Рекомбинантная клеточная линия cyto-car-yt-lact, проявляющая повышенную цитотоксическую активность по отношению к psca-позитивным раковым клеткам человека
Владельцы патента RU 2724431:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантной клеточной CYTO-CAR-YT-Lact, проявляющей повышенную цитотоксическую активность по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека. Линия получена в два этапа: сначала осуществляют трансдукцию клеточной линии YT лентивирусными частицами, кодирующими химерный антигенный рецептор против белка PSMA и рекомбинантный пептид лактаптин, а затем осуществляют трансдукцию полученной линии CAR-YT-Lact лентивирусными частицами, предварительно наработанными с использованием рекомбинантных лентивирусных плазмид lentiCRISPRv2-Shp2g1 и lentiCRISPRv2-Shp2g2, характеризующимися в соответствии с физическими картами, представленными на фиг. 1 и фиг. 3, следующими признаками: имеют размер 13012 п.о., кодируют основные функционально-структурные элементы системы CRISPR/Cas9 и состоят из следующих элементов: промотора U6 мяРНК человека; сгРНК к третьему и пятому экзонам гена PTPN11, соответственно; промотора EF1a человека; химерного белка состава Cas9-NLS-FLAG-P2A-PURO. Изобретение позволяет повысить цитотоксическую активность по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека. 8 ил., 6 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и генетической инженерии, в частности, к получению рекомбинантных клеточных линий, используемых в иммунотерапии аденокарциномы предстательной железы.
На сегодняшний день рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний среди мужчин. Согласно данным общемировой статистики рак простаты остается третьей по частоте причиной смерти от злокачественных опухолей мужчин старшего возраста. Ввиду отсутствия ярко выраженных симптомов и надежной диагностики на ранних этапах болезни, примерно 90% случаев рака предстательной железы выявляются уже на поздних (III-IV) стадиях заболевания, что приводит к летальному исходу более половины больных и продолжает оставаться серьезной проблемой во всем мире [1].
Характерной особенностью значительного числа случаев рака предстательной железы, является экспрессия раковыми клетками на своей поверхности белка PSMA [2]. Помимо раковых клеток, этот белок на невысоком уровне может экспрессироваться и нормальными клетками эпителия простаты [3,4], однако ткань предстательной железы не является критически важной для жизнедеятельности и по жизненным показаниям терапия, элиминирующая PSMA-позитивные клетки, может быть крайне эффективной для борьбы с метастазами при запущенных случаях рака поджелудочной железы.
Клеточные линии млекопитающих, в частности NK-клеточные линии с усиленным противоопухолевым потенциалом, являются ценным инструментом в области создания иммунотерапевтических и иммунобиологических препаратов [5].
Известны CAR-T клеточные линии, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы (CAR) (далее CAR-T-клетки), что позволяет перенаправить цитотоксическую активность Т-лимфоцитов против опухолевых клеток, несущих целевой поверхностный антиген. Данные линии получают путем доставки кассет, кодирующих CAR, в собственные Т-лимфоциты пациента, культивируемые ex vivo, с последующим введением их обратно в организм больного. Размножаясь в организме, CAR-T-клетки способны находить и направленно уничтожать опухолевые клетки, экспонирующие распознаваемый CAR антиген [6-9].
Геномное редактирование с использованием системы CRISPR/Cas9 является наиболее эффективным из существующих инструментов направленной модификации последовательностей ДНК в живых организмах и клеточных линиях. Успешное использование различных вариантов данной системы в контексте первичных и линейных NK-клеток человека было описано ранее [10-12].
Например, известна NK-клеточная линия человека NK-92, нокаутная по гену PRF1, полученная путем нуклеофекции плазмидных ДНК, кодирующих PRF1-специфические сгРНК и Cas9/Cas9n, в сочетании с донорной плазмидой, обеспечивающей устойчивость клеток с нокаутом по PRF1 к пуромицину [13]. Данная PRF1-негативная NK-клеточная линия служит удобной клеточной моделью семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза 2 человека, т.к. обладает обладает характерным для этого заболевания сниженным уровнем экспрессии PRF1. Однако компоненты CRISPR/Cas9 были доставлены в NK-клетки временно и терялись при последующем их делении. Недостатком клеточной линии NK-92 с нокаутом по PRF1 является невозможность ее использования в качестве иммунотерапевтического инструмента для лечения онкологических больных, поскольку она лишена экспрессии перфорина (PRF1), необходимого для цитолиза клеток-мишеней.
Известна также линия клеток CAR-YT, модифицированная с помощью генной инженерии, обладающая поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов (CAR), специфически распознающих раково-эмбриональный антиген (СБА). Данная клеточная линия содержит один или несколько рецепторов (состоящих из вариабельных областей, специфичных к опухоли или специфичных к клетке антител (одноцепочечных фрагментов scFv) и способна вызывать лизис клеток линий колоректального рака человека [14]. Однако известная линия клеток YT не обладает цитотоксической активностью по отношению к PSCA-позитивным раковым клеткам человека, - она проявляет цитотоксический эффект только в отношении клеток колоректального рака человека.
Наиболее близкой к заявляемой линии - прототипом, является NK-клеточная линия CAR-YT-Lact [15], обладающая поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов и секрецией противоопухолевого пептида лактаптина, в результате чего проявляет цитотоксическую активность по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека. Данная линия была получена путем трансдукции клеточной линии YT лентивирусными частицами, кодирующими PSMA-специфичый CAR и противоопухолевый пептид лактаптин.
Основным недостатком прототипа является недостаточная цитотоксическая активность известной линии, так как чувствительность таких клеток к негативным сигналам от опухолевых клеток-мишеней, предотвращающих их полное уничтожение.
Задачей настоящего изобретения является получение новой стабильной клеточной линии CYTO-CAR-YT-Lact, обладающей поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов к белку рака простаты PSMA и проявляющей цитотоксическую активность по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека, а также характеризующейся сниженным ингибирующим сигналингом и продукцией противоопухолевого белка - лактаптина.
Технический результат заявляемого изобретения: повышение цитотоксической активности клеточной линии CYTO-CAR-YT-Lact по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека.
Указанный технический результат достигается путем трансдукции клеточной линии YT лентивирусными частицами, предварительно наработанными с использованием кальций-фосфатной трансфекции клеточной линии HEK293T рекомбинантной лентивирусной плазмидой PSMA-CD8-CAR [16] и рекомбинантной лентивирусной плазмидой pEL1 [17-18], в структуре которых закодирован химерный антигенный рецептор против белка PSMA и кДНК белка RL2 (лактаптин (Lact)) [19], соответственно, что обеспечивает стабильную встройку последовательности CAR и лактаптина в геном клеток линии YT, тем самым обеспечив стабильную экспрессию данных молекул в полученных клетках. Дополнительно в указанных клетках происходит удаление последовательностей гена PTPN11, что снижает ингибирующий сигналлинг и повышает цитотоксичность в отношении опухолевых клеток.
Сущность заявляемого изобретения заключается в следующем.
На первом этапе на основе линии YT получают линию CAR-YT-Lact. Для этого проводят две последовательных трансдукции лентивирусными частицами, кодирующими химерный антигенный рецептор со специфичностью к PSMA и кДНК белка RL2 (лактаптина).
Сначала получают клеточную линию CAR-YT на основе клеточной линии YT путем ее трансдукции (заражения) лентивирусными частицами. Для получения лентивирусных частиц ДНК рекомбинантной лентивирусной плазмиды PSMA-CD8-CAR смешивают с ДНК вспомогательных плазмид pMD.2G и psPAX2, необходимых для упаковки лентивирусных частиц [20] в молярном соотношении 4:1:3 и трансформируют клетки эмбрионального почечного эпителия человека HEK293T методом кальций-фосфатной трансфекции, после чего выращивают 6 ч в среде IMDM с добавлением фетальной сыворотки коров до 10%, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяют на новую и инкубируют клетки 48 часов. После этого супернатанты кондиционированной среды фильтруют через 0.45 мкм PES-фильтры и используют для заражения клеточной линии YT методом спинокуляции в присутствии полибрена (8 мкг/мл). Полученные таким способом клетки экспрессируют на своей поверхности CAR, специфичные к белку PSMA, и обладают цитотоксической активностью в отношении PSMA-позитивных раковых клеток, в частности, клеток аденокарциномы простаты человека.
Затем, аналогичным образом, используя плазмиду pEL1, в указанные клетки интегрируют последовательность, кодирующую бицистронную кассету кДНК лактаптина - copGFP. При помощи анализа флуоресценции copGFP верифицируют факт интеграции целевой кассеты. Полученные таким способом клетки CAR-YT-Lact одновременно продуцируют белок лактаптин и экспрессируют CAR [21].
На втором этапе, для получения клеточной линии CYTO-CAR-YT-Lact проводят дизайн гРНК к последовательностям человеческого гена PTPN11, кодирующего негативный регулятор активности NK-клеток, белок SHP-2 [22]. Выбирают последовательности протоспейсеров состава: 5'-Gacagtactacaactcaagc-3' и 5'-gtgcagatcctacctctgaa-3', которые интегрируют в лентивирусный экспрессирующий вектор lentiCRISPR v2 [23] по сайтам рестрикции BsmBI, используя стандартные молекулярно-биологические методики [24]. Каждая из полученных таким образом рекомбинантных лентивирусных плазмид lentiCRISPRv2-Shp2g1 и lentiCRISPRv2-Shp2g2 кодирует два основных элемента системы CRISPR/Cas9, а именно 1) PTPN11-специфичную сгРНК, экспрессия которой находится под контролем промотора гена U6 мяРНК человека, и 2) химерный белок Cas9 Streptococcus pyogenes с сигналом ядерной локализации белка нуклеоплазмина и FLAG-эпитопом, соединенный в общей рамке считывания через "саморасщепляющийся" Р2А-пептид тешовируса свиней с белком пуромицин N-ацетилтрасферазы (РАС) стрептомицет, обеспечивающим устойчивость клеток к пуромицину. Экспрессия химерного белка находится под контролем конститутивного промотора гена EF1a.
Рекомбинантная лентивирусная плазмида lentiCRISPRv2-Shp2g1 имеет следующие характеристики:
- имеет размер 13012 п.о.;
- кодирует основные функционально-структурные элементы системы CRISPR/Cas9.
- состоит из следующих элементов:
промотор U6 мяРНК человека;
сгРНК к третьему экзону гена PTPN11;
промотор EF1a человека;
химерный белок состава Cas9-NLS-FLAG-P2A-PURO.
Графическая карта рекомбинантной лентивирусной плазмиды lentiCRISPRv2-Shp2g1 представлена на Фиг. 1, а ее нуклеотидная последовательность представлена на Фиг. 2.
Рекомбинантная лентивирусная плазмида lentiCRISPRv2-Shp2g2 идентична lentiCRISPRv2-Shp2g1 во всех элементах последовательности за исключением протоспейсера сгРНК и имеет следующие характеристики:
- имеет размер 13012 п.о.;
- кодирует основные функционально-структурные элементы системы CRISPR/Cas9.
- состоит из следующих элементов:
промотор U6 мяРНК человека;
сгРНК к пятому экзону гена PTPN11;
промотор EF1a человека;
химерный белок состава Cas9-NLS-FLAG-P2A-PURO.
Графическая карта рекомбинантной лентивирусной плазмиды lentiCRISPRv2-Shp2g2Ha представлена на Фиг. 3, а ее нуклеотидная последовательность представлена на Фиг. 4.
Для получения лентивирусных частиц ДНК рекомбинантных лентивирусных плазмид lentiCRISPRv2-Shp2g1 и lentiCRISPRv2-Shp2g2 смешивают с ДНК вспомогательных плазмид pMD2.G и psPAX2, необходимых для упаковки лентивирусных частиц в молярном соотношении 10:10:7.5:2.5 и трансфецируют клетки эмбрионального почечного эпителия человека HEK293T методом кальций-фосфатной трансфекции [25], после чего выращивают 6 ч в среде IMDM с добавлением фетальной сыворотки коров до 10%, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяют на новую и инкубируют клетки 48 часов. После этого супернатанты кондиционированной среды фильтруют через 0.45 мкм PES-фильтры и используют для заражения клеточной линии CAR-YT-Lact методом спинокуляции в присутствии полибрена (8 мкг/ мл) [26].
Полученные таким образом клетки селектируют на антибиотике пуромицин (1 мкг/мл) в течение 7 дней, после чего отбирают и выращивают моноклоны. Далее анализируют локус PTPN11 в монолокнах, для выбора нокаутных клеток. Для поиска моноклонов, в которых произошло нокаутирование гена PTPN11, используют праймеры SPH2F (5'-cacccagcctattatctgtctt-3') и SHP2R (5'-gatagttgaagctgcaatgggtac-3'), сайты отжига которых располагаются по обе стороны от целевой последовательности гРНК в пятом экзоне гена PTPN11. Геномную ДНК моноклонов выделяют согласно наборами "Биолабмикс" согласно протоколу производителя. Продукты ПЦР на матрице геномной ДНК моноклонов секвенируют по Сэнгеру (с набором реагентов BigDye согласно протоколу производителя) и выбирают моноклон, в геномной ДНК которого произошло мутирование обоих гомологов гена PTPN11. Конкретно в моноклоне С1 в одном из гомологов произошла делеция нуклеотида А в геномной позиции chr12: 112454671, в другом из гомологов произошла делеция 14 пар нуклеотидов (GTACTACAACTCAA), соответствующих геномному интервалу chr12: 112454663-112454676 (сборка генома человека GRCh38/hg38), что должно приводить к сбою рамки считывания и формированию укороченного и нефункционального белка SHP2.
Факт геномного нокаута подтверждают вестерн-блот анализом с антителами против белка SHP2 (продукт гена PTPN11). На вестерн-блоте сигнал, соответствующий подвижности SHP2, должен отсутствовать (Фиг. 5).
Далее верифицируют факт увеличения цитотоксической активности полученных CYTO-CAR-YT-Lact клеток при помощи RTCA или FACS анализа с клетками PC3-PSMA или Du145-PSMA в качестве мишени. CYTO-CAR-YT-Lact клетки обладают большим уровнем цитотоксической активности, чем CAR-YT-Lact клетки, если в качестве мишени используются линии клеток-мишеней, обладающих способностью индуцировать ингибирующие сигнальные каскады. В случае использования против таких линий CYTO-CAR-YT-Lact клетки в меньшей степени подвержены ингибирующему влиянию за счет геномного нокаута PTPN11.
Таким образом, клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact обладает повышенным цитотоксическим действием за счет трех механизмов. 1) химерный антигенный рецептор со специфичностью к PSMA индуцирует активирующий сигналлинг, приводящий к цитотоксическому воздействию на клетки-мишени; 2) нокаут по гену PTPN11 снижает ингибирующий сигналлинг, делая возможным использование таких клеток в отношении резистентных мишеней; 3) продукция белка лактаптина воздействует на клетки-мишени, в том числе на клетки-эскейперы, лишенные маркера PSMA, и, следовательно, неуязвимые для действия CAR-клеток.
Клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клеточная линия состоит из округлых клеток равной величины, растущих одиночно или образующих скопления. Клеточная линия суспензионная.
Культуральные признаки. Клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact культивируется на питательной среде IMDM, содержащей 4 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в атмосфере 5% CO2 при 37°С. В культуральные чашки диаметром 6 см в 5 мл среды засевают 1×106 клеток. Время субкультивирования составляет 2-3 суток, кратность рассева 1:5-1:6.
При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.
Криоконсервирование. Для длительного хранения культуру клеток криоконсервируют путем замораживания в жидком азоте. Размораживание клеток проводят при температуре 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания оценивают по включению трипанового синего и составляет не менее 90%.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1. Графическая карта (строение) рекомбинантной лентивирусной плазмиды lentiCRISPRv2-Shp2g1, кодирующей Cas9 и сгPHK1 против гена SHP2. Обозначения: EF1a - сильный конститутивный промотор человеческого гена EF1a, регулирующий экспрессию Cas9; hU6 promoter - РНК-полимераза III-зависимый промотор гена U6 мяРНК человека, Cas9 - кодирующая последовательность белка Cas9 S. pyogenes, puro - ген устойчивости к пуромицину; SHP2 guide1 - последовательность протоспейсера сгРНК, специфичной к третьему экзону гена SHP2 (PTPN11), sgRNA - сгPHK1.
Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность рекомбинантной лентивирусной плазмиды lentiCRISPRv2-Shp2g1, кодирующей Cas9 и сгPHK1 против гена SHP2.
Фиг. 3. Графическая карта рекомбинантной лентивирусной плазмиды lentiCRISPRv2-Shp2g, кодирующей Cas9 и сгPHК1 против гена SHP2. Обозначения: EF1a - сильный конститутивный промотор человеческого гена EF1a, регулирующий экспрессию Cas9; hU6 promoter - РНК-полимераза III-зависимый промотор гена U6 мяРНК человека, Cas9 - кодирующая последовательность белка Cas9 S. pyogenes, puro - ген устойчивости к пуромицину; SHP2 guide2 - последовательность протоспейсера сгРНК, специфичной к пятому экзону гена SHP2 (PTPN11), sgRNA - сгРНК2.
Фиг. 4. Нуклеотидная последовательность рекомбинантной лентивирусной плазмиды lentiCRISPRv2-Shp2g2, кодирующей Cas9 и сгРНК2 против гена SHP2.
Фиг. 5. Вестерн-блот анализ экспрессии белков SHP2 и β-актина в нокаутных линиях. Обозначения: WT - клеточная линия YT, 293Т-клеточная линия HEK293T, обе не несут нокаут гена SHP2; B1, С1, С3, С4 - экспериментальные клеточные линии YT с нокаутом SHP2; М - маркер молекулярного веса. Сверху - окрашивание антителами против белка SHP2 (72 kDa), снизу - антителами против белка β-актина (42 kDa).
Фиг. 6. Цитометрический анализ поверхностной экспрессии CAR (против белка PSMA) трансдуцированной линии YT после окраски Protein L (черная кривая). Отрицательный контроль - интактная линия YT (серая кривая).
Фиг. 7. Цитометрический анализ экспрессии copGFP (экспрессируется с бицистронной кассеты вместе с лактаптином) в трансдуцированной линии CYTO-CAR-YT-Lact (черная кривая). Отрицательный контроль - интактная линия YT (серая кривая).
Фиг. 8. Уровень цитотоксичности, проявляемый клеточной линией CYTO-CAR-YT-Lact при инкубации с клетками-мишенями Du145-PSMA. В качестве контроля использованы клетки YT дикого типа и CAR-YT-Lact клетки с интактным локусом PTPN11. Все показатели представлены в виде «среднее ± стандартное отклонение». Время коинкубации 8 часов.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют конкретные примеры их осуществления.
Пример 1. Трансдукции клеточной линии YT лентивирусными частицами, кодирующими CAR со специфичностью к PSMA и белок лактаптин.
Доставка ДНК-кассет, кодирующих CAR, в клетки линии YT осуществляется с помощью лентивирусных частиц, псевдотипированных поверхностным белком G вируса везикулярного стоматита (VSV), для наработки которых используются клетки линии HEK293T. Клетки линии HEK293T в чашке диаметром 5 см с конфлюэнтностью 60-70% трансфецируют препаратами плазмид при помощи кальций-фосфатной трансфекции. Для этого ДНК рекомбинантной плазмиды PSMA-CD8-CAR смешивают с ДНК вспомогательных плазмид psPAX2 (упаковочная плазмида, кодирующая GAG, POL и REV под контролем сильного конститутивного промотора CAG) и pMD2.G (упаковочная плазмида, кодирующая белок оболочки G вируса везикулярного стоматита) в молярном соотношении 4:3:1 (5 мкг плазмиды PSMA-CD8-CAR: 3,7 мкг psPAX2: 1,3 мкг pMD2.G). Полученную смесь смешивают с 31.2 мкл CaCl2 и добавляют воду до 250 мкл. После этого смесь постепенно добавляют к 250 мкл стерильного HBS (150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, рН 7,0), интенсивно перемешивая его на вортексе. Полученную таким образом суспензию комплексов фосфата кальция и ДНК плазмиды осторожно раскапывают по поверхности чашки с трансфецируемыми клетками HEK293T. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяют на новую и инкубируют клетки 48 часов. После этого супернатанты кондиционированных сред, полученные центрифугированием при 20000 g в течение 3 часов, фильтруют через 0.45 мкм PES-фильтры, чтобы избавиться от фрагментов клеток и агрегатов, и используют для трансдукции клеток линии YT методом спинокуляции. Для этого в лунки 96-луночного планшета вносят клетки линии YT в количестве 10000 клеток на лунку, после чего к ним добавляют препарат лентивируса в различном объеме: 25 и 75 мкл (с MOI равном 1), также в каждую лунку вносят полибрен (Sigma Aldrich) до финальной концентрации 8 мкг/мл. После этого клетки центрифугируют при 500 g в течение 40 минут, при 32°С, далее инкубируют при температуре 37°С и 5% атмосфере CO2. Через 24 часа после трансдукции среду в лунках планшета заменяют на новую.
Аналогичным образом проводят трансдукцию частицами, кодирующими белок лактаптин, за исключением того, что в качестве плазмиды, используемой для сборки вирусных частиц, используют плазмиду рЕL1 (вместо PSMA-CD8-CAR).
Пример 2. Проведение геномного редактирования линии CAR-YT-Lact и отбор клонов, нокаутных по гену PTPN11.
Доставка ДНК-кассет, кодирующих сгРНК и Cas9, в клетки линии CAR-YT-Lact осуществляется с помощью лентивирусных частиц, псевдотипированных поверхностным белком G вируса везикулярного стоматита (VSV), аналогично примеру 1, с тем отличием, что используют плазмиды lentiCRISPRv2-Shp2g1 и lentiCRISPRv2-Shp2g2 вместо PSMA-CD8-CAR. Через 48 часов после трансдукции проводят селекцию на антибиотике пуромицин в течение 7 дней. Обогащенные таким образом клетки подвергают моноклонированию посредством рассаживания по одной в отдельные лунки 96-луночного планшета. Таким образом, из индивидуальных клеток получают моноклональные дериваты линии YT.
Геномную ДНК нескольких моноклонов выделяют наборами "Биолабмикс" следуя протоколу производителя. Затем проводят ПНР с праймерами SPH2F (5'-cacccagcctattatctgtctt-3') и SHP2R (5'-gatagttgaagctgcaatgggtac-3'), а также с праймерами SHP1F (5'-acacttaggtaaaatccgacgtg-3') и SHP1R (5'-agccaccatagaaaactgctgcta-3'), сайты отжига которых располагаются по обе стороны от целевых последовательностей сгРНК в пятом экзоне и третьем экзонах гена PTPN11, соответственно. Продукты ПНР на матрице геномной ДНК моноклонов разделяют при помощи электрофореза в 1% агарозном геле, фрагменты ДНК выделяют из геля, секвенируют по Сэнгеру и выбирают моноклон, в геномной ДНК которого произошло мутирование обоих гомологов гена PTPN11, по крайней мере, в одном из экзонов.
Для дополнительной верификации геномного нокаута проводят вестерн-блот с антителами к SHP-2 (продукт гена PTPN11). В качестве первичных антител использовали моноклональные кроличьи антитела против SHP2 (каталожный №3397S, Cell Signaling Technology) и моноклональные антитела против белка β-актина (№ ab3280, Abcam), разведенные в пропорции 1:3000 в 3%-м растворе сухого молока в PBST. В качестве конъюгата использовали антитела коза-против-кролика и кролик-против-мыши, меченые пероксидазой хрена (RAM-HR, №а9044, Sigma-Aldrich), разведенные в пропорции 1:8300 в 3%-м растворе сухого молока в PBST. Детекцию хемилюминесценции проводили на приборе Amersham Imager 600 с экспозицией 1 мин. В результате подтверждается факт отсутствия белка SHP-2 (Фиг. 5). Таким образом получают линию CYTO-CAR-YT-Lact, нокаутную по гену PTPN11.
Пример 3. Анализ поверхностной экспрессии CAR в клетках линий CYTO-CAR-YT-Lact.
Детекцию поверхностной экспрессии CAR клеточной линии CYTO-CAR-YT-Lact осуществляют с помощью окраски клеток антителами против эпитопа с-myc, содержащегося в структуре CAR или с помощью ко-инкубации полученных клеток с биотинилированным Protein L, способным связывать каппа-цепи иммуноглобулинов. Для этого клетки в количестве ~ 100000 клеток переносят в цитометрическую пробирку, и осаждают центрифугированием при 500 g в течение 4 минут, после чего клетки отмывают от остатков культуральной среды в 2 мл PBS (рН 7,4: 1,7 мМ KH2PO4, 5,2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl), содержащего 1,5% FCS и 0,06% NaN3, с последующим центрифугированием. Затем клетки инкубируют с мышиными моноклональными антителами против c-myc (Abcam, клон 9Е10) или с Protein L-bio (GenScript, М00097) в концентрации 1 мкг/ мкл в течение 30 минут при 4°С. По окончании инкубации клетки дважды отмывают от первичных антител раствором PBS с 1,5% FCS и 0,06% NaN3 и инкубируют с флуоресцентно-мечеными конъюгатами вторичных антител. В качестве конъюгатов к антителам против с-myc используют ослиные антитела против IgG мыши, меченые РЕ (BioLegend), а в качестве конъюгатов к Protein L-bio, - стрептавидин-РЕ (Thermo Fisher Scientific). Используемые конъюгаты разводят в соотношении 1:800 в PBS с 1,5% FCS и 0,06% NaN3. Инкубацию проводят в течение 30 минут при 4°С, после чего дважды промывают образцы и для исключения из анализа мертвых клеток добавляют 1 мкг/ мкл 7AAD (Biolegend). Образцы анализируют с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II (Becton Dickinson and Company). Анализ полученных данных проводят с помощью программного обеспечения BD FACSDiva Software. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 6 и свидетельствуют о том, что в сравнении с интактными клетками линии YT, полученная клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact, обладает высоким уровнем поверхностной экспрессии CAR.
Пример 4. Верификация экспрессии белка лактаптина в клетках линий CYTO -CAR-YT-Lact.
Детекцию продукции белка лактаптина клеточной линией CYTO-CAR-YT-Lact проводят при помощи контроля флуоресценции зеленого флуоресцентного белка copGFP, который закодирован в бисицтронной кассете под одним промотором с лактаптином. Таким образом, факт экспрессии copGFP подтверждает продукцию белка лактаптина. Для этого клетки в количестве ~ 100000 клеток переносят в цитометрическую пробирку и осаждают центрифугированием при 500 g в течение 4 минут, после чего клетки отмывают от остатков культуральной среды в 2 мл PBS (рН 7,4: 1,7 мМ KH2PO4, 5,2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl), содержащего 1,5% FCS и 0,06% NaN3, с последующим центрифугированием. Затем образцы анализируют с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II (Becton Dickinson and Company). Анализ полученных данных проводят с помощью программного обеспечения BD FACSDiva Software. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 7 и свидетельствуют о том, что в сравнении с интактными клетками линии YT, полученная клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact обладает продукцией GFP и, следовательно, продуцирует белок актаптин.
Пример 5. Анализ цитотоксической активности клеток CYTO-CAR-YT-Lact.
Анализ цитотоксической активности проводят на платформе iCelligence, для этого суспензию клеток-мишеней Du145-PSMA с концентрацией 1×105 клеток/мл в теплой культуральной среде и вносят в лунки 8-луночного планшета для iCelligence по 500 мкл суспензии. Ведут запись изменения импеданса в течение суток. Через сутки отбирают супернатант и добавляют 500 мкл суспензии клеток-эффекторов CYTO-CAR-YT-Lact в концентрации 1×105 клеток/мл, также разведенных в теплой культуральной среде. Ведут запись изменения импеданса в течение суток. Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения xCELLigence RTCA Software. Результаты, представленные на Фиг. 8, свидетельствуют о повышенной цитотоксической активности по сравнению с клетками YT дикого типа и CAR-YT-Lact клетками.
Пример 6. Культивирование клеточной линии CYTO-CAR-YT-Lact
Клеточную линию CYTO-CAR-YT-Lact культивируют в питательной среде IMDM (Sigma), содержащей 4 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Клетки пересевают один раз в два дня или за сутки перед проведением трансдукции.
Для длительного хранения клетки криоконсервируют путем замораживания в жидком азоте. Для этого клетки ресуспендируют в среде для заморозки - питательная среда IMDM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки 10% и 10% ДМСО. Снижение температуры обеспечивается со скоростью 1°С в минуту до минус 70°С, затем проводится быстрое замораживание клеток в жидком азоте.
Размораживание клеток быстрое, при температуре 37°С, после чего клетки разводят в 5 мл культуральной среды и осаждают центрифугированием при 500 g. После чего клеточный осадок поднимают в 5 мл свежей культуральной среды и переносят в культуральную чашку диаметром 6 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет не менее 60%.
Полученная таким образом клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact представляет собой культуру клеток, которая может быть использована для адаптивного переноса пациентам, страдающим онкологическими заболеваниями, такими как рак предстательной железы, характеризующимися повышенным уровнем экспрессии белка PSMA.
Источники информации
1. Miller KD, Siegel RL, Lin CC, Mariotto AB, Kramer JL, Rowland JH, et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 2016; 66:271-89.
2. Bostwick DG, Pacelli A, Blute M, Roche P, Murphy GP. Prostate specific membrane antigen expression in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma: a study of 184 cases. Cancer. 1998; 82(11):2256-61.
3. Silver DA, Pellicer I, Fair WR, Heston WD, Cordon-Cardo C. Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues. Clin Cancer Res. 1997; 3(1):81-5.
4. Mhawech-Fauceglia P, Zhang S, Terracciano L, et al. Prostate-specific membrane antigen (PSMA) protein expression in normal and neoplastic tissues and its sensitivity and specificity in prostate adenocarcinoma: an immunohistochemical study using mutiple tumour tissue microarray technique. Histopathology. 2007; 50(4):472-483.
5. Yodoi J, Teshigawara K, Nikaido T, Fukui K, Noma T, et al. TCGF (IL 2)-receptor inducing factor(s). I. Regulation of IL 2 receptor on a natural killerlike cell line (YT cells). J. Immunol. 1985, 134(3): 1623-30.
6. Dotti G, Gottschalk S, Savoldo B, Brenner MK. Design and development of therapies using Chimeric Antigen receptor-expressing T cells. Immunol. Rev. 2014; 257(1); 580:6269-74.
7. Кулемзин CB, Кузнецова BB, Мамонкин M, Таранин AB, Горчаков AA. Основы дизайна химерных антигенных рецепторов. Acta Naturae. 2017; 9(1):6-15.
8. Savoldo В, Ramos CA, Liu E, Mims MP, Keating MJ, Carrum G, Kamble RT, Bollard CM, Gee AP, Mei Z, Liu H, Grilley B, Rooney CM, Heslop HE, Brenner MK, Dotti G. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 2011; 121:1822-6.
9. Beatty GL, O'Hara M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: Defining the challenges and next steps. Pharmacol. Ther. 2016; 166:30-9.
10. Kararoudi N, Dolatshad H, Trikha P, Hussain SA, Elmas E, Foltz JA, Moseman JE, Thakkar A, Nakkula RJ, Lamb M, Chakravarti N, McLaughlin KJ, Lee DA. Generation of knock-out primary and expanded human NK cells using Cas9 ribonucleoproteins. J. Vis Exp. 2018; 136.
11. Dong G, Li Y, Jiang B, Yee J-K,, Lee DA, McKeithan TW, Chan WC. Generation of Natural Killer cell lymphoma models in vitro by gene editing. Blood. 2016; 128:2724.
12. Rautela J, Surgenor E, Huntington N.D. Efficient genome editing of human natural killer cells by CRISPR RNP. bioRxiv. 2018.
13. Sevim H, Kocaefe YC, Onur MA, Uckan-Cetinkaya D, Bone marrow derived mesenchymal stem cells ameliorate inflammatory response in an in vitro model of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis 2. Stem Cell Research & Therapy. 2018; 9:198.
14. Патент ЕР 1383872 B1, опубл. 23.11.2005.
15. Беловежец T.H, Матвиенко Д.А, Волкова О.Ю, Коваль О.А, Ткаченко А.В, Кулигина Е.В, Таранин А.В, Рихтер В.А. Создание и анализ цитотоксической активности in vitro NK-клеточной линии человека с экспрессией PSMA-специфичного химерного антигенного рецептора и противоопухолевого агента лактаптина. Гены и Клетки. 2018; XIII(3):89-93.
16. Кулемзин С.В, Чикаев Н.А, Волкова О.Ю, Кузнецова В.В, Таранин А.В, Горчаков А.А. Модульная система лентивирусных векторов для работы с химерными антигенными рецепторами. Биоорганическая химия. 2017; 43(2): 124-32.
17. Semenov DV, Fomin AS, Kuligina EV, Koval OA, Matveeva VA, Babkina IN, Tikunova NV, Richter VA. Recombinant analogs of a novel milk pro-apoptotic peptide, lactaptin, and their effect on cultured human cells. Protein J. 2010; 29(3):174-80.
18. Патент RU 2401307 C1, опубл. 10.10.2010.
19. Коваль О.А, Волкова О.Ю, Горчаков А.А, Кулемзин С.В, Ткаченко А.В, Нуштаева А.А, Кулигина Е.В, Рихтер В.А, Таранин А.В. Сравнительный анализ активности лактаптина, полученного в про- и эукариотических системах экспрессии. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017; 21(7):764-9.
20. Salmon Р, Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 2006; 37(1):4.21.1-24.
21. Патент RU 2683221 C1, опубл. 26.03.2019.
22. Purdy, A. Campbell, K. SHP-2 expression negatively regulates NK cell function. The Journal of Immunology, 2009; 183(11):7234-43.
23. Sanjana N, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 2014; 11(8):783-4.
24. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular Cloning. 2012. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
25. Kutner R.H., Zhang X.-Y., Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 2009; 4(4):495-505.
26. O'Doherty U, Swiggard W, Malim M. Human Immunodeficiency Virus Type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J. Virol. 2000; 74(21): 10074-80.
--->
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)
<120> Рекомбинантная клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact, проявляющая повышенную цитотоксическую активность по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека
<160> 2
<210> 1
<211> 13012
<212> DNA
<400> 1
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta aggtaccgag ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg 2640
catatacgat acaaggctgt tagagagata attagaatta atttgactgt aaacacaaag 2700
atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta 2760
aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc 2820
ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacaccgtgc agatcctacc tctgaagttt 2880
tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 2940
ccgagtcggt gcttttttga attcgctagc taggtcttga aaggagtggg aattggctcc 3000
ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg 3060
gtcggcaatt gatccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc 3120
gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc 3180
gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggaccg gttctagagc 3240
gctgccacca tggacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc 3300
tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac 3360
accgaccggc acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa 3420
acagccgagg ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac 3480
cggatctgct atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc 3540
ttccacagac tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc 3600
atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac 3660
ctgagaaaga aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc 3720
ctggcccaca tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac 3780
aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag 3840
gaaaacccca tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc 3900
aagagcagac ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg 3960
ttcggaaacc tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac 4020
ctggccgagg atgccaaact gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac 4080
ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc 4140
gacgccatcc tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg 4200
agcgcctcta tgatcaagag atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct 4260
ctcgtgcggc agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac 4320
ggctacgccg gctacattga cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag 4380
cccatcctgg aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac 4440
ctgctgcgga agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga 4500
gagctgcacg ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg 4560
gaaaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg 4620
ggaaacagca gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac 4680
ttcgaggaag tggtggacaa gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac 4740
ttcgataaga acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac 4800
ttcaccgtgt ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc 4860
gccttcctga gcggcgagca gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg 4920
aaagtgaccg tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc 4980
gtggaaatct ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg 5040
ctgaaaatta tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa 5100
gatatcgtgc tgaccctgac actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa 5160
acctatgccc acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc 5220
ggctggggca ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag 5280
acaatcctgg atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc 5340
cacgacgaca gcctgacctt taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc 5400
gatagcctgc acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc 5460
ctgcagacag tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag 5520
aacatcgtga tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc 5580
cgcgagagaa tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa 5640
gaacaccccg tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag 5700
aatgggcggg atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat 5760
gtggaccata tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg 5820
accagaagcg acaagaaccg gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag 5880
aagatgaaga actactggcg gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc 5940
gacaatctga ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc 6000
aagagacagc tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc 6060
cggatgaaca ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc 6120
ctgaagtcca agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag 6180
atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg 6240
atcaaaaagt accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac 6300
gtgcggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc 6360
ttctacagca acatcatgaa ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc 6420
cggaagcggc ctctgatcga gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc 6480
cgggattttg ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag 6540
accgaggtgc agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat 6600
aagctgatcg ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc 6660
accgtggcct attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg 6720
aagagtgtga aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat 6780
cccatcgact ttctggaagc caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag 6840
ctgcctaagt actccctgtt cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc 6900
ggcgaactgc agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac 6960
ctggccagcc actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg 7020
tttgtggaac agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc 7080
aagagagtga tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac 7140
cgggataagc ccatcagaga gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat 7200
ctgggagccc ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc 7260
agcaccaaag aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag 7320
acacggatcg acctgtctca gctgggaggc gacaagcgac ctgccgccac aaagaaggct 7380
ggacaggcta agaagaagaa agattacaaa gacgatgacg ataagggatc cggcgcaaca 7440
aacttctctc tgctgaaaca agccggagat gtcgaagaga atcctggacc gaccgagtac 7500
aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc 7560
gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag 7620
cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg 7680
tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg 7740
ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc 7800
gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc 7860
ctggccaccg tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg 7920
ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg 7980
ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg 8040
cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc 8100
gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 8160
gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 8220
cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 8280
ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 8340
actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 8400
cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 8460
ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg 8520
ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 8580
ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 8640
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt 8700
taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg 8760
gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt 8820
ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 8880
ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 8940
actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg 9000
cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 9060
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 9120
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 9180
gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg 9240
gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac 9300
gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 9360
acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 9420
ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 9480
gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 9540
tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 9600
ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 9660
gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 9720
gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 9780
caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 9840
caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 9900
tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 9960
cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc 10020
tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg 10080
gagcttgtat atccattttc ggatctgatc agcacgtgtt gacaattaat catcggcata 10140
gtatatcggc atagtataat acgacaaggt gaggaactaa accatggcca agttgaccag 10200
tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg gtcgagttct ggaccgaccg 10260
gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc ggtgtggtcc gggacgacgt 10320
gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg gacaacaccc tggcctgggt 10380
gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt ccacgaactt 10440
ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag cagccgtggg ggcgggagtt 10500
cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg gccgaggagc aggactgaca 10560
cgtgctacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt 10620
tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc 10680
ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 10740
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 10800
tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc 10860
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 10920
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 10980
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 11040
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 11100
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 11160
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 11220
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 11280
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 11340
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 11400
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 11460
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 11520
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 11580
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 11640
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 11700
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 11760
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 11820
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 11880
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 11940
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 12000
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 12060
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 12120
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 12180
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 12240
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 12300
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 12360
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 12420
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 12480
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 12540
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 12600
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 12660
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 12720
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 12780
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 12840
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 12900
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 12960
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg ac 13012
<---
Фиг.2
--->
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)
<120> Рекомбинантная клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact, проявляющая повышенную цитотоксическую активность по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека
<160> 2
<210> 2
<211> 13012
<212> DNA
<400> 2
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta aggtaccgag ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg 2640
catatacgat acaaggctgt tagagagata attagaatta atttgactgt aaacacaaag 2700
atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta 2760
aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc 2820
ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacaccgaca gtactacaac tcaagcgttt 2880
tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 2940
ccgagtcggt gcttttttga attcgctagc taggtcttga aaggagtggg aattggctcc 3000
ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg 3060
gtcggcaatt gatccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc 3120
gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc 3180
gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggaccg gttctagagc 3240
gctgccacca tggacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc 3300
tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac 3360
accgaccggc acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa 3420
acagccgagg ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac 3480
cggatctgct atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc 3540
ttccacagac tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc 3600
atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac 3660
ctgagaaaga aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc 3720
ctggcccaca tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac 3780
aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag 3840
gaaaacccca tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc 3900
aagagcagac ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg 3960
ttcggaaacc tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac 4020
ctggccgagg atgccaaact gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac 4080
ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc 4140
gacgccatcc tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg 4200
agcgcctcta tgatcaagag atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct 4260
ctcgtgcggc agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac 4320
ggctacgccg gctacattga cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag 4380
cccatcctgg aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac 4440
ctgctgcgga agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga 4500
gagctgcacg ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg 4560
gaaaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg 4620
ggaaacagca gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac 4680
ttcgaggaag tggtggacaa gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac 4740
ttcgataaga acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac 4800
ttcaccgtgt ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc 4860
gccttcctga gcggcgagca gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg 4920
aaagtgaccg tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc 4980
gtggaaatct ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg 5040
ctgaaaatta tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa 5100
gatatcgtgc tgaccctgac actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa 5160
acctatgccc acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc 5220
ggctggggca ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag 5280
acaatcctgg atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc 5340
cacgacgaca gcctgacctt taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc 5400
gatagcctgc acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc 5460
ctgcagacag tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag 5520
aacatcgtga tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc 5580
cgcgagagaa tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa 5640
gaacaccccg tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag 5700
aatgggcggg atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat 5760
gtggaccata tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg 5820
accagaagcg acaagaaccg gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag 5880
aagatgaaga actactggcg gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc 5940
gacaatctga ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc 6000
aagagacagc tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc 6060
cggatgaaca ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc 6120
ctgaagtcca agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag 6180
atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg 6240
atcaaaaagt accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac 6300
gtgcggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc 6360
ttctacagca acatcatgaa ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc 6420
cggaagcggc ctctgatcga gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc 6480
cgggattttg ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag 6540
accgaggtgc agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat 6600
aagctgatcg ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc 6660
accgtggcct attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg 6720
aagagtgtga aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat 6780
cccatcgact ttctggaagc caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag 6840
ctgcctaagt actccctgtt cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc 6900
ggcgaactgc agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac 6960
ctggccagcc actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg 7020
tttgtggaac agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc 7080
aagagagtga tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac 7140
cgggataagc ccatcagaga gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat 7200
ctgggagccc ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc 7260
agcaccaaag aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag 7320
acacggatcg acctgtctca gctgggaggc gacaagcgac ctgccgccac aaagaaggct 7380
ggacaggcta agaagaagaa agattacaaa gacgatgacg ataagggatc cggcgcaaca 7440
aacttctctc tgctgaaaca agccggagat gtcgaagaga atcctggacc gaccgagtac 7500
aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc 7560
gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag 7620
cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg 7680
tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg 7740
ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc 7800
gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc 7860
ctggccaccg tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg 7920
ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg 7980
ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg 8040
cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc 8100
gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 8160
gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 8220
cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 8280
ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 8340
actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 8400
cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 8460
ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg 8520
ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 8580
ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 8640
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt 8700
taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg 8760
gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt 8820
ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 8880
ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 8940
actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg 9000
cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 9060
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 9120
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 9180
gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg 9240
gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac 9300
gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 9360
acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 9420
ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 9480
gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 9540
tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 9600
ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 9660
gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 9720
gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 9780
caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 9840
caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 9900
tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 9960
cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc 10020
tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg 10080
gagcttgtat atccattttc ggatctgatc agcacgtgtt gacaattaat catcggcata 10140
gtatatcggc atagtataat acgacaaggt gaggaactaa accatggcca agttgaccag 10200
tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg gtcgagttct ggaccgaccg 10260
gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc ggtgtggtcc gggacgacgt 10320
gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg gacaacaccc tggcctgggt 10380
gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt ccacgaactt 10440
ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag cagccgtggg ggcgggagtt 10500
cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg gccgaggagc aggactgaca 10560
cgtgctacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt 10620
tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc 10680
ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 10740
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 10800
tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc 10860
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 10920
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 10980
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 11040
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 11100
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 11160
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 11220
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 11280
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 11340
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 11400
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 11460
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 11520
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 11580
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 11640
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 11700
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 11760
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 11820
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 11880
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 11940
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 12000
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 12060
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 12120
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 12180
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 12240
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 12300
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 12360
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 12420
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 12480
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 12540
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 12600
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 12660
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 12720
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 12780
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 12840
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 12900
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 12960
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg ac 13012
<---
Фиг.4
Рекомбинантная клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact, проявляющая повышенную цитотоксическую активность по отношению к PSMA-позитивным раковым клеткам человека, полученная в два этапа, сначала путем трансдукции клеточной линии YT лентивирусными частицами, кодирующими химерный антигенный рецептор против белка PSMA и рекомбинантный пептид лактаптин, а затем, на втором этапе, трансдукцией полученной линии CAR-YT-Lact лентивирусными частицами, предварительно наработанными с использованием рекомбинантных лентивирусных плазмид lentiCRISPRv2-Shp2g1 и lentiCRISPRv2-Shp2g2, характеризующимися в соответствии с физическими картами, представленными на фиг. 1 и фиг. 3, следующими признаками: имеют размер 13012 п.о., кодируют основные функционально-структурные элементы системы CRISPR/Cas9 и состоят из следующих элементов: промотора U6 мяРНК человека; сгРНК к третьему и пятому экзонам гена PTPN11, соответственно; промотора EF1a человека; химерного белка состава Cas9-NLS-FLAG-P2A-PURO.
