Рекомбинантная плазмидная днк pf267, кодирующая гибридный полипептид, содержащий проинсулин лизпро, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин лизпро

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного проинсулина лизпро человека. Рекомбинантный проинсулин получают в составе гибридного полипептида, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро человека, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А. Для этого используют рекомбинантную плазмидную ДНК pF267 и штамм-продуцент Escherichia coli BL21/pF267. Изобретение обеспечивает синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 4,5% от сырого веса клеточной биомассы, позволяет увеличить долю инсулина в гибридном белке до 49,5% и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг0-А-лизпро. 3 н.п. ф-лы, 5 пр., 7 ил.

 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Изобретение предлагает рекомбинантную плазмидную ДНК для получения рекомбинантного инсулина лизпро и может быть использовано для приготовления лекарственных препаратов, в частности, инсулинов и их аналогов для лечения сахарного диабета.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к биотехнологии. Данное изобретение может быть использовано для получения рекомбинантного проинсулина лизпро, имеющего в своем составе цепь B, С- пептид и цепь А. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая гибридный tac-промотор, терминатор рибосомного оперона Е. coli, искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящий из короткой лидерной последовательности фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, пептидного линкера GlyHis6GlySerArg, сайта протеолиза «Арг», цепи B, сайта протеолиза «Арг Арг», С-пептида, сайта протеолиза «Арг» и цепи А.

Также предложен штамм Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина лизпро, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению, и гибридный полипептид, состоящий из короткой лидерной последовательности фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, пептидного линкера GlyHis6GlySerArg, сайта протеолиза «Арг», цепи B, сайта протеолиза «Арг Арг», С-пептида, сайта протеолиза «Арг» и цепи А. При этом, биосинтез гибридного полипептида индуцируется изопропилтиогалактопиранозидом, уровень его биосинтеза составляет не ниже 4,5% от массы влажного осадка клеточной биомассы.

Настоящее изобретение позволяет получать гибридный полипептид с высокой долей инсулина лизпро (до 49,5%) и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг₀-А-лизпро. Изобретение направлено на получение высокопродуктивного бактериального штамма - продуцента инсулинового аналога лизпро, использование которого может значительно удешевить процесс производства аналога инсулина - инсулина лизпро.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время сахарный диабет представляет собой серьезнейшую медицинскую и социально-экономическую проблему во всем мире. Число больных сахарным диабетом 1 типа постоянно растет, и эффективная заместительная инсулинотерапия как основной способ терапии инсулинозависимого сахарного диабета, имеет, в связи с этим, особое значение (1). Экономические потери, связанные с диабетом составляют в России около 3,12 млрд. долларов США в год. К 2030 году эта сумма может увеличиться до 3,35 млрд. (2).

Эффективная заместительная инсулинотерапия, как основной способ терапии инсулинозависимого сахарного диабета, имеет, в связи с этим, особое значение. Природные и рекомбинантные инсулины уже не способны в полной мере удовлетворить потребности клиницистов и пациентов. Современная медицина требует применения более совершенных противодиабетических препаратов, таких как генно-инженерные аналоги человеческого инсулина.

Инсулин Лизпро - это первый разработанный и произведенный аналог инсулина. Молекулярная структура инсулина лизпро идентична таковой человеческого инсулина за исключением позиций 28 и 29 бета-цепи молекулы, где лизин и пролин расположены в обратном порядке (Фиг. 1).

По сравнению с Лизпро рекомбинантный инсулин имеет два главных недостатка - относительно медленное начало действия (обычно требуется инъекция за 30-40 минут до приема пищи), и увеличенная продолжительность действия, в связи с чем, существует риск развития гиперинсулинемии. Естественный и рекомбинантный инсулины не способны нормализовать пики глюкозы крови после принятия пищи без риска гипогликемии (3).

По сравнению с рекомбинантным инсулином, Лизпро демонстрирует профиль глюкозы в крови, значительно более близкий к физиологическому профилю (4). Обратное расположение лизина и пролина позволяет молекуле Лизпро диссоциировать в два раза быстрее. В результате переход в активную форму происходит в два раза быстрее, чем сходный процесс у рекомбинантных инсулинов. При подкожном введении физиологический эффект Лизпро возникает уже через 10-15 минут после инъекции. Те же самые особенности молекулы Лизпро ведут к ускорению достижения пика активности препарата, который возникает приблизительно через 1,5 часа после инъекции, в то время как у обычных инсулинов это время составляет 3-4 часа. Продолжительность действия инсулина Лизпро составляет 3-4 часа (6-8 часов в случае обычного инсулина). В результате кривая активности инсулина Лизпро оказывается практически идентичной кривой активности эндогенного инсулина, поступающего в кровоток после приема пищи. Благодаря этому у пациентов снижается как частота развития осложнений самого сахарного диабета, так и риск развития такого осложнения инсулинотерапии как гипогликемия, которая наблюдается при использовании инсулина Лизпро на 30% реже по сравнению с рекомбинантными инсулинами (4).

В связи с этим разработка и внедрение современных методов терапии сахарного диабета является одним из наиболее приоритетных направлений медицины и фармацевтической промышленности.

В настоящее время наиболее перспективной является технология получения инсулина и инсулиновых аналогов с использованием методов экспрессии гена проинсулина человека в клетках Escherichia coli в составе гибридных белков в виде нерастворимых "телец включения" (5). Структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида), экспрессируемого в известных штаммах-продуцентах инсулина человека, представляет собой лидерный пептид, сайт протеолиза «Арг» или «Лиз» или «Лиз Арг», цепь B, сайт протеолиза «Арг Арг», С-пептид, сайт протеолиза «Лиз Арг», цепь А (Фиг. 2).

Необходимость включать лидерные пептиды в состав гибридного полипетипда связана с низкой стабильностью проинсулина в клетках Escherichia coli, время полужизни которого составляет 2 минуты (4). В качестве лидерных последовательностей, защищающих проинсулин от протеолитической деградации, используют глутатион-трансферазу (6), иммуноглобулин IgG, связывающий домен белка А из S.aureus (7), интерлейкин-2 (8) и др.

Технологические схемы получения инсулина лизпро и инсулина человека идентичны и характеризуются следующими этапами: наращивание биомассы клеток штамма-продуцента, выделение телец включения, денатурация гибридного полипептида, ренатурация гибридного полипептида. Следующим этапом технологического процесса является ферментативный гидролиз гибридного полипептида с использованием смеси двух ферментов: трипсина и карбоксипептидазы B. Под действием трипсина осуществляется гидролиз пептидной связи гибридного полипептида преимущественно после аргинина, под действием карбоксипептидазы B происходит отщепление положительно заряженные аминокислоты с C-конца инсулина или его аналога (лизин и аргинин). В результате совместного гидролиза трипсином и карбоксипептидазой B образуется нативный инсулин или инсулиновый аналог лизпро.

Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому изобретению являются рекомбинантные плазмиды ДНК pPINS07 (9), pLP-3.1 (10), pHINS11 (11) и pHILP07 (12), обеспечивающие синтез гибридных полипептидов, имеющих в своем составе IgG-связывающий домен стафилококкового белка А (pPINS07, pLP-3.1) и N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (pHINS11).

Патент РФ №2144957 описывает штамм E.coli JM109/pPINS07, обеспечивающий синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 25-30%. Рекомбинатная плазмидная ДНК pPINS07 детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором единственный IgG-связывающий домен стафилококкового белка А соединен через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека. Преимущества предложенного конструкта заключаются в высоком уровне экспрессии гибридного полипептида и в его эффективной ренатурации (рефолдинге) и, как следствие, высоком выходе правильно свернутого полипептида. Рекомбинантная плазмидная ДНК pLP-3.1, полученная методом сайт-направленного мутагенеза плазмиды pPINS07, экспрессирует гибридный белок, в котором единственный IgG-связывающий домен стафилококкового белка А соединен через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро (10).

Существенным недостатком рекомбинантных плазмид pPINS07 и pLP-3.1 является то, что они кодируют белок с низкой долей инсулина и инсулина лизпро, соответственно, составляющего около 33%.

Патент РФ №2354702 описывает рекомбинантную плазмидную ДНК pHINS11 и штамм E.coli JM109/ pHINS11. Данная рекомбинантная плазмидная ДНК детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека и обеспечивает его высокую экспрессию. Использование этих конструкций в технологическом процессе позволяет получать высокоочищенный инсулин человека с чистотой не ниже 98% и активностью не менее 27,5 МЕ/мг. Для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза гибридного полипептида и более высокая доля инсулина в гибридном полипептиде (до 38%) по сравнению с рекомбинантной плазмидной ДНК pPINS07 (до 33%), при этом стадия ренатурации продуцируемого гибридного полипептида является недостаточно эффективной (11).

Описана также рекомбинантная плазмидная ДНК pHILP07, полученная методом сайт-направленного мутагенеза плазмиды pHINS11, с экспрессией гибридного полипептида, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро (12).

Общим недостатком гибридных полипептидов в описанных патентах является сайт протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью, допускающий образование близкородственной примеси Арг0-А-лизпро.

В целом же, к недостаткам использованных ранее генетических конструкций для экспрессии гибридного полипептида относятся:

1. Низкий выход конечного продукта - инсулина лизпро или самого инсулина. Это связанно с тем, что лидерные пептиды представляют собой достаточно протяженные аминокислотные последовательности и составляют от 40 до 60% массы гибридного полипептида.

2. Образование близкородственной примеси Арг₀-А-лизпро в результате гидролиза трипсином пептидной связи в положении после лизина между С-пептидом и А-цепью (фиг. 2).

Задачей предлагаемого изобретения является конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающий высокий уровень индуцируемой экспрессии гибридного полипептида с высокой долей инсулина лизпро и модифицированным сайтом протеолиза между С-пептидом и А-цепью с целью предотвращения возможности образования близкородственной примеси Арг0-А-лизпро при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.

Поставленная задача решается конструированием рекомбинантной плазмидной ДНК pF267 и штамма Escherichia coli BL21/pF267, трансформированного с ее помощью и обеспечивающего синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 4,5% от сырого веса клеточной биомассы.

Описание фигур

На Фиг. 1 показана молекулярная структура Лизпро (источник: US FDA, NDA 21-017).

На Фиг. 2 показана структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида) в штаммах продуцентах инсулина.

На Фиг. 3 представлена структура последовательности ДНК, полученной методом химического синтеза.

На Фиг. 4 показано расположение праймеров Pr237 и Pr238 на плазмиде pF173 для сайт-направленного мутагенеза сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью.

На Фиг. 5 представлено расположение праймеров Pr072 и Pr073 на плазмиде pF265 для сайт-направленного мутагенеза последовательности цепи B инсулина.

На Фиг. 6 показана первичная структура EcoRI/HindIII-фрагмента плазмиды pF267, кодирующая гибридный полипептид. Подчеркнуты инициирующий и терминирующие кодоны, обозначены сайты узнавания рестриктаз.

На Фиг. 7 показана физическая карта рекомбинантной плазмиды pF265. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции, pBR322 ori - участок инициации репликации плазмиды, Ptac - гибридный промотор транскрипции, rrnB - терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, Лидерный пептид - MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), и пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, Пролизпро - проинсулин лизпро, LacI - транскрипционный репрессор, регулирующий транскрипцию Tac-промотора.

Подробное описание изобретения

Согласно изобретению, предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pF267, кодирующая гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро,

с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, с молекулярной массой 1,4 МДа (4537 п.о.),

содержащая

- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину;

- участок инициации репликации (ori);

- ROP ген, регулирующий копийность плазмиды;

- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyr GluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро;

- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI - 115, BamHI - 176, SpeI - 438, HindIII - 444, BglII - 1872, NdeI - 2476, AatII - 4468.

При этом, данная рекомбинантная плазмидная ДНК может иметь размер 4537 п.о.

Кроме того, предложен штамм Escherichia coli BL21/pF267 - продуцента гибридного полипептида с последовательностью проинсулина лизпро, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.

Также предложен гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, полученный с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.

Общим недостатком гибридных полипептидов в патентах, описанных в предшествующем уровне техники, является то, что получаемый гибридный полипептид включает сайт протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью, допускающий образование близкородственной примеси Арг0-А-лизпро.

Авторы настоящего изобретения установили, что при существенном сокращении размера гибридного полипептида за счет использования короткой лидерной последовательности, состоящей из 31 аминокислоты, и изменении сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью на «Арг» можно достичь высоких выходов целевого гибридного полипептида.

В составе лидерного пептида имеется короткая последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, образующая выраженную пространственную структуру типа «альфа-спираль». Наличие N-концевого альфа-спирального участка в лидерном пептиде положительно влияет на уровень ренатурации гибридного полипептида.

Настоящее изобретение позволяет получать гибридный полипептид с высокой долей инсулина лизпро (до 49,5%) и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг₀-А-лизпро. Изобретение направлено на получение высокопродуктивного бактериального штамма - продуцента инсулинового аналога лизпро, использование которых может значительно упростить процесс производства инсулиновых аналога инсулина лизпро и снизить затраты на очистку целевого продукта.

Исходной плазмидой для создания экспрессионного вектора pF267 послужила плазмида pF019, представляющая собой рекомбинантный вектор pBR322 (13), в которой методами молекулярного клонирования был полностью удален ген устойчивости к тетрациклину (пример 1).

На следующем этапе синтезировали фрагмент ДНК размером 1,6 кб, содержащий следующие элементы и сайты рестрикции (Фиг. 3):

- Tac промотер и Lac оператор для контроля экспрессии гибридного полипептида (14), фланкированный сайтами рестрикции XhoI и EcoRI.

- Терминатор транскрипции rnnB оперона штамма K-12 ER3413 (REGION: 4143199..4143361), перед которым расположен сайт рестрикции HindIII.

- LacI ген штамма K-12 ER3413 (REGION: 365804 to 367006) с сайтом рестрикции BglII на 3’-конце. Введение LacI гена в экспрессионную конструкцию решает задачу контроля экспрессии гибридного полипептида при использовании широкого круга штаммов-хозяев, включая BL21, характеризующийся повышенной стабильностью рекомбинантных полипептидов за счет удаления клеточных протеаз lon и ompT.

Синтезированный фрагмент ДНК и плазмиду pF019 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции XhoI и BglII в течение 3-х часов при 37°C. Соответствующие ДНК-фрагменты выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coli выделенные из выросших колоний плазмидные ДНК тестировали с помощью ПЦР и секвенирования.

Таким образом, был получен экспрессионный вектор pF20 на основе плазмиды pBR322, содержащий Тас промотер, rnnB терминатор и LacI ген, кодирующий транскрипционный репрессор Тас промотера, а также сайты рестрикции EcoRI и HindIII для последующей вставки гена, кодирующего гибридный полипептид.

ДНК последовательность гибридного полипептида, содержащую в качестве лидерного пептида IgG-связывающий домен белка А из Staphylococcus aureus, пептидный линкер His6GlySerArg и проинсулина человека, вырезали из плазмиды pPIN07 (9) с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI/HindIII и вставляли по соответствующим сайтам рестрикции в экпрессионный вектор pF20 описанным выше способом, при этом в получающемся векторе появлялся сайт рестрикции BamHI, образованный кодирующей последовательностью двух аминокислот пептидного линкера GlySer (GGATCC). В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF100.

На следующим этапе получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF173 после замены ДНК последовательности IgG-связывающего домена белка А из Staphylococcus aureus ДНК последовательностью, кодирующей более короткий лидерный пептид MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, представляющий собой фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), регулируемой фактором роста гепатоцитов (пример 2).

Аминокислотная последовательность LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp локализована в альфа-спиральном участке белка TKS (№ 3D структуры в базе данных PDB: 3F1I). Наличие альфа-спирального участка в лидерном пептиде способствует эффективной ренатурации гибридного полипептида.

Методом сайт-направленного мутагенеза в плазмиде pF173 удаляли кодон «aag» в положении 373-375, соответствующий аминокислоте лизин сайта протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью проинсулина. В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF265, экспрессирующую проинсулин человека в составе гибридного полипептида (пример 3).

Рекомбинантную плазмидную ДНК pF267 получали методом сайт-направленного мутагенеза рекомбинантной плазмидной ДНК pF265, в которой последовательность «ccgaag», кодирующая аминоксилоты пролин и лизин, заменили на последовательность «aagccg», кодирующую аминокислоты лизин и пролин (пример 4).

Полученная в результате описанных молекулярно-генетических манипуляций рекомбинантная плазмидная ДНК pF267, кодирующая гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро, характеризуется следующими признаками:

имеет молекулярную массу 1,4 МДа (4537 п.о.);

состоит из следующих структурных элементов (Фиг.7):

- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину;

- участок инициации репликации (ori);

- ROP ген, регулирующий копийность плазмиды;

- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро;

- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, а также

- транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора;

содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: EcoRI - 115, BamHI - 176, SpeI - 438, HindIII - 444, BglII - 1872, NdeI - 2476, AatII - 4468.

Преимуществами предложенной рекомбинантной плазмидной ДНК конструкции являются высокая доля инсулина лизпро в гибридном полипептиде (до 49,5%), наличие в составе лидерного пептида последовательности, образующей пространственную структуру типа «альфа-спирали» для улучшения эффективности ренатурации гибридного полипептида, модификация сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью, исключающая образование близкородственной примеси Арг0-А-лизпро при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином лизпро электрокомпетентные клетки штамма реципиента Escherichia coli BL21 трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК pF267 методом электропорации согласно описанной методике (15) и высевали на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина.

Полученный штамм-продуцент Escherichia coli BL21/pF267 характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки: Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1x3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного полипептида.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые; край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°C, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мг/мл).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование промежуточной генетической конструкции pF019

ПЦР-продукт размером 2.8 кб, полученный в результате амплификации плазмиды pBR322 с праймерами Pr033 (5'-ccaacgtaacagatct (BglII) aacagctcgaactcgag (XhoI) ttgaagacgaaagggcctcg-3') и Pr039 (5'-ccaaccgtaacagatct (BglII) ctgtggaacacctacatctg-3'), вырезали из геля, очищали с использованием набора Qiagen. После инкубации с эндонуклеазой рестрикции BglII в течение 3-х часов при 37°C очищенный ДНК-фрагмент лигировали с помощью T4 ДНК лигазы и использовали для трансформации XL1-Blue штамма E.coli (Agilent Technology, 200249) методом электропорации (15). Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) подтверждали секвенированием. Описанным выше способом была получена плазмида pF019, представляющая собой фрагмент плазмиды pBR322 с полной делецией гена устойчивости к тетрациклину.

Пример 2. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pF173

Для введения в состав проинсулина короткого лидерного пептида были синтезированы праймеры pr096 (tcaacgtaacgaattct atg ctg tat tat gaa ggc ctg cag gac ggc agc agc cac cac catcatcatcatggatcccg) и pr130 (tgcctggcggcagtagcgcg). Праймер pr096 имеет в своем составе сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции EcoRI; область, кодирующую аминокислотную последовательность лидерного пептида; последовательность, соответствующую пептидному линкеру His6GlySerArg конструкции pF100.

В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

- 10 мкл 10-кратного буфера для PFU ДНК-полимеразы,

- 0.1 нг плазмидной ДНК pF100,

- 1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

- 0.5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

- 2 ед. Taq ДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 Thermal Cycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96°С (5 мин), 30 циклов - 96°С (15 сек), 55°С (15 сек), 72°С (30 сек).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру 600 п.о., вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE (Трис-борат-ЭДТА) c использованием 1%-ной агарозы. Полученную ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей ситемы Fusion-SL2-400.

Вырезанный из геля ПЦР-продукт и плазмиду pF100 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII в течение 3-х часов при 37°С. Соответствующие ДНК-фрагменты (330 п.о. и 4,2 кб) выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coli выделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью ПЦР и секвенирования.

Пример 3. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 с помощью сайт-направленного мутагенеза плазмиды pF173

Для модификации сайта протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью проинсулина синтезировали олигонуклеотиды Pr237 (cgtggtatcgttgaacagtg) и Pr238 (ctgcagagaaccttccagag), содержащие фосфатную группу с 5'-конца (Фиг. 3).

В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,

- 0,1 нг плазмидной ДНК pF173,

- 1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

- 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

- 2 ед. Taq ДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 Thermal Cycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96°С (5 мин), 30 циклов - 96°С (15 сек), 55°С (15 сек), 72°С (3 мин).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру плазмиде pF173 (4,5 кБ), вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE c использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей ситемы Fusion-SL2-400.

Для получения плазмидной ДНК pF265 концы выделенного из геля ПЦР-продукта лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующая смесь (10 мкл) использовали для трансформации штамма BL21 методом электропорации (15). После трансформации отбирали колонии, выращенные на среде с ампициллином, из них выделяли плазмиды и анализировали с помощью секвенирования последовательности гибридного полипептида. В результате получили рекомбинантную плазмидную ДНК pF265, экспрессирующую проинсулин в составе гибридного полипептида.

Пример 4. Получение конечной генетической конструкции рекомбинантной плазмидной ДНК pF267, экспрессирующей гибридный полипептид проинсулина Лизпро

Рекомбинантную плазмидную ДНК pF267 получали методом сайт-направленного мутагенеза рекомбинантной плазмидной ДНК pF265. Для этого синтезировали олигонуклеотиды (праймеры) Pr072 (aagccgacccgtcgtgaagctgaag) и Pr073 (ggtgtagaagaaaccacgttc), содержащие фосфатную группу с 5'-конца. Праймер Pr072 содержал последовательность aagccg, кодирующую аминокислоты лизин и пролин (Фиг. 5).

В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

- 10 мкл 10-кратного буфера для PFU ДНК-полимеразы,

- 0,1 нг плазмидной ДНК pF265,

- 1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

- 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

- 2 ед. Taq ДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 Thermal Cycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96°С (5 мин), 30 циклов - 96°С (15 сек), 55°С (15 сек), 72°С (3 мин).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 (4,5 кБ), вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE c использованием 1%-й агарозы. Полученную рекомбинантную плазмидную ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей ситемы Fusion-SL2-400.

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК концы выделенного из геля ПЦР-продукта лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Использовали лигирующую смесь (10 мкл) для трансформации штамма BL21 методом электропорации (15).

После трансформации отбирали колонии, выращенные на среде с ампициллином, из них выделяли плазмиды и анализировали с помощью секвенирования последовательности гибридного полипептида. В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF267, экспрессирующую проинсулин Лизпро в составе гибридного полипептида.

Пример 5. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида

Индивидуальную колонию клеток штамма E. coli BL21, содержащую рекомбинантную плазмидную ДНК pF265, инокулировали 2 мл LB среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, растили в термошейкере при 37°С в течение 22 часов при перемешивании (170 об./мин). После измерения оптической плотности OD₆₀₀ ночной культуры засевали 40 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина (ODстартовая₆₀₀ = 0,1) и растили 1-2 часа при 37°С на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) до достижения оптической плотности OD₆₀₀ = (0,8 ± 0,2). 20 мл культуры переносили в другую колбу (контроль без индукции), к оставшимся 20 мл добавляли 10 мкл 1М ИПТГ (изопропил-бета-галактопиранозид) (конечная концентрация ИПТГ - 0,5 мМ). После 4 часов инкубирования на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) клеточные культуры центрифугировали (15 мин, 3000 об/мин), определяли массу влажного осадка клеток, замораживали. Содержание гибридного полипептида в % от массы влажного осадка измеряли методом капиллярного электрофореза.

Источники информации

1. King H, Aubert RE, Herman WH. Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes care. 1998 Sep; 21(9):1414-31. PubMed PMID: 9727886.

2. Zhang P, Zhang X, Brown J, Vistisen D, Sicree R, Shaw J, et al. Global healthcare expenditure on diabetes for 2010 and 2030. Diabetes research and clinical practice. 2010 Mar; 87(3):293-301. PubMed PMID: 20171754.

3. Meece JD, Campbell RK. Insulin lispro update. The Diabetes educator. 2002 Mar-Apr; 28(2):269-77. PubMed PMID: 11924304.

4. Heller S. Insulin lispro: a useful advance in insulin therapy. Expert opinion on pharmacotherapy. 2003 Aug; 4(8):1407-16. PubMed PMID: 12877647.

5. Баирамашвили ДИ. Генноинженерный инсулин человека: успехи и перспективы. Рос хим ж (Ж Рос об-ва им ДИ Менделеева). 2005; XLIX(1):34-45.

6. Berg H, Walter M, Mauch L, Seissler J, Northemann W. Recombinant human preproinsulin. Expression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus. Journal of immunological methods. 1993 Sep 15; 164(2):221-31. PubMed PMID: 8370928.

7. Jonasson P, Nilsson J, Samuelsson E, Moks T, Stahl S, Uhlen M. Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptide. European journal of biochemistry / FEBS. 1996 Mar 1; 236(2):656-61. PubMed PMID: 8612642.

8. Castellanos-Serra LR, Hardy E, Ubieta R, Vispo NS, Fernandez C, Besada V, et al. Expression and folding of an interleukin-2-proinsulin fusion protein and its conversion into insulin by a single step enzymatic removal of the C-peptide and the N-terminal fused sequence. FEBS letters. 1996 Jan 8; 378(2):171-6. PubMed PMID: 8549827.

9. Коробко ВГ, Болдырева ЕФ, Шингарова ЛН. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07, кодирующая гибридный полипептид, содержащий проинсулин человека, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека: Патент РФ №2144957; 1999.

10. Патрушев ЛИ, Костромина ТИ, Баирамашвили ДИ, Мирошников АИ, Рекомбинантная плазмидная ДНК pLP-3.1, кодирующая полипептид проинсулина Lispro человека, и штамм бактерий Escherichia coli pLP-3.1/TG1 - продуцент рекомбинантного проинсулина Lispro2003.

11. Шматченко ВВ, Шматченко НА, Байдусь АН. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHINS11, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека, клетка Escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной ДНК pPHINS11, штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHINS11 - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека и способ получения инсулина человека2006. Available from: http://bd.patent.su/2263000-2263999/pat/servl/servletc85e.html.

12. Шматченко ВВ, Рекомбинантная плазмидная днк philp07, кодирующая гибридный белок с проинсулином lispro человека, клетка escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной днк philp07, и штамм бактерий escherichia coli jm109/philp07-продуцент гибридного белка с проинсулином lispro человека 2013.

13. Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW, et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene. 1977; 2(2):95-113. PubMed PMID: 344137. Epub 1977/01/01.

14. de Boer HA, Comstock LJ, Vasser M. The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983 Jan;80(1):21-5. PubMed PMID: 6337371.

15. Lessard JC. Transformation of E. coli via electroporation. Methods in enzymology. 2013;529:321-7. PubMed PMID: 24011058. Epub 2013/09/10.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ZakrytoeAktsionernoeObshchestvo "FARM-Kholding"

<120> Recombinant Plasmid DNA pF267 encoding Hybrid polypeptide comprising lispro proinsulin, and lispro proinsulin- comprising hybrid polypeptide producer bacterial strain Escherichia coli

<140> RU 2019116104

<141> 2019-05-23

<160> 1

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 1

GlyHisHisHisHisHisHisGlySerArg

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 2

HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 3

MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 4

HisHisHisHisHisHisGlySerArg

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 5

LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 6

ccaacgtaacagatct 16

aacagctcgaactcgag 17

ttgaagacgaaagggcctcg 20

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 7

ccaaccgtaacagatct 17

ctgtggaacacctacatctg 20

<210> 8

<211> 79

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 8

tcaacgtaacgaattct 17

atgctgtattatgaaggcctgcaggacggcagcagccaccac 42

catcatcatcatggatcccg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 9

cgtggtatcgttgaacagtg

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 10

ctgcagagaaccttccagag

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 11

aagccgacccgtcgtgaagctgaag

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 12

ggtgtagaagaaaccacgttc

<210> 13

<211> 720

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 13

tttgtttaactttaagaaggagagaattctatgctgtattatgaa 45

aaacaaattgaaattcttcctctcttaagatacgacataatactt 45

ggcctgcaggacggcagcagccaccaccatcatcatcatggatcc 45

ccggacgtcctgccgtcgtcggtggtggtagtagtagtacctagg 45

cgttttgttaaccaacacctgtgcggttctcacctggttgaagct 45

gcaaaacaattggttgtggacacgccaagagtggaccaacttcga 45

ctgtacctggtttgcggtgaacgtggtttcttctacaccaagccg 45

gacatggaccaaacgccacttgcaccaaagaagatgtggttcggc 45

acccgtcgtgaagctgaagacctgcaggttggtcaggttgaactg 45

tgggcagcacttcgacttctggacgtccaaccagtccaacttgac 45

ggtggtggtccgggtgctggtagcctgcaaccgctggctctggaa 45

ccaccaccaggcccacgaccatcggacgttggcgaccgagacctt 45

ggttctctgcagcgtggtatcgttgaacagtgctgcacctctatc 45

ccaagagacgtcgcaccatagcaacttgtcacgacgtggagatag 45

tgctctctgtaccagctggaaaactactgcaactagtaagcttag 45

acgagagacatggtcgaccttttgatgacgttgatcattcgaatc 45

<210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 14

MetLeuTyrTyrGlu5

GlyLeuGlnAspGlySerSerHisHisHisHisHisHisGlySer15

ArgPheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAla15

LeuTyrLeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrLysPro 15

ThrArgArgGluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeu 15

GlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGlu 15

GlySerLeuGlnArgGlyIleValGluGlnCysCysThrSerIle 15

CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn11

<---

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pF267 для экспрессии в Escherichia coli проинсулина лизпро человека в составе гибридного полипептида, имеющая карту плазмиды как показано на Фиг. 7, с молекулярной массой 1,4 МДа (4537 п.о.),

кодирующая гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14,

при этом плазмидная ДНК pF267 содержит:

- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину;

- участок инициации репликации (ori);

- ROP ген, регулирующий копийность плазмиды;

- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором нуклеотидная последовательность соответствует SEQ ID NO:13;

- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI- 115, BamHI – 176, SpeI – 438, HindIII – 444, BglII – 1872, NdeI – 2476, AatII– 4468.

2. Штамм Escherichia coli BL21/pF267 - продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина лизпро, при этом штамм получен путем трансформации клеток штамма E. coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pF267 по п. 1.

3. Гибридный полипептид проинсулина лизпро человека, в котором последовательность MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина лизпро, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.