Способ трансплантации фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку иммунодефицитных мышей

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии. Вводят наркоз иммунодефицитным мышам. Послойно рассекают кожу и ткани брюшной стенки. При этом рассечение брюшной стенки производят вдоль средней линии тела, начало разреза расположено на расстоянии 20 мм от конца мечевидного отростка, конец разреза находится на расстоянии 5 мм от уретры. Слепую кишку выводят в операционную рану. На расстоянии 5 мм от крайней точки концевой части слепой кишки накладывают кисетный серозно-мышечный шов, не затягивая нитей. В концевой части слепой кишки рассекают серозно-мышечный слой длиной 3 мм. Производят инвагинацию концевой части слепой кишки, формируя таким образом карман, в который погружают фрагмент опухоли толстой кишки человека объемом 27 мм³. Затягивают лигатуру. Погружают слепую кишку в брюшную полость. Послойно ушивают стенку брюшной полости. Способ позволяет получить ортотопическую пациентоподобную модель рака толстого кишечника, наиболее адекватно отражающую особенности колоректального рака человека и представляющую собой ценный инструмент для проведения доклинических исследований различных способов лечения рака толстой кишки, в том числе для исследований эффективности новых фармакологических субстанций, а также обеспечивает высокий потенциал приживления опухолевого материала. 6 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа трансплантации фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку иммунодефицитных мышей для получения ортотопической пациентоподобной модели, имеющей наиболее приближенные к человеческому организму молекулярно-биохимические и гистологические характеристики.

Рак толстой кишки по распространенности занимает лидирующие позиции среди всех онкозаболеваний (см. Егоренков В.В., Моисеенко Ф.В. Скрининг рака толстой кишки // Практическая онкология. - 2010. - Т. 11. - №2. - С. 81-87). На долю колоректального рака приходится 15% от всех первично диагностированных опухолей всех локализаций (см. Денисенко В.Л., Гаин Ю.М. Осложнения колоректального рака: проблемы и перспективы // Новости хирургии. - 2011. - Т. 19. - №1. - С. 103-111). В мире ежегодно регистрируется около 800 тысяч новых случаев рака толстой кишки. При этом пятилетняя выживаемость составляет 60% в развитых странах и около 40% в развивающихся государствах (см. Имянитов Е.Н. Клинико-молекулярные аспекты колоректального рака: этиопатогенез, профилактика, индивидуализация лечения // Практическая онкология. - 2005. - Т. 6. - №2. - С. 65-70; Земляной В.П., Трофимова Т.Н., Непомнящая С.Л., Дементьева Т.В. Современные методы диагностики и оценки степени распространенности рака ободочной и прямой кишки // Практическая онкология. - 2005. - Т. 6. - №2. - С. 71-80). В настоящее время отмечается мировая тенденция к увеличению заболеваемости и смертности от колоректального рака. При этом на 100 вновь выявленных больных данным заболеванием приходится более 70 умерших. Одной из причин данного факта является выявление заболевания на поздних стадиях (III-IV стадии) в большинстве случаев (около 70%). В связи с чем ранняя диагностика колоректального рака не может на сегодняшний день считаться удовлетворительной (см. Егоренков В.В., Моисеенко Ф.В. Скрининг рака толстой кишки // Практическая онкология. - 2010. - Т. 11. - №2. - С. 81-87; Денисенко В.Л., Гаин Ю.М. Осложнения колоректального рака: проблемы и перспективы // Новости хирургии. - 2011. - Т. 19. - №1. - С. 103-111). Главными задачами современной медицины применительно к раку толстой кишки являются решение проблемы ранней диагностики и скрининга данного заболевания, а также создание более эффективных способов лечения.

Однако следует отметить, что в последние годы средняя продолжительность жизни больных колоректальным раком была увеличена с 4-6 месяцев при симптоматической терапии до 20-24 месяцев - при проведении химиотерапии с использованием таргтных препаратов (см. Федянин М.Ю., Трякин А.А., Тюляндин С.А. Химиотерапия больных метастатическим раком толстой кишки // Онкологическая колопроктология. - 2012. - №2. - С. 26-34). Данная тенденция дает основание считать актуальным вопрос о разработке новых химиотерапевтических препаратов. При проведении доклинических исследований химических субстанций, обладающих потенциальным противоопухолевым эффектом, используются различные модели опухолевого процесса. С целью получения более объективных данных об испытуемом объекте стремятся разработать модели, наиболее адекватно отражающие реальное развитие опухоли в человеческом организме. В настоящее время такими моделями являются ортотопические пациентоподобные модели, характеризующиеся клеточным составом имплантируемой опухоли и ее клеточным микроокружением, схожими с таковыми у пациентов (см. Yu Wang, Jiujie Cui, Liwei Wang. Patient-derived xenografts: a valuable platform for clinical and preclinical research in pancreatic cancer // Chin Clin Oncol. - 2019. - №8(2): 17. P. 1-11; Холоденко И.В., Доронин И.И., Холоденко P.B. Опухолевые модели в изучении онкологических заболеваний // Иммунология. - 2013. - №5. - С. 282-286).

Известен способ создания подкожной пациентоподобной модели рака толстой кишки, при котором фрагменты опухоли трансплантировали подкожно в бок иммунодефицитных мышей (см. Mitsunobu Takeda, Jun Koseki, Hidekazu Takahashi et al. Disruption of Endolysosomal RAB5/7 Efficiently Eliminates Colorectal Cancer Stem Cells // Cancer Res. - 2019. - 79(7). - P. 1426-1437; Magdalena Cybulska, Tomasz Olesinski, Krzysztof Goryca et al. Challenges in Stratifying the Molecular Variability of Patient-Derived Colon Tumor Xenografts // BioMed Research International. - 2018. - P. 1-9; Ruidi Teng, Jingjing Zhao, Yiding Zhao et al. Chimeric Antigen Receptor-modified T Cells Repressed Solid Tumors and Their Relapse in an Established Patient-derived Colon Carcinoma Xenograft Model // J Immunother. - 2019. №2. - P. 33-42). Недостатком данного способа является имплантация опухолевого материала в сайт с чужеродным микроокружением, при влиянии которого выявляются некоторые характеристики, не соответствующие реальной картине онкогенеза.

Известен способ ортотопической трансплантации опухоли толстой кишки, при котором опухолевый материал от пациента суспендировали на клетки в соотношении 1×10⁶ клеток в 50 мл PBS, вводили в стенку слепой кишки иммунодефицитных мышей (см. Isabel Puig, Irene Chicote, Stephan P. Tenbaum et al. A Personalized Preclinical Model to Evaluate the Metastatic Potential of Patient-Derived Colon Cancer Initiating Cells // Clinical Cancer Research. - October 29. - 2013. - P. 6787-6801). Преимуществом этого способа является ортотопический сайт трансплантации опухоли. Однако существуют литературные данные о том, что суспендированный трансплантант имеет низкую скорость развития, а также более низкий потенциал метастазирования по сравнению с несуспендированными трансплантантами (см. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши Balb/c Nude и моделирование различных вариантов опухолевого роста для доклинических исследований // Российский биотерапевтический журнал. - 2017. - Т. 16. - №16. - С. 6-13).

Известен способ трансплантации рака толстой кишки иммунодефицитным мышам, при котором фрагменты опухоли от пациента имплантировали в бок под кожу животного. А по достижении ксенотрансплантанта определенных размеров, его резецировали из тела мыши-донора, очищали от некротических участков, разрезали на мелкие фрагменты, каждый из которых подшивали при помощи 8-0 нейлонового шовного материала к брыжейке слепой кишки, предварительно выведенной в операционную рану. После этого слепая кишка возвращалась в брюшную полость, операционную рану зашивали в 2 слоя (см. Yukihiko Hiroshima, Ali Maawy, Cristina A. Metildi et al. Successful Fluorescence-Guided Surgery on Human Colon Cancer Patient-Derived Orthotopic Xenograft Mouse Models Using a Fluorophore-Conjugated Anti-CEA Antibody and a Portable Imaging System // J. of Laparoendoscopic &Advanced Surgical Techniques. - 2014. - №4. - P. 241-247; Cristina A. Metildi, Sharmeela Kaushal, George A. Luiken et al. Fluorescently-labeled chimeric anti-CEA antibody improves detection and resection of human colon cancer in an orthotopic nude mouse model // J Surg Oncol. - 2014. - 109(5). - P. 451-458). Бесспорным преимуществом данного способа является ортотопическая фрагментарная трансплантация опухолевого материала, позволяющая получить наиболее адекватную модель колоректального рака. Недостатком данного способа является то, что он предполагает минимальный контакт только с наружной стенкой слепой кишки небольшой площади, не затрагивая мышечный и подслизистый слои, благодаря чему развитие опухоли будет проходить медленно, а влияние ортотопического микроокружения будет минимальным.

Известен способ ортотопической трансплантации фрагментов опухоли толстой кишки, при котором кишечник выводится в операционную рану, в месте имплантации удаляют серозный слой и подшивают хирургический материал gelfoam (Upjohn), кишечник помещают обратно в брюшную полость, которую ушивают послойно. Через 20 дней проводят имплантацию опухолевого материала в образованный при помощи хирургического материала gelfoam (Upjohn) карман в слепой кишке (см. Xinyu Fu, Jeffrey М. Besterman, Ann Monosov et al. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens // Proc. Nati. Acad. Sci. - 1991. - P. 9345-9349). Преимуществом данного метода является ортотопическая имплантация фрагмента, соприкасающегося не только с наружной серозной стенкой кишечника, но и с подлежащими слоями. Также использование данной техники трансплантации позволяет вызвать индукцию сосудистого роста в опухоли и перитуморальной области. Существенным недостатком данного способа является большая трудоемкость всех процедур. Проведение подряд двух оперативных вмешательств в брюшной полости с интервалом 20 дней может тяжело переносится мышами и оказывать негативное влияние на послеоперационное состояние животных.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа трансплантации фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку иммунодефицитных мышей, обеспечивающего высокий потенциал приживления опухолевого материала благодаря помещению фрагмента в формируемый в слепой кишке карман и обилию в районе трансплантации лимфоидной ткани, и позволяющего получить ортотопическую пациентоподобную модель рака толстого кишечника, являющуюся наиболее адекватным отражением особенностей данного заболевания у человека.

Технический результат изобретения достигается тем, что осуществляют трансплантацию фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку иммунодефицитных мышей, включающий наркоз иммунодефицитных мышей, послойное рассечение кожи и тканей брюшной стенки, отличающийся тем, что рассечение брюшной стенки производят вдоль средней линии тела, начало разреза расположено на расстоянии 20 мм от конца мечевидного отростка, конец разреза находится на расстоянии 5 мм от уретры, слепую кишку выводят в операционную рану, на расстоянии 5 мм от крайней точки концевой части слепой кишки накладывают кисетный серозно-мышечный шов, не затягивая нитей, в концевой части слепой кишки рассекают серозно-мышечный слой длиной 3 мм, производят инвагинацию концевой части слепой кишки, формируя таким образом карман, в который погружают фрагмент опухоли толстой кишки человека объемом 27 мм³, затягивают лигатуру, погружают слепую кишку в брюшную полость, послойно ушивают стенку брюшной полости.

Способ осуществляют следующим образом.

Фрагмент рака толстой кишки после иссечения незамедлительно помещается в среду Хенкса. Непосредственно перед трансплантацией вырезают кусочки объемом 27 мм³. Время от момента резекции опухолевого материала у человека до имплантации в слепую кишку иммунодефицитной мыши не должно превышать 20 минут.

Реципиентом опухолевого материала служат иммунодефицитные мыши Balb/c Nude.

Наркоз животных осуществляют с использованием ксилазина концентрацией 20 мг/мл и золетила концентрацией 22,57 мг/мл.

Брюхо животного обрабатывают 10% раствором повидон-йода.

Для обеспечения оптимального доступа к слепой кишке иммунодефицитной мыши производят послойное рассечение кожи и тканей брюшной стенки вдоль средней линии тела. Разрез начинается на расстоянии 20 мм от конца мечевидного отростка, заканчивается на расстоянии 5 мм от уретры.

Для удобства проведения трансплантации слепую кишку выводят в операционную рану. На расстоянии 5 мм от крайней точки концевой части слепой кишки накладывают кисетный серозно-мышечный шов с использованием шовного материала пролен 5-0. Лигатуру при этом не затягивают. В концевой части слепой кишки рассекают серозно-мышечный слой длиной 3 мм, производят инвагинацию концевой части слепой кишки, формируя таким образом карман, в который погружают фрагмент опухоли толстой кишки человека. Затягивают лигатуру. Слепую кишку погружают в брюшную полость, после чего послойно ушивают стенку брюшной полости. Изобретение иллюстрируется фигурами (1-6).

На Фиг. 1. изображено наложение кисетного серозно-мышечного шва в концевой части слепой кишки иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.

На Фиг. 2. изображено рассечение серозно-мышечного слоя в концевой части слепой кишки иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.

На Фиг. 3. изображена инвагинация концевой части слепой кишки иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.

На Фиг. 4. изображена имплантация фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.

На Фиг. 5. изображена затяжка кисетного шва на слепой кишке иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.

На Фиг. 6. изображено ушитие операционной раны иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.

Данным способом произведена трансплантация фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку 32 иммунодефицитных мышей Balb/c Nude.

Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что он позволяет получить ортотопическую пациентоподобную модель рака толстого кишечника, наиболее адекватно отражающую особенности колоректального рака человека и представляющую собой ценный инструмент для проведения доклинических исследований различных способов лечения рака толстой кишки, в том числе для исследований эффективности новых фармакологических субстанций.

Пример.

Данным способом был прооперирован самец иммунодефицитной мыши Balb/c Nude возрастом 7 недель массой 26 г. В качестве трансплантируемого материала служил фрагмент опухоли толстой кишки человека объемом 27 мм³, который сразу же после выделения из организма человека был помещен в среду Хенкса. Интервал между выделением опухолевого материала из донорского организма до его имплантации в тело животного составил 18 минут.

Премедикацию осуществляли при помощи ксилазина концентрацией 20 мг/мл. В качестве основного наркотизирующего вещества использовали золетила концентрацией 22,57 мг/мл.

Брюхо мыши обработали 10% раствором повидон-йода. Далее послойно рассекли кожу и ткани брюшной стенки вдоль средней линии тела. Начало разреза находилось на расстоянии 20 мм от конца мечевидного отростка, конец разреза - на расстоянии 5 мм от уретры. В операционную рану вывели слепую кишку. От крайней точки концевой части слепой кишки наложили кисетный серозно-мышечный шов при помощи пролена 5-0. Не затягивая лигатуру, в концевой части слепой кишки рассекли серозно-мышечный слой длиной 3 мм, инвагинировали концевую часть слепой кишки, сформировав при этом карман. В образованный карман в слепой кишке погрузили фрагмент опухоли толстой кишки человека. Затянули лигатуру. Слепую кишку погрузили в брюшную полость, после чего послойно ушили стенку брюшной полости.

Мышь благополучно перенесла операцию, без осложнений.

Способ трансплантации фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку иммунодефицитных мышей, включающий наркоз иммунодефицитных мышей, послойное рассечение кожи и тканей брюшной стенки, отличающийся тем, что рассечение брюшной стенки производят вдоль средней линии тела, начало разреза расположено на расстоянии 20 мм от конца мечевидного отростка, конец разреза находится на расстоянии 5 мм от уретры, слепую кишку выводят в операционную рану, на расстоянии 5 мм от крайней точки концевой части слепой кишки накладывают кисетный серозно-мышечный шов, не затягивая нитей, в концевой части слепой кишки рассекают серозно-мышечный слой длиной 3 мм, производят инвагинацию концевой части слепой кишки, формируя таким образом карман, в который погружают фрагмент опухоли толстой кишки человека объемом 27 мм³, затягивают лигатуру, погружают слепую кишку в брюшную полость, послойно ушивают стенку брюшной полости.