PD1-49A2	VH3-30	97,90%	O1	93,10%	13
PD1-51D9	VH1-3	82,70%	A3	94,00%	14
PD1-52E8	VH3-9	91,80%	V2-17	90,50%	15

Антитела, включая последовательности участков CDR и FR тяжелой и легкой цепи выбранных антител, а также содержащие их вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, представлены ниже в таблицах 4 и 5.

Таблица 4. Вариабельные области тяжелой цепи у клонов PD1

Название	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
PD1-45D6	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ VPGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	96	31	114	57	135
PD1-49A2	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NPKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGRGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	32	115	58	136
PD1-27A12	QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS	GFTFNDYA	MHWVRQ VPGKGLE WVSG	ISWNSGRI	VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARSQQQ ILDY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	81	2	98	33	116	59	137
PD1-27B1	QVQLVESG GGLVKPGGS LRLSCAAS	GFTFNDYA	MHWVRQ VPGKGLE WVSG	ISWNSGRI	VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARSIRQI LDY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	82	2	98	33	116	60	137
PD1-28D12	QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS	GFTFNDYA	MHWVRQ VPGKGLE WVSG	ISWNSGRI	VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARSLPXS RSRLDV	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	81	2	98	33	116	61	137
PD1-29A2	QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS	GFTFNDYA	MHWVRQ VPGKGLE WVSG	ISWNSGRI	VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARAXTS PLDMSL DY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	81	2	98	33	116	62	137
PD1-29H3	QMQLVESG GNLVQPGRS LRLSCAAS	GFTFDDYG	MHWVRQ APGKGLE WVSS	ISWNSGTI	GYADSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR SEDTAVYYC	ARLLHQ MNEHEF MDV	WGQGTT VTVSS
SEQ ID NO:	83	3	99	34	117	63	138
PD1-31F3	QVQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS	GGTFSSYA	ISWVRQA PGQGLEW MGG	IIPLFSTA	HSAQKFQGRVTITAD ESSSTAYMELSSLRSE DTAVYYC	AKHKGL PFDWSP DGFDT	WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:	84	4	100	35	118	64	139
PD1-32A6	QVQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS	GDTFTRNA	VSWVRQA PGEGLEW MAD	IIPIFGSA	NYAQKFQGRLTLTA DVSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC	ARTIEGA FDI	WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:	84	5	101	36	119	65	139
PD1-41C9	QMQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNRLR SEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL ITVSS
SEQ ID NO:	85	1	97	32	120	58	140
PD1-42G4	QVQLVESG GGLVKPGGS LRLSCAAS	GFTFSDYY	MSWIRQA PGKGLEW VSD	ISASGNSI	YYADSVKRRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VTSGPFGEFRN	WGLGTL VTVSS
SEQ ID NO:	82	6	102	37	121	66	141
PD1-44B5	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARLMHT FSVQYF LDV	WGQGTT VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	32	114	67	138
PD1-45D6	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ VPGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	96	31	114	57	135
PD1-45F1	QVQLVQSG AEVKKPGAS VKLSCKAS	GYTFNSYY	VHWVRQ APGQGLE WMGI	INPSDGSA	TYAQKFQGRVTMTS DTSTSSVYMELSSLR SEDTAVYYC	ARDGNY YDSRGY YYDTFDM	WGQGTL ITVSS
SEQ ID NO:	86	7	103	38	122	68	140
PD1-45F4	QMQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS	GFTFDDYA	MHWVRQ APGQGLE WVSG	ISWNSNNI	KYADSVKGRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARGALTPLDV	WGQGTP VTVSS
SEQ ID NO:	87	8	104	39	123	69	142
PD1-47B8	QMQLVQSG AEVKKPGAS VKVSCKAS	GYTFTSYD	INWVRQA SGQAPEW MGW	LHADSGKT	GYAQTFQGRVTMTR DTSIDTAYLELSSLRS EDTAVYYC	ARGTHWLDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	88	9	105	40	124	70	137
PD1-48A6	QVQLVQSG GGLIQPGGSL RLSCAAS	GFTVSRNS	MNWVRQ TPGKGPE WVSL	IFSGGTTK	YKDSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCA	AREEQF LIALAGR YFDY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	89	10	106	41	125	71	138
PD1-48A9	QMQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS	GDTFTRYI	INWVRQA PGQGLEW MGR	VIPTLGLT	TYAQNFQDTVTIIAD KSTNTAYMELKNLRS EDTAVYYC	ARGYGS GAFDI	WGQGT MITVSS
SEQ ID NO:	90	11	107	42	126	72	143
PD1-48G6	QMQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSHYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSKI	YYADSVKGRFTVSR DNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYC	ARIGYK DAFDI	WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:	85	12	97	43	127	73	139
PD1-49A2	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NPKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGRGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	32	115	58	136
PD1-49B9	QMQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS	GFTFEDYA	MHWVRQ PPGKGLE WVSS	ISWNSHNI	AYADSVKGRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	STSGLGVHA	WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:	87	13	108	44	128	74	139
PD1-51A6	QVQLVESG GGLVQPGGS LRLSCAAS	GLSFSSYW	MTWVRQ APGKGLE WVAN	IKQDGSEK	YYVDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARDSFG GHLDL	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	91	14	109	45	129	75	137
PD1-51D9	QVQLVESG AEVKKPGAS VKLSCKAS	GYTFSSYW	MHWVRQ APGQRLE WMGE	INPGNGHT	NYNEKFKSRVTITVD KSASTAYMELSSLRS EDTAVYYC	AREGDG SYWGYFDS	WGQGTP ITVSS
SEQ ID NO:	92	15	110	46	130	76	144
PD1-52E8	QVQLVQSG GNLVQPGRS LRLSCAAS	GFTFDDYA	MHWVRQ APGKGLE WVSG	ISWNSGTP	GYADSVQGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARGHNY LDSSYYDY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	93	8	111	47	131	77	137
PD1-62E1	QVQLVESG GDLVKPGRS LRLSCTGS	GFTFGDHP	LTWVRQI PGKGLEW VGF	IRSKAYGE	TTEYAASVKGRFTIS RDDSKSIAYLQMNSL RAEDTAVY	ASVSYC SGGSCY QGTFDY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	94	16	112	48	132	78	137
PD1-72D10	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	32	114	58	137
PD1-74A11	QVQLVQSG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	ARTTFDY	WGQGTL ITVSS
SEQ ID NO:	95	1	97	32	114	79	140
PD1-75C10	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	32	114	57	135
PD1-74A01	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRS EDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	32	133	57	135
PD1-74H12	QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGSNK	YYADSVKGRFTISRD NSKNMLYLEMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	32	134	57	135

Таблица 5. Вариабельные области легкой цепи у клонов PD1

Название	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
PD1-27A12	DIQMTQSPSS VSASVGDRV TITCRAS	RDISRW	LAWYQQKP GEAPKLLIY	GAS	SLRSGVSSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPED FATYFC	QQGKSF PYT	FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:	270	198	295	223	316	242	356
PD1-27B1	DIVMTQTPLS SPVTLGQPAS ISCRSS	QSLVH	LNWFHQRP GQPPRLLIH	KIS	NRVSGVPDRFSGSG AGTDFTLKISRVEA EDVGVYYC	MQSTQF PYT	FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:	271	199	296	224	317	243	356
PD1-28D12	DIQMTQSPSS VSASLGDRV TITCRAS	QAISNW	LTWYQQKP GKAPKLLIY	ATS	SLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPED VATYYC	QQTDSF PLT	FGGGTK VDIK
SEQ ID NO:	272	200	297	225	318	244	357
PD1-29A2	SYELTQSPSV SMSPGQTARI TCSGD	ALSKQY	ASWYQLKP GQAPVVVMY	KDT	ERPSGIPDRFSGSSS GTTVTLTISGVQAE DGADYYC	QSITDKS GTDVI	FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:	273	201	298	226	319	245	358
PD1-29H3	QLVLTQPSS MSEAPGQRV TISCSGG	TSNIGTNA	VNWYQQPP GKAPTLLIY	YDD	RLTSGVSDRFSGSK SGTSASLAISRLQSE DEADYYC	AAWDDS LNGWV	FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:	274	202	299	227	320	246	358
PD1-31F3	QFVLTQPPSV SGAPGQRVII SCTGS	SSNIGAGYD	VHWYQQLP GTAPKVLIY	GNS	DRPSGVPDRFSASK SATSASLAITGLQA EDEADYYC	QSYDSS LSGYV	FGTGTK VTVL
SEQ ID NO:	275	203	300	228	321	247	359
PD1-32A6	DIQMTQSPSS VSASVGDRV TITCRAS	QGIVSW	LAWYQQKP GKAPRLLIY	RAS	DLETGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPE DVATYYC	QQADSF PLT	FGGGTK VEIK
SEQ ID NO:	270	204	301	229	322	248	360
PD1-41C9	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDSE DGNTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC	LQRMGF PYT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	323	249	361
PD1-42G4	DIQMTQSPSS LSASVGDRV TTTCRAS	QGISSY	LAWYQQKP GKAPKLLIY	AAS	TLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPE DFATYFC	QQSYTSPRT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	277	206	303	231	324	250	361
PD1-44B5	QFVLTQSPSA SGTPGQNIVI SCSAS	TFNIGTTT	VNWYQRLP GTAPKLLIY	NYD	QRPSGVPDRFSGSK SGTSASLAISGLQSE DEADYYC	AAWDDS LNAWL	FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:	278	207	304	232	325	251	358
PD1-45D6	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDSD DGKTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	YRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC	MQRVEF PFT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	276	208	302	230	326	252	361
PD1-45F1	SYELTQDPA VSVALGQTV RITCQGD	SLRTYY	ASWYQQKP GQAPILVIY	GKN	NRPSGIPDRFSGSSS GNTASLTITAAQAE DEADYYC	NSRDSS GKSLV	FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:	279	209	305	233	327	253	358
PD1-45F4	SYELTQAPSL SVSPGQTANI ICSGD	NLRTKY	VSWYQQKP GQSPLLVIY	QDT	RRPSGIPARFSGSNS GNTATLTISGTQTR DESTYYC	MTWDV DTTSMI	FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:	280	210	306	234	328	254	358
PD1-47B8	QSALTQPASV SGSPGQSITIS CTGT	SSDVGG YNY	VSWYQQHP GKAPKLMIY	DVS	KRPSGVSNRFSGSK SGNTASLTISGLQA EDEADYYC	SSFTSSSTVV	FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:	281	211	307	235	329	255	358
PD1-48A6	QFVLTQPPSV SGAPGQRVTI SCTGS	RSNFGA GHD	VHWCQQLP GTAPKLLIY	GNN	NRPSGVPDRFSGSK SGTSASLAITGLQA EDEAEYYC	QSYDSSLSAWG	VRRRDQ ADRP
SEQ ID NO:	282	212	308	236	330	256	362
PD1-48A9	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS HDGNTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC	MQRIDFPYT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	283	213	302	230	331	257	363
PD1-48G6	NFMLTQPPST SGTPGQRVTI SCSGR	SSNIGINT	VTWYQQLP GTAPKVLMY	RDD	QRPSGVPDRFSGSR SGISASLAISGLQSE DEADYYC	ASWDDTLNGWV	FGGGTKLTVL
SEQ ID NO:	284	214	309	237	332	258	358
PD1-49A2	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLFDSD DGNTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC	LQRMGFPYT	FGQGTKVEIK
SEQ ID NO:	285	215	302	230	333	249	363
PD1-49B9	QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGT	SSDVGG YNY	VSWYQQHP GKAPKLMIY	EVS	KRPSGVPDRFSGSK SGNTASLTVSGLQP EDEADYYC	SSFARNSNYV	FGTGTKVTVL
SEQ ID NO:	286	211	307	238	334	259	359
PD1-51A6	DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSS	QSLLYIDGETY	LFWYLQKP GQSPQLLIY	EVS	SRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC	MQGIHLPLT	FGQGTRLEIK
SEQ ID NO:	287	216	310	238	335	260	364
PD1-51D9	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLHS NGNNY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	LGS	YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC	MQGLQIPST	FGPGTKVDIK
SEQ ID NO:	283	217	302	239	336	261	365
PD1-52E8	SYELTQPLSL SVAPGQTARI TCSGD	ALSKEY	SYWYQQKP GQAPVLVMY	KDS	ERPSGIPERFSGSSS GTTVTLTISGVQAE DEADYYC	QSVDSSDTSVV	FGGGTKLTVL
SEQ ID NO:	288	218	311	240	337	262	358
PD1-62E1	DIQMTQSPAI LSLSPGERAT LSCRAS	QSVTSD	VAWYQHIR GQAPRLLIY	DAS	NRASGIPARFSGGG SGTEFTLTISSLEPE DFAVYYC	QQYNNWPLT	FGGGTKVEIK
SEQ ID NO:	289	219	312	241	338	263	360
PD1-72D10	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTKLEIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	333	252	366
PD1-74A11	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLFDSDDGNTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAAEDVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTKVDIK
SEQ ID NO:	283	215	302	230	353	252	356
PD1-75C10	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKITRVEA EDVGVYYC	MQRIEFPYT	FGQGTKLEIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	354	264	366
PD1-74A01	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDR GGGHTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC	MQRKEFPLT	FGPGTKLEIK
SEQ ID NO:	283	222	302	230	333	268	367
PD1-74H12	DIVMTQTPLS LSVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDSD DGNTY	LDWYLQKP GQSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGRG SHTDFTLTISSVEAE DVGVYYC	MQRIHFPLT	FGQGTRLEIK
SEQ ID NO:	294	220	302	230	355	269	364

Пример 3. Получение человеческих антител к PD-1

1. Преобразование из формата scFv в формат IgG

Для перевода выбранных 15 видов моноклональных фаговых антител к PD1 из фагов в целый IgG-вектор проводили ПЦР (iCycler iQ, BioRad) на тяжелых и легких цепях. В результате получали тяжелые и легкие цепи, а векторы и тяжелые и легкие цепи каждого из клонов разрезали (расщепляли) рестрикционными ферментами. Из каждого вектора и тяжелой цепи выделяли ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из геля (Qiagen). Проводили лигирование путем смешивания 1 мкл (10 нг) вектора, 15 мкл (100-200 нг) тяжелой цепи, 2 мкл 10-кратного буфера, 1 мкл лигазы (1 ед./мкл) и дистиллированной воды, а затем инкубации смеси при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Полученную смесь вводили в трансформируемые клетки (компетентные клетки, XL1-blue), помещали клетки на лед на 5 мин и подвергали их тепловому шоку при 42°C в течение 90 сек.

После теплового шока к клеткам добавляли 1 мл среды, а затем культивировали клетки при 37°C в течение 1 часа, рассеивали шпателем по чашке с LB Amp и инкубировали при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом колонии инокулировали в 5 мл среды LB Amp, культивировали при 37°C в течение 16 часов и проводили выделение ДНК с помощью набора DNA-prep (Nuclogen). Заказывали анализ последовательностей полученных ДНК (Solgent).

В результате было подтверждено, что последовательности тяжелых цепей и легких цепей у 15 клонов для PD1, переведенных в целые IgG, соответствуют последовательностям фаговых антител 15 клонов, приведенных в таблице 3. Для трансфекции в клетки HEK293F тяжелые и легкие цепи соответствующих клонов, переведенных в целые IgG, культивировали в 100 мл среды LB Amp и выделяли ДНК с помощью набора Midi-prep (QIAgen).

2. Получение человеческих антител

Клонированные векторы pNATVH и pNATVL в соотношении 6:4 совместно трансфецировали в клетки HEK293F, на 7-й день собирали супернатанты, удаляли клетки и обломки клеток центрифугированием и через фильтры на 0,22 мкм, а супернатанты собирали и подвергали аффинной хроматографии на белке A для очистки IgG-антител. Антитела после очистки проводили через глициновый буфер и заменяли буфер таким образом, чтобы конечным буфером при ресуспендировании был PBS. Проводили количественное определение очищенных антител методом BCA и Nanodrop, а затем каждое из 15 видов антител наносили в дозе 5 мкг в восстановительных и невосстановительных условиях и анализировали методом SDS-PAGE для определения чистоты и подвижности очищенного белка (фиг. 5).

В результате, как видно из фиг. 5, в невосстановительных условиях все 15 антител детектировались при молекулярной массе 150 кДа и больше, а в качестве контрольного антитела был получен ниволумаб.

Пример 4. Характеристики моноклональных антител к PD-1

1. Оценка активности антител

Проводили тестирование выбранных антител на активность с помощью набора для биоанализа блокировки PD1/PD-L1 (Promega, J1250). В 96-луночный планшет высеивали клетки линии CHO с высокой экспрессией PD-L1, культивировали в течение 16 часов или дольше, обрабатывали каждым антителом в серийном разведении при постоянной концентрации, а затем культивировали вместе с клетками линии Jurkat с высокой экспрессией PD-1 человека в течение 6 часов. Определяли степень восстановления ингибирования у антител на спектрофотометре (SpectraMax M5, Molecular Devices, USA) по интенсивности люминесценции, возникающей при расщеплении субстрата люциферазой. Активность 16 видов антител к PD-1, включая контрольное антитело, определяли по значениям для восстановления пониженного сигнала при образовании комплекса PD-1/PD-L1, причем 41C9, 45D6 и 49A2 проявляли активность, близкую контрольному антителу (фиг. 6).

Для измерения активности антител 41C9, 45D6 и 49A2 к PD-1 в зависимости от концентрации делали серийные разведения и опять проводили биоанализ блокирования PD1/PD-L1 по восстановлению пониженного сигнала зависимым от концентрации образом. Степень восстановления выражали в виде EC₅₀ (эффективная концентрация mAb при 50%-м уровне восстановления сигнала) при анализе с помощью Graphpad Prism6, а значения EC₅₀ по способности к восстановлению ингибирования in vitro представлены на фиг. 7.

2. Сродство антител к PD1 к гиперэкспрессированным клеткам

Обращаясь к пулам трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1, клетки HEK293E трансформировали плазмидой pcDNA3.1, содержащей PD-1 человека (NM_005018.2), и проводили скрининг в селективной среде, содержащей 150 мкг/мл зеоцина (#R25001, Thermo Fisher). Каждый пул клеток идентифицировали и отбирали методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с помощью антитела против PD-1 (#557860, BD) и использовали для таких функциональных анализов, как анализ связывания по FACS или анализ конкуренции по FACS.

Из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1 человека отбирали образцы по 0,5-1×10⁶ клеток, готовили серийные разведения антител при постоянной степени разведения и проводили реакцию с полученными клетками при 4°C в течение 20 мин. Затем клетки трижды промывали PBS (#LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной телячьей сыворотки, и проводили реакцию при 4°C в течение 20 мин с антителом против IgG человека (#FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин-изотиоцианат). Клетки опять промывали так же, как описано выше, а затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащем 2% FBS (#26140-079, Thermo Fisher), и проводили проточную цитометрию на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, USA). При этом все три антитела к PD-1 специфически связывались, а их способность к связыванию определяли по константе равновесной диссоциации (K_d), полученной через функцию анализа Graphpad Prism6.

В результате, как видно из фиг. 8, способность к связыванию у антител при зависимом от концентрации связывании с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, можно определять по MFI (средней интенсивности флуоресценции).

3. Скрининг положительных фаговых антител со сходной последовательностью с PD1-45D6 и 49A2

Проводили дополнительный скрининг антител на близость к 45D6 и 49A2, наряду с 41C9, которые проявляли отличную активность и способность к связыванию при анализе методом FACS.

Антитела со сходной последовательностью с PD1-45D6 и 49A2 подвергали дальнейшему скринингу по той же методике, что и в Примере 2. Их характеристики приведены ниже в таблице 6.

Таблица 6. Характеристики проходивших дополнительный скрининг клонов антител, близких к 45D6 и 49A2

Название клона	VH	Идентичность	VL	Идентичность	Группа
PD1-72D10	VH3-30	96,90%	O1	94,10%	1
PD1-74A11	VH3-30	97,96%	O1	95,05%	2
PD1-75C10	VH3-30	96,94%	O1	95,05%	3
PD1-74A01	VH3-30	95,92%	O1	92,08%	4
PD1-74H12	VH3-30	94,90%	O1	92,08%	5

4. Сродство антител к PD1 на приборе ProteOn XPR36

Использовали прибор ProteOn XPR36 (BioRad). На приборе устанавливали сенсорный чип GLC (BioRad) и промывали его буфером PBST, а поверхность карбоксиметилдекстрана активировали смесью растворов EDC и сульфо-NHS. На сенсорный чип GLC наносили и иммобилизировали PD1-hFc, растворенный при концентрации 5 мкг/мл в буферном растворе 10 мМ ацетата натрия (pH 5,0).

Для того, чтобы дезактивировать активированные карбоксильные группы, не прореагировавшие с белком PD1, пропускали 1М этаноламин и вводили 10 мМ глицина (рН 2,0) с тем, чтобы смыть белки, не связавшиеся с сенсорным чипом. Затем регистрировали данные для сенсограммы при связывании и диссоциации по времени, пропуская антитела со скоростью подачи 30 мкл/мин (от 30 нМ до 0,123 нМ) в течение 10 мин с помощью буфера PBST.

Рассчитывали равновесные константы диссоциации (K_D) путем нанесения на график и аппроксимации данных по сенсограмме в состоянии равновесия в зависимости от концентрации. При этом 45D6 и 49A2 проявляли значения K_D 0,001 нМ и 0,019 нМ, соответственно, что указывает на высокое сродство к антигену PD1 (фиг. 9).

Пример 5. Оптимизация антител PD1-45D6 и 49A2

1. Получение библиотек для оптимизации антител PD1-45D6 и 49A2

Для оптимизации антител получали новые библиотеки с перетасовкой LC путем иммобилизации тяжелой цепи и введения пула 10⁵-10⁶ легких цепей (LC) от фирмы Ybiologics, Inc. Также проводили оптимизацию антител следующими тремя способами: перетасовки LC; базовой упаковки + перетасовки LC, включая сравнительный анализ остатков в структурно важных сайтах типа гидрофобной сердцевины тяжелых цепей, открытых остатков, кластеров зарядов, солевых мостиков, мутационное превращение их в консервативные остатки, а затем проведение перетасовки LC; и горячих точек CDR + перетасовки LC в случае ДНК вариабельных областей антител, включая случайный мутагенез мутационных горячих точек, которые часто могут мутировать в процессе созревания сродства in vivo, а затем проведение перетасовки LC.

Для получения библиотек с перетасовкой LC расщепляли гены LC антител 45D6 и 49A2 с помощью BstXI и затем использовали их в качестве векторов, а библиотечные пулы фирмы Ybiologics, Inc. расщепляли с помощью BstXI и использовали в качестве вставок. После лигирования с помощью лигазы проводили трансформацию клеток методом электропорации. Библиотеки антител получали, собирая трансформированные клетки на квадратной пластине. При этом получали библиотеки с разнообразием в 1,5×10⁷. Результаты анализа последовательностей показали, что все последовательности HC были идентичными, а последовательности LC отличались друг от друга.

Чтобы получить библиотеки упаковки ядра + перестановки LC, сайты каркаса (FR) антител 45D6 и 49A2 были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, гены LC были разрезаны BstX I и затем использованы в качестве векторов, а пулы библиотеки принадлежащие Ybiologics, Inc. были вырезаны с помощью BstX I, а затем использованы в качестве вставок. После лигирования с лигазой трансформацию осуществляли с использованием клеток для электропорационной трансформации. Библиотеки антител были получены путем сбора трансформированных клеток на квадратной пластине. В результате были получены библиотеки с разнообразием 8,4х10⁶. Результат анализа последовательностей показал, что сайты FR HC были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, а последовательности LC отличались друг от друга.

Для получения библиотек ядра горячей точки + тасования LC сайты каркаса (FR) антител 45D6 были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, библиотеки с горячими точками в CDR1 были вырезаны с помощью Sfi I и использованы в качестве вставок, а пулы библиотек, принадлежащие Ybiologics, Inc., разрезали с помощью Sfi I и затем использовали в качестве векторов. После лигирования с лигазой трансформацию осуществляли с использованием клеток для электропорационной трансформации. Библиотеки антител были получены путем сбора трансформированных клеток на квадратной пластине. В результате было получено около 5,6х10⁶ различных библиотек. Результат анализа последовательностей показал, что сайты FR HC были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, последовательности горячих точек CDR1 были мутированы случайным образом, а последовательности LC отличались друг от друга.

Пример 6. Скрининг человеческих антител к PD-1

1. Подготовка антигенов

В качестве белковых антигенов PD1-hFc и PD1-mFc, полученные на фирме Ybiologics, Inc, и PD1-his (кат. № 10377-H08H), приобретенный у Sino Biological Inc., фиксировали в дозе 50 мкг на иммуносорбционных пробирках, а затем блокировали.

2. Биопэннинг (просеивание)

Получали фаговую библиотеку человеческих антител путем инфицирования бактерий библиотекой scFv человека с разнообразием в 2,7×10¹⁰, а затем культивирования при 30°C в течение 16 ч. Культуральный раствор после культивирования центрифугировали, а супернатант концентрировали с помощью PEG и затем растворяли в буфере PBS для получения библиотеки человеческих антител. Фаговую библиотеку человеческих антител вносили в иммунологическую пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После отмывки 1 раз PBS/T и 1 раз PBS элюировались только scFv-фаги, специфически связавшиеся с антигеном.

Элюированными фагами опять инфицировали E. coli и проводили амплификацию (процесс пэннинга), получая пул положительных фагов. Для оптимизации антител проводили только первый раунд пэннинга. В результате, как видно из таблицы 7, оказалось, что количество фагов, связавшихся с антигеном (на выходе) при первом раунде пэннинга, немного повысилось по сравнению с количеством фагов на входе.

Таблица 7. Сравнение титра антител при оптимизационном пэннинге

Образец	Количество фагов на входе	Количество фагов на выходе
45D6 (LS)	1,3×1013	2,8×107
45D6 (базовая упаковка + LS)	1,1×1013	4,8×107
45D6 (горячие точки в CDR + LS)	1,1×1013	3,6×106
49A2 (LS)	1,3×1013	1,8×107
49A2 (горячие точки в CDR + LS)	1,1×1013	1,6×106

3. Скрининг положительных фагов

Колонии, полученные при пэннинге, культивировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками на 1 мл (Bioneer, 90030) при 37°C в течение 16 часов. По 100-200 мкл выращенных при этом клеток вносили в среду, содержащую 1 мл 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, до значения OD₆₀₀ = 0,1, а затем культивировали в глубоком 96-луночном планшете при 37°C в течение 2-3 часов до OD₆₀₀ = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 часов.

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока. В каждую лунку вносили по 1 мкл моноклонального scFv-фага (100 scFv-фагов) после промывки 0,2 мл PBS/T и культивирования в течение 16 часов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате были получены одиночные фаговые клоны с более высокой способностью к связыванию с каждым антигеном, чем у исходных антител (49A2 или 45D6), а результаты представлены на фиг. 10.

4. Анализ нуклеотидных последовательностей положительных фаговых антител

Из отобранных одиночных клонов выделяли ДНК с помощью набора для очистки ДНК (Qiagen, Germany) и заказывали анализ последовательностей этих ДНК (Solgent). Исходя из результатов анализа последовательностей, идентифицировали участки CDR из V_H и V_L у выбранных антител, и исследовали сходство (идентичность) между этими антителами и группами гаметных антител с помощью программы Ig BLAST на веб-сайте NCBI по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. В результате было получено 25 видов фаговых антител (49A2: 10 видов, 45D6: 15 видов) с более высокой способностью к связыванию, чем у исходных антител, а результаты приведены ниже в таблице 8.

Таблица 8. Характеристики моноклонов PD1 от вариантов антител, отобранных при оптимизации

Название клона	VH	Идентичность	VL	Идентичность	Группа
PD1-49A2(A/1B2)	VH3-30	92,86%	O1	93,07%	1
PD1-49A2(A/1D11)	VH3-30	91,84%	O1	97,03%	2
PD1-49A2(A/1F12)	VH3-30	92,86%	O1	93,07%	3
PD1-49A2(A/1H4)	VH3-30	92,86%	O1	92,08%	4
PD1-49A2(A/1H8)	VH3-30	92,86%	O1	90,10%	5
PD1-49A2(A/2A6)	VH3-30	91,84%	O1	89,11%	6
PD1-49A2(A/2A11)	VH3-30	93,88%	O1	90,10%	7
PD1-49A2(A/2B9)	VH3-30	92,86%	O1	93,07%	8
PD1-49A2(A/2B10)	VH3-30	93,88%	O1	95,05%	9
PD1-45D6(A/3D2)	VH3-30	93,88%	O1	94,06%	10
PD1-45D6(A/3G1)	VH3-30	93,88%	O1	95,05%	11
PD1-45D6(A/3H4)	VH3-30	93,88%	O1	93,07%	12
PD1-45D6(A/3H6)	VH3-30	93,88%	O1	95,05%	13
PD1-45D6(A/3H7)	VH3-30	93,88%	O1	92,08%	14
PD1-45D6(A/4C1)	VH3-30	94,90%	O1	96,04%	15
PD1-45D6(A/4C9)	VH3-30	94,90%	O1	93,07%	16
PD1-45D6(A/4D4)	VH3-30	94,90%	O1	92,08%	17
PD1-45D6(A/4H6)	VH3-30	94,90%	O1	95,05%	18
PD1-49A2(A/2D7)	VH3-30	92,86%	O1	95,05%	19
PD1-45D6(A/5A6)	VH3-30	91,84%	O1	96,04%	20
PD1-45D6(A/5B2)	VH3-30	93,88%	O1	94,06%	21
PD1-45D6(A/5B5)	VH3-30	92,86%	O1	92,08%	22
PD1-45D6(A/5B12)	VH3-30	93,88%	O1	94,06%	23
PD1-45D6(A/5C8)	VH3-30	92,86%	O1	95,05%	24
PD1-45D6(A/5H9)	VH3-30	92,86%	O1	94,06%	25

Антитела, включая последовательности участков CDR и FR тяжелой и легкой цепи выбранных антител, а также содержащие их вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, представлены ниже в таблицах 9 и 10.

Таблица 9. Вариабельные области тяжелой цепи у человеческих антител PD1

Название	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
PD1-49A2 (A/1B2)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFLRYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGQDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGRGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	17	97	49	114	58	136
PD1-49A2 (A/1D11)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFKNNA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGRHK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	18	97	50	114	58	137
PD1-49A2 (A/1F12)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFRNYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGQHK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WSQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	19	97	51	114	58	145
PD1-49A2 (A/1H4)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFPIYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGAHK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	20	97	52	114	58	137
PD1-49A2 (A/1H8)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFKTYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGQHK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	21	97	51	114	58	137
PD1-49A2 (A/2A6)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFKYYA	MHWVRQ APGKGLE WVTV	ISYDGQYK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	22	113	53	114	58	137
PD1-49A2 (A/2A11)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFRSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGQDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	23	97	49	114	58	137
PD1-49A2 (A/2B9)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFLRYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGRYK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	17	97	54	114	58	137
PD1-49A2 (A/2B10)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFLVYA	MHWVRQ APGKGLEWVAV	ISYDGSHK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	24	97	55	114	58	137
PD1-49A2 (A/2D7)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFKTYA	MHWVRQ APGKGLEWVAV	ISYDGQHK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	TTTTFDS	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	21	97	51	114	58	137
PD1-45D6 (A/3D2)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ VPGKGLEWVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	96	31	114	57	135
PD1-45D6 (A/3G1)	QVQLVESG GGVVQPGRSLRLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ VPGKGLEWVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	96	31	114	57	135
PD1-45D6 (A/3H4)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ VPGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	96	31	114	57	135
PD1-45D6 (A/3H6)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ VPGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	96	31	114	57	135
PD1-45D6 (A/3H7)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ VPGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	96	31	114	57	135
PD1-45D6 (A/4C1)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/4C9)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/4D4)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLEWVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/4H6)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSSYA	MHWVRQ APGKGLEWVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	1	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/5A6)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFRLYA	MHWVRQ APGKGLEWVAV	ISHDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	25	97	56	114	57	137
PD1-45D6 (A/5B2)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSFYA	MHWVRQ APGKGLEWVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	26	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/5B5)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFRTYA	MHWVRQ APGKGLEWVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	27	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/5B12)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFSVYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	28	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/5C8)	QVQLVESG GGVVQPGRSLRLSCAAS	GFTFMRYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	29	97	31	114	57	137
PD1-45D6 (A/5H9)	QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS	GFTFWTYA	MHWVRQ APGKGLE WVAV	ISYDGNDK	YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC	VPTTFEY	WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:	80	30	97	31	114	57	137

Таблица 10. Вариабельные области легкой цепи у человеческих антител PD1

Название	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
PD1-49A2 (A/1B2)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:	283	220	302	230	339	252	366
PD1-49A2 (A/1D11)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLFDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	283	215	302	230	340	252	366
PD1-49A2 (A/1F12)	DIVMTQTPHS LPVTPGEPASISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC	MQRIEFPYT	FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:	290	205	302	230	341	264	366
PD1-49A2 (A/1H4)	DIVMTQSPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC	MQRVEFPYT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	291	205	302	230	342	265	361
PD1-49A2 (A/1H8)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLD RDGGHTY	VDWYLQKPG QSPRLLIY	TLS	HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DDVGLYYC	MQRIEFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	283	221	313	230	343	266	363
PD1-49A2 (A/2A6)	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQRPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPGRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	276	205	314	230	344	252	363
PD1-49A2 (A/2A11)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLFDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPRLLIY	TLS	HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC	LQRMGFPYT	FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:	283	215	315	230	345	249	366
PD1-49A2 (A/2B9)	DIVMTQTPLS LPVTPGEAASISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC	MQRRDFPFT	FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	346	267	356
PD1-49A2 (A/2B10)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	283	220	302	230	323	252	361
PD1-49A2 (A/2D7)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLD RDGGHTY	VDWYLQKPG QSPRLLIY	TLS	HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DNVGLYYC	MQRIEFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	283	221	313	230	347	266	363
PD1-45D6 (A/3D2)	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	333	252	363
PD1-45D6 (A/3G1)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	283	205	302	230	346	252	361
PD1-45D6 (A/3H4)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLFDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVSDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	283	215	302	230	348	252	361
PD1-45D6 (A/3H6)	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	349	252	366
PD1-45D6 (A/3H7)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPGRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:	283	220	302	230	344	252	366
PD1-45D6 (A/4C1)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	283	220	302	230	333	252	361
PD1-45D6 (A/4C9)	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	350	252	366
PD1-45D6 (A/4D4)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:	283	205	302	230	339	252	356
PD1-45D6 (A/4H6)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLFDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:	283	215	302	230	331	252	366
PD1-45D6 (A/5A6)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC	MQRIDFPYT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	283	205	302	230	349	257	361
PD1-45D6 (A/5B2)	DIVMTQTPLS PPVTPGEPASI SCRSS	QSLLDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC	MQRRDFPFT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	292	220	302	230	346	267	361
PD1-45D6 (A/5B5)	DIVMTQTPLS LPVMPGEAA SISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DDVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	293	205	302	230	351	252	363
PD1-45D6 (A/5B12)	DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	276	205	302	230	333	252	363
PD1-45D6 (A/5C8)	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS EDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC	MQRVEFPFT	FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:	285	205	302	230	349	252	361
PD1-45D6 (A/5H9)	DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS	QSLLDS DDGNTY	LDWYLQKPG QSPQLLIY	TLS	HRASGVSDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC	MQRRDFPFT	FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:	283	220	302	230	352	267	363

Пример 7. Получение человеческих антител к PD-1

1. Преобразование из формата scFv в формат IgG

Для перевода выбранных 25 видов моноклональных фаговых антител к PD1 из фагов в целый IgG-вектор проводили ПЦР (iCycler iQ, BioRad) на тяжелых и легких цепях. В результате получали тяжелые и легкие цепи, а векторы и тяжелые и легкие цепи каждого из клонов разрезали (расщепляли) рестрикционными ферментами. Из каждого вектора и тяжелой цепи выделяли ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из геля (Qiagen). Проводили лигирование путем смешивания 1 мкл (10 нг) вектора, 15 мкл (100-200 нг) тяжелой цепи, 2 мкл 10-кратного буфера, 1 мкл лигазы (1 ед./мкл) и дистиллированной воды, а затем инкубации смеси при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Полученную смесь вводили в трансформируемые клетки (компетентные клетки, XL1-blue), помещали клетки на лед на 5 мин и подвергали их тепловому шоку при 42°C в течение 90 сек.

После теплового шока к клеткам добавляли 1 мл среды, а затем культивировали клетки при 37°C в течение 1 часа, рассеивали шпателем по чашке с LB Amp и инкубировали при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом колонии инокулировали в 5 мл среды LB Amp, культивировали при 37°C в течение 16 часов и проводили выделение ДНК с помощью набора DNA-prep (Nuclogen). Заказывали анализ последовательностей полученных ДНК (Solgent).

В результате было подтверждено, что последовательности тяжелых цепей и легких цепей у 25 клонов для PD1, переведенных в целые IgG, соответствуют последовательностям фаговых антител. Для трансфекции в клетки HEK293F тяжелые и легкие цепи соответствующих клонов, переведенных в целые IgG, культивировали в 100 мл среды LB Amp и выделяли ДНК с помощью набора Midi-prep (QIAgen).

2. Получение человеческих антител

Клонированные векторы pNATVH и pNATVL в соотношении 6:4 совместно трансфецировали в клетки HEK293F, на 7-й день собирали супернатанты, удаляли клетки и обломки клеток центрифугированием и через фильтры на 0,22 мкм, а супернатанты собирали и подвергали аффинной хроматографии на белке A для очистки IgG-антител. Антитела после очистки проводили через глициновый буфер и заменяли буфер таким образом, чтобы конечным буфером при ресуспендировании был PBS. Проводили количественное определение очищенных антител методом BCA и Nanodrop, а затем каждое из 25 видов антител наносили в дозе 5 мкг в восстановительных и невосстановительных условиях и анализировали методом SDS-PAGE для определения чистоты и подвижности очищенного белка. Кроме того, некоторые из супернатантов наносили на SDS-PAGE для сравнения скорости экспрессии с исходным антителом, причем большинство антител экспрессировались сильнее, чем исходное антитело, а результаты представлены на фиг. 11.

Пример 8. Характеристики моноклональных антител к PD-1

1. Оценка активности антител

Проводили тестирование выбранных антител на активность с помощью набора для биоанализа блокировки PD1/PD-L1 (Promega, J1250). В 96-луночный планшет высеивали клетки линии CHO с высокой экспрессией PD-L1, культивировали в течение 16 часов или дольше, обрабатывали каждым антителом в серийном разведении при постоянной концентрации, а затем культивировали вместе с клетками линии Jurkat с высокой экспрессией PD-1 человека в течение 6 часов. Определяли степень восстановления ингибирования у антител на спектрофотометре (SpectraMax M5, Molecular Devices, USA) по интенсивности люминесценции, возникающей при расщеплении субстрата люциферазой. Активность 24 видов антител к PD-1 определяли по значениям для восстановления пониженного сигнала при образовании комплекса PD-1/PD-L1, причем 45D6-3D2, 45D6-3H7, 45D6-5B2 и 45D6-5B5 из числа антител 45D6 и 49A2-1B2, 49A2-1H8, 49A2-2A6 и 49A2-2B9 из числа антител 49A2 проявляли большую активность, чем исходное антитело, близкую к активности контрольного антитела (фиг. 12).

Для измерения активности 8 видов антител к PD-1 (45D6-3D2, 45D6-3H7, 45D6-5B2, 45D6-5B5, 49A2-1B2, 49A2-1H8, 49A2-2A6, 49A2-2B9) в зависимости от концентрации делали серийные разведения и опять проводили биоанализ блокирования PD1/PD-L1 по восстановлению пониженного сигнала зависимым от концентрации образом. Степень восстановления выражали в виде EC₅₀ (эффективная концентрация mAb при 50%-м уровне восстановления сигнала) при анализе с помощью Graphpad Prism6, причем 49A2-1B2 проявляло наибольшую способность к восстановлению ингибирования in vitro по значению EC₅₀ (фиг. 13, таблица 11).

Таблица 11. Активность моноклонов PD1 от выбранных вариантов антител

Антитело	EC50 [нM]	Антитело	EC50 [нM]
PD-1-41C9	3,91	PD-1-49A2	3,78
PD-1-45D6	2,00	PD-1-49A2-A-1B2	1,30
PD-1-45D6-A-3D2	2,16	PD-1-49A2-A-1D11	2,89
PD-1-45D6-A-3G1	0,98	PD-1-49A2-A-1F12	1,03
PD-1-45D6-A-3H4	1,67	PD-1-49A2-A-1H4	0,84
PD-1-45D6-A-3H6	1,49	PD-1-49A2-A-1H8	1,21
PD-1-45D6-A-3H7	1,98	PD-1-49A2-A-2A11	0,79
PD-1-45D6-A-4C1	1,76	PD-1-49A2-A-2A6	1,51
PD-1-45D6-A-4C9	2,72	PD-1-49A2-A-2B10	0,65
PD-1-45D6-A-4D4	1,74	PD-1-49A2-A-2B9	1,23
PD-1-45D6-A-4H6	1,19	PD-1-51D9	~4,695
PD-1-45D6-A-5A6	0,92	PD-1-52E8	8,43
PD-1-45D6-A-5B12	0,80	PD-1-62E1	2,73
PD-1-45D6-A-5B2	1,48	PD1-72D10	1,21
PD-1-45D6-A-5B5	1,68	PD1-74A11	1,31
PD-1-45D6-A-5C8	1,44	PD1-75C10	0,81
PD-1-45D6-A-5H9	2,00	PD1-74A01	1,01
PD-1-48A9	8,64	PD1-74H12	0,98

2. Сродство антител к PD1 к гиперэкспрессированным клеткам

Обращаясь к пулам трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1, клетки HEK293E трансформировали плазмидой pcDNA3.1, содержащей PD-1 человека (NM_005018.2) или PD-L1 человека (NM_014143.2), и проводили скрининг в селективной среде, содержащей 400 мкг/мл зеоцина (#R25001, Thermo Fisher). Каждый пул клеток идентифицировали и отбирали методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с помощью антитела против PD-1 (#557860, BD) и использовали для таких функциональных анализов, как анализ связывания по FACS или анализ конкуренции по FACS. Из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1 человека отбирали образцы по 0,5-1×10⁶ клеток, готовили серийные разведения антител при постоянной степени разведения и проводили реакцию с полученными клетками при 4°C в течение 20 мин. Затем клетки трижды промывали PBS (#LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной телячьей сыворотки, и проводили реакцию при 4°C в течение 20 мин с антителом против IgG человека (#FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин-изотиоцианат). Клетки опять промывали так же, как описано выше, а затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащем 2% FBS (#26140-079, Thermo Fisher), и проводили проточную цитометрию на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, USA).

От 0,5 до 1 × 10⁶ клеток на каждый образец получали из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией человеческого PD-1, и антитела серийно разводили с постоянной скоростью разведения и реагировали с полученными клетками при 4°С в течение 20 минут. Затем клетки трижды промывали PBS (# LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной бычьей сыворотки, и подвергали реакции при 4°С в течение 20 минут с антителом против человеческого IgG (# FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин изотиоцианат). Затем клетки подвергали тому же процессу промывания, что и выше, и затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащий 2% FBS (# 26140-079, Thermo Fisher), с помощью проточного цитометра FACSCanto II (BD Biosciences, США) в качестве проточного цитометра. Определяли способность к связыванию по константе равновесной диссоциации (K_d), полученной через функцию анализа Graphpad Prism6. При этом, как видно из фиг. 15, способность к связыванию у антител при зависимом от концентрации связывании с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, можно определять по MFI (средней интенсивности флуоресценции). Как видно из фиг. 14 и 15, антитела, за исключением 49A2 (исходное 49A2), проявляли близкие способности к связыванию.

3. Способность антител ингибировать образование комплекса PD-1/PD-L1 или PD-1/PD-L2 при иммуноадсорбции фермента

В лунки 96-луночного иммунопланшета (#439454, Thermo) вносили PD-1-Fc (S1420, Y-Biologics) или PD-L2-Fc (#10292-H02H, Sino) человека, а затем трижды промывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (#P9416, Sigma-Aldrich), после чего оставляли на 1 час при комнатной температуре в чистящем растворе, содержащем 4% обезжиренного молока (#232120, Becton, Dickinson and Company), для блокировки неспецифического связывания. В то же время проводили реакции человеческих PD-L1-His (S1479, Y-Biologics) или PD-1-His (S1352, Y-Biologics) с серийными разведениями антител при постоянной степени разведения при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего оставляли в том же микропланшете при комнатной температуре на 1 час. Затем полученные продукты промывали так же, как и выше, в лунки микропланшета добавляли антитело против биотина-His (#MA1-21315-BTIN, Thermo) в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавляли антитело против стрептавидина с поли-HRP (#21140, Pierce) в разведении 1:5000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промывали таким же образом. К продуктам реакции добавляли 100 мкл раствора субстрата TMB (#T0440, Sigma-Aldrich), заслоняли от света и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавляли 50 мкл 2,5 М серной кислоты (#S1478, Samchun) для остановки реакции и измеряли поглощение при 450 нм на спектрофотометре GM3000 (Glomax^® Discover System, Promega). Результаты представлены на фиг. 16.

4. Сродство антител к PD1 на приборе ProteOn XPR36

Использовали прибор ProteOn XPR36 (BioRad). На приборе устанавливали сенсорный чип GLC (BioRad) и промывали буфером PBST, а поверхность карбоксиметилдекстрана активировали смесью растворов EDC и сульфо-NHS. На сенсорный чип GLC наносили и иммобилизировали PD1-hFc, растворенный при концентрации 5 мкг/мл в буферном растворе 10 мМ ацетата натрия (pH 5,0).

Для того, чтобы дезактивировать активированные карбоксильные группы, не прореагировавшие с белком PD1, пропускали 1М этаноламин и вводили 10 мМ глицина (рН 2,0) с тем, чтобы смыть белки, не связавшиеся с сенсорным чипом. Затем регистрировали данные для сенсограммы при связывании и диссоциации по времени, пропуская антитела со скоростью подачи 30 мкл/мин (от 30 нМ до 0,123 нМ) в течение 10 мин с помощью буфера PBST.

Рассчитывали равновесные константы диссоциации (K_D) путем нанесения на график и аппроксимации данных по сенсограмме в состоянии равновесия в зависимости от концентрации. При этом 49A2 (2B9) проявляло значение K_D 0,001 нМ, что указывает на высокое сродство к антигену PD1 (фиг. 17).

Сродство других антител к белку PD-1 человека, сродство к белку PD-1 обезьян и сродство к белку PD-1 крыс представлены в таблице 12-14.

Таблица 12. Кинетика связывания между белком PD-1 человека и выбранными антителами

Антитело	KD (M)	Ka (1/Ms)	Kd (1/s)
PD1-49A2	2,371×10-10	3,953×105	9,372×10-5
PD1-49A2-1H8	1,245×10-11	2,201×105	2,741×10-6
PD1-49A2-1B2	1,659×10-10	3,853×105	6,390×10-5
PD1-49A2-2A6	6,907×10-11	3,101×105	2,142×10-5
PD1-49A2-2B9	1,0×10-12	3,774×105	1,00×10-7
PD1-45D6	1,0×10-12	2,701×105	1,07×10-7
PD1-45D6-3D2	1,0×10-12	1,810×105	1,00×10-7
PD1-45D6-3H7	2,530×10-11	3,076×105	7,781×10-6
PD1-45D6-5B2	5,818×10-11	3,315×105	1,928×10-5
PD1-45D6-5B5	4,773×10-11	2,960×105	1,413×10-5

Таблица 13. Кинетика связывания между белком PD-1 обезьяны и выбранными антителами

Антитело	KD (M)	Ka (1/Ms)	Kd (1/s)
PD-1-49A2	1,0×10-12	1,683×105	1,0×10-7
PD-1-49A2-2B9	1,0×10-12	1,853×105	1,0×10-7
PD-1-45D6	1,0×10-12	1,535×105	1,0×10-7
PD-1-45D6-5B2	1,0×10-12	2,078×105	1,0×10-7

Таблица 14. Кинетика связывания между белком PD-1 крысы и выбранными антителами

Антитело	KD (M)	Ka (1/Ms)	Kd (1/s)
PD-1-49A2-2B9	4,231×10-9	1,478×105	6,252×10-4
PD-1-45D6	2,391×10-9	5,544×104	1,326×10-4
PD-1-45D6-5B2	4,590×10-9	1,879×105	8,626×10-4

Пример 9. Определение эпитопов у моноклональных антител к PD-1

Моноклональные scFv-фаги, связывающиеся с антигеном PD1, культивировали в среде, содержащей 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом клетки вносили в среду, содержащую 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, при OD₆₀₀ = 0,1, а затем культивировали при 37°С в течение 2-3 часов до OD₆₀₀ = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ IPTG, при 30°C в течение 16 часов.

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 дикого типа (WT) или некоторые варианты (фиг. 18) при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем блокировали лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Каждую лунку промывали 0,2 мл PBS/T, а затем вносили одиночный клон scFv-фага (по 100 scFv-фагов) после культивирования в течение 16 часов, в дозе 100 мкл и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате оказалось, что выбранные одиночные клоны scFv-фагов, контрольный scFv-фаг и варианты PD-1 проявляли разные характеристики связывания, следовательно, они содержат разные эпитопы (фиг. 19).

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 дикого типа (WT) или некоторые варианты (фиг. 18) при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем блокировали лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Каждую лунку промывали 0,2 мл PBS/T, а затем вносили одиночный клон scFv-фага после культивирования в течение 16 ч в дозе 100 мкл (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против Fab в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате оказалось, что контрольный scFv-фаг и варианты PD-1 проявляют разные характеристики связывания, следовательно, они содержат разные эпитопы (фиг. 20).

Пример 10. Специфическое связывание исходного антитела к PD-1

Для определения способности к связыванию у исходного антитела к PD1 и контрольного антитела (ниволумаб) с другими антигенами, чем антиген PD1 (таблица 15), на 96-луночных иммунопланшетах фиксировали около 90 неспецифических антигенов при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 часов и блокировали соответствующие лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Лунки промывали 0,2 мл PBS/T, а затем в каждую лунку вносили исходное антитело и контрольное антитело в дозе 100 мкл (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, а затем добавляли вторичное антитело против каппа с HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате оказалось, что и контрольное антитело, и исходное антитело специфически связываются только с антигеном PD1 и не связываются с неспецифическими антигенами (фиг. 21).

Пример 11. Сравнение продуктивности в системе краткосрочной экспрессии моноклональных антител к PD1

Как оказалось, оптимизированные антитела обладают сравнительно однородной и высокой продуктивностью благодаря превосходным физическим свойствам при получении и очистке в системе краткосрочной экспрессии. Некоторые антитела обладают большей продуктивностью, чем обычные коммерчески доступные антитела (фиг. 22).

Пример 12. Повышение активности под действием моноклональных антител к PD1 при аллогенной реакции MLR

Смешивали Т-клетки с происходящими из моноцитов дендритными клетками, выделенными от разных людей, в соотношении 1:10 и культивировали в течение 5 дней, а затем измеряли количество γ-интерферона в культуральной среде. При этом культуральные среды, содержащие исходные антитела 45D6 и 49A2, проявляли зависимое от концентрации повышение количества γ-интерферона (фиг. 23).

Пример 13. Испытание моноклональных антител к PD1 на термостабильность

Белок антител разводили в DPBS до 3 мкМ, отбирали 45 мкл и смешивали с 5 мкл 200-кратного красителя Sypro Orange (#S6650, Thermo), а затем по 50 мкл вносили в пробирки для qPCR (#B77009, B57651, Bioplastics). Проводили количественный ПЦР (qPCR) в реальном времени на установке BioRad CFX96. Условия qPCR задавали следующим образом: реакция при 25°C в течение 30 сек, повышение температуры на 1°C вплоть до 99°C и в то же время реакция при каждой температуре в течение 1 мин, а затем заключительная реакция при 25°C в течение 10 сек. В качестве константы, характеризующей разупорядочение структуры антител, использовали Tm (температура плавления). Результаты представлены ниже в таблице 16.

Таблица 16

Образец	Tm
Пембролизумаб	63
Опдиво	64
45D6	63
49A2	63
49A2-2B9	64

Промышленная применимость

Новые антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут связываться с PD-1 и ингибировать активность PD-1, поэтому они применимы для разработки иммунотерапевтических средств от различных заболеваний, связанных с PD-1.

Хотя конкретные конфигурации настоящего изобретения были описаны подробно, однако специалистам в данной области должно быть ясно, что данное описание приводится в качестве предпочтительных воплощений для иллюстративных целей и не должно рассматриваться как ограничивающее объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и её эквивалентами.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Y-BIOLOGICS INC.

<120> NOVEL ANTIBODY AGAINST PROGRAMMED CELL DEATH PROTEIN (PD-1), AND

USE THEREOF

<130> PF-B2149

<140> PCT/KR2017/008494

<141> 2017-08-07

<150> KR10-2016-0100210

<151> 2016-08-05

<160> 420

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 4

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 5

Gly Asp Thr Phe Thr Arg Asn Ala

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 8

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 10

Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn Ser

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 11

Gly Asp Thr Phe Thr Arg Tyr Ile

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 12

Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Ala

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr Ala

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 14

Gly Leu Ser Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 15

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 16

Gly Phe Thr Phe Gly Asp His Pro

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 17

Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr Ala

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 18

Gly Phe Thr Phe Lys Asn Asn Ala

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 19

Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 20

Gly Phe Thr Phe Pro Ile Tyr Ala

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 21

Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr Ala

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 22

Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 23

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 24

Gly Phe Thr Phe Leu Val Tyr Ala

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 25

Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr Ala

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 26

Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Ala

1 5

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 27

Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Ala

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 28

Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Ala

1 5

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 29

Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr Ala

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 30

Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr Ala

1 5

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 31

Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 32

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 33

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 34

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 35

Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala

1 5

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 36

Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala

1 5

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 37

Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 38

Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 39

Ile Ser Trp Asn Ser Asn Asn Ile

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 40

Leu His Ala Asp Ser Gly Lys Thr

1 5

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 41

Ile Phe Ser Gly Gly Thr Thr Lys

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 42

Val Ile Pro Thr Leu Gly Leu Thr

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 43

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Ile

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 44

Ile Ser Trp Asn Ser His Asn Ile

1 5

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 45

Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 46

Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr

1 5

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 47

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Pro

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 48

Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 49

Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys

1 5

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 50

Ile Ser Tyr Asp Gly Arg His Lys

1 5

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 51

Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 52

Ile Ser Tyr Asp Gly Ala His Lys

1 5

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 53

Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Tyr Lys

1 5

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 54

Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Tyr Lys

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 55

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser His Lys

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 56

Ile Ser His Asp Gly Asn Asp Lys

1 5

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 57

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr

1 5

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 58

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser

1 5

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 59

Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ile Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 60

Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 61

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 61

Ala Arg Ser Leu Pro Xaa Ser Arg Ser Arg Leu Asp Val

1 5 10

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 62

Ala Arg Ala Xaa Thr Ser Pro Leu Asp Met Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 63

Ala Arg Leu Leu His Gln Met Asn Glu His Glu Phe Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 64

Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp

1 5 10 15

Thr

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 65

Ala Arg Thr Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 66

Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn

1 5 10

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 67

Ala Arg Leu Met His Thr Phe Ser Val Gln Tyr Phe Leu Asp Val

1 5 10 15

<210> 68

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 68

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Phe Asp Met

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 69

Ala Arg Gly Ala Leu Thr Pro Leu Asp Val

1 5 10

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 70

Ala Arg Gly Thr His Trp Leu Asp Ser

1 5

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 71

Ala Arg Glu Glu Gln Phe Leu Ile Ala Leu Ala Gly Arg Tyr Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 72

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 72

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 73

Ala Arg Ile Gly Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 74

Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val His Ala

1 5

<210> 75

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 75

Ala Arg Asp Ser Phe Gly Gly His Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 76

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 76

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Tyr Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 77

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 77

Ala Arg Gly His Asn Tyr Leu Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 78

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 78

Ala Ser Val Ser Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Gly Thr Phe

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 79

Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 80

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 80

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 81

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 82

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 82

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 83

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 83

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 84

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 84

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 85

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 85

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 86

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 86

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 87

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 87

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 88

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 88

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 89

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 89

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 90

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 90

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 91

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 92

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 92

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 93

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 94

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser

20 25

<210> 95

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 95

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 96

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 96

Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 97

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 97

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 98

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 98

Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 99

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 99

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 100

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 100

Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 101

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 101

Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met Ala

1 5 10 15

Asp

<210> 102

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 102

Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Asp

<210> 103

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 103

Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Ile

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 104

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 105

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 105

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Trp

<210> 106

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 106

Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Leu

<210> 107

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 107

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 108

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 108

Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 109

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 109

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Asn

<210> 110

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 110

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Glu

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 111

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 112

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 112

Leu Thr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

1 5 10 15

Phe

<210> 113

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 113

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr

1 5 10 15

Val

<210> 114

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 114

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 115

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 115

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 116

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 116

Val Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 117

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 117

Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 118

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 118

His Ser Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 119

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 119

Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val

1 5 10 15

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 120

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 120

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 121

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 121

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 122

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 122

Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr

1 5 10 15

Ser Thr Ser Ser Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 123

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 123

Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 124

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 124

Gly Tyr Ala Gln Thr Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr

1 5 10 15

Ser Ile Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 125

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 125

Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

35

<210> 126

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 126

Thr Tyr Ala Gln Asn Phe Gln Asp Thr Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys

1 5 10 15

Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 127

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 127

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 128

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 128

Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 129

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 129

Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 130

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 130

Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 131

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 131

Gly Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 132

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 132

Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

1 5 10 15

Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

20 25 30

Glu Asp Thr Ala Val Tyr

35

<210> 133

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 133

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 134

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 134

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 135

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 135

Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 136

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 136

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 137

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 137

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 138

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 138

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 139

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 139

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 140

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 140

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 141

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 141

Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 142

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 142

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 143

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 143

Trp Gly Gln Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 144

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 144

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Ile Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 145

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 145

Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 146

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 146

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 147

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 147

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 148

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 148

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 149

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 149

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 150

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 150

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Pro Xaa Ser Arg Ser Arg Leu Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 151

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 151

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Xaa Thr Ser Pro Leu Asp Met Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 152

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 152

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Leu His Gln Met Asn Glu His Glu Phe Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 153

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 153

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala His Ser Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp

100 105 110

Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 154

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 154

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Arg Asn

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Asp Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 155

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 155

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 156

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 156

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn Trp Gly Leu Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 157

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 157

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Met His Thr Phe Ser Val Gln Tyr Phe Leu Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 158

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 158

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 159

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 159

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Ser Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

100 105 110

Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 160

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 160

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Leu Thr Pro Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Pro

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 161

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 161

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Leu His Ala Asp Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Gln Thr Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr His Trp Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 162

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 162

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Phe Ser Gly Gly Thr Thr Lys Tyr Lys Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Glu Gln Phe Leu Ile Ala Leu Ala Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 163

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 163

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Ile Pro Thr Leu Gly Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Asn Phe

50 55 60

Gln Asp Thr Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Ile Thr Val Ser Ser

115

<210> 164

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 164

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Gly Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 165

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 165

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 166

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 166

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser His Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val His Ala Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 167

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 167

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Phe Gly Gly His Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 168

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 168

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Tyr Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Pro Ile Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 169

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 169

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly His Asn Tyr Leu Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 170

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 170

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp His

20 25 30

Pro Leu Thr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ser Val Ser Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Gly

100 105 110

Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 171

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 171

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 172

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 172

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asn Asn

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 173

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 173

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 174

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 174

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Ile Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ala His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 175

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 175

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 176

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 176

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 177

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 177

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 178

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 178

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 179

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 179

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Val Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 180

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 180

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 181

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 181

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 182

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 182

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 183

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 183

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser His Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 184

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 184

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 185

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 185

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 186

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 186

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 187

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 187

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 188

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 188

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 189

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 189

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 190

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 190

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 191

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 191

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 192

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 192

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 193

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 193

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 194

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 194

ccaggatggt tcttagactc ccc 23

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 195

caccagggtt tggaactggc 20

<210> 196

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 196

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 197

<211> 233

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 197

Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe

50 55 60

Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu

65 70 75 80

Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

85 90 95

Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys

100 105 110

Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser

115 120 125

Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met

130 135 140

Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro

145 150 155 160

Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn

165 170 175

Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser

195 200 205

Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

225 230

<210> 198

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 198

Arg Asp Ile Ser Arg Trp

1 5

<210> 199

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 199

Gln Ser Leu Val His

1 5

<210> 200

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 200

Gln Ala Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 201

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 201

Ala Leu Ser Lys Gln Tyr

1 5

<210> 202

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 202

Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn Ala

1 5

<210> 203

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 203

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 204

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 204

Gln Gly Ile Val Ser Trp

1 5

<210> 205

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 205

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 206

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 206

Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 207

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 207

Thr Phe Asn Ile Gly Thr Thr Thr

1 5

<210> 208

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 208

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 209

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 209

Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr

1 5

<210> 210

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 210

Asn Leu Arg Thr Lys Tyr

1 5

<210> 211

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 211

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 212

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 212

Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly His Asp

1 5

<210> 213

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 213

Gln Ser Leu Leu Asp Ser His Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 214

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 214

Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn Thr

1 5

<210> 215

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 215

Gln Ser Leu Phe Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 216

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 216

Gln Ser Leu Leu Tyr Ile Asp Gly Glu Thr Tyr

1 5 10

<210> 217

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 217

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Asn Tyr

1 5 10

<210> 218

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 218

Ala Leu Ser Lys Glu Tyr

1 5

<210> 219

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 219

Gln Ser Val Thr Ser Asp

1 5

<210> 220

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 220

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 221

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 221

Gln Ser Leu Leu Asp Arg Asp Gly Gly His Thr Tyr

1 5 10

<210> 222

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 222

Gln Ser Leu Leu Asp Arg Gly Gly Gly His Thr Tyr

1 5 10

<210> 223

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 223

Gly Ala Ser

1

<210> 224

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 224

Lys Ile Ser

1

<210> 225

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 225

Ala Thr Ser

1

<210> 226

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 226

Lys Asp Thr

1

<210> 227

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 227

Tyr Asp Asp

1

<210> 228

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 228

Gly Asn Ser

1

<210> 229

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 229

Arg Ala Ser

1

<210> 230

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 230

Thr Leu Ser

1

<210> 231

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 231

Ala Ala Ser

1

<210> 232

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 232

Asn Tyr Asp

1

<210> 233

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 233

Gly Lys Asn

1

<210> 234

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 234

Gln Asp Thr

1

<210> 235

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 235

Asp Val Ser

1

<210> 236

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 236

Gly Asn Asn

1

<210> 237

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 237

Arg Asp Asp

1

<210> 238

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 238

Glu Val Ser

1

<210> 239

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 239

Leu Gly Ser

1

<210> 240

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 240

Lys Asp Ser

1

<210> 241

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 241

Asp Ala Ser

1

<210> 242

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 242

Gln Gln Gly Lys Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 243

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 243

Met Gln Ser Thr Gln Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 244

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 244

Gln Gln Thr Asp Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 245

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 245

Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr Asp Val Ile

1 5 10

<210> 246

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 246

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val

1 5 10

<210> 247

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 247

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 248

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 248

Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 249

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 249

Leu Gln Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 250

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 250

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Arg Thr

1 5

<210> 251

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 251

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Trp Leu

1 5 10

<210> 252

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 252

Met Gln Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 253

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 253

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ser Leu Val

1 5 10

<210> 254

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 254

Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser Met Ile

1 5 10

<210> 255

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 255

Ser Ser Phe Thr Ser Ser Ser Thr Val Val

1 5 10

<210> 256

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 256

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Gly

1 5 10

<210> 257

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 257

Met Gln Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 258

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 258

Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu Asn Gly Trp Val

1 5 10

<210> 259

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 259

Ser Ser Phe Ala Arg Asn Ser Asn Tyr Val

1 5 10

<210> 260

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 260

Met Gln Gly Ile His Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 261

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 261

Met Gln Gly Leu Gln Ile Pro Ser Thr

1 5

<210> 262

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 262

Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser Val Val

1 5 10

<210> 263

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 263

Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 264

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 264

Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 265

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 265

Met Gln Arg Val Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 266

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 266

Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 267

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 267

Met Gln Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 268

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 268

Met Gln Arg Lys Glu Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 269

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 269

Met Gln Arg Ile His Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 270

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 270

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 271

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 271

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 272

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 272

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 273

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 273

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp

20 25

<210> 274

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 274

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Met Ser Glu Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly

20 25

<210> 275

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 275

Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser

20 25

<210> 276

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 276

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 277

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 277

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 278

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> QFVLTQSPSA SGTPGQNIVI SCSAS

<400> 278

Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Asn Ile Val Ile Ser Cys Ser Ala Ser

20 25

<210> 279

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 279

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp

20 25

<210> 280

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 280

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp

20 25

<210> 281

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 281

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr

20 25

<210> 282

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 282

Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser

20 25

<210> 283

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 283

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 284

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 284

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg

20 25

<210> 285

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 285

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 286

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 286

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr

20 25

<210> 287

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 287

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser

20 25

<210> 288

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 288

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp

20 25

<210> 289

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 289

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 290

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 290

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro His Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 291

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 291

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 292

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 292

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Pro Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 293

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 293

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Met Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 294

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 294

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 295

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 295

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 296

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 296

Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

His

<210> 297

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 297

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 298

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 298

Ala Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Met

1 5 10 15

Tyr

<210> 299

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 299

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 300

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 300

Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 301

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 301

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 302

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 302

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 303

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 303

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 304

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 304

Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 305

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 305

Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 306

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 306

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 307

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 307

Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 308

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 308

Val His Trp Cys Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 309

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 309

Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Met

1 5 10 15

Tyr

<210> 310

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 310

Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 311

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 311

Ser Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met

1 5 10 15

Tyr

<210> 312

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 312

Val Ala Trp Tyr Gln His Ile Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 313

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 313

Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 314

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 314

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 315

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 315

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 316

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 316

Ser Leu Arg Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Phe Cys

35

<210> 317

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 317

Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 318

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 318

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 319

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 319

Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Gly Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 320

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 320

Arg Leu Thr Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 321

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 321

Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Ala

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 322

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 322

Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 323

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 323

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 324

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 324

Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Phe Cys

35

<210> 325

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 325

Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 326

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 326

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 327

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 327

Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 328

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 328

Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg Asp Glu Ser

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 329

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 329

Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 330

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 330

Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Glu Tyr Tyr Cys

35

<210> 331

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 331

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 332

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 332

Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

1 5 10 15

Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 333

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 333

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 334

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 334

Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 335

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 335

Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 336

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 336

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 337

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 337

Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 338

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 338

Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 339

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 339

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 340

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 340

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 341

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 341

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 342

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 342

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 343

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 343

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 344

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 344

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 345

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 345

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 346

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 346

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 347

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 347

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asn Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 348

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 348

His Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 349

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 349

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 350

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 350

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 351

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 351

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 352

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 352

His Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 353

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 353

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 354

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 354

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 355

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 355

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser His

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 356

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 356

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 357

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 357

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 358

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 358

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 359

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 359

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

1 5 10

<210> 360

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 360

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 361

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 361

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 362

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 362

Val Arg Arg Arg Asp Gln Ala Asp Arg Pro

1 5 10

<210> 363

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 363

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 364

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 364

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 365

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 365

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 366

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 366

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 367

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 367

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 368

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 368

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Arg Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 369

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 369

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Leu

20 25 30

Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile His

35 40 45

Lys Ile Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Thr Gln Phe Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 370

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 370

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asp Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 371

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 371

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ser Lys Gln Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Met Tyr

35 40 45

Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 372

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 372

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Met Ser Glu Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Asp Asp Arg Leu Thr Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 373

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 373

Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 374

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 374

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Val Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 375

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 375

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln

85 90 95

Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 376

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 376

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

100 105

<210> 377

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 377

Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Asn Ile Val Ile Ser Cys Ser Ala Ser Thr Phe Asn Ile Gly Thr Thr

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Tyr Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Ala Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 378

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 378

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 379

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 379

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ser

85 90 95

Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 380

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 380

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Thr Lys Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Thr Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg

65 70 75 80

Asp Glu Ser Thr Tyr Tyr Cys Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser

85 90 95

Met Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 381

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 381

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 382

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 382

Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly

20 25 30

His Asp Val His Trp Cys Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Ala Trp Gly Val Arg Arg Arg Asp Gln Ala Asp Arg Pro

100 105 110

<210> 383

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 383

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

His Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 384

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 384

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn

20 25 30

Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

35 40 45

Met Tyr Arg Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 385

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 385

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln

85 90 95

Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 386

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 386

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Ala Arg Asn

85 90 95

Ser Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 387

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 387

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ile

20 25 30

Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Ile His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 388

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 388

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Gln Ile Pro Ser Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105 110

<210> 389

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 389

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ser Lys Glu Tyr Ser

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 390

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 390

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln His Ile Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 391

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 391

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 392

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 392

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 393

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 393

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro His Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 394

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 394

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 395

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 395

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg

20 25 30

Asp Gly Gly His Thr Tyr Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 396

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 396

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 397

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 397

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln

85 90 95

Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 398

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 398

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 399

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 399

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 400

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 400

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg

20 25 30

Asp Gly Gly His Thr Tyr Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asn Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 401

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 401

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 402

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 402

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 403

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 403

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 404

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 404

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 405

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 405

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 406

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 406

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 407

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 407

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 408

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 408

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 409

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 409

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 410

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 410

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 411

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 411

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Pro Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 412

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 412

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Met Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 413

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 413

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 414

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 414

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 415

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 415

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 416

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 416

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 417

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 417

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 418

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 418

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 419

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 419

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg

20 25 30

Gly Gly Gly His Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Lys Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 420

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 420

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser His Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<---

1. Антитело, связывающееся с PD-1, либо его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO: 33, и CDR3 тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO: 59, вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO: 198, CDR2 легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO: 242,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 33, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 60, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 199, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 224, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 243,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 33, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 61, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 200, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 225, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 244 CDR3,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 33, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 62, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 201, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 226, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 245,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 34, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 63, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 202, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 227, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 246,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 35, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 64, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 203, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 247,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 5, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 36, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 65, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 204, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 229, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 248,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 249,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 37, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 66, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 206, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 231, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 250,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 67, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 207, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 232, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 251,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 208, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 38, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 68, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 209, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 233, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 253,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 69, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 210, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 234, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 254,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 9, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 40, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 70, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 235, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 255,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 41, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 71, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 236, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 256,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 42, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 72, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 213, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 257,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 12, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 43, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 73, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 214, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 237, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 258,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 249,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 44, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 74, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 238, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 259,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 14, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 45, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 75, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 216, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 238, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 260,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 46, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 76, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 239, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 261,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 47, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 240, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 262,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 48, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 78, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 219, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 241, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 263,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 79, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 264,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 268,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 32, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 269,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 49, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 54, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 267,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 50, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 51, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 264,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 52, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 265,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 51, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 266,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 53, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 23, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 49, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 249,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 24, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 55, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 51, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 266,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 56, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 257,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 26, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 267,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 27, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 28, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 29, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 252, или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 31, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 230, CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 267.

2. Антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающие:

FR1 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 80-95;

FR2 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 96-113;

FR3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 114-134; и

FR4 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 135-145.

3. Антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающие:

FR1 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 270-294;

FR2 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 295-315;

FR3 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 316-355; и

FR4 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 356-367.

4. Антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающие:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 146-193.

5. Антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающие:

вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 368-420.

6. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5.

7. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 6.

8. Клетка для продуцирования антитела по п. 1, трансформированная экспрессионным вектором по п. 7.

9. Способ получения антитела, связывающегося с PD-1, либо его антигенсвязывающего фрагмента, включающий:

(a) культивирование клетки по п. 8; и

(b) извлечение антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента из клеточной культуры.

10. Композиция для профилактики или лечения рака, характеризующегося экспрессией PD-1, содержащая в качестве активного ингредиента антитело по любому из пп. 1-5.

11. Композиция по п. 10, при этом рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака легких, рака печени, глиоцитомы, рака яичников, рака толстой кишки, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака почек, рака желудка, рака молочной железы, метастатического рака, рака простаты и рака поджелудочной железы.