Мета-азациклические производные аминобензойной кислоты в качестве антагонистов пан-интегрина

Изобретение относится к соединению формулы (I), в которой А представляет собой C-OH или N; R′ представляет собой водород или алкил_(C1-8); и каждый из X и Y независимо представляет собой галоген, фторалкокси_(С1-2), алкил_(С1-2) или фторалкил_(С1-2) при условии, что X и Y одновременно не представляют собой алкил_(С1-2); или к фармацевтически приемлемой соли вышеуказанного соединения. Изобретение также относится к фармацевтической композиции на основе соединений формулы (I) для опосредования патологических процессов ангиогенеза и фиброза. Технический результат - получены новые соединения и фармацевтическая композиция на их основе, которые могут найти применение в медицине для лечения таких заболеваний, как фиброз легких, печени, почек, миокарда и поджелудочной железы, склеродермии, рубцевания, рака, аутоиммунных заболеваний и инфекции. 3 н. и 47 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 17 пр.

(I)

 

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент США №62/273246, поданной 30 декабря 2015 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Область техники

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов, медицины и клеточной биологии. Более конкретно, оно относится к фармацевтическим агентам (соединениям), пригодным в качестве антагонистов интегриновых рецепторов, обладающим биологической антагонистической активностью в отношении одного или более интегринов, опосредующих патологические процессы ангиогенеза и фиброза. Как таковые, эти соединения могут быть использованы в фармацевтических композициях и в способах лечения заболеваний и расстройств, включая состояния, опосредованные одним или более такими интегринами.

II. Уровень техники

Интегрины представляют собой семейство интегральных белков цитоплазматической мембраны, опосредующих взаимодействия клеток с другими клетками и с внеклеточным матриксом. Примерно одна треть членов семейства интегринов непосредственно связывается с определенным аминокислотным мотивом, аргинин-глицин-аспартатом (RGD), который содержится в последовательности их родственных белковых лигандов. В данной области техники было установлено, что пептиды, содержащие RGD-последовательность, и синтетические малые молекулы, имитирующие RGD-последовательность, способны связываться с этими интегриновыми рецепторами с различной степенью специфичности и тем самым ингибировать связывание с нормальными физиологическими лигандами (Millard, 2011; Sun et al., 2014). Биологическое действие при лечении такими агентами зависит от их молекулярных свойств, находящих отражение в структуре, которые определяют, в какой степени определенный интегрин или комбинация интегринов ингибируется в тканях организма в течение определенного периода времени.

Многие заболевания человека характеризуются одним из или обоими распространенными задействованными патологическими механизмами: ангиогенезом и фиброзом. Различные подгруппы RGD-связывающих интегринов играют основные роли в управлении этими двойными процессами, так что для одновременного антагонизма ангиогенеза и фиброза необходимы агенты, способные эффективно связываться с несколькими целевыми интегринами. В этом они отличны от агентов, разработанных специально для связывания с одним интегрином, которые могут быть менее эффективными в некоторых областях применения из-за их более ограниченного механизма действия.

Интегрины, которые, как было показано, играют роль в развитии ангиогенеза, включают αvβ3, αvβ5 и α5β1. αvβ3 и αvβ5 изначально были описаны как медиаторы вызванного bFGF (основным фактором роста фибробластов) и VEGF (фактором роста эндотелия сосудов) ангиогенеза, соответственно, на моделях роговицы или хорион-аллантоисной оболочки. Полученные впоследствии данные исследований с использованием мышей, не имеющих этих интегринов, также подтверждают важную функциональную роль α5β1. Интегрин α5β1 (также известный как VLA-5) часто называют «классическим рецептором фибронектина», что отражает его хорошо охарактеризованное взаимодействие с этим белком внеклеточного матрикса. Клетки, экспрессирующие α5β1, связываются с фибронектином в области, включающей девятый и десятый фибронектиновые повторы III типа, последний из которых содержит мотив RGD, являющийся ключевым для связывания интегрина. В литературе описано, что помимо фибронектина α5β1 взаимодействует с другими белками внеклеточного матрикса, содержащими RGD, включая фибриноген, денатурированный коллаген и фибриллин-1 (Вах et al., 2003; Perdih, 2010; Suehiro et al., 2000). Эти лиганды являются компонентами временной матрицы, которая формируется клетками как часть процесса заживления повреждения тканей. Ключевыми компонентами этого ответа являются ангиогенез (образование новых кровеносных сосудов) и фиброз (образование рубцов), которые благоприятны для заживления острых травм, но могут оказывать пагубное действие на фоне многих заболеваний.

Антагонисты RGD-связывающих интегринов должны быть пригодны для лечения заболеваний человека, основной частью патологии которых является ангиогенез или фиброз. В частности, важная роль α5β1 в ангиогенезе подтверждена многочисленными исследованиями. Например, мыши, лишенные этого интегрина, демонстрируют эмбриональную смертность на 10-11 день с фенотипом, включающим дефекты как в эмбриональной, так и внеэмбриональной кровеносной системе (Yang et al., 1993). Ангиогенные цитокины, такие как bFGF, IL-8, TGFβ и TNFα, повышают экспрессию α5β1 на эндотелиальных клетках in vitro и in vivo, и иммуногистохимия показывает согласованное увеличение как α5β1, так и фибронектинового окрашивания в кровеносных сосудах, полученных из биопсий различных типов опухоли человека и ксенотрансплантатных опухолей животных (Collo, 1999; Kim et al., 2000). Моноклональные антитела, специфически ингибирующие α5β1, и соединения, описанные в качестве ингибиторов α5β1, значительно уменьшают ангиогенез в ряде экспериментальных моделей (Kim et al., 2000; Bhaskar et al., 2007; Livant et al., 2000; Zahn et al., 2009).

Поскольку экспрессия α5β1 не ограничивается эндотелием, помимо ангиогенеза он обладает и другими функциональными ролями. Он экспрессируется в различной степени во многих типах клеток, включая фибробласты, гемопоэтические и иммунные клетки, гладкомышечные клетки, эпителиальные клетки и опухолевые клетки. Экспрессия на опухолевых клетках была связана с прогрессированием роста и метастазирования опухоли (Adachi et al., 2000; et al., 1995; Danen et al, 1994; Edward, 1995). В фибробластах человека α5β1 способствует подвижности и выживанию (Lobert et al., 2010). В звездчатых клетках поджелудочной железы он взаимодействует с фактором роста соединительной ткани для стимуляции адгезии, миграции и фиброгенеза (Gao and Brigstock, 2006). Было показано, что фармакологический антагонизм α5β1 ингибирует присоединение, миграцию и пролиферацию клеток эпителия сетчатки человека in vitro и снижает пролиферацию и рубцевание клеток сетчатки при интравитреальном введении кроликам с отслоением сетчатки (Li et al., 2009; Zahn et al., 2010).

Помимо α5β1, еще одним RGD-связывающим интегрином семейства бета-1, экспрессия которого повышается после повреждения органов, является α8β1. Исследования показали, что этот интегрин коэкспрессируется с маркерами миофибробластов ткани, основными клеточными медиаторами фиброза (Levine et al., 2000; Bouzeghrane et al., 2004). Свойство эктопической экспрессии α8β1, придаваемое клеткам, увеличивало распространение и адгезию на латентном TGFβ, главном профибротическом цитокине, зависимым от RGD образом (Lu et al., 2002).

RGD-связывающие интегрины семейства альфа-v были связаны со стимуляцией биологической активации латентного профибротического цитокина TGFβ. Это опосредуется связыванием с латентно-ассоциированным пептидом (LAP), в частности, с помощью αvβ6 и αvβ8, но также αvβ1, αvβ3 и αvβ5. Кроме того, альфа-v-интегрины опосредуют присоединение, миграцию, пролиферацию и другие функции в различных типах клеток, связанные с процессом восстановления раны. Эта функциональная избыточность, дифференциальная клеточная экспрессия и известные фиброзные фенотипы мышей с нокаутом интегрина свидетельствуют о том, что очень эффективный антагонист всего этого подсемейства может быть особенно пригодным для терапевтического исследования. Для достижения активации TGFβ все эти интегрины принципиальным образом зависят от аминокислотной последовательности arg-gly-asp (RGD), содержащейся в LAP. Действительно, мыши, содержащие мутацию в RGD-последовательности LAP, неспособны активировать TGFβ и повторяют фенотип мышей с нокаутом TGFβ. Генетическая абляция экспрессии альфа-v-интегринов исключительно из миофибробластов у мышей обеспечивала защиту от развития фиброза в нескольких моделях повреждения органов, и аналогичным образом такую эффективность обеспечивала непрерывная инфузионная терапия низкомолекулярным антагонистом RGD-связывающих интегринов, известным как CWHM-12 (Henderson et al., 2013). Такие исследования подтверждают идею о том, что одновременное ингибирование нескольких интегринов может быть особенно подходящим для предотвращения или лечения ряда фиброзных состояний.

Соединения-антагонисты нескольких интегриновых рецепторов, ранее описанные в данной области техники, как правило, или не демонстрируют активности широкого спектра по отношению ко всем RGD-интегринам, описанным выше, или не имеют фармакокинетических свойств, подходящих для пролонгированной активности при пероральном введении, или не имеют ни того, ни другого. Длительный период полувыведения из плазмы в терапевтически значимых концентрациях после перорального введения является крайне желательным свойством для разработки лекарственных препаратов для клинического лечения, так как это обеспечивает удобство введения, как правило, без необходимости медицинского наблюдения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антагонистам интегриновых рецепторов, содержащим их фармацевтическим композициям, способам их получения и способам их применения.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к соединениям формулы:

где:

А представляет собой С-Н, С-ОН или N;

R' представляет собой водород, алкил_(C≤8), замещенный алкил_(C≤8) или заместитель, превращаемый в водород in vivo; и

каждый из X и Y независимо представляет собой циано, галоген, фторалкокси_(С1-2), алкил_(С1-2) или фторалкил_(С1-2), при условии, что X и Y одновременно не представляют собой циано или алкил_(С1-2);

или к фармацевтически приемлемой соли или таутомеру вышеуказанной формулы.

В некоторых вариантах осуществления соединение дополнительно определено как:

где:

А представляет собой С-ОН или N;

R' представляет собой водород, алкил_(С≤8), замещенный алкил_(С≤8) или заместитель, превращаемый в водород in vivo; и

каждый из X и Y независимо представляет собой циано, галоген, фторалкокси_(С1-2), алкил_(С1-2) или фторалкил_(С1-2), при условии, что X и Y одновременно не представляют собой циано или алкил_(С1-2);

или фармацевтически приемлемая соль или таутомер вышеуказанной формулы.

В некоторых вариантах осуществления А представляет собой N. В других вариантах осуществления А представляет собой С-ОН. В некоторых вариантах осуществления R' представляет собой водород.

В некоторых вариантах осуществления X представляет собой галоген, такой как -F, -Cl или -Br. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой -F. В других вариантах осуществления X представляет собой -Cl. В других вариантах осуществления X представляет собой -Br. В других вариантах осуществления X представляет собой фторалкокси_(С1-2), такой как -OCF₃. В других вариантах осуществления X представляет собой фторалкил_(С1-2). В некоторых вариантах осуществления X представляет собой -CHF₂. В других вариантах осуществления X представляет собой -CF₃. В других вариантах осуществления X представляет собой алкил_(С1-2), такой как-СН₃.

В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой галоген, такой как -F, -Cl или -Br. В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой -F. В других вариантах осуществления Y представляет собой -Cl. В других вариантах осуществления Y представляет собой -Br. В других вариантах осуществления Y представляет собой фторалкокси_(C1-2), такой как -OCF₃. В других вариантах осуществления Y представляет собой фторалкил_(С1-2). В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой -CHF₂. В других вариантах осуществления Y представляет собой -CF₃. В других вариантах осуществления Y представляет собой алкил_(С1-2), такой как -СН₃.

В некоторых вариантах осуществления каждый из X и Y независимо выбран из групп, состоящих из -F, -Cl, -Br, -OCF₃, -СН₃, -CHF₂ и -CF₃, при условии, что X и Y одновременно не представляют собой -СН₃.

В некоторых вариантах осуществления атом углерода, отмеченный β, находится в 5-конфигурации. В некоторых вариантах осуществления соединения дополнительно определены как:

или фармацевтически приемлемая соль или таутомер любой из вышеуказанных формул.

В некоторых вариантах осуществления соединения являются эффективными для ингибирования трех или более RGD-интегринов, выбранных из группы, состоящей из α5β1, αvβ1, α8β1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8, где эффективность соединения соответствует значению IC₅₀ менее 10 нМ для каждого из трех или более RGD-интегринов, при измерении с помощью твердофазного рецепторного анализа (SPRA) функции соответствующего интегрина.

В некоторых вариантах осуществления соединения обладают фармакокинетическими свойствами, позволяющими достичь терапевтически значимых концентраций в плазме и/или поддерживать их у пациента в течение двух или более часов после перорального введения. В некоторых вариантах осуществления соединения имеют пролонгированный период полувыведения из плазмы, составляющий по меньшей мере два часа, при измерении у крысы с применением в/в болюса, содержащего 1 мг соединения на кг массы крысы.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим:

a) соединение, описанное в настоящем документе; и

b) эксципиент.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения и/или предотвращения заболевания или расстройства у нуждающегося в этом пациента, включающим введение пациенту соединения или композиции, описанных в настоящем документе, в количестве, достаточном для лечения и/или предотвращения заболевания или расстройства.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство связано с ангиогенезом. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство связано с фиброзом. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство связано с фиброзом и/или ангиогенезом.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляют собой фиброз легких, печени, почек, миокарда и поджелудочной железы, склеродермию, рубцевание, ретинопатию недоношенных, семейную экссудативную витреоретинопатию, пролиферативные витреоретинопатии, макулодистрофию, диабетическую ретинопатию, рак, остеопороз, аутоиммунные заболевания, гуморальную гиперкальциемию при злокачественных новообразованиях, болезнь Педжета, заболевание периодонта, псориаз, артрит, рестеноз и инфекцию. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой фиброз легких. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой фиброз печени. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет фиброз миокарда. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляют собой фиброз почек. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой фиброз печени.

В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой склеродермию. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой рубцевание. В некоторых вариантах осуществления рубцевание представляет собой рубцевание кожи. В других вариантах осуществления рубцевание представляет собой рубцевание сетчатки. В других вариантах осуществления рубцевание представляет собой рубцевание роговицы.

В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой ретинопатию недоношенных. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой семейную экссудативную витреоретинопатию. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой пролиферативные витреоретинопатии. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой макулодистрофию. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой диабетическую ретинопатию.

В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления рак включает рост солидной опухоли или неоплазию. В некоторых вариантах осуществления рак включает метастазирование опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак мочевого пузыря, крови, кости, мозга, груди, центральной нервной системы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, пищевода, желчного пузыря, гениталий, мочеполового тракта, головы, почки, гортани, печени, легкого, мышечной ткани, шеи, слизистой оболочки полости рта или носа, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи, селезенки, тонкого кишечника, толстого кишечника, желудка, яичка или щитовидной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой карциному, саркому, лимфому, лейкоз, меланому, мезотелиому, множественную миелому или семиному.

В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой остеопороз. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное расстройство представляет собой рассеянный склероз. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой гуморальную гиперкальциемию при злокачественных новообразованиях. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой болезнь Педжета. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой заболевание периодонта. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой псориаз. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой артрит. В некоторых вариантах осуществления артрит представляет собой ревматоидный артрит. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой рестеноз. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой инфекцию.

В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой человека, обезьяну, корову, лошадь, овцу, козу, собаку, кошку, мышь, крысу, морскую свинку или их трансгенные виды. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой обезьяну, корову, лошадь, овцу, козу, собаку, кошку, мышь, крысу или морскую свинку. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой человека.

В некоторых аспектах настоящего изобретения предполагается тот факт, что связь между фенильным кольцом и аминокислотной цепью на β-аминокислоте свободно вращается. Таким образом, в некоторых аспектах предполагается, что структура может вращаться таким образом, что группа X обращена по направлению к основной цепи, а группа Y обращена в направлении от основной цепи, что соответствует наиболее часто используемому в описании способу изображения структуры, в котором группа X обращена по направлению к основной цепи, а группа Y обращена в направлении от основной цепи, как показано в приведенных ниже структурах. Структура:

эквивалентна структуре:

при условии свободного вращения связи, соединяющей атом углерода основной цепи, отмеченный β, и атом углерода ароматического кольца, отмеченный 1.

Другие объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения. Однако следует понимать, что подробное описание изобретения и конкретные примеры, указывающие конкретные варианты осуществления изобретения, одновременно приведены только в иллюстративных целях, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники из этого подробного описания изобретения. Следует отметить, что просто потому, что конкретное соединение отнесено к одной определенной общей формуле, нельзя полагать, что оно не может также принадлежать другой общей формуле.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Приведенные ниже графические материалы являются частью настоящего описания и включены для дополнительной иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято со ссылкой на один или более из этих графических материалов в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов его осуществления, представленных в настоящем документе.

ФИГ. 1 - точечные диаграммы, на которых сравнивается эффективность соединений сравнения (сравнительных) и примеров, показанных в таблицах 1А и В, для каждого интегрина. Горизонтальные линии обозначают средние групповые значения. Статистический анализ проводили с помощью стандартного двустороннего t-критерия для сравнения групповых средних.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В настоящем документе раскрыты новые соединения и композиции, обладающие свойствами антагонистов интегриновых рецепторов, способы их получения и способы их применения, в том числе для лечения и/или предотвращения заболевания.

I. Соединения и способы синтеза

Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены с использованием способов, приведенных ниже и дополнительно описанных в разделе «Примеры». Соединения сравнения, показанные в таблице 1 и перечисленные в таблицах 3-5, были синтезированы, как описано в литературных источниках. Кроме того, эти соединения сравнения также могут быть легко синтезированы специалистами в данной области техники с использованием способов и методик, описанных в настоящем документе. Общие последовательности проведения синтеза для получения соединений, пригодных для настоящего изобретения, приведены на схемах I-VIII. В соответствующих случаях приведено как пояснение, так и конкретные действия для различных аспектов настоящего изобретения. Следующие схемы и примеры предназначены лишь для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают ни его объем, ни сущность. Специалисты в данной области техники легко поймут, что для синтеза соединений согласно настоящему изобретению могут быть использованы известные варианты условий и процессов, описанные в схемах и примерах. Использованные исходные материалы и оборудование были либо коммерчески доступны, либо получены способами, описанными ранее и легко воспроизводимыми специалистами в данной области техники.

На схеме I проиллюстрирован общий принцип, который может быть использован для получения замещенной циклическим гуанидином левосторонней части ароматической кислоты формулы I согласно настоящему изобретению, которая затем может быть подвергнута реакции сочетания со сложным эфиром Gly-β-аминокислоты или сначала со сложным эфиром Gly, а затем (после гидролиза сложного эфира) с соответствующим сложным эфиром β-аминокислоты. Кратко, на схеме I соответствующую аминобензойную (или пиридинсодержащую) кислоту подвергают взаимодействию с тиоцианатом аммония в горячей разбавленной соляной кислоте с получением в результате 3-тиомочевинобензойной (или пиридинсодержащей) кислоты после обычной обработки. Исходные аминобензойные (или пиридинсодержащие) кислоты либо коммерчески доступны, либо могут быть превращены в такие аминобензойные (или пиридинсодержащие) кислоты путем восстановления соответствующей нитробензойной (или пиридинсодержащей) кислоты, которая может быть получена коммерчески или синтезирована путем нитрования подходящей бензойной (или пиридинсодержащей) кислоты с последующим восстановлением до требуемой аминобензойной (или пиридинсодержащей) кислоты, или с помощью других описанных в литературе методик, известных специалистам в данной области техники. Это промежуточное соединение тиомочевины превращают в S-метильное производное путем взаимодействия с иодметаном в этаноле при кипячении с обратным холодильником. Подходящий 1,3-диамино-2-гидроксипропан подвергают взаимодействию с полученным промежуточным соединением в горячем ДМА (или ДМФА). После охлаждения образуется осадок, и цвиттерионный продукт выделяют фильтрацией. Соль с HCl может быть получена путем лиофилизации из разбавленной соляной кислоты. В качестве альтернативы, продукт может быть выделен из исходной реакционной смеси путем удаления летучих веществ и концентрирования. Полученный продукт растворяют в воде и доводят значение рН до приблизительно 5-7, при котором цвиттерионный продукт выпадает в осадок и может быть выделен фильтрованием. Соль с HCl может быть получена, как указано выше, или просто путем растворения в разбавленной соляной кислоте и концентрирования до твердого состояния, и сушки.

На схеме II проиллюстрирован принцип, который может быть использован для получения части тетрагидропиримидинбензойной кислоты формулы I согласно настоящему изобретению, которая затем может быть подвергнута реакции сочетания со сложным эфиром Gly-β-аминокислоты или сначала со сложным эфиром Gly, а затем (после гидролиза сложного эфира) с соответствующим сложным эфиром β-аминокислоты. Кратко, на схеме II 3,5-дигидроксибензойную кислоту превращают в 3-амино-5-гидроксибензойную кислоту, используя методику, описанную в источниках Austr. J. Chem. 1981 или Becker et al., 1983. Продукт подвергают взаимодействию с метилизотиоцианатом в ДМФА при комнатной температуре (Organic Process Research & Development, 2004) с получением 3-N'-метилтиомочевино-5-гидроксибензойной кислоты после обычной обработки. Это промежуточное соединение тиомочевины превращают в S-метильное производное путем взаимодействия с беспримесным метил иодидом при менее 40°С. 1,3-диамино-2-гидроксипропан подвергают взаимодействию с этим полученным промежуточным соединением в горячем ДМА (или ДМФА). После охлаждения образуется осадок, и цвиттерионный продукт выделяют фильтрацией. Соль с HCl может быть получена путем лиофилизации из разбавленной соляной кислоты. В качестве альтернативы, продукт может быть выделен из исходной реакционной смеси путем удаления летучих веществ и концентрирования. Полученный продукт растворяют в воде и доводят значение рН до приблизительно 5-7, при котором цвиттерионный продукт выпадает в осадок и может быть выделен фильтрованием. Соль с HCl может быть получена, как указано выше, или просто путем растворения в разбавленной соляной кислоте и концентрирования до твердого состояния, и сушки.

На схеме III проиллюстрирован общий принцип, который может быть использован для синтеза части сложного эфира бета-аминокислоты формулы I согласно настоящему изобретению, используя в качестве исходного вещества подходящий бензальдегид. Этот сложный эфир бета-аминокислоты затем может быть подвергнут реакции сочетания с Вос-глицином с последующей (после удаления защитной группы Вос) реакцией сочетания с соответствующей ароматической кислотой, описанной на схемах I и II, или с ароматической кислотой, подвергнутой реакции сочетания с глицином. Кратко, на схеме III к соответствующему бензальдегиду в изопропаноле добавляют ацетат аммония, а затем малоновую кислоту. Реакционную смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником, полученный осадок фильтруют и промывают горячим изопропанолом, и сушат с получением требуемой рацемической бета-аминокислоты. Этиловый сложный эфир синтезируют путем нагревания этой кислоты в избытке этанола в присутствии избытка газа HCl. Эти рацемические сложные эфиры бета-аминокислот могут быть разделены на (R)- и (S)-энантиомеры путем хирального хроматографического разделения или с помощью ферментативного разделения, как описано в источниках Faulconbridge et al., 2000 или Landis et al., 2002, включенных в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления (S)-энантиомер является предпочтительным энантиомером β-аминокислотной группы.

На схеме IV проиллюстрирован общий принцип, который может быть использован для получения этил-N-Cly-бета-аминокислотной части формулы I согласно настоящему изобретению, которая может быть подвергнута реакции сочетания с частью ароматической кислоты формулы I, описанной на схемах I и II. В этом способе описана реакция сочетания сложного эфира бета-аминокислоты с глицином. Кратко, требуемый сложный эфир бета-аминокислоты (описанный на схеме III выше) обрабатывают активированным Вос-глицином. Удаление защитной группы Boc (например, обработкой этанолом/HCl) дает глицинамид соответствующего сложного эфира бета-аминокислоты ((S)-энантиомер получают путем использования сложного эфира (S)-бета-аминокислоты, описанного на схеме выше).

На схеме V проиллюстрирован общий принцип, который может быть использован для получения различных соединений согласно настоящему изобретению. Кратко, замещенную циклическим гуанидином левостороннюю часть ароматической кислоты формулы I (описанную на схемах I и II) активируют для проведения реакции сочетания с использованием известных способов. Таким образом, после растворения в подходящем растворителе, таком как ДМА, добавляют эквивалент NMM. Реакционную смесь охлаждают до температуры ледяной бани и добавляют IBCF. К промежуточному смешанному ангидриду добавляют сложный эфир Gly-β-аминокислоты (описанный на схеме IV) и NMM. После завершения реакции продукт очищают препаративной ВЭЖХ и гидролизуют сложный эфир до кислоты путем обработки основанием, таким как LiOH, в подходящем растворителе (диоксане/воде или ацетонитриле/воде). В качестве альтернативы, может быть использована подходящая кислота, такая как TFA. Продукт выделяют препаративной ВЭЖХ или путем выделения цвиттериона при рН, равном 5-7, и превращения в требуемую соль с помощью стандартных методик. ((S)-энантиомер получают путем использования сложного эфира (S)-бета-аминокислоты, описанного на схемах выше).

На схеме VI проиллюстрирован общий принцип, который может быть использован для получения различных соединений согласно настоящему изобретению. Кратко, 3-гидрокси-5-[(1,4,5,6-тетрагидро-5-гидрокси-2-пиримидинил)амино]бензойную кислоту (описанную на схеме II) активируют для проведения реакции сочетания с использованием известных способов. Таким образом, после растворения в подходящем растворителе, таком как ДМА, добавляют эквивалент NMM. Реакционную смесь охлаждают до температуры ледяной бани и добавляют IBCF. К промежуточному смешанному ангидриду добавляют сложный эфир Gly-β-аминокислоты (описанный на схеме IV) и NMM. После завершения реакции продукт очищают препаративной ВЭЖХ и гидролизуют сложный эфир до кислоты путем обработки основанием, таким как LiOH, в подходящем растворителе (диоксане/воде или ацетонитриле/воде). В качестве альтернативы, может быть использована подходящая кислота, такая как TFA. Продукт выделяют препаративной ВЭЖХ или путем выделения цвиттериона при рН, равном 5-7, и превращения в требуемую соль с помощью стандартных методик. ((S)-энантиомер получают путем использования сложного эфира (S)-бета-аминокислоты, описанного на схемах выше).

На схеме VII проиллюстрирован общий принцип, который может быть использован для получения различных соединений согласно настоящему изобретению. Кратко, замещенную циклическим гуанидином левостороннюю часть ароматической кислоты формулы I (описанную, например, на схемах I и II) активируют для проведения реакции сочетания с использованием известных способов. Таким образом, после растворения в подходящем растворителе, таком как ДМА, добавляют эквивалент NMM. Реакционную смесь охлаждают до температуры ледяной бани и добавляют IBCF. К промежуточному смешанному ангидриду добавляют этилглицинат гидрохлорид и NMM. После завершения реакции продукт очищают препаративной ВЭЖХ и гидролизуют сложный эфир до кислоты путем обработки основанием, таким как NaOH, в подходящем растворителе (воде, диоксане/воде или ацетонитриле/воде), с последующим подкислением. Этот продукт присоединения Gly затем активируют для проведения реакции сочетания с использованием известных способов. Таким образом, после растворения в подходящем растворителе, таком как ДМА, добавляют эквивалент NMM. Реакционную смесь охлаждают до температуры ледяной бани и добавляют IBCF. К промежуточному смешанному ангидриду добавляют подходящую соль сложного эфира бета-аминокислоты (описанного на схеме III выше) и NMM. После завершения реакции продукт очищают препаративной ВЭЖХ и гидролизуют сложный эфир до кислоты путем обработки основанием, таким как LiOH, в подходящем растворителе (диоксане/воде или ацетонитриле/воде). В качестве альтернативы, может быть использована подходящая кислота, такая как TFA. Продукт выделяют препаративной ВЭЖХ или путем выделения цвиттериона при рН, равном 5-7, и превращения в требуемую соль с помощью стандартных методик ((S)-энантиомер получают путем использования сложного эфира (S)-бета-аминокислоты, описанного на схемах выше).

На схеме VIII проиллюстрирован общий принцип, который может быть использован для получения различных соединений, описанных в настоящем документе. Кратко, 3-гидрокси-5-[(1,4,5,6-тетрагидро-5-гидрокси-2-пиримидинил)амино]бензойную кислоту (описанную на схеме II) активируют для проведения реакции сочетания с использованием известных способов. Таким образом, после растворения в подходящем растворителе, таком как ДМА, добавляют эквивалент NMM. Реакционную смесь охлаждают до температуры ледяной бани и добавляют IBCF. К промежуточному смешанному ангидриду добавляют этилглицинат гидрохлорид и NMM. После завершения реакции продукт очищают препаративной ВЭЖХ и гидролизуют сложный эфир до кислоты путем обработки основанием, таким как NaOH, в подходящем растворителе (воде, диоксане/воде или ацетонитриле/воде), с последующим подкислением. Этот продукт присоединения Gly затем активируют для проведения реакции сочетания с использованием известных способов. Таким образом, после растворения в подходящем растворителе, таком как ДМА, добавляют эквивалент NMM. Реакционную смесь охлаждают до температуры ледяной бани и добавляют IBCF. К промежуточному смешанному ангидриду добавляют подходящую соль сложного эфира бета-аминокислоты (описанного на схеме III выше) и NMM. После завершения реакции продукт очищают препаративной ВЭЖХ и гидролизуют сложный эфир до кислоты путем обработки основанием, таким как LiOH, в подходящем растворителе (диоксане/воде или ацетонитриле/воде). В качестве альтернативы, может быть использована подходящая кислота, такая как TFA. Продукт выделяют препаративной ВЭЖХ или путем выделения цвиттериона при рН, равном 5-7, и превращения в требуемую соль с помощью стандартных методик ((S)-энантиомер получают путем использования сложного эфира (S)-бета-аминокислоты, описанного на схемах выше).

В некоторых вариантах осуществления соединения согласно настоящему изобретению представляют собой соединения, описанные в таблице 1А (ниже), примерах и формуле изобретения.

Все эти способы, описанные выше, могут быть дополнительно модифицированы и оптимизированы с использованием принципов и методов, описанных в патентах США 6013651 и 6028223, включенных в настоящий документ посредством ссылки, а также принципов и методов органической химии, применяемых специалистом в данной области техники. Такие принципы и методы приведены, например, в источнике March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007), включенном в настоящий документ посредством ссылки.

Соединения, используемые в способах согласно изобретению, могут содержать один или более асимметрически замещенных атомов углерода или азота, и могут быть выделены в оптически активной или рацемической форме. Таким образом, подразумеваются все хиральные, диастереомерные, рацемические формы, эпимерные формы и все геометрические изомерные формы структуры, если специально не указано конкретное пространственное строение или изомерная форма. В некоторых вариантах осуществления β-аминокислотная часть формулы I находится в (S)-конфигурации. В некоторых вариантах осуществления (S)-энантиомер является предпочтительным энантиомером β-аминокислотной группы. Соединения могут находиться в виде рацематов и рацемических смесей, отдельных энантиомеров, диастереомерных смесей и индивидуальных диастереомеров. В некоторых вариантах осуществления получают один диастереомер. Хиральные центры соединений согласно настоящему изобретению могут иметь S- или R-конфигурацию, как определено в Рекомендациях ИЮПАК (Международного союза теоретической и прикладной химии) 1974 года. Например, смеси стереоизомеров могут быть разделены с помощью методик, описанных ниже в разделе «Примеры», а также их модификаций. Также включены таутомерные формы, а также фармацевтически приемлемые соли таких изомеров и таутомеров.

Подразумевается, что атомы, составляющие соединения согласно настоящему изобретению, включают все изотопные формы таких атомов. Соединения согласно настоящему изобретению включают соединения с одним или более изотопно-модифицированными или обогащенными атомами, в частности соединения с фармацевтически приемлемыми изотопами или соединения, пригодные для фармацевтических исследований. В контексте настоящего документа изотопы включают атомы, имеющие одинаковое атомное число, но разные массовые числа. В качестве общего примера и без ограничения, изотопы водорода включают дейтерий и тритий, а изотопы углерода включают ¹³С и ¹⁴С. Аналогичным образом предполагается, что один или более атомов углерода в соединении согласно настоящему изобретению могут быть заменены атомом(ами) кремния. Кроме того, предполагается, что один или более атомов кислорода в соединении согласно настоящему изобретению могут быть заменены атомом(ами) серы или селена.

Соединения согласно настоящему изобретению могут также существовать в форме пролекарства. Так как пролекарства, как известно, усиливают различные желательные качества фармацевтических препаратов (например, растворимость, биодоступность, производство и т.д.), соединения, используемые в некоторых способах согласно изобретению могут, при необходимости, быть доставлены в форме пролекарства. Таким образом, в изобретении предполагаются пролекарства соединений согласно настоящему изобретению, а также способы доставки пролекарств. Пролекарства соединений, используемых в изобретении, могут быть получены путем модификации функциональных групп, присутствующих в соединении, таким образом, что модификации расщепляются либо при обычном воздействии, либо in vivo, в исходное соединение. Соответственно, пролекарства включают, например, описанные в настоящем документе соединения, в которых гидроксильная, амино- или карбоксигруппа связаны с любой группой, которая при введении пролекарства субъекту расщепляется с образованием гидроксигруппы, аминогруппы или карбоновой кислоты, соответственно.

Необходимо принять во внимание, что конкретный анион или катион, являющийся частью любой соли согласно настоящему изобретению, неважен при условии, что соль в целом является фармакологически приемлемой. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых солей и способы их получения и применения приведены в источнике Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002), включенном в настоящий документ посредством ссылки.

Необходимо также принять во внимание, что соединения согласно настоящему изобретению включают соединения, которые были дополнительно модифицированы путем включения заместителей, превращаемых в водород in vivo. Сюда входят те группы, которые могут превращаться в атом водорода под воздействием ферментативных или химических средств, включая, но не ограничиваясь перечисленным, гидролиз и гидрогенолиз. Примеры включают гидролизуемые группы, такие как ацильные группы, группы, имеющие оксикарбонильную группу, аминокислотные остатки, пептидные остатки, о-нитрофенилсульфенил, триметилсилил, тетрагидропиранил, дифенилфосфинил и тому подобные. Примеры ацильных групп включают формил, ацетил, трифторацетил и тому подобные. Примеры групп, имеющих оксикарбонильную группу, включают этоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил (-С(O)ОС(СН₃)₃, Boc), бензилоксикарбонил, n-метоксибензилоксикарбонил, винилоксикарбонил, β-(n-толуолсульфонил)этоксикарбонил и тому подобные. Подходящие аминокислотные остатки включают, но не ограничены перечисленным, остатки Gly (глицина), Ala (аланина), Arg (аргинина), Asn (аспарагина), Asp (аспарагиновой кислоты), Cys (цистеина), Glu (глутаминовой кислоты), His (гистидина), Ile (изолейцина), Leu (лейцина), Lys (лизина), Met (метионина), Phe (фенилаланина), Pro (пролина), Ser (серина), Thr (треонина), Trp (триптофана), Тир (тирозина), Val (валина), Nva (норвалина), Hse (гомосерина), 4-Нур (4-гидроксипролина), 5-Hyl (5-гидроксилизина), Orn (орнитина) и β-Ala. Примеры подходящих аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки, защищенные защитной группой.

Примеры подходящих защитных групп включают защитные группы, обычно используемые в пептидном синтезе, включая ацильные группы (такие как формил и ацетил), арилметоксикарбонильные группы (такие как бензилоксикарбонил и n-нитробензилоксикарбонил), трет-бутоксикарбонильные группы (-С(O)ОС(СН₃)₃, Boc) и тому подобные. Подходящие пептидные остатки включают пептидные остатки, содержащие от двух до пяти аминокислотных остатков. Остатки этих аминокислот или пептидов могут находиться в стереохимических конфигурациях D-формы, L-формы или их смесей. Кроме того, аминокислотный или пептидный остаток может иметь асимметрический атом углерода. Примеры подходящих аминокислотных остатков, имеющих асимметрический атом углерода, включают остатки Ala, Leu, Phe, Trp, Nva, Val, Met, Ser, Lys, Thr и Tyr. Пептидные остатки, имеющие асимметрический атом углерода, включают пептидные остатки, имеющие в составе один или более аминокислотных остатков, имеющих асимметрический атом углерода. Примеры подходящих защитных групп аминокислот включают защитные группы, обычно используемые в пептидном синтезе, включая ацильные группы (такие как формил и ацетил), арилметоксикарбонильные группы (такие как бензилоксикарбонил и n-нитробензилоксикарбонил), трет-бутоксикарбонильные группы (-С(О)ОС(СН₃)₃) и тому подобные. Другие примеры заместителей, «превращаемых в водород in vivo», включают удаляемые восстановлением гидрогенолизуемые группы. Примеры подходящих удаляемых восстановлением гидрогенолизуемых групп включают, но не ограничены перечисленным, арилсульфонильные группы (такие как о-толуолсульфонил); метильные группы, замещенные фенилом или бензилокси (такие как бензил, тритил и бензилоксиметил); арилметоксикарбонильные группы (такие как бензилоксикарбонил и о-метоксибензилоксикарбонил); и галогенэтоксикарбонильные группы (такие как β,β,β-трихлорэтоксикарбонил и β-иодэтоксикарбонил).

Соединения согласно изобретению могут также иметь преимущество, заключающееся в том, что они могут быть более эффективными, быть менее токсичными, характеризоваться более длительным действием, быть более активными, вызывать меньше побочных эффектов, более легко абсорбироваться, и/или характеризоваться лучшим фармакокинетическим профилем (например, более высокой пероральной биодоступностью и/или более низким клиренсом), и/или иметь другие полезные фармакологические, физические или химические свойства по сравнению с соединениями, известными из уровня техники, независимо от того, применяют ли их согласно указанным в настоящем документе показаниям или иным образом.

II. Биологическая активность

В некоторых вариантах осуществления соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы для антагонистического действия на несколько RGD-связывающих интегринов. В некоторых из этих вариантов осуществления соединения могут быть использованы для лечения или предотвращения заболеваний, при которых более чем один интегрин способствует аберрантному ангиогенезу. Например, соединения могут быть особенно пригодными, когда второй патологический процесс, который либо является зависимым от ангиогенеза, либо независимым от него, опосредуется RGD-интегринами, которые могут одновременно быть поражены антиангиогенным антагонистом. Известно, что опухоли зависят от образования новых кровеносных сосудов, необходимых для поддержания роста более чем на несколько миллиметров в диаметре. Аберрантный ангиогенез в сетчатке характерен для многих приводящих к слепоте расстройств, таких как влажная форма возрастной макулодистрофии, витреоретинопатии, ретинопатия недоношенных и диабетическая ретинопатия. Ангиогенез был связан с прогрессированием фиброза легких и печени, а также с ростом синовиального паннуса при ревматоидном артрите.

Интегрины αvβ3 и αvβ5 были связаны с развитием ангиогенеза (Avraamides et al., 2008), поэтому можно предположить, что антагонистическое действие на них в сочетании с другими интегринами может обеспечить превосходную блокаду этого процесса. Известно, что интегрин αvβ3 также играет роль в метастазировании опухолевых клеток и в повышенной костной резорбции, связанной с остеопорозом и некоторыми видами рака. Антагонисты согласно изобретению обладают различной активностью по отношению по меньшей мере к пяти интегринам, которые, как описано в литературе, связывают комплекс латентного цитокина TGFβ in vitro: αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8. См. (Asano et al., 2005; Mu et al., 2002; Munger et al., 1999; Wipff et al., 2007; и Munger et al., 1998), включенные в настоящий документ посредством ссылки. TGFβ часто коэкспрессируется с ангиогенным цитокином VEGF и индуцирует его синтез (Ferrari et al., 2006). Помимо сосудистой регулятивной активности, TGFβ является мощным индуктором фиброза во многих тканях, таких как легкие, печень, почки и кожа (Nishimura, 2009). Практически весь TGFβ выделяется клетками в комплексе, содержащем латентно-ассоциированный пептид (LAP). Интегрины αvβ3, αvβ5 и αvβ6 взаимодействуют с мотивом RGD, содержащимся в LAP, вызывая конформационное изменение в комплексе, позволяющее TGFβ связывать клеточные рецепторы, активирующие профибротические сигнальные пути. Интегрин αvβ8 также активирует TGFβ RGD-зависимым образом, но использует механизм, зависящий от протеазы, отличный от других интегринов.

Латентный TGFβ повсеместно присутствует в тканях и активируется интегринами пространственно-ограниченным и ограниченным во времени образом. Поэтому повышение экспрессии эпителиального интегрина αvβ6 в легких или печени может способствовать локализованному отложению коллагена и рубцеванию, как это наблюдается у пациентов с идиопатическим фиброзом легких (Horan et al., 2008) или фиброзом печени (Popov et al., 2008). Аналогично, αvβ5 и в меньшей степени αvβ3 находятся в мезенхимальных клетках и способны активировать мезенхимальный TGFβ (Wipff et al., 2007; Scotton et al., 2009). Интегрин αvβ8 экспрессируется на разновидностях эпителиальных, нервных, иммунных и мезенхимальных типов клеток. В коже активация TGFβ, сопровождающая процесс заживления ран, опосредует отложение матрикса и способствует образованию рубцов. Соединения согласно настоящему изобретению в силу их способности одновременно ингибировать несколько TGFβ-активирующих интегринов имеют потенциал для большей эффективности при лечении фиброза, чем ранее описанные соединения, имеющие более ограниченные профили ингибирования. Кроме того, предложенные в настоящем документе соединения, включая, например, соединения, обладающие хорошей эффективностью в отношении α5β1, могут быть использованы для лечения и/или предотвращения заболеваний, характеризующихся как аберрантной ангиогенной, так и фиброзной патологией.

TGFβ является важным индуктором образования регуляторных Т-клеток (T_reg) FoxP3⁺ (Yoshimura, 2011). В некоторых вариантах осуществления соединения согласно настоящему изобретению, включая соединения, ингибирующие активацию TGFβ и/или уменьшающие активность T_reg, могут быть использованы для ослабления подавления иммунного ответа при патологических состояниях, таких как рак, при введении по отдельности или в комбинации с существующими методами лечения. Подавление активности T_reg с помощью таких соединений также может усилить активность вакцин, предназначенных для предотвращения или лечения рака и инфекционных заболеваний. TGFβ в присутствии IL-6 способствует превращению наивных Т-клеток в ТН17-клетки (Yoshimura, 2011). Эти клетки способствуют развитию различных аутоиммунных заболеваний. Сообщалось, что мыши, не обладающие какой-либо экспрессией αvβ8 на дендритных клетках, имеют почти полную защиту от экспериментального аутоиммунного энцефалита, модели рассеянного склероза (Melton et al., 2010). Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению, в том числе соединения, ингибирующие активацию TGFβ и/или уменьшающие активность Th1 7, могут применяться для предотвращения или лечения аутоиммунного заболевания при введении по отдельности или в комбинации с существующими методами лечения.

Известно, что антагонизм интегрина aIIbβ3 (также известного как рецептор фибриногена) блокирует агрегацию тромбоцитов как часть процесса свертывания крови. Следовательно, чтобы избежать усиленного кровотечения при лечении расстройств или патологических состояний, опосредованных интегрином α5β1 и другими интегринами, было бы предпочтительно использовать соединения, которые селективно не взаимодействуют с αIIbβ3.

Как обсуждается выше, интегрины представляют собой семейство интегральных белков цитоплазматической мембраны, опосредующих взаимодействия клеток с другими клетками и с внеклеточным матриксом (ВКМ). Эти белки также играют роль в клеточной сигнализации и тем самым регулируют форму клеток, подвижность и клеточный цикл. Интегрины не только выполняют сигнализацию «снаружи внутрь», типичную для рецепторов, но также работают в режиме «изнутри наружу». Таким образом, они передают информацию из ВКМ в клетку, а также показывают статус клетки окружающей среде, что позволяет быстро и гибко реагировать на изменения в окружающей среде, например, чтобы обеспечить свертывание крови тромбоцитами.

Существует множество типов интегринов, и многие клетки имеют несколько типов на своей поверхности. Интегрины имеют жизненно важное значение для всех животных и были обнаружены у всех исследованных животных, от губок до млекопитающих. Как таковые, соединения, целенаправленно воздействующие на интегрины, нашли множество применений у различных животных, включая домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных зоопарка, а также диких животных. Интегрины были широко изучены у людей. Для опосредования взаимодействий и передачи сигналов клетка-клетка и клетка-матрикс интегрины работают вместе с другими белками, такими как кадгерины, молекулы клеточной адгезии суперсемейства иммуноглобулинов, селектины и синдеканы. Интегрины связывают клеточную поверхность и компоненты ВКМ, такие как фибронектин, витронектин, коллаген и ламинин.

Каждый интегрин образован нековалентной гетеродимеризацией альфа- и бета-субъединиц гликопротеинов, комбинация которых передает уникальные биологические активности, такие как прикрепление, миграция, пролиферация, дифференцировка и выживание клеток. В настоящее время у млекопитающих описано 24 интегрина, образованные путем спаривания 18 α-субъединиц и 8 β-субъединиц, как указано в таблице 2.

Кроме того, варианты некоторых субъединиц образуются путем дифференциального сплайсинга; например, существует четыре варианта субъединицы бета-1. Через различные комбинации этих α- и β-субъединиц генерируется 24 уникальных интегрина, хотя их число различается согласно различным исследованиям.

III. Терапевтические способы

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов, медицины и клеточной биологии. Более конкретно, оно относится к фармацевтическим агентам (соединениям) и содержащим их фармацевтическим композициям, которые могут быть использованы в качестве антагонистов интегриновых рецепторов, включая, в некоторых вариантах осуществления, антагонисты нескольких интегриновых рецепторов. Как таковые, эти соединения могут быть использованы в фармацевтических композициях и в способах лечения состояний, опосредованных одним или более такими интегринами, например, путем ингибирования или антагонизма одного или более из этих интегринов. В нескольких аспектах настоящего изобретения предложенные в настоящем документе соединения могут быть использованы во множестве биологических, профилактических или терапевтических областей, включая те, в которых играют роль один или более интегринов α5b1, α8β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, avb6 и avb8.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования или антагонизма одного или более интегринов α5β1, α8β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8 с использованием одного или более соединений, раскрытых в настоящем документе, а также содержащих их фармацевтических композиций. В некоторых вариантах осуществления эти способы ингибируют связанные с ними патологические состояния, такие как ангиогенез, включая опухолевый ангиогенез, фиброз и фиброзные заболевания, такие как фиброз легких, почек, миокарда, мышц и печени, рубцевание, такое как рубцевание сетчатки, роговицы и кожи, ретинопатию, включая диабетическую ретинопатию и макулодистрофию, витреоретинопатию, включая ретинопатию недоношенных (ROP) и семейную экссудативную витреоретинопатию (FEVR), остеопороз, гуморальную гиперкальциемию при злокачественных новообразованиях, болезнь Педжета, метастазирование опухоли, рост солидной опухоли (неоплазию), артрит, включая ревматоидный артрит, заболевание периодонта, псориаз, миграцию клеток гладких мышц и рестеноз, аутоиммунное заболевание, такое как рассеянный склероз, и инфекционные патогены, путем введения терапевтически эффективного количества соединения, предложенного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления соединение вводят в составе фармацевтической композиции, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления соединения и/или содержащие их фармацевтические композиции могут быть введены перорально, парентерально или с помощью ингаляционного спрея, или местно в единичных лекарственных формах, содержащих общепринятые фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители. В контексте настоящего документа термин «парентерально» включает, например, подкожную, внутривенную, внутримышечную, интрастернальную, инфузионную методики или внутрибрюшинно. В некоторых вариантах осуществления соединения согласно настоящему изобретению вводят любым подходящим путем в форме фармацевтической композиции, подходящей для такого пути, и в дозе, эффективной для планируемого лечения. Терапевтически эффективные дозы соединений, требуемые для предотвращения, или остановки прогрессирования, или лечения патологического состояния, легко определяются специалистом в данной области техники с использованием предклинических и клинических подходов, известных в области медицины.

На основе стандартных лабораторных экспериментальных методов и методик, хорошо известных и высоко оцененных специалистами в данной области, а также сравнений с соединениями, имеющими известную пригодность, описанные выше соединения могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих вышеуказанными патологическими состояниями. Специалист в данной области техники поймет, что выбор наиболее подходящего соединения согласно изобретению находится в пределах возможностей специалиста в данной области техники и будет зависеть от множества факторов, включая оценку результатов, полученных в стандартном анализе и экспериментальных моделях на животных.

В другом аспекте предложенные в настоящем документе соединения могут быть использованы во множестве биологических, профилактических или терапевтических областей, включая те, в которых играют роль один или более интегринов α5b1, α8β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, avb6 и avb8. Изобретение также относится к лечению или ингибированию связанных с ними патологических состояний, таких как ангиогенез, включая опухолевый ангиогенез, фиброз и фиброзные заболевания, такие как фиброз легких, почек, миокарда, мышц и печени, склеродерму, рубцевание, такое как рубцевание сетчатки, роговицы и кожи, ретинопатию, включая диабетическую ретинопатию и макулодистрофию, витреоретинопатию, включая ретинопатию недоношенных (ROP) и семейную экссудативную витреоретинопатию (FEVR), остеопороз, гуморальную гиперкальциемию при злокачественных новообразованиях, болезнь Педжета, метастазирование опухоли, рост солидной опухоли (неоплазию), артрит, включая ревматоидный артрит, заболевание периодонта, псориаз, миграцию клеток гладких мышц и рестеноз, у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении. Кроме того, такие фармацевтические агенты пригодны в качестве противовирусных агентов и противомикробных препаратов. Кроме того, такие фармацевтические агенты пригодны в качестве модуляторов иммунной системы посредством ингибирования активации TGF-β, возникающей в результате ингибирования или антагонизма целевых интегринов. Такая иммунная модуляция влияет на иммунную активность и функции Т-регуляторных и Т-эффекторных клеток, и как таковая может быть пригодна для лечения патологий, связанных с иммунной системой, включая аутоиммунные заболевания, такие как рассеянный склероз, а также при лечении опухолей и инфекционных патогенов.

IV. Фармацевтические составы и пути введения

Другой целью изобретения является обеспечение фармацевтических композиций, содержащих одно или более соединений, описанных в настоящем документе. Такие композиции пригодны для ингибирования или антагонизма интегринов, включая, например, интегрины α5β1, α8β1, αvβ1, αvβ3, αvβ6 и αvβ8. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение, эффективное для ингибирования или антагонизма одного или более интегринов α5β1, α8β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8, с использованием одного или более соединений, раскрытых в настоящем документе, а также содержащих их фармацевтических композиций. В некоторых из этих вариантов осуществления такие фармацевтические композиции дополнительно содержат один или более нетоксичных, фармацевтически приемлемых носителей, и/или разбавителей, и/или адъювантов.

Для целей введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтические составы (также называемые фармацевтическими препаратами, фармацевтическими композициями, фармацевтическими продуктами, лекарственными препаратами, лекарственными средствами, медицинскими препаратами или медикаментами) содержат терапевтически эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению в смеси с одним или более эксципиентами и/или носителями лекарственного средства, соответствующими указанному пути введения. В некоторых вариантах осуществления из соединений согласно настоящему изобретению получают лекарственные формы, подходящие для лечения людей и/или ветеринарных пациентов. В некоторых вариантах осуществления получение лекарственной формы включает смешивание или объединение одного или более соединений согласно настоящему изобретению с одним или более из следующих эксципиентов: лактоза, сахароза, крахмальный порошок, сложные эфиры целлюлозы и алкановых кислот, алкиловые эфиры целлюлозы, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, оксид магния, натриевые и кальциевые соли фосфорной и серной кислот, желатин, аравийская камедь, альгинат натрия, поливинилпирролидон и/или поливиниловый спирт. В некоторых вариантах осуществления, например, для перорального введения, фармацевтический состав может быть таблетирован или заключен в капсулу. В некоторых вариантах осуществления соединения могут быть растворены или суспендированы в воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, кукурузном масле, хлопковом масле, арахисовом масле, кунжутном масле, бензиловом спирте, хлориде натрия и/или различных буферах. Фармацевтические составы могут быть подвергнуты общепринятым фармацевтическим манипуляциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать носители лекарственного средства и/или эксципиенты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, инкапсулирующие агенты, такие как липиды, дендримеры, полимеры, белки, такие как альбумин, или нуклеиновые кислоты, и буферы, и т.д.

Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть подвергнуты общепринятым фармацевтическим манипуляциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать общепринятые фармацевтические носители и эксципиенты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, буферы и т.д.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть введены различными способами, например, перорально или путем инъекции (например, подкожной, внутривенной, внутрибрюшинной и т.д.). В зависимости от пути введения активные соединения могут быть покрыты веществом для защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение. Их также можно вводить путем непрерывной перфузии/инфузии пораженного участка или места раны.

Для введения терапевтического соединения путем, отличным от парентерального введения, может потребоваться покрыть это соединение веществом для предотвращения его инактивации или совместное введение соединения с таким веществом. Например, терапевтическое соединение может быть введено пациенту в подходящем носителе, например, липосомах, или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают солевые и водные буферные растворы. Липосимы включают эмульсии на основе камеди кукурузных волокон (CGF) типа вода-в-масле-в-воде, а также общепринятые липосомы.

Терапевтическое соединение может также быть введено парентерально, внутрибрюшинно, интраспинально или интрацеребрально. Дисперсии могут быть получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, и в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические композиции могут подходить для инъекционного применения, включая стерильные водные растворы (в случае растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и текучей до такой степени, чтобы ее легко можно было ввести с помощью шприца. Она должна быть стабильной при условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (такой как глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и тому подобные), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвратить воздействие микроорганизмов можно с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Во многих случаях может быть целесообразным включать в состав композиции изотонические агенты, например сахара, хлорид натрия или многоатомные спирты, такие как маннит и сорбит. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена включением в композицию агента, который замедляет абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.

Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем объединения терапевтического соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией. В общем, дисперсии получают введением терапевтического соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов способы получения включают вакуумную сушку и лиофилизацию, которая дает порошок активного ингредиента (т.е., терапевтического соединения) плюс любой дополнительный требуемый ингредиент из его раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.

Терапевтическое соединение может быть введено перорально, например, с помощью инертного разбавителя или усваиваемого пищевого носителя. Терапевтическое соединение и другие ингредиенты также могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессованы в таблетки или введены непосредственно в рацион субъекта. Для перорального терапевтического введения терапевтическое соединение может быть объединено с эксципиентами и использовано в форме проглатываемых таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного. Процентное содержание терапевтического соединения в композициях и препаратах может, разумеется, различаться. Количество терапевтического соединения в таких терапевтически пригодных композициях представляет собой количество для получения подходящей дозы.

В некоторых вариантах осуществления предпочтительно получать парентеральные композиции в дозированной лекарственной форме для удобства введения и постоянства дозировки. В контексте настоящего документа дозированная лекарственная форма относится к физически разделенным единицам, подходящим в качестве однократных доз для подлежащих лечению пациентов; причем каждая единица содержит заранее определенное количество терапевтического соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в комбинации с необходимым фармацевтическим носителем. Требования к дозированным лекарственным формам согласно изобретению продиктованы и непосредственно зависят от (а) уникальных характеристик терапевтического соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (б) ограничений, присущих области составления композиций такого терапевтического соединения для лечения выбранного состояния у пациента.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое соединение может также быть введено местно на кожу, глаз или слизистую оболочку. В качестве альтернативы, если требуется местная доставка в легкие, терапевтическое соединение может быть введено путем ингаляции в виде сухого порошка или аэрозольного состава.

Активные соединения вводят в терапевтически эффективной дозе, достаточной для лечения состояния, связанного с состоянием у пациента. Например, эффективность соединения может быть оценена в системе экспериментальной модели на животном, с помощью которой можно прогнозировать эффективность при лечении заболевания у человека или другого животного, такой как системы экспериментальных моделей, показанные в примерах и на графических материалах.

Диапазон эффективных доз терапевтического средства может быть рассчитан из эффективных доз, определенных в исследованиях на животных для различных животных. Обычно эквивалентную дозу для человека (HED) в мг/кг можно рассчитать по следующей формуле (см., например, источник Reagan-Shaw et al., 2008, включенный в настоящий документ посредством ссылки):

HED (мг/кг)=Доза для животного (мг/кг) × (К_m животного/К_m человека)

Использование коэффициентов K_m при преобразовании приводит к более точным значениям HED, основанных на площади поверхности тела (BSA), а не только на массе тела. Коэффициенты K_m для людей и различных животных хорошо известны. Например, K_m для среднестатистического человека массой 60 кг (с BSA 1,6 м²) составляет 37, тогда как K_m ребенка массой 20 кг (BSA 0,8 м²) будет составлять 25. K_m для некоторых применимых экспериментальных моделей на животных также хорошо известны, в том числе: K_m мыши составляет 3 (при массе 0,02 кг и БСА 0,007); K_m хомяка составляет 5 (при массе 0,08 кг и BSA 0,02); K_m крысы составляет 6 (при массе 0,15 кг и BSA 0,025) и K_m обезьяны составляет 12 (при массе 3 кг и BSA 0,24).

Точные количества терапевтической композиции зависят от решения практикующего клинициста и индивидуальны для каждого пациента. Тем не менее, рассчитанная доза HED дает общее руководство. Другие факторы, влияющие на дозу, включают физическое и клиническое состояние пациента, путь введения, предполагаемую цель лечения и эффективность, стабильность и токсичность конкретного терапевтического состава.

Фактическая величина дозы соединения согласно настоящему изобретению или композиции, содержащей соединение согласно настоящему изобретению, вводимой субъекту, может определяться физическими и физиологическими факторами, такими как вид подлежащего лечению животного, возраст, пол, масса тела, тяжесть состояния, тип подлежащего лечению заболевания, предшествующие или сопутствующие терапевтические вмешательства, идиопатию субъекта и путь введения. Эти факторы могут быть определены квалифицированным специалистом. Практикующий клиницист, ответственный за введение, обычно будет определять концентрацию активного(ых) ингредиента(ов) в композиции и подходящую(ие) дозу(ы) для отдельного субъекта. В случае каких-либо осложнений лечащий врач может корректировать дозировку.

Эффективное количество обычно будет составлять от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 1000 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 750 мг/кг, от приблизительно 100 мг/кг до приблизительно 500 мг/кг, от приблизительно 1,0 мг/кг до приблизительно 250 мг/кг, от приблизительно 10,0 мг/кг до приблизительно 150 мг/кг на одно или более введений доз в сутки в течение одного или нескольких дней (разумеется, в зависимости от способа введения и факторов, обсуждаемых выше). Другие подходящие диапазоны доз включают от 1 мг до 10000 мг в сутки, от 100 мг до 10000 мг в сутки, от 500 мг до 10000 мг в сутки и от 500 мг до 1000 мг в сутки. В некоторых конкретных вариантах осуществления количество составляет менее 10000 мг в сутки при диапазоне от 750 мг до 9000 мг в сутки.

Эффективное количество может составлять менее 1 мг/кг/сут, менее 500 мг/кг/сут, менее 250 мг/кг/сут, менее 100 мг/кг/сут, менее 50 мг/кг/сут, менее 25 мг/кг/сут или менее 10 мг/кг/сут. В качестве альтернативы, оно может составлять от 1 мг/кг/сут до 200 мг/кг/сут. Например, при лечении пациентов с диабетом единичная доза может представлять собой количество, снижающее уровень глюкозы в крови по меньшей мере на 40% по сравнению с субъектом, не получившим лечение. В другом варианте осуществления единичная доза представляет собой количество, снижающее уровень глюкозы в крови до уровня, составляющего ±10% от уровня глюкозы в крови субъекта, не страдающего диабетом.

В других неограничивающих примерах доза может также составлять от приблизительно 1 мкг/кг/массы тела, приблизительно 5 мкг/кг/массы тела, приблизительно 10 мкг/кг/массы тела, приблизительно 50 мкг/кг/массы тела, приблизительно 100 мкг/кг/массы тела, приблизительно 200 мкг/кг/массы тела, приблизительно 350 мг/кг/массы тела, приблизительно 500 мкг/кг/массы тела, приблизительно 1 мкг/кг/массы тела, приблизительно 5 мг/кг/массы тела, приблизительно 10 мг/кг/массы тела, приблизительно 50 мг/кг/массы тела, приблизительно 100 мг/кг/массы тела, приблизительно 200 мг/кг/массы тела, приблизительно 350 мг/кг/массы тела, приблизительно 500 мг/кг/массы тела, до приблизительно 1000 мг/кг/массы тела или более на введение, и любой диапазон, получаемый из этих значений. В неограничивающих примерах диапазона, получаемого из перечисленных в настоящем документе значений, может быть введен диапазон от приблизительно 5 мг/кг/массы тела до приблизительно 100 мг/кг/массы тела, от приблизительно 5 мкг/кг/массы тела до приблизительно 500 мг/кг/массы тела, и т.д., на основании чисел, описанных выше.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать, например, по меньшей мере приблизительно 0,1% соединения согласно настоящему изобретению. В других вариантах осуществления соединение согласно настоящему изобретению может составлять, например, от приблизительно 1 масс. % до приблизительно 75 масс. % относительно массы единицы, или от приблизительно 25 масс. % до приблизительно 60 масс. %, и любой диапазон, получаемый из этих значений.

Предполагаются разовая или многократные дозы агентов. Желательные промежутки времени для доставки многократных доз могут быть определены специалистом в данной области техники с использованием не более чем обычных экспериментов. В качестве примера, пациентам могу быть введены две дозы ежесуточно с интервалом примерно 12 часов. В некоторых вариантах осуществления агент вводят один раз в сутки.

Агент(ы) может(гут) быть введен(ы) по обычному графику. В контексте настоящего документа обычный график относится к заранее определенному установленному периоду времени. Обычный график может охватывать одинаковые или различные по длине периоды времени, при условии, что график определен заранее. Например, обычный график может включать введение дважды в день, каждый день, каждые два дня, каждые три дня, каждые четыре дня, каждые пять дней, каждые шесть дней, еженедельно, ежемесячно или с любым установленным количеством дней или недель между введениями. В качестве альтернативы, заранее определенный обычный график может включать введение дважды в день в течение первой недели, а затем ежедневное введение в течение нескольких месяцев, и т.д. В других вариантах осуществления изобретения предусмотрено, что агент(ы) может(гут) быть принят(ы) перорально и время приема зависит или не зависит от приема пищи. Так, например, агент можно принимать каждое утро и/или каждый вечер, вне зависимости от того, когда пациент принимал или будет принимать пищу.

V. Комбинированная терапия

Помимо применения в качестве монотерапии, соединения согласно настоящему изобретению также могут найти применение в комбинированных видах терапии. Эффективная комбинированная терапия может быть достигнута с помощью одной композиции или фармакологического состава, включающего оба агента, или с помощью двух различных композиций или составов, вводимых одновременно, где одна композиция включает соединение согласно изобретению, а другая включает второй(ые) агент(ы). В качестве альтернативы, терапия может предшествовать или следовать за лечением другим агентом с интервалом от нескольких минут до нескольких месяцев.

Неограничивающие примеры такой комбинированной терапии включают комбинацию одного или более соединений согласно изобретению с другим агентом, например, противовоспалительным агентом, химиотерапевтическим средством, лучевой терапией, антидепрессантом, антипсихотическим средством, противосудорожным средством, нормотимиком, противоинфекционным средством, антигипертензивным средством, гипохолестеринемическим средством или другим модулятором липидов крови, средством, способствующим снижению массы тела, антитромботическим средством, средством для лечения или профилактики сердечнососудистых событий, таких как инфаркт миокарда или инсульт, противодиабетическим средством, средством для снижения отторжения трансплантата или реакции «трансплантат против хозяина», противоартритным средством, обезболивающим средством, противоастматическим средством или другим средством лечения заболеваний дыхательной системы, или средством для лечения или предотвращения кожных заболеваний. Соединения согласно изобретению могут быть объединены с агентами, предназначенными для улучшения иммунного ответа пациента на рак, включая (но не ограничиваясь перечисленным) противораковые вакцины.

VI. Определения

При использовании в контексте химической группы: «водород» означает -Н; «гидрокси» означает -ОН; «оксо» означает =O; «карбонил» означает -С(=O)-; «карбокси» означает -С(=O)ОН (также записывается как -СООН или -СО₂Н); «галоген» означает независимо -F, -Cl, -Br или -I; и «амино» означает -NH₂.

В контексте химических формул символ «-» означает простую связь, «=» означает двойную связь, а «≡» означает тройную связь. Символ «----» представляет собой необязательную связь, которая, если она присутствует, является либо простой, либо двойной. Символ «» представляет собой простую связь или двойную связь. Так, например, формула включает , , и . И подразумевается, что ни один такой атом кольца не является частью более чем одной двойной связи. Кроме того, отмечается, что символ ковалентной связи «-» в случае, когда она соединяет один или два стереогенных атома, не указывает на какую-либо предпочтительную стереохимию. Вместо этого он охватывает все стереоизомеры, а также их смеси. Символ «», когда он изображен перпендикулярно направлению связи (например, для метила), указывает точку прикрепления группы. Отмечается, что точку прикрепления обычно указывают таким образом только для крупных групп, чтобы помочь читателю однозначно идентифицировать точку прикрепления. Символ «» означает простую связь, где группа, прикрепленная к толстому концу клина, направлена «за пределы страницы». Символ «» означает простую связь, где группа, прикрепленная к толстому концу клина, направлена «к странице». Символ «» означает простую связь, где геометрия при двойной связи (например, Е- или Z-) не определена. Таким образом, подразумеваются оба варианта, а также их комбинации. Любая неопределенная валентность на атоме структуры, представленной в настоящей заявке, подразумевает атом водорода, связанный с этим атомом. Жирная точка на атоме углерода указывает, что водород, прикрепленный к этому углероду, направлен за пределы плоскости бумаги.

Для химических групп и классов соединений число атомов углерода в группе или классе указано следующим образом: «Cn» определяет точное число (n) атомов углерода в группе/классе. «Cn≤» определяет максимальное число (n) атомов углерода, которое может присутствовать в группе/классе, причем минимальное число является наименьшим из возможных для рассматриваемой группы/класса, например, следует понимать, что минимальное число атомов углерода в группе «алкенил_(с≤8)» или классе «алкен_(С≤8)» равно двум. Сравните с «алкокси_(С≤10)», который обозначает алкоксигруппы, имеющие от 1 до 10 атомов углерода. «Cn-n'» определяет как минимальное (n), так и максимальное число (n') атомов углерода в группе. Таким образом, «алкил_(С2-10)» обозначает алкильные группы, имеющие от 2 до 10 атомов углерода. Эти индикаторы числа атомов углерода могут предшествовать или следовать за химическими группами или классом, которые они модифицируют, и могут быть или не быть заключены в круглые скобки, что не указывает на какое-либо изменение их значения. Таким образом, все термины «С5 олефин», «С5-олефин», «олефин_(С5)» и «олефин_С5» являются синонимами.

Термин «насыщенный» при использовании для модификации соединения или химической группы означает, что соединение или химическая группа не имеют двойных углерод-углеродных и тройных углерод-углеродных связей, за исключением случаев, указанных ниже. Когда этот термин используется для модификации атома, это означает, что атом не является частью какой-либо двойной или тройной связи. В случае замещенных вариантов насыщенных групп может присутствовать одна или более двойных связей между углеродом и кислородом или двойных связей между углеродом и азотом. И когда такая связь присутствует, не исключаются углерод-углеродные двойные связи, которые могут возникать как часть кето-енольной таутомерии или имин/енаминной таутомерии. Когда термин «насыщенный» используется для модификации раствора вещества, это означает, что в этом растворе не может быть растворено большее количество этого вещества.

Термин «алифатический» при использовании без модификатора «замещенный» означает, что модифицированное таким образом соединение или химическая группа представляет собой ациклическое или циклическое, но неароматическое углеводородное соединение или группу. В алифатических соединениях/группах атомы углерода могут быть объединены в прямые цепи, разветвленные цепи или неароматические (алициклические) кольца. Алифатические соединения/группы могут быть насыщенными, то есть, соединяться простыми углерод-углеродными связями (алканы/алкил), или ненасыщенными, с одной или более двойными углерод-углеродными связями (алкены/алкенил), или с одной или более тройными углерод-углеродными связями (алкины/алкинил).

Термин «ароматический» при использовании для модификации соединения или химической группы относится к плоскому ненасыщенному кольцу атомов с 4n+2 электронов в полностью сопряженной циклической π-системе.

Термин «алкил» при использовании без модификатора «замещенный» относится к одновалентной насыщенной алифатической группе с атомом углерода в качестве точки присоединения, линейной или разветвленной ациклической структурой, и не содержащей атомов, отличных от углерода и водорода. Группы -СН₃ (Me), -СН₂СН₃ (Et), -СН₂СН₂СН₃ (н-Pr или пропил), -СН(СН₃)₂ (i-Pr, ⁱPr или изопропил), -СН₂СН₂СН₂СН₃ (н-Bu), -СН(СН₃)СН₂СН₃ (втор-бутил), -СН₂СН(СН₃)₂ (изобутил), -С(СН₃)₃ (трет-бутил, t-бутил, t-Bu или ^tBu) и -СН₂С(СН₃)₃ (неопентил) являются неограничивающими примерами алкильных групп. Термин «алкандиил» при использовании без модификатора «замещенный» относится к двухвалентной насыщенной алифатической группе с одним или двумя насыщенным(и) атомом(ами) углерода в качестве точки(ек) присоединения, линейной или разветвленной ациклической структурой, и не содержащей двойных или тройных углерод-углеродных связей, а также атомов, отличных от углерода и водорода. Группы -СН₂- (метилен), -СН₂СН₂-, -СН₂С(СН₃)₂СН₂- и -СН₂СН₂СН₂- представляющие собой неограничивающие примеры алкандиильных групп. Термин «алкилиден» при использовании без модификатора «замещенный» относится к двухвалентной группе =CRR', в которой R и R' независимо представляют собой водород или алкил. Неограничивающие примеры алкилиденовых групп включают: =СН₂, =СН(СН₂СН₃) и =С(СН₃)₂. «Алкан» относится к классу соединений, имеющих формулу H-R, где R представляет собой алкил, как определено выше. Когда любой из этих терминов используется с модификатором «замещенный», один или более атомов водорода были независимо замещены -ОН, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -СО₂СН₃, -CN, -SH, -ОСН₃, -ОСН₂СН₃, -С(O)СН₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH или -S(O)₂NH₂. Следующие группы являются неограничивающими примерами замещенных алкильных групп: -СН₂ОН, -CH₂Cl, -CF₃, -CH₂CN, -СН₂С(O)ОН, -СН₂С(O)ОСН₃, -CH₂C(O)NH₂, -CH₂C(O)CH₃, -СН₂ОСН₃, -СН₂ОС(O)СН₃, -CH₂NH₂, -CH₂N(CH₃)₂ и -CH₂CH₂Cl. Термин «галогеналкил» представляет собой разновидность замещенного алкила, в которой замещение атома водорода ограничено замещением на галоген (т.е. -F, -Cl, -Br или -I), так что отсутствуют атомы, отличные от углерода, водорода и галогена. Группа -CH₂Cl представляет собой неограничивающий пример галогеналкила. Термин «фторалкил» представляет собой разновидность замещенного алкила, в которой замещение атома водорода ограничено замещением на фтор, так что отсутствуют атомы, отличные от углерода, водорода и фтора. Группы CH₂F, -CF₃ и -CH₂CF₃ представляет собой неограничивающие примеры фторалкильных групп.

Термин «алкокси» при использовании без модификатора «замещенный» относится к группе -OR, где R представляет собой алкил, как определено выше. Неограничивающие примеры включают: -ОСН₃ (метокси), -ОСН₂СН₃ (этокси), -ОСН₂СН₂СН₃, -ОСН(СН₃)₂ (изопропокси), -ОС(СН₃)₃ (трет-бутокси), -ОСН(СН₂)₂, -О-циклопентил и -О-циклогексил. Термин «фторалкокси» при использовании без модификатора «замещенный» относится к группам, определенным как -OR, где R представляет собой фторалкил. Термин «алкилтио» и «ацилтио» при использовании без модификатора «замещенный» относится к группе -SR, где R представляет собой алкил и ацил, соответственно. Термин «спирт» соответствует алкану, как определено выше, где по меньшей мере один из атомов водорода замещен гидроксильной группой. Термин «простой эфир» соответствует алкану, как определено выше, где по меньшей мере один из атомов водорода замещен алкоксигруппой. Когда любой из этих терминов используется с модификатором «замещенный», один или более атомов водорода были независимо замещены -ОН, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -СО₂СН₃, -CN, -SH, -ОСН₃, -ОСН₂СН₃, -С(O)СН₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH или -S(O)₂NH₂.

В контексте описания и/или формулы изобретения термин «эффективный» означает достаточный для достижения желаемого, ожидаемого или предполагаемого результата. «Эффективное количество», «терапевтически эффективное количество» или «фармацевтически эффективное количество» при использовании в контексте лечения пациента или субъекта соединением означает количество соединения, которое при введении субъекту или пациенту для лечения заболевания является достаточным для осуществления такого лечения заболевания.

В контексте настоящего документа термин «IC₅₀» относится к ингибирующей дозе, составляющей 50% от максимального полученного ответа. Эта количественная мера указывает, сколько конкретного лекарственного средства или другого вещества (ингибитора) необходимо для ингибирования данного биологического, биохимического или химического процесса (или компонента процесса, т.е., фермента, клетки, клеточного рецептора или микроорганизма) наполовину.

«Изомер» первого соединения представляет собой отдельное соединение, в котором каждая молекула содержит те же составляющие атомы, что и первое соединение, но где конфигурация этих атомов в трех измерениях различна.

В контексте настоящего документа термин «пациент» или «субъект» относится к живому организму млекопитающего, такому как человек, обезьяна, корова, овца, коза, собака, кошка, мышь, крыса, морская свинка или их трансгенные виды. В некоторых вариантах осуществления пациент или субъект представляет собой примата. Неограничивающими примерами субъектов-людей являются взрослые, подростки, младенцы и плоды.

В целом в контексте настоящего документа термин «фармацевтически приемлемый» относится к соединениям, веществам, композициям и/или лекарственным формам, которые, в пределах здравого медицинского суждения, пригодны для использования в контакте с тканями, органами и/или биологическими жидкостями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соразмерно с разумным соотношением польза/риск.

«Фармацевтически приемлемые соли» означают соли соединений согласно настоящему изобретению, которые являются фармацевтически приемлемыми, как определено выше, и обладают требуемой фармакологической активностью. Такие соли включают кислотно-аддитивные соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобные; или с органическими кислотами, такими как 1,2-этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, 4,4'-метиленбис(3-гидрокси-2-ен-1-карбоновая кислота), 4-метилбицикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбоновая кислота, уксусная кислота, алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, алифатические серные кислоты, ароматические серные кислоты, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, камфорсульфоновая кислота, угольная кислота, коричная кислота, лимонная кислота, циклопентанпропионовая кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, глюкогептоновая кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, гептановая кислота, гексановая кислота, гидроксинафтойная кислота, молочная кислота, лаурилсерная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, муконовая кислота, о-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, щавелевая кислота, n-хлорбензолсульфоновая кислота, фенилзамещенные алкановые кислоты, пропионовая кислота, n-толуолсульфоновая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, винная кислота, трет-бутилуксусная кислота, триметилуксусная кислота и тому подобные. Фармацевтически приемлемые соли также включают основно-аддитивные соли, которые могут образовываться, когда присутствующие кислые протоны способны взаимодействовать с неорганическими или органическими основаниями. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид натрия, карбонат натрия, гидроксид калия, гидроксид алюминия и гидроксид кальция. Приемлемые органические основания включают этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, N-метилглюкамин и тому подобные. Необходимо принять во внимание, что конкретный анион или катион, являющийся частью любой соли согласно настоящему изобретению, неважен при условии, что соль в целом является фармакологически приемлемой. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых солей и способы их получения и применения представлены в источнике Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

В контексте настоящего документа термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает фармацевтически приемлемое вещество, композицию или наполнитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, предназначенный для переноса или транспортировки химического агента.

«Предотвращение» или «предотвращать» включает: (1) ингибирование начала заболевания у субъекта или пациента, который может быть подвержен риску и/или предрасположен к заболеванию, но еще не испытывает или не проявляет частично либо полностью патологических признаков или симптомов заболевания, и/или (2) замедление начала проявления патологических признаков или симптомов заболевания у субъекта или пациента, который может быть подвержен риску и/или предрасположен к заболеванию, но еще не испытывает или не проявляет частично либо полностью патологических признаков или симптомов заболевания.

«Пролекарство» означает соединение, метаболически превращаемое in vivo в ингибитор согласно настоящему изобретению. Само пролекарство может также проявлять или не проявлять активность по отношению к данному целевому белку. Например, соединение, содержащее гидроксигруппу, может быть введено в виде сложного эфира, который в результате гидролиза in vivo превращается в гидроксисоединение. Подходящие сложные эфиры, способные превращаться in vivo в гидроксисоединения, включают ацетаты, цитраты, лактаты, фосфаты, тартраты, малонаты, оксалаты, салицилаты, пропионаты, сукцинаты, фумараты, малеаты, метилен-бис-β-гидроксинафтоат, гентизаты, изетионаты, ди-n-толуоилтартраты, метансульфонаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, n-толуолсульфонаты, циклогексилсульфаматы, хинаты, сложные эфиры аминокислот и тому подобные. Аналогично, соединение, содержащее аминогруппу, может быть введено в виде амида, который в результате гидролиза in vivo превращается в аминное соединение.

«Стереоизомер» или «оптический изомер» представляет собой изомер данного соединения, в котором одни и те же атомы связаны с одними и теми же другими атомами, но при этом трехмерная конфигурация этих атомов различается. «Энантиомеры» представляют собой стереоизомеры данного соединения, которые являются зеркальными изображениями друг друга, такими как левая и правая руки. «Диастереомеры» представляют собой стереоизомеры данного соединения, которые не являются энантиомерами. Хиральные молекулы содержат хиральный центр, также называемый стереоцентром или стереогенным центром, который представляет собой любую точку, хотя и не обязательно атом, в молекуле, несущей группы таким образом, что перестановка любых двух групп приводит к стереоизомеру. В органических соединениях хиральный центр обычно представляет собой атом углерода, фосфора или серы, хотя другие атомы также могут быть стереоцентрами в органических и неорганических соединениях. Молекула может иметь несколько стереоцентров, что приводит к множеству ее стереоизомеров. В соединениях, стереоизомерия которых обусловлена тетраэдрическими стереогенными центрами (например, тетраэдрическим атомом углерода), общее количество гипотетически возможных стереоизомеров не будет превышать 2ⁿ, где n - число тетраэдрических стереоцентров. Количество стереоизмеров у молекулы с симметрией часто меньше максимально возможного. Смесь энантиомеров 50:50 называется рацемической смесью. В качестве альтернативы, смесь энантиомеров может быть энантиомерно обогащена, так что один энантиомер присутствует в количестве, превышающем 50%. Как правило, энантиомеры и/или диастереомеры могут быть разделены или отделены с использованием методов, известных в данной области техники. Предполагается, что для любого стереоцентра или оси хиральности, для которых стереохимия не была определена, этот стереоцентр или ось хиральности может присутствовать в R-форме, S-форме или в виде смеси R- и S- форм, включая рацемические и нерацемические смеси. В контексте настоящего документа фраза «по существу не содержащий других стереоизомеров» означает, что композиция содержит ≤15%, более предпочтительно ≤10%, еще более предпочтительно ≤5% или наиболее предпочтительно ≤1% другого(их) стереоизомера(ов).

«Заместитель, превращаемый в водород in vivo» означает любую группу, превращаемую в атом водорода с помощью ферментативных или химических средств, включая, но не ограничиваясь перечисленным, гидролиз и гидрогенолиз. Примеры включают гидролизуемые группы, такие как ацильные группы, группы, имеющие оксикарбонильную группу, аминокислотные остатки, пептидные остатки, о-нитрофенилсульфенил, триметилсилил, тетрагидропиранил, дифенилфосфинил и тому подобные. Примеры ацильных групп включают формил, ацетил, трифторацетил и тому подобные. Примеры групп, имеющих оксикарбонильную группу, включают этоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил (-С(O)ОС(СН₃)₃), бензилоксикарбонил, n-метоксибензилоксикарбонил, винилоксикарбонил, β-(n-толуолсульфонил)этоксикарбонил и тому подобные. Подходящие аминокислотные остатки включают, но не ограничены перечисленным, остатки Gly (глицина), Ala (аланина), Arg (аргинина), Asn (аспарагина), Asp (аспарагиновой кислоты), Cys (цистеина), Glu (глутаминовой кислоты), His (гистидина), Ile (изолейцина), Leu (лейцина), Lys (лизина), Met (метионина), Phe (фенилаланина), Pro (пролина), Ser (серина), Thr (треонина), Trp (триптофана), Тир (тирозина), Val (валина), Nva (норвалина), Hse (гомосерина), 4-Нур (4-гидроксипролина), 5-Hyl (5-гидроксилизина), Orn (орнитина) и β-Ala. Примеры подходящих аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки, защищенные защитной группой. Примеры подходящих защитных групп включают защитные группы, обычно используемые в пептидном синтезе, включая ацильные группы (такие как формил и ацетил), арилметоксикарбонильные группы (такие как бензилоксикарбонил и n-нитробензилоксикарбонил), трет-бутоксикарбонильные группы (-С(O)ОС(СН₃)₃) и тому подобные. Подходящие пептидные остатки включают пептидные остатки, содержащие от двух до пяти аминокислотных остатков. Остатки этих аминокислот или пептидов могут находиться в стереохимических конфигурациях D-формы, L-формы или их смесей. Кроме того, аминокислотный или пептидный остаток может иметь асимметрический атом углерода. Примеры подходящих аминокислотных остатков, имеющих асимметрический атом углерода, включают остатки Ala, Leu, Phe, Trp, Nva, Val, Met, Ser, Lys, Thr и Tyr. Пептидные остатки, имеющие асимметрический атом углерода, включают пептидные остатки, имеющие в составе один или более аминокислотных остатков, имеющих асимметрический атом углерода. Примеры подходящих защитных групп аминокислот включают защитные группы, обычно используемые в пептидном синтезе, включая ацильные группы (такие как формил и ацетил), арилметоксикарбонильные группы (такие как бензилоксикарбонил и n-нитробензилоксикарбонил), трет-бутоксикарбонильные группы (-С(O)ОС(СН₃)₃) и тому подобные. Другие примеры заместителей, «превращаемых в водород in vivo», включают удаляемые восстановлением гидрогенолизуемые группы. Примеры подходящих удаляемых восстановлением гидрогенолизуемых групп включают, но не ограничены перечисленным, арилсульфонильные группы (такие как о-толуолсульфонил); метальные группы, замещенные фенилом или бензилокси (такие как бензил, тритил и бензилоксиметил); арилметоксикарбонильные группы (такие как бензилоксикарбонил и о-метоксибензилоксикарбонил); и галогенэтоксикарбонильные группы (такие как β,β,β-трихлорэтоксикарбонил и β-иодэтоксикарбонил).

«Лечение» или «лечить» включает (1) ингибирование заболевания у субъекта или пациента, испытывающего или проявляющего патологические признаки или симптомы заболевания (например, остановка дальнейшего развития патологии и/или симптоматики), (2) уменьшение интенсивности заболевания у субъекта или пациента, испытывающего или проявляющего патологические признаки или симптомы заболевания (например, способствование регрессии патологии и/или симптоматики) и/или (3) осуществление любого измеримого снижения заболевания у субъекта или пациента, испытывающего или проявляющего патологические признаки или симптомы заболевания.

Другие сокращения, используемые в настоящем документе, представляют собой следующие: ¹Н ЯМР - протонный ядерный магнитный резонанс, АсОН - уксусная кислота, Ar - аргон, ACN или CH₃CN - ацетонитрил, CHN-анализ - элементный анализ водорода/углерода/азота, CHNCl-анализ - элементный анализ углерода/водорода/азота/хлора, CHNS-анализ - элементный анализ углерода/водорода/азота/серы, ДИ вода - деионизированная вода, ДИК - диизопропилкарбодиимид, ДМА - N,N-диметилацетамид, ДМАП - 4-(N,N-диметиламино)пиридин, ДМФА - N,N-диметилформамид, EDCl - 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид, EtOAc - этилацетат, EtOH-этанол, FAB MS - масс-спектроскопия с бомбардировкой быстрыми атомами, г-грамм(ы), НОВТ - гидрат 1-гидроксибензотриазола, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, IBCF - изобутилхлорформиат, KSCN - тиоцианат калия, л - литр, LiOH - гидроксид лития, MEM - метоксиэтоксиметил, MEMCl-метоксиэтоксиметил хлорид, МеОН - метанол, мг - миллиграмм, MgSO₄ - сульфат магния, мл - миллилитр, МС - масс-спектроскопия, МТБЭ - метил-трет-бутиловый эфир, N₂ - азот, NaHCO₃ - бикарбонат натрия, NaOH - гидроксид натрия, Na₂SO₄ - сульфат натрия, NMM-N-метилморфолин, NMP-N-метилпирролидон, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, Р₂О₅ - пентаоксид фосфора, PTSA - пара-толуолсульфоновая кислота, RPHPLC - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, комн. темп. - комнатная температура, TFA - трифторуксусная кислота, ТГФ - тетрагидрофуран, TMS - триметилсилил, и Δ означает нагрев реакционной смеси.

Вышеприведенные определения заменяют любое противоречивое определение в любом из цитируемых источников, включенных в настоящий документ посредством ссылки. Однако не следует считать тот факт, что некоторые термины имеют определения, указывающим на то, что любой не имеющий определения термин является неопределенным. Скорее предполагается, что все используемые термины описывают изобретения так, чтобы специалист в данной области техники мог оценить объем и реализацию настоящего изобретения.

VII. Примеры

Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методы, раскрытые в следующих далее примерах, представляют собой методы, которые, как было открыто авторами настоящего изобретения, надлежаще функционируют при реализации изобретения, и, таким образом, они могут считаться предпочтительными способами его реализации. Однако специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения должно быть понятно, что в конкретных раскрытых вариантах осуществления может быть сделано большое количество изменений с получением при этом аналогичных или схожих результатов, не отстраняясь при этом от сущности и объема изобретения.

А. Технические средства и общие подходы.

Аналитические анализы ВЭЖХ проводили на системе Agilent 1100, а анализ ЖХМС проводили в системе Agilent 1100 Series LC/MSD. Очистку с помощью обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ проводили на системе Biotage SP4 HPFC с использованием двухволнового УФ-детектора с переменной длиной волны на колонке Biotage SNAP KP-C18-HS 120 г с использованием градиента ацетонитрил/вода, содержащего 0,05% TFA. Все конечные соединения анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ и проверяли пики при 210, 254 и 280 нМ на чистоту. Спектры ¹Н и ¹⁹F ЯМР регистрировали в ДМСО-d₆ на спектрометре Bruker Avance-III/400 МГц, оборудованном широкополосным зондом ЯМР. Сигнал дейтерированного растворителя использовали в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги выражены в ppm (δ) и константы взаимодействия (J) приведены в герцах (Гц). ¹⁹F ЯМР обнаруживает сигнал соли конечных продуктов с TFA (прибл. 74 ppm), возникающий из TFA в растворителях для препаративной ВЭЖХ во время окончательной очистки. Реакции проводили в атмосфере сухого азота, если не указано иное.

В. Получение соединений

Пример А

Получение 3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)аминобензойной кислоты

3-Гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)аминобензойную кислоту синтезировали согласно описанным в литературе методикам (см. источник Organic Process Research & Development, 8:571-575, 2004, включенный в настоящий документ посредством ссылки).

Пример В

Получение 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты

2-(3-Гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусную кислоту получали согласно следующей методике:

Проведение реакции сочетания 3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)аминобензойной кислоты с этиловым эфиром глицина:

К суспензии 3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)аминобензойной кислоты (9,013 г, 35,87 ммоль) в смеси ДМФА (50,0 мл) и ДХМ (50,0 мл) в соотношении 1:1 добавляли гидрохлорид этилового эфира глицина (5,02 г, 35,95 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в атмосфере азота. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли беспримесный N,N'-диизопропилкарбодиимид (6,75 мл, 43,60 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи с получением бесцветной суспензи. Неочищенную реакционную смесь использовали без дополнительной очистки для гидролиза вышеуказанного сложного эфира.

Вышеуказанную неочищенную реакционную смесь охлаждали до 10°С (ледяная баня) и медленно добавляли 2,5 н. раствор NaOH (90,0 мл) при перемешивании, температуру раствора поддеживали ниже 20°С, с получением бледно-желтого раствора/суспензии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Реакционную смесь подкисляли 5 н. HCl при перемешивании до значения рН, равного 5, с получением бесцветного осадка, перемешивали смесь при комнатной температуре в течение еще 15 мин и фильтровали с получением бесцветного твердого вещества. Твердое вещество промывали водой (1×25 мл) и затем ацетонитрилом (1×25 мл). Твердое вещество сушили в вакууме с получением бесцветного порошка (9,686 г, выход 88%).

¹Н ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 3,37 (dd, J=12,7 и 3,1 Гц, 2Н), 3,50 (dd, J=12,7 и 2,8 Гц, 2Н), 4,17 (s, 2Н), 4,37 (m, 1Н), 6,97 (t, J=2,01 Гц, 1Н), 7,17-7,26 (m, 2Н). Спектр ¹Н ЯМР образца соответствовал предполагаемой структуре продукта.

Пример С

Получение 5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)аминоникотиновой кислоты

5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)аминоникотиновую кислоту получали согласно следующей методике:

Стадия 1

Смесь соединения 1 (40 г, 0,3 моль) и бензоилизотиоцианата (95 г, 0,58 моль) в CH₃CN (2,0 л) перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. ТСХ (тонкослойная хроматография) показала, что исходного вещества не осталось. Осадок отфильтровывали и промывали CH₃CN, сушили с получением Соединения 2 (80 г, 90%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Стадия 2

К перемешиваемому раствору соединения 2 (80 г, 0,27 моль) в безводном СН₃ОН (500 мл) медленно при комнатной температуре добавляли NaOMe (28,5 г, 0,53 моль). Через 20 мин получали прозрачный раствор и перемешивали реакционную смесь в течение 1 ч. Растворитель удаляли и остаток очищали путем промывки t-BuOMe с получением светло-желтого порошка. Порошок разбавляли Н₂О, подкисляли до рН=2-3. Образовавшееся желтое твердое вещество отфильтровывали, сушили с получением Соединения 3 (33,7 г, 65%).

Стадия 66

К перемешиваемому раствору соединения 3 (33,7 г, 0,17 моль) в ДМФА (200 мл) медленно добавляли CH₃I (24,3 г, 0,17 моль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. ТСХ показала, что исходного вещества не осталось. Растворитель удаляли и получали Соединение 4 (34,3 г, 95%) в виде желтого масла.

Стадия 4

Смесь соединения 4 (15,5 г, 0,074 моль) и гидроксидиаминопропана (20 г, 0,22 моль) в ДМФА (100 мл) нагревали до кипения с обратным холодильником и перемешивали в течение 5 ч. Образовавшееся твердое вещество отфильтровывали и сушили. Получали пример С (5,2 г, 30%) в виде белого твердого вещества.

ЖХ/МС (М+Н=237) соответствует целевому продукту. ¹Н ЯМР: ДМСО-d₆ 400 МГц δ 13,053 (s, 1H), 9,881 (s, 2Н), 8,783 (s, 1Н), 8,630 (s, 1H), 7,897 (s, 1Н), 5,492 (s, 1Н), 4,112 (s, 1Н), 3,410 (s, 2Н), 3,228-3,190 (m, 2Н).

Пример D

Получение 2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]уксусной кислоты

2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]уксусную кислоту получали согласно следующей методике:

Стадия 67

К суспензии 5-((5-Гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)никотиновой кислоты (1,20 г, 5,08 ммоль) в смеси ДМФА (10,0 мл) и ДХМ (10., мл) в соотношении 1:1 добавляли гидрохлорид этилового эфира глицина (0,798 г, 5,717 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 10 мин. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли беспримесный N,N'-диизопропилкарбодиимид (1,10 мл, 7,104 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи с получением суспензии цветом от бесцветного до кремового. Растворитель испаряли в вакууме с получением бледно-желтого вязкого остатка. Анализ остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 322 (М+Н), m/z 344 (M+Na) и m/z 643 (2М+Н Рассчитано для C₁₄H₁₉N₅O₄:321.33. Неочищенный продукт использовали без дополнительной очистки на следующей стадии для омыления вышеуказанного сложного эфира.

Стадия 2

Пример D

Вышеуказанный неочищенный продукт растворяли в смеси ДМФА/ДХМ (1:1) (10 мл) и охлаждали раствор до 10°С (ледяная баня), и медленно добавляли 2,5 н. раствор NaOH (10,0 мл) при перемешивании, температуру раствора поддерживали ниже 20°С, с получением бледно-желтого раствора. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь подкисляли 5 н. HCl при перемешивании до значения рН, равного 5, с получением желто-оранжевого раствора. Смесь разбавляли ДХМ (25 мл) и разделяли органический и водный слои. Водный слой испаряли в вакууме с получением желтого клейкого твердого вещества. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-40% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта в виде клейкого твердого вещества цветом от бесцветного до желтого. Твердое вещество очищали путем промывки ацетонитрилом с получением кристаллического твердого вещества цветом от бесцветного до бледно-желтого, которое перекристаллизовывали из метанола с получением твердого вещества кремового цвета (869,3 мг, выход 59%). Анализ твердого вещества с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 294 (М+Н) и m/z 316 (M+Na); Рассчитано для C₁₂H₁₅N₅O₄:293.28. ¹Н ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 3,19 (dd, J=12,47 и 3,67 Гц, 2Н), 3,37 (dd, J=12,47 и 2,93 Гц, 2Н), 3,96 (s, 2Н), 4,11 (m, 1Н), 8,12 (t, J=2,20 Гц, 1Н), 8,64 (d, J=2,45 Гц, 1Н), 8,90 (d, J=1,96 Гц, 1Н). Спектр ¹Н ЯМР соединения соответствовал предполагаемой структуре продукта, представляющего собой пример D.

Бета-аминокислоты и их соответствующие сложные бета-аминоэфирные промежуточные соединения

Бета-аминокислоты и их соответствующие сложные бета-аминоэфирные промежуточные соединения, используемые в качестве исходных веществ и реагентов в синтезах примеров 1-17, могут быть синтезированы, как показано на схеме III выше. Кратко, такие бета-аминокислоты и сложные эфиры могут быть синтезированы из подходящего бензальдегида и в показанных условиях. В качестве альтернативы, подходящий бензальдегид может быть подвергнут взаимодействию с моноэтил- или метилмалонатом с получением непосредственно рацемического сложного бета-аминоэтилового эфира. Примеры, в которых используется этот альтернативный способ, описаны ниже. Если в примере не показано иначе, все соответствующие бензальдегиды являются легко коммерчески доступными или они могут быть легко синтезированы из подходящего фенилбромида, н-BuLi и ДМФА способами, известными специалистам в данной области техники. Как отмечено в схеме III, соответствующие рацемические сложные бета-аминоэфиры могут быть превращены в целевой (S)-энантиомер либо путем разделения сверхкритической флюидной хиральной хроматографией, либо путем селективного ферментативного расщепления сложного (S)-бета-аминоэфира помощью липазы Amano PS (Sigma Aldrich) до легко выделяемой (S)-бета-аминокислоты, которая затем может быть превращена в (S)-слоожный эфир и использована без дополнительной очистки в синтезах примеров 1-17, раскрытых в настоящем документе.

Следующие иллюстративные способы демонстрируют ряд общих методик, используемых на различных стадиях образования всех сложных бета-аминоэфирных промежуточных соединений, используемых в синтезе нижеследующих примеров 1-17, и предназначены лишь для иллюстрации общих свойств этих способов:

Пример Е

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил]пропаноата гидрохлорида

NH₄OAc (1,33 г, 0,12 моль), HOOCCH₂COOEt (4,5 г, 0,034 моль) и бензальдегид 1 (3,6 г, 0,017 моль) в EtOH (30 мл) перемешивали при 70°С в течение 6 ч. Смесь концентрировали и доводили до значения рН=7,5 добавлением водн. NaHCO₃. Смесь экстрагировали EtOAc (3×50 мл). Органический слой промывали рассолом, сушили с помощью Na₂SO₄ и концентрировали до сухости с получением масла. Неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле с получением рацемического соединения 2 (1,5 г, 29,4%). (S)-энантиомер, пример Е, выделяли с помощью процедур ферментативного разделения, описанных для примера F (ниже).

Пример F

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]пропаноата гидрохлорида

Стадия 1

Получение рацемического этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]пропаноата

Рацемический этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]пропаноат получали согласно способу, описанному для получения примера Е, заменяя 3-бром-5-трифторметилбензальдегид на 3-хлор-5-трифторметилбензальдегид.

Стадия 2

Получение (3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]пропановой кислоты

Ферментативное разделение рацемической смеси: суспензию рацемического этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]пропаноата (570,0 мг, 1,676 ммоль) в 50 мМ растворе KH₂PO₄ (30,0 мл) перемешивали при комнатной температуре и доводили значение рН водного слоя до 8,32 добавлением 1,0 н. раствора NaOH и 50 мМ раствора KH₂PO₄. К вышеуказанной суспензии добавляли липазу Amano PS (625,0 мг) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 дней. Смесь разбавляли МТБЭ (метил-трет-бутиловым эфиром) (25 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч для экстракции (R)-сложного эфира. Слой МТБЭ, содержащий (R)-сложный эфир, отбрасывали после анализа с помощью ЖХ-МС. После испарения водного слоя в вакууме получали твердое вещество кремового цвета, содержащее (S)-кислоту, а также липазу Amano и соль фосфатного буфера. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта в виде бесцветного стекловидного твердого вещества (231,0 мг). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 312 (^79BrM+H), w/z 314 (^81BrM+H), m/z 334 (^79BrM+Na) и m/z 336 (^81BrM+Na); рассчитано для C₁₀H₉BrF₃NO₂: 312,08. Выделенную соль TFA и (S)-кислоты использовали без дополнительной очистки для получения (S)-сложного эфира.

Стадия 3

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]пропаноата гидрохлорида (Пример F)

К раствору соли TFA и (3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]пропановой кислоты со стадии 2 выше (231,0 мг, 0,542 ммоль) в абсолютном этаноле (3 мл) добавляли абсолютный этиловый спирт, насыщенный сухим газом HCl (10 мл), и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1,5 ч. После испарения растворителя в вакууме получали бесцветное кристаллическое твердое вещество (пример F) (198,5 мг, 97%). Анализ твердого вещества с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 340 (^79BrM+H), m/z 342 (^81BrM+H), m/z 362 (^79BrM+Na) и m/z 364 (^81BrM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃BrF₃NO₂: 340,14.

Пример G

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата гидрохлорида

Стадия 1

Получение рацемического этил-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси) фенил]пропаноата

Раствор смеси 3-хлор-5-(трифторметокси)бензальдегида (1,05 г, 4,676 ммоль), моноэтилмалоната (1,54 г, 11,69 ммоль) и ацетата аммония (1,985 г, 25,75 ммоль) в абсолютном этаноле (30 мл) нагревали при 80°С в течение ночи с получением бесцветного раствора. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и испаряли растворитель в вакууме с получением желтой вязкой жидкости. Остаток разделяли между насыщенным водным раствором NaHCO₃ (50 мл) и этилацетатом (50 мл), органический слой удаляли, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и испаряли в вакууме с получением желто-коричневой вязкой жидкости (1,56 г). Анализ неочищенного продукта с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 312 (^35ClM+Н), m/z 314 (^37ClM+Н), m/z 334 (^35ClM+Na) и m/z 336 (^37ClM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃ClF₃NO₃: 311,68. ЖХ-МС также демонстрирует массу побочного продукта, (E)-этил-3-(3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)акрилата: m/z 295 (^35ClM+Н) и m/z 297 (^37ClM+Н); рассчитано для C₁₂H₁₀ClF₃O₃: 294,65. К раствору неочищенного остатка в абсолютном этаноле (2 мл) добавляли 2,0 М раствор HCl в диэтиловом эфире (10,0 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч с получением желтого раствора. После испарения растворителей остаток разделяли между водой (25 мл) и дихлорметаном (50 мл). Органический и водный слои разделяли. Водный слой испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Остаток очищали обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA. Смесь чистых фракций испаряли в вакууме с получением целевого продукта в виде бесцветного кристаллического твердого вещества (347,2 мг, выход 24%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 312 (^35ClM+H), m/z 314 (^37ClM+Н), m/z 334 (^35ClM+Na) и m/z 336 (^37ClM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃ClF₃NO₃: 311,68

Стадия 2

Получение рацемического этил-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропаноат гидрохлорида

К раствору полученной выше соли TFA и рацемического этил-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата (347,2 мг, 0,816 ммоль) в абсолютном этаноле (2 мл) добавляли абсолютный этиловый спирт, насыщенный сухим газом HCl (5 мл), и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. После испарения растворителя в вакууме получали бесцветное клейкое твердое вещество. Твердое вещество суспендировали в гексанах (2×10 мл), слой растворителя отделяли декантацией и остаток сушили в вакууме с получением бесцветного кристаллического твердого вещества (270,7 мг, выход 95%). Анализ твердого вещества с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 312 (^35ClM+Н), m/z 314 (^37ClM+H), m/z 334 (^35ClM+Na) и m/z 336 (^37ClM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃ClF₃NO₃: 311,68 ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 1,08 (t, J=7,1 Гц, 3Н, CH₃-CH₂-), 3,06 (dd, J=16,1 и 8,8 Гц, 1Н, СНН-С=O-), 3,20 (dd, J=16,4 и 10,3 Гц, 1Н, -CHH-С=O-), 4,01 (q, J=7,1 и 2,0 Гц, 2Н, СН₃-СН₂-), 4,72 (m, 1Н, -NH₂-CH-CH₂-C=O-), 7,62 (s, 1Н, Н-2), 7,64 (s, 1Н, H-6), 7,80 (s, 1H, Н-4), 8,87 (brs, 3Н, -NH_2.HCl). Спектр ¹Н ЯМР твердого вещества соответствовал предполагаемой структуре продукта.

Стадия 3

Получение (3S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропановой кислоты

Ферментативное разделение рацемической смеси: Суспензию рацемического этил-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата гидрохлорида (185,30 мг, 0,532 ммоль) в 50 мМ растворе KH₂PO₄ (25,0 мл) перемешивали при комнатной температуре и доводили значение рН до 8,32 добавлением 1,0 н. раствора NaOH и 50 мМ раствора KH₂PO₄. К вышеуказанной суспензии добавляли липазу Amano PS (201,0 мг) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 дней. Смесь разбавляли МТБЭ (25 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч для экстракции (R)-сложного эфира. Слой МТБЭ, содержащий (R)-сложный эфир, отбрасывали после анализа с помощью ЖХ-МС. После испарения водного слоя в вакууме получали твердое вещество кремового цвета, содержащее (S)-кислоту, а также липазу Aman и соль фосфатного буфера. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта в виде бесцветного стекловидного твердого вещества (83,1 мг). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 284 (^35ClM+H), m/z 286 (^37ClM+Н), m/z 306 (^35ClM+Na) и m/z 308 (^37ClM+Na); рассчитано для C₁₀H₉ClF₃NO₃: 283,63. Выделенную соль TFA и (S)-кислоты использовали без дополнительной очистки для получения (S)-сложного эфира.

Стадия 4

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата гидрохлорида (Пример G)

К раствору соли TFA и (S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропановой кислоты с вышеуказанной стадии 3 (83,0 мг, 0,209 ммоль), в абсолютном этаноле (2,0 мл), добавляли абсолютный этиловый спирт, насыщенный сухим газом HCl (5 мл), и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч с получением бесцветного раствора. Анализ реакционной смеси с помощью ЖХ-МС через 1 ч показал массу целевого продукта, этил-(3S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата: m/z 312 (^35ClM+Н), m/z 314 (^37ClM+Н), m/z 334 (^35ClM+Na) и m/z 336 (^37ClM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃ClF₃NO₃: 311.68. Растворитель испаряли в вакууме с получением целевой соли HCl и сложного эфира (пример G) в виде бесцветного кристаллического твердого вещества (68,70 мг, выход 94%).

Пример Н

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата гидрохлорида

Стадия 1

Получение рацемического этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата

Раствор смеси 3-бром-5-(трифторметокси)бензальдегида (1,05 г, 3,90 ммоль), моноэтилмалоната (1,31 г, 9,91 ммоль) и ацетата аммония (1,68 г, 21,79 ммоль) в абсолютном этаноле (25 мл) нагревали при 80°С в течение 5 ч с получением бесцветного раствора. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и испаряли растворитель в вакууме с получением бесцветной вязкой жидкости. Остаток разделяли между насыщенным водным раствором NaHCO₃ (50 мл) и этилацетатом (50 мл), органический слой удаляли, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и испаряли в вакууме с получением бледно-желтой вязкой жидкости (1,40 г). Анализ неочищенного продукта с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 356 (^79BrM+H), m/z 358 (^81BrM+H), m/z 378 (^79BrM+Na) и m/z 380 (^81BrM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃BrF₃NO₃: 356,14. ЖХ-МС также демонстрирует массу побочного продукта, (Е)-этил-3-(3-бром-5-(трифторметокси)фенил)акрилата: m/z 339 (^79BrM+Н) и m/z 341 (^81BrM+Н); рассчитано для C₁₂H₁₀BrF₃O₃: 339,11. К раствору неочищенного остатка в абсолютном этаноле (2 мл) добавляли 2,0 М раствор HCl в диэтиловом эфире (15,0 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин с получением бледно-желтого раствора. После испарения растворителей остаток разделяли между водой (25 мл) и дихлорметаном (25 мл). Органический и водный слои разделяли. Водный слой испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Остаток очищали обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA. Смесь чистых фракций испаряли в вакууме с получением целевого продукта в виде бесцветного кристаллического твердого вещества (442,5 мг, выход 31%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 356 (^79BrM+H), m/z 358 (^81BrM+H), m/z 378 (^79BrM+Na) и m/z 380 (^81BrM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃BrF₃NO₃: 356,14.

Стадия 2

Получение рацемического этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата гидрохлорида

К раствору полученной выше соли TFA и рацемического этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропаноатв (442,8 мг, 0,942 ммоль) в абсолютном этаноле (2 мл) добавляли 2,0 М раствор HCl в диэтиловом эфире (10 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. После испарения растворителя в вакууме получали бесцветное клейкое твердое вещество. Твердое вещество суспендировали в гексанах (2×10 мл), слой растворителя отделяли декантацией и сушили остаток в вакууме с получением бесцветного кристаллического твердого вещества (358,0 мг, выход 96%). Анализ твердого вещества с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 356 (^79BrM+H), m/z 358 (^81BrM+Н), m/z 378 (^79BrM+Na) и m/z 380 (^81BrM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃BrF₃NO₃: 356,14. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 1,08 (t, J=7,1 Гц, 3Н, СН₃-СН₂-), 3,095 (двойной АВ q, J=16,4 и 8,7 Гц, и J=16,4 и 10,3 Гц, (каждый 1Н), 2Н, -CHH-С=O- и -CHH-С=O-; диастереотопные), 4,01 (dq, J=7,1 и 2,0 Гц, 2Н, СН₃-CH₂-), 4,72 (dd, J=8,3 и 6,1 Гц, 1Н, -NH₂-CH-CH₂-C=O-), 7,65 (appt, J=1,7 Гц, 1Н), 7,73 (appt, J=1,7 Гц, 1H), 7,90 (appt, J=1,5 Гц, 1H), 8,74 (brs, 3H, -NH₂.HCl). Спектр ¹H ЯМР твердого вещества соответствовал предполагаемой структуре продукта.

Стадия 3

Получение (3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропановой кислоты

Ферментативное разделение рацемической смеси:

Суспензию раемического этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата гидрохлорида со стадии 2 выше (345,40 мг, 0,880 ммоль) в 50 мМ растворе KH₂PO₄ (30,0 мл) перемешивали при комнатной температуре и доводили значение рН водного слоя до 8,32 добавлением 1,0 н. раствора NaOH и 50 мМ раствора KH₂PO₄. К вышеуказанной суспензии добавляли липазу Amano PS (317,0 мг) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли МТБЭ (25 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч для экстракции (R)-сложного эфира. Слой МТБЭ, содержащий (R)-сложный эфир, отбрасывали после анализа с помощью ЖХ-МС. После испарения водного слоя в вакууме получали твердое вещество кремового цвета, содержащее (S)-кислоту, а также липазу Amano и соль фосфатного буфера. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта в виде бесцветного стекловидного твердого вещества (201,3 мг). ЖХ/МС анализ продукта демонстрирует массу целевого продукта: m/z 328 (^79BrM+H), m/z 330 (^81BrM+H), m/z 350 (^79BrM+Na) и m/z 352 (^81BrM+Na), рассчитано для C₁₀H₉BrF₃NO₃: 328,08. Выделенную соль TFA и (S)-кислоты использовали без дополнительной очистки для получения (S)-сложного эфира.

Стадия 4

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата гидрохлорида (Пример Н)

К раствору соли TFA и (S)-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропановой кислоты со стадии 3 выше (201,30 мг, 0,455 ммоль) в абсолютном этаноле (2,0 мл) добавляли абсолютный этиловый спирт, насященный сухим газом HCl (5 мл), и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1,5 ч с получением бесцветного раствора. Анализ реакционной смеси с помощью ЖХ-МС через 1,5 ч показал массу целевого продукта, (S)-этил-3-амино-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]пропаноата: m/z 356 (^79BrM+H), m/z 358 (^81BrM+H), m/z 378 (^79BrM+Na) и m/z 380 (^81BrM+Na); рассчитано для C₁₂H₁₃BrF₃NO₃: 356,14. Растворитель испаряли в вакууме с получением целевой соли HCl и сложного эфира (пример Н) в виде бесцветного кристаллического твердого веществоа (171,0 мг, выход 95%).

Пример I

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3,5-дихлор-фенил]пропаноата гидрохлорида

Стадия 1

Получение (S)-3-амино-3-[3,5-дихлор-фенил]пропановой кислоты

Ферментативное разделение рацемической смеси: суспензию рацемического этил-3-амино-3-[3,5-дихлорфенил]пропаноата гидрохлорида (синтезированного согласно методикам, описанным в настоящем документе, используя в качестве исходного вещества 3,5-дихлорфенилбензальдегид) (316,0 мг, 1,058 ммоль) в 50 мМ растворе KH₂PO₄ (30,0 мл) перемешивали при комнатной температуре и доводили значение рН водного слоя до 8,32 добавлением 1,0 н. раствора NaOH и 50 мМ раствора KH₂PO₄. К вышеуказанной суспензии добавляли липазу Amano PS (295,0 мг) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 дней. Смесь разбавляли МТБЭ (25 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч для экстракции (R)-сложного эфира. Слой МТБЭ, содержащий (R)-сложный эфир, отбрасывали после анализа с помощью ЖХ-МС. После испарения водного слоя в вакууме получали твердое вещество кремового цвета, содержащее (S)-кислоту, а также липазу Amano и соль фосфатного буфера. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-50% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта в виде бесцветного стекловидного твердого вещества (103,0 мг). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 234 (^35ClM+Н), m/z 236 (^37ClM+Н), m/z 256 (^35ClM+Na) и m/z 258 (^37ClM+Na); рассчитано для C₉H₉Cl₂NO₂: 234,08. Выделенную соль TFA и (S)-кислоты использовали без дополнительной очистки для получения (S)-сложного эфира.

Стадия 2

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3,5-дихлор-фенил]пропаноата гидрохлорида (Пример I)

К суспензии (S)-3-амино-3-[3,5-дихлорфенил]пропановой кислоты со стадии 1 выше (103,0 мг, 0,440 ммоль) в абсолютном этаноле (2.0 мл) добавляли абсолютный этиловый спирт, насыщенный сухим газом HCl (5 мл), и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч с получением бесцветного раствора. Анализ реакционной смеси методом ЖХ-МС через 1,5 ч показал массу целевого продукта, (S)-этил-3-амино-3-[3,5-дихлорфенил]пропаноата: m/z 262 (^35ClM+Н), m/z 264 (^37ClM+H), m/z 284 (^35ClM+Na) и m/z 286 (^37ClM+Na); рассчитано для C₁₁H₁₃Cl₂NO₂: 262,13. Растворитель испаряли в вакууме с получением целевой соли HCl и сложного эфира (пример I) в виде бесцветного кристаллического твердого вещества (131,20 мг, выход 99%).

Пример J

Получение рацемического этил-3-амино-3-[3,5-бромфенил]пропаноата гидрохлорида

Стадия 1

Получение рацемической 3-амино-3-[3,5-бром-фенил]пропановой кислоты

Суспензию 3,5-дибромбензальдегида (50 г, 189,39 ммоль), малоновой кислоты (39,39 г, 378,78 ммоль) и ацетата аммония (29,19 г, 378,78 ммоль) в изопропаноле (350 мл) нагревали при температуре кипения с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 14 ч с получением вязкого бесцветного твердого вещества. Твердое вещество отфильтровывали горячим, промывали горячим изопропанолом (2×100 мл) и сушили в вакууме с получением целевого рацемического продукт в виде бесцветного твердого вещества (32,2 г).

Стадия 2

Получение рацемического этил-3-амино-3-[3,5-бромфенил]пропаноата гидрохлорида

К 3-амино-3-(3,5-дибромфенил)-пропионовой кислоты со стадии 1 выше (32 г, 99,07 ммоль) добавляли абсолютный этанол (500 мл, насыщенный безводным газом HCl) и нагревали реакционную смесь до кипения с обратным холодильником в течение 1,5 ч с получением бледно-желтого раствора. Растворитель удаляли в вакууме с получением бесцветного твердого вещества. Твердое вещество промывали гексаном (2×100 мл). После отделения декантацией слоя растворителя остаток сушили в вакууме с получением рацемического гидрохлорида сложного аминоэфира (пример J) в виде белого твердого вещества (38 г).

Пример K

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-бром-5-(дтфторметил)фенил]пропаноата гидрохлорида

Стадия 1

3,5-дибромбензальдегид 1 (10 г, 37,8 ммоль, 1,0 экв.), этин-1,2-диол (7,0 г, 114 ммоль, 3,0 экв.) и TsOH (0,32 г, 1,89 ммоль) в толуоле (20 мл) перемешивали при 110°С в течение 4 ч. Смесь охлаждали до 23°С и концентрировали, экстрагировали EtOAc. Органический слой промывали рассолом, сушили (Na₂SO₄) и концентрировали до сухости с получением соединения 2 (9,2 г, 83,6%) в виде масла.

Стадия 2

Соединение 2 (9,2 г, 29,8 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (100 мл) перемешивали при -78°С. К вышеуказанной смеси по каплям добавляли н-BuLi (12 мл, 1,0 экв.) при -78°С. Смесь перемешивали при -78°С в течение 1 ч. К вышеуказанной смеси по каплям добавляли ДМФА (4,56 г, 1,5 экв.) при -78°С. Смесь перемешивали при -78°С в течение 3 ч, затем подогревали до 25°С. К смеси добавляли воду и затем экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали рассолом, сушили (Na₂SO₄) и концентрировали до сухости с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле с получением соединения 3 (6,6 г, 86,8%) в виде белого твердого вещества.

Стадия 3

Соединение 3 (6,6 г, 0,026 моль) добавляли к ДХМ (50 мл), затем к раствору добавляли DAST (8,3 г, 0,052 моль) и перемешивали реакционную смесь в течение 8 ч в атмосфере N₂. Раствор промывали водн. NaHCO₃ и экстрагировали смесь ДХМ. Органический слой промывали рассолом, сушили (Na₂SO₄) и концентрировали. Неочищенное вещество очищали хроматографией на силикагеле с получением соединения 4 (4,2 г, 58,3%).

Стадия 4

Соединение 4 (4,2 г, 0,026 моль) добавляли к раствору ТГФ (40 мл) и 3 н. HCl (20 мл), и перемешивали реакционную смесь в течение 6 ч. Смесь концентрировали и очищали неочищенный продукт хроматографией на силикагеле с получением соединения 5 (3,6 г, 76,9%).

Стадия 5

NH₄OAc (0,54 г, 0,077 моль), HOOCCH₂COOEt (2,9 г, 0,022 моль) и соединение 5 (3,6 г, 0,011 моль) в EtOH (30 мл) перемешивали при 70°С в течение 6 ч. Смесь концентрировали и доводили до значения рН=7,5 добавлением водн. NaHCO₃. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой промывали рассолом, сушили (Na₂SO₄) и концентрировали до сухости с получением масла. Неочищенное вещество очищали хроматографией на силикагеле с получением соединения 6 (0,6 г, 17,1%). (S)-энантиомер, пример K, выделяли с помощью методик ферментативного разделения, описанных выше.

Пример L

Получение этил-(3S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(дифторметил)фенил]пропаноата гидрохлорида

Пример L синтезировали, как описано в методике для примера K, но заменяя 3-бром-5-хлорбензальдегид на 3,5-дибромбензальдегид на стадии 1.

Пример 1

Получение (3S)-3-(3,5-дибромфенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Стадия 1

Получение этил-(3S) 3-[3,5-дибромфенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (513,80 мг, 1,667 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3,5-дибромфенил)пропаноата гидрохлорида ((S-сложный эфир примера J, образованный способом ферментативного расщепления липазой) (645,80 мг, 1,667 ммоль) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (52,0 мг, 0,340 ммоль) растворяли в смеси ДМФА (6 мл) и дихлорметана (6 мл), и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин с получением суспензии кремового цвета. Добавляли беспримесный N,N'-диизопропилкарбодиимид (360,0 мкл, 2,325 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного вязкого остатка продукта, этил-(3S)-3-[3,5-дибромфенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата. ЖХ-МС анализ неочищенного остатка демонстрирует массу целевого продукта: m/z 640 (^{79Br, 79Br}M+H), m/z 642 (^{79Br, 81Br}M+H), m/z 644 (^{81Br, 81Br}M+H), m/z 662 (^{79Br, 79Br}M+Na), m/z 664 (^{79Br, 81Br}M+Na) и m/z 666 (^{81Br, 81Br}M+Na); рассчитано для C₂₄H₂₇Br₂N₅O₆: 641,31. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-(3,5-дибромфенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного этил-(3S)-3-[3,5-дибромфенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]безоил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (1,667 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (10 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (350,0 мг, 8,341 ммоль), и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь нейтрализовали TFA (1,0 мл в 10,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 1) (684,2 мг, выход 67%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 612 (^{79Br, 79Br}M+Н), m/z 614 (^{79Br, 81Br}M+Н) и m/z 616 (^{81Br, 81Br}M+H); рассчитано для C₂₂H₂₃Br₂N₅O₆: 613,26. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,74 (d, J=7,10 Гц, 2Н), 3,16 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,33 (d, J=11,25 Гц, 2Н), 3,86 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,08 (brs, 1Н), 5,14 (q, J=7,34 Гц, 1Н), 6,74 (appt, J=2,0 Гц, 1Н), 7,11 (appt, 1Н), 7,14 (appt, J=1,7 Гц, 1Н), 7,56 (d, J=1,71 Гц, 2Н), 7,71 (t, J=1,7 Гц, 1Н), 8,11 (s, 1Н), 8,53 (d, J=7,8 Гц, 1H), 8,64 (t, J=6,0 Гц, 1Н), 9,61 (s, 1H), 10,01 (brs, 1Н), 12,40 (brs, 1H). Спектр ¹H ЯМР образца соответствовал структуре, предложенной для примера 1.

Пример 2

Получение (3S)-3-(3-бром-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Стадия 1

Получение этил-(3S)-3-(3-бром-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусноой кислоты (пример В) (83,0 мг, 0,269 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3-бром-5-(трифторметил)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример F) (102,0 мг, 0,271 ммоль) растворяли в ДМФА (4 мл) и дихлорметане (4 мл) с получением суспензии кремового цвета. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (8,7 мг, 0,057 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (60,0 мкл, 0,387 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветный клейкого остатка продукта, этил-(3S)-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 630 (^79BrM+H), m/z 632 (^81BrM+H), m/z 652 (^79BrM+Na) и m/z 654 (^81BrM+Na); рассчитано для C₂₅H₂₇BrF₃N₅O₆: 630,41. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-(3-бром-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного этил-(3S)-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,344 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (4 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (77,0 мг, 1,83 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Смесь нейтрализовали TFA (1,0 мл в 10,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 2) (124,0 мг, выход 60%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 602 (^79BrM+Н) и m/z 604 (^81BrM+Н); рассчитано для C₂₃H₂₃BrF₃N₅O₆: 602,36. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,78 (d, J=7,3 Гц, 2Н), 3,16 (d, J=12,2 Гц, 2Н), 3,33 (d, J=12,2 Гц, 2Н), 3,87 (d, J=5,8 Гц, 2Н), 4,08 (appt, J=3,07 Гц, 1Н), 5,23 (q, J=7,3 Гц, 1Н), 6,74 (t, J=2,1 Гц, 1Н), 7,11 (t, J=1,8 Гц, 1Н), 7,14 (t, J=1,8 Гц, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,87 (s, 1Н), 8,10 (brs, 2H), 8,61 (d, J=7,9 Гц, 1H), 8,64 (t, J=5,9 Гц, 1H), 9,60 (s, 1H), 10,02 (brs, 1H), 12,41 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 2. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -61,09 (s) и -73,82 (s).

Пример 3

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

Стадия 1

Получение (3S)-этил-3-[3-хлор-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (27,0 мг; 0,088 ммоль), (S)-этил-3-амино-3-(3-хлор-5-(1-(дифторметил)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример L) (27,51 мг, 0,088 ммоль) растворяли в ДМФА (1 мл) и дихлорметане (1 мл) с получением бесцветной суспензи. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (3,0 мг, 0,020 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (20,0 мкл, 0,129 ммоль) перемешивали и реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бледно-желтого вязкого остатка продукта, (3S)-этил-3-(3-хлор-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 568 (^35ClM+H), m/z 570 (^37ClM+Н), m/z 590 (^35ClM+Na) и m/z 592 (^37ClM+Na); рассчитано для C₂₅H₂₈ClF₂N₅O₆: 567,97. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

К суспензии неочищенного (3S)-этил-3-(3-хлор-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата со стадии 1 выше (0,088 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (4 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (20,0 мг, 0,477 ммоль) перемешивали и реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Смесь нейтрализовывали TFA (1 мл в 10,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением желтого клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 3) (41,2 мг, выход 87%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 540 (^35ClM+Н) и m/z 542 (^37ClM+Н), Рассчитано для C₂₃H₂₄ClF₂N₅O₆: 539,92. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,76 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,33 (d, J=10,76 Гц, 2Н), 3,87 (dd/m, 3Н), 4,08 (t, J=3,18 Гц, 1Н), 5,21 (q, J=7,34 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,74 (t, J=2,08 Гц, 1Н), 7,03 (s, 1H), 7,11 (t, J=1,71 Гц, 1H), 7,13 (apt, 1H), 7,53 (brs, 1H), 7,59 (s, 1H), 8,14 (brs, 2H), 8,63 (t, J=5,87 Гц, 1H), 9,67 (brs, 1H), 10,02 (brs, 1H), 12,44 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 3. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -74,12 (s) и -110.28 (d, J=560 Гц).

Пример 4

Получение (3S)-3-[3-бром-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

Получение (3S)-этил-3-[3-бром-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (25,0 мг; 0,081 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3-бром-5-(1-(дифторметил)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример K) (29,08 мг, 0,081 ммоль) растворяли в ДМФА (1 мл) и дихлорметане (1 мл) с получением бесцветной суспензии. К вышеуказанной реакционной смеси добавлили твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (3,0 мг, 0,020 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (20,0 мкл, 0,129 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением желто-оранжевого вязкого остатка продукта, (3S)-этил-3-(3-бром-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 612 (^79BrM+H), m/z 614 (^81BrM+Н), m/z 634 (^79BrM+Na) и m/z 636 (^81BrM+Na); рассчитано для C₂₅H₂₈BrF₂N₅O₆ 612,42. Неочищенный остаток будет использован без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-бром-5-(дифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

К суспензии неочищенного этил-(3S)-3-(3-бром-5-(diфторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата со стадии 1 выше (0,080 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (4 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (18,0 мг, 0,429 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Смесь нейтрализовывали TFA (500 мкл в 5,0 мл CH₃CN) и смесь испаряли в вакууме с получением желтого клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 4) (33,4 мг, выход 71%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 584 (^79BrM+H), m/z 586 (^81BrM+Н), m/z 606 (^79BrM+Na) и m/z 608 (^81BrM+Na); рассчитано для C₂₃H₂₄BrF₂N₅O₆: 584,37. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,76 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (d, J=12,47 Гц, 2Н), 3,33 (d, J=10,76 Гц, 2Н), 3,87 (dd/m, 3Н), 4,08 (t, J=2,90 Гц, 1Н), 5,21 (q, J=7,34 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,74 (t, J=2,08 Гц, 1Н), 7,02 (appt, 1H), 7,14 (appt, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 8,13 (brs, 1H), 8,58 (s, 1H), 8,62 (t, J=5,99 Гц, 1H), 9,65 (brs, 1H), 10,02 (brs, 1H), 12,40 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 4. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -73,81 (s) и -110,23 (d, J=56,0 Гц).

Пример 5

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

Получение (3S)-этил-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (43,0 мг; 0,139 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3-хлор-5-(1-(трифторметил)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример Е) (46,33 мг, 0,139 ммоль) растворяли в ДМФА (1 мл) и дихлорметане (1 мл) с получением бесцветной суспензии. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (4,40 мг, 0,029 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добаляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (32,0 мкл, 0,207 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка продукта, (3S)-этил-3-(3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 586 (^35ClM+Н), m/z 588 (^37ClM+Н), m/z 608 (^35ClM+Na) и m/z 610 (^37ClM+Na); рассчитано для C₂₅H₂₇ClF₃N₅O₆: 585.96. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

К суспензии неочищенного этил-(3S)-3-(3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата со стадии 1 выше (0,139 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (4 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (30.0 мг, 0.715 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Смесь нейтрализовали TFA (1 мл в 10,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением клейкого остатка кремового цвета. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 5) (63,2 мг, выход 81%)). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 558 (^35ClM+Н) и m/z 560 (^37ClM+Н), рассчитано для C₂₃H₂₃ClF₃N₅O₆: 557,91. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,79 (d, J=7,09 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (d, J=11,98 Гц, 2Н), 3,33 (d, J=11,00 Гц, 2Н), 3,87 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,08 (t, J=3,18 Гц, 1Н), 5,24 (q, J=7,09 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,75 (s, 1Н), 7,11 (s, 1H), 7,13 (t, J=2,00 Гц, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,74 (s, 1H), 8,12 (brs, 1H), 8,61 (d, J=8,07 Гц, 1H), 8,65 (t, J=5,75 Гц, 1H), 9,66 (brs, 1H), 10,02 (brs, 1H), 12,43 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 5. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -61,11 (s) и -73,94 (s).

Пример 6

Получение (3S)-3-[3-бром-5-хлор-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

Получение (3S)-этил-3-[3-бром-5-хлор-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (82,0 мг; 0,266 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3-бром-5-хлор-фенил)пропаноата гидрохлорида (синтезированного как в описанных выше способах с использованием в качестве исходного вещества 3-бром-5-хлорбензальдегида) (91,40 мг, 0,266 ммоль) растворяли в ДМФА (1.5 мл) и дихлорметане (1,5 мл) с получением суспензии кремово-оранжевого цвета. К вышеуказанной реакционной смеси добаавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (9,0 мг, 0,059 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (60,0 мкл, 0,387 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением гряжно-желто-оранжевого клейкого остатка продукта, (3S)-этил-3-(3-бром-5-хлор-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 596 (^35Cl,79BrM+H), m/z 598 (^{35Cl,81Br,37Cl,79Br}M+Н)) m/z 600 (^37Cl,81BrM+H); m/z 618 (^35C1,79BrM+Na), m/z 620 (^{35Cl,81Br,37Cl,79Br}M+Na) и m/z 622 (^37Cl,8lBrM+Na); рассчитано для C₂₄H₂₇BrClN₅O₆: 596,86. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-бром-5-хлор-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

К суспензии неочищенного этил-(3S)-3-(3-бром-5-хлор-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата со стадии 1 выше (0,266 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (4 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (56,0 мг, 0.1.334 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 4 ч с получением оранжево-желтого раствора. Смесь нейтрализовывали TFA (1 мл в 10,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 6) (88,7 мг, выход 59%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 568 (^35Cl,79BrM+H)) m/z 570 (^{35Cl,81Br,37Cl,79Br}M+H) и m/z 572 (^37Cl,81BrM+H); рассчитано для C₂₂H₂₃BrClN₅O₆: 568,80. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,74 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -СН₂-СООН), 3,16 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,34 (d, J=11,74 Гц, 2Н), 3,87 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,08 (appt, 1Н), 5,15 (q, J=7,42 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,75 (t, J=1,96 Гц, 1Н), 7,11 (s, 1H), 7,14 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 8,13 (brs, 1H), 8,84 (d, J=8,07 Гц, 1H), 8,64 (t, J=5,87 Гц, 1H), 9,65 (brs, 1H), 10,03 (brs, 1H), 12,45 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 6.

Пример 95

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

Получение этил-(3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата

Смесь 2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]уксусной кислоты (пример D) (56,0 мг, 0,115 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример Е) (38,05 мг, 0,115 ммоль) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (3,5 мг, 0,023 ммоль) растворяли в ДМФА (3 мл) и дихлорметане (3 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 10 мин с получением суспензии кремового цвета. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (25 мкл, 0,161 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого твердого вещества, представляющего собой промежуточный продукт, этил-(3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноат. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 571 (^35ClM+Н), m/z 573 (^37ClM+Н); m/z 5 93 (^35ClM+Na) и m/z 595 (^37ClM+Na); рассчитано для C₂₄H₂₆ClF₃N₆O₅: 570,95. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

К суспензии этил-(3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,115 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (4 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (25,0 мг, 0,596 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь нейтрализовывали TFA (250 мкл в 5 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного остатка. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 7) (46,4 мг, выход 74%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 558 (^35ClM+Н) и m/z 560 (^37ClM+Н); рассчитано для C₂₂H₂₂ClF₃N₆O₅: 542,90. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,79 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,17 (d, J=11,98 Гц, 2Н), 3,36 (d, J=11,98 Гц, 2Н), 3,94 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,11 (brt, 1Н), 5,25 (q, J=7,09 Гц, 1H, -NH-CH-СН₂-СООН), 7,70 (s, 1Н), 7,75 (s, 2Н), 8,02 (s, 1Н), 8,43 (brs, 2Н), 8,59 (brs, 1Н), 8,66 (d, J=8,07 Гц, 1Н), 8,90 (brs, 1H), 9,04 (t, J=5,75 Гц, 1H), 9,92 (s, 1H), 12,41 (brs, 1Н, -СООН). Спектр ¹Н ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 7. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -61,12 (s) и -74,31 (s).

Пример 97

Получение (3S)-3-(3-бром-5-хлор-фенил)-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

Получение этил-(3S)-3-(3-бромо-5-хлор-фенил)-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата

Смесь 2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]уксусной кислоты (пример D) (80,0 мг, 0,164 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-[3-бром-5-хлорфенил)пропаноата гидрохлорида (синтезированного как в описанных выше способах с использованием в качестве исходного вещества 3-бром-5-хлорбензальдегида) (56,15 мг, 0,164 ммоль) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (6,0 мг, 0,039 ммоль) растворяли в ДМФА (3 мл) и дихлорметане (3 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 10 мин с получением суспензии кремового цвета. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (35,0 мкл, 0,226 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного твердого вещества, представляющего собой промежуточный продукт, этил-(3S)-3-[3-бром-5-хлор-фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноат. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 581 (^35Cl,79BrM+H), m/z 583 (^{35Cl,81Br,37Cl,79Br}M+H), m/z 5 8 5 (^37Cl,81BrM+H), m/z 603 (^35Cl,79BrM+Na), m/z 605 (^{35Cl,81Br,37Cl,79Br}M+Na) и m/z 607 (^37Cl,81BrM+Na); рассчитано для C₂₃H₂₆IBrClN₆O₅: 581,85. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-(3-бром-5-хлор-фенил)-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

К суспензии этил-(3S)-3-[3-бром-5-хлор-фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,164 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (35,0 мг, 0,834 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь нейтрализовывали TFA (250 мкл в 5 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного кристаллического твердого вещества. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-50% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 8) (55,0 мг, выход 61%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 553 (^35Cl,79BrM+H), m/Z 555 (^{35Cl,81Br,37Cl,79Br}M+Н) и m/z 557 (^37Cl,81BrM+H); рассчитано для C₂₁H₂₂BrClN₆O₅ 553,79. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,75 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -СН₂-СООН), 3,17 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,36 (d, J=11,00 Гц, 2Н), 3,94 (d, J=5,62 Гц, 2Н), 4,11 (t, J=3,20 Гц, 1Н), 5,16 (q, J=7,42 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-СООН), 7,44 (t, J=1,47 Гц, 1Н), 7,53 (apt, 1Н), 7,60 (t, J=1,83 Гц, 1Н), 8,03 (t, J=2,08 Гц, 1Н), 8,42 (brs, 2H), 8,59 (d, J=7,82 Гц, 1Н), 8,90 (brs, 1H), 9,03 (t, J=5,87 Гц, 1H), 9,90 (s, 1H), 12,42 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 8.

Пример 9

Получение (3S)-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

Получение этил-(3S)-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата

Смесь 2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]уксусной кислоты (пример D) (64,0 мг, 0,131 ммоль), этил-(35)-3-амино-3-(3-бром-5-(трифторметил)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример F) (49,31 мг, 0,131 ммоль) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (5,0 мг, 0,033 ммоль) растворяли в ДМФА (3 мл) и дихлорметане (3 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 10 мин с получением суспензии кремового цвета. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (30,0 мкл, 0,194 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого твердого вещества, представляющего собой промежуточный продукт, этил-(3S)-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноат. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 615 (^79BrM+Н), m/z 617 (^81BrM+H), m/z 637 (^79BrM+Na) и m/z 639 (^81BrM+Na); рассчитано для C₂₄H₂₆BrF₃N₆O₅: 615,40. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

К суспензии этил-(3S)-3-[3-бром-5-(трифторметил)фенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,131 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (30,0 мг, 0,715 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь нейтрализовывали TFA (250 мкл в 5 мл CH₃CN) и испаряли смесь в вакууме с получением бесцветного кристаллического твердого вещества. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 9) (69,6 мг, выход 90%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 587 (^79BrM+H), m/z 589 (^81BrM+H), m/z 609 (^79BrM+Na) и m/z 611 (^81BrM+Na); рассчитано для C₂₂H₂₂BrF₃N₆O₅: 587,35. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,79 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -СН₂-СООН), 3,17 (d, J=12,47 Гц, 2Н), 3,36 (d, J=11,74 Гц, 2Н), 3,94 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,11 (brt, 1Н), 5,24 (q, J=7,25 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 7,73 (s, 1Н), 7,85 (s, 1H), 8,02 (t, J=2,08 Гц, 1H), 8,43 (brs, 2H), 8,59 (d, J=1,96 Гц, 1H), 8,66 (d, J=8,07 Гц, 1H), 8,90 (s, 1H), 9,05 (t, J=5,75 Гц, 1H), 9,92 (s, 1H), 12,43 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 9. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -61,10 (s) и -74,47 (s).

Пример 10

Получение (3S)-3-[3,5-бис(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

Получение этил-(3S)-3-[3,5-бис(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (65,50 мг; 0,212 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3,5-бис(1-(трифторметил)фенил)пропаноата гидрохлорида (синтезированного как в описанных выше способах с использованием в качестве исходного вещества 3,5-бистрифторметилбензальдегида) (77,70 мг, 0,212 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) с получением бесцветной суспензии. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (7,0 мг, 0,046 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (45,0 мкл, 0,291 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветный клейкого остатка продукта, этил-(3S)-3-(3,5-бис(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 620 (М+Н) и m/z 642 (M+Na); рассчитано для C₂₆H₂₇F₆N₅O₆: 619,51. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3,5-бис(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропановой кислоты

К суспензии неочищенного этил-(3S)-3-(3,5-бис(трифторметил)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата со стадии 1 выше (0,212 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (45,0 мг, 1,072 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь нейтрализовывали TFA (250 мкл в 5,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-60% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 10) (69,2 мг, выход 55%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 592 (М+Н) и m/z 614 (M+Na), рассчитано для C₂₄H₂₃F₆N₅O_6: 591,46. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,83 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -СН₂-СООН), 3,15 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,33 (brd, J=10,67 Гц, 2Н), 3,87 (d, J=5,62 Гц, 2Н), 4,08 (d, J=3,18 Гц, 1Н), 5,33 (q, J=7,09 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,74 (t, J=2,08 Гц, 1Н), 7,10 (appt, 1H), 7,13 (appt, 1H), 7,85-8,22 (m, 4H), 8,48-8,93 (m, 2H), 9,64 (s, 1H), 10,02 (brs, 1H), 12,45 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 10. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -61,14 (s) и -73,73 (s).

Пример 11

Получение (3S)-3-[3-бром-5-метил-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Получение метил-(3S)-3-[3-бром-5-метил-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (94,70 мг, 0,307 ммоль), метил-(3S)-3-амино-3-(3-бром-5-метил-фенил)пропаноата гидрохлорида (синтезированного как в описанных выше способах с использованием в качестве исходного вещества 3-бром-5-метил-бензальдегида) (94,80 мг, 0,307 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) с получением суспензии кремового цвета. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (10,20 мг, 0,067 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавяли N,N'-диизопропилкарбодиимид (70 мкл, 0,452 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка продукта, метил-(3S)-3-[3-бром-5-метил-фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 562 (^79BrM+H), m/z 564 (^81BrM+H), m/z 584 (^79BrM+Na) и m/z 586 (^81BrM+Na), Рассчитано для C₂₄H₂₈BrN₅O₆: 562,41. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-бром-5-метил-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного метил-(3S)-3-[3-бром-5-метил-фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,307 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (65 мг, 1,55 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь нейтрализовывали TFA (500 мкл в 5,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-50% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 11) (105,3 мг, выход 62%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 548 (^79BrM+H) и m/z 550 (^81BrM+Н); рассчитано для C₂₃H₂₆BrN₃O₆: 548,39. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,28 (s, 3Н, СН₃-), 2,70 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,34 (d, J=11,98 Гц, 2Н), 3,86 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,09 (t, J=2,90 Гц, 1H), 5,13 (q, J=7,50 Гц, 1Н, -NH-CH-СН₂-СООН), 6,74 (t, J=1,96 Гц, 1H), 7,11 (s, 1Н), 7,14 (appt, 1H), 7,28 (apt, 1H), 7,31 (apt, 1H), 8,13 (brs, 1H), 8,48 (d, J=8,31 Гц, 1H), 8,61 (t, J=5,87 Гц, 1H), 9,64 (s, 1H), 10,02 (brs, 1Н), 12,37 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 11.

Пример 12

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-метил-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Получение этил-(3S) 3-(3-хлор-5-метил-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (81,80 мг, 0,265 ммоль), (S)-этил-3-амино-3-(3-хлор-5-метил-фенил)пропаноата гидрохлорида (синтезированного как в описанных выше способах с использованием в качестве исходного вещества 3-хлор-5-метил-бензальдегида) (73,81 мг, 0,265 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) с получением суспензии кремового цвета. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (8,4 мг, 0,055 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (60 мкл, 0,390 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка продукта, этил-(3S)-3-[3-хлор-5-метил-фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 532 (^35ClM+H), m/z 534 (^37ClM+Н), m/z 554 (^35ClM+Na) и m/z 556 (^37ClM+Na), рассчитано для C₂₅H₃₀ClN₅O₆: 531,99. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-метил-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного этил-(3S)-3-[3-хлор-5-метил-фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,265 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (56 мг, 1,334 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь нейтрализовывали TFA (500 мкл в 5,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветный вязкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-50% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 12) (89,4 мг, выход 67%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 504 (^35ClM+Н), m/z 506 (^37ClM+H), m/z 526 (^35ClM+Na) и m/z 528 (^37ClM+Н); рассчитано для C₂₃H₂₆ClN₅O₆: 503,94. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,29 (s, 3Н, CH₃-), 2,70 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (d, J=11,98 Гц, 2Н), 3,34 (d, J=11,00 Гц, 2Н), 3,86 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,09 (appt/m, 1Н), 5,14 (q, J=7,25 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,74 (t, J=1,96 Гц, 1Н), 7,11 (d, J=1,47 Гц, 2H), 7,14 (appt, 2H), 7,18 (s, 1H), 8,14 (br s, 2H), 8,48 (d, J=8,31 Гц, 1H), 8,61 (t, J=5,99 Гц, 1H), 9,67 (s, 1H), 10,03 (brs, 1H), 12,32 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 12.

Пример 107

Получение (3S)-3-[3-бром-5-фторфенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Получение этил-(3S) 3-[3-бром-5-фторфенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо]пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (79,50 мг, 0,258 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3-бром-5-фторфенил)пропаноата гидрохлорида (синтезированного как в описанных выше способах с использованием в качестве исходного вещества 3-бром-5-фторбензальдегида) (84,22 мг, 0,258 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) с получением суспензии кремового цвета. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (8,0 мг, 0,052 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (60 мкл, 0,387 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка продукта, этил-(3S)-3-[3-бром-5-фторфенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 580 (^79BrM+H), m/z 582 (^81BrM+H), m/z 602 (^79BrM+Na) и m/z 604 (^81BrM+Na), рассчитано для C₂₄H₂₇BrFN₅O₆: 580.40. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-бром-5-фторфенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного этил-(3S)-3-[3-бром-5-фторфенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,258 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (55 мг, 1,32 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Смесь нейтрализовывали TFA (250 мкл в 5,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-50% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 13) (110,3 мг, выход 77%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 552 (^79BrM+Н) и m/z 554 (^81BrM+Н); рассчитано для C₂₂H₂₃BrFN₅O₆: 552,35. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,74 (d, J=7,58 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,34 (d, J=10,80 Гц, 2Н), 3,87 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,08 (t, J=3,18 Гц, 1Н), 5,17 (q, J=7,34 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,75 (t, J=1,96 Гц, 1Н), 7,11 (t, J=1,47 Гц, 1H), 7,14 (appt, 1H), 7,21 (t, J=1,71 Гц, 1H), 7,24 (appt, 1H), 7,41 (m, 2H), 8,13 (brs, 1H), 8,53 (d, J=8,07 Гц, 1H), 8,64 (t, J=5,75 Гц, 1H), 9,66 (brs, 1H), 10,03 (brs, 1H), 12,40 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 13. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -74,07 (s) и -110,57 (t, J=8,85 Гц).

Пример 109

Получение (3S)-3-(3,5-дибромфенил)-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

Получение этил-(3S)-3-(3,5-дибромфенил)-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата

Смесь 2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]уксусной кислоты (пример D) (78,0 мг, 0,266 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3,5-дибромфенил)пропаноата гидрохлорида ((5)-сложный эфир примера J, образованный в результате способа ферментативного расщепления липазой) (103,06 мг, 0,266 ммоль) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (8,15 мг, 0,053 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 10 мин с получением суспензии кремового цвета. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (60,0 мкл, 0,387 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного кристаллического твердого вещества, представляющего собой промежуточный продукт, этил-(3S)-3-[3,5-дибромфенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноат. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 625 (^79Br,79BrM+Н), m/z 627 (^79Br,81BrM+H), m/z 629 (^81Br,81BrM+H), m/z 647 (^79Br,79BrM+Na), m/z 649 (^79Br,81BrM+Na) и m/z 651 (^81Br,81BrM+Na); рассчитано для C₂₃H₂₆Br₂N₆O₄: 626,30. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-(3,5-дибромфенил)-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропановой кислоты

К суспензии этил-(3S)-3-[3,5-дибромфенил]-3-[[2-[[5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]пиридин-3-карбонил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,266 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (56,0 мг, 0.1.334 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь нейтрализовывали TFA (250 мкл в 5 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного кристаллического/клейкого твердого вещества. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-50% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 14) (82,5 мг, выход 52%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 597 (^79Br,79BrM+H), m/z 599 (^79Br,81BrM+H) и m/z 601 (^81Br,81BrM+H); рассчитано для C₂₁H₂₂Br₂N₆O₅: 598,24. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,74 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,17 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,36 (d, J=11,0 Гц, 2Н), 3,93 (d, J=5,62 Гц, 2Н), 4,11 (t, J=3,06 Гц, 1Н), 5,15 (q, J=7,42 Гц, 1H, -NH-CH-CH₂-COOH), 7,57 (d, J=1,71 Гц, 1Н), 7,72 (s, 1H), 8,03 (t, J=2,20 Гц, 1H), 8,42 (brs, 1H), 8,59 (m, 2H), 8,90 (d, J=1,71 Гц, 1H), 9,03 (t, J=5,75 Гц, 1H), 9,88 (s, 1H), 12,42 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 14.

Пример 111

Получение (3S)-3-[3,5-дихлор-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Получение этил-(3S) 3-(3,5-дихлорфенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (87,0 мг, 0,282 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3,5-дихлорфенил)пропаноата гидрохлорида (пример I) (84,26 мг, 0,282 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) с получением суспензии кремового цвета. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (9,0 мг, 0,059 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (65 мкл, 0,420 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением бесцветного клейкого остатка продукта, этил-(3S)-3-[3,5-дихлорфенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 552 (^35ClM+Н), m/z 554 (^37ClM+Н), m/z 574 (^35ClM+Na) и m/z 576 (^37ClM+Na), рассчитано для C₂₄H₂₇Cl₂N₅O₆: 552,41 Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3,5-дихлор-фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного этил-(3S)-3-[3,5-хлорфенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,282 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (60 мг, 1,43 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь нейтрализовывали TFA (100 мкл в 5,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного вязкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-50% CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 15) (101,2 мг, выход 68%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 524 (^35ClM+Н) и m/z 526 (^37ClM+Н); рассчитано для C₂₂H₂₃Cl₂N₅O₆: 524,35. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,75 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (brd, J=11,98 Гц, 2Н), 3,33 (brd, J=12,23 Гц, 2Н), 3,87 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,08 (brs, 1H), 5,15 (q, J=7,17 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-COOH), 6,75 (t, J=2,08 Гц, 1H), 7,11 (appt, 1H), 7,14 (appt, 1H), 7,40 (d, J=1,96 Гц, 1H), 7,49 (appt, 1H), 8,12 (s, 2H), 8,54 (d, J=8,07 Гц, 1H), 8,64 (t, J=5,87 Гц, 1H), 9,64 (s, 1H), 10,02 (brs, 1H), 12,40 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 15.

Пример 16

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Получение этил-(3S)-3-(3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (61,0 мг, 0,198 ммоль), этил-(3S)-3-амино-3-(3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример G) (68,89 мг, 0,198 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) с получением суспензии кремового цвета. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (6,1 мг, 0,040 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (46 мкл, 0,297 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением клейкого остатка продукта кремового цвета, этил-(3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 602 (^35ClM+Н), m/z 604 (^37ClM+H), m/z 624 (^35ClM+Na) и m/z 626 (^37ClM+Na), рассчитано для C₂₅H₂₇ClF₃N₅O₇: 601,96. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного этил-(3S)-3-[3-хлор-5-(трифторметокси)фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноата со стадии 1 выше (0,198 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (42 мг, 1.10 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь нейтрализовывали TFA (100 мкл в 5,0 мл CH₃CN) и смесь в вакууме с получением бесцветный вязкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 16) (69,50 мг, выход 61%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 574 (^35ClM+H), m/z 576 (^37ClM+Н), m/z 596 (^35ClM+Na) и m/z 598 (^37ClM+Na), рассчитано для C₂₃H₂₃ClF₃N₅O₇: 573,91. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,76 (d, J=7,34 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,17 (d, J=12,47 Гц, 2Н), 3,34 (d, J=12,72 Гц, 2Н), 3,88 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,09 (t, J=3,20 Гц, 1H), 5,21 (q, J=7,17 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-СООН), 6,76 (t, J=2,08 Гц, 1Н), 7,12 (t, J=1,59 Гц, 1Н), 7,14 (t, J=1,00 Гц, 1Н), 7,35 (s, 1Н), 7,45 (d, J=0,73 Гц, 1Н), 7,49 (t, J=1,47 Гц, 1Н), 8,13 (brs, 1Н), 8,58 (d, J=7,82 Гц, 1Н), 8,65 (t, J=5,87 Гц, 1Н), 9,64 (s, 1H), 10,03 (brs, 1Н), 12,44 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 16. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -56,83 (s) и -73,70 (s).

Пример 17

Получение (3S)-3-(3-бром-5-(трифторметокси)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

Получение этил-(3S) 3-(3-бром-5-(трифторметокси)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропаноата

Смесь 2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)уксусной кислоты (пример В) (65,0 мг, 0,211 ммоль), (S)-этил-3-амино-3-(3-бром-5-(трифторметокси)фенил)пропаноата гидрохлорида (пример Н) (82,75 мг, 0,211 ммоль) растворяли в ДМФА (2 мл) и дихлорметане (2 мл) с получением бесцветной суспензии. К вышеуказанной реакционной смеси добавляли твердый гидрат 1-гидроксибензотриазола (7,0 мг, 0,046 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (50 мкл, 0,323 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Растворитель испаряли в вакууме с получением клейкого остатка продукта кремового цвета, этил-(3S)-3-[3-бром-5-(трифторметокси)фенил]-3-[[2-[[3-гидрокси-5-[(5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино]бензоил]амино]ацетил]амино]пропаноаат. Анализ неочищенного остатка с помощью ЖХ-МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 646 (^79BrM+H), m/z 648 (^81BrM+H), m/z 668 (^79BrM+Na) и m/z 670 (^81BrM+Na), Рассчитано для C₂₅H₂₇BrF₃N₅O₇: 646,41. Неочищенный остаток использовали без дополнительной очистки для реакции омыления на стадии 2.

Стадия 2

Получение (3S)-3-(3-бром-5-(трифторметокси)фенил)-3-(2-(3-гидрокси-5-((5-гидрокси-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-ил)амино)бензамидо)ацетамидо)пропановой кислоты

К раствору неочищенного продукта (0,211 ммоль) со стадии 1 выше в смеси ацетонитрил/вода с соотношением 1:1 (6 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат гидроксида лития (48 мг, 1,144 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь нейтрализовывали TFA (0,1 мл в 5,0 мл CH₃CN) и испаряли в вакууме с получением бесцветного вязкого остатка. Вышеуказанный неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом 10-70% раствора CH₃CN в воде, содержащего 0,05% TFA, с получением целевого продукта, после лиофилизации, в виде бесцветного лиофилизированного твердого вещества (пример 17) (83,2 мг, выход 64%). Анализ продукта с помощью ЖХ/МС демонстрирует массу целевого продукта: m/z 618 (^79BrM+Н), m/z 620 (^81BrM+Н), m/z 640 (^79BrM+Na) и m/z 642 (^81BrM+Na), рассчитано для C₂₃H₂₃BrF₃N₅O₇: 618,36. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 2,75 (d, J=7,09 Гц, 2Н, -CH₂-СООН), 3,16 (d, J=12,23 Гц, 2Н), 3,33 (d, J=11,25 Гц, 2Н), 3,87 (d, J=5,87 Гц, 2Н), 4,08 (t, J=3,20 Гц, 1Н), 5,19 (q, J=7,42 Гц, 1Н, -NH-CH-CH₂-СООН), 6,75 (t, J=1,96 Гц, 1Н), 7,11 (appt, 1Н), 7,14 (t, J=1,70 Гц, 1Н), 7,38 (s, 1Н), 7,55 (s, 1H), 7,61 (s, 1Н), 8,12 (brs, 1Н), 8,58 (d, J=7,82 Гц, 1Н), 8,64 (t, J=5,87 Гц, 1Н), 9,63 (brs, 1H), 10,02 (brs, 1Н), 12,42 (brs, 1H, -COOH). Спектр ¹H ЯМР продукта соответствовал структуре, предложенной для примера 17. ¹⁹F ЯМР (376 МГц, ДМСО-d₆): δ -56,81 (s) и -73,81 (s).

С.Результаты биологического анализа

В следующих анализах и экспериментальных исследованиях были протестированы активности соединений согласно настоящему изобретению и соединений сравнения. Результаты представлены в таблицах 2, 3 и 4, и на фиг. 1.

1. Твердофазный рецепторный анализ (SPRA) функции α5β1

Очищенный фибронектин человека (R&D Systems, 1918-FN), разбавленный до 2 мкг/мл в буфере TBS+ (25 мМ Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ MnCl₂), добавляли в лунки (50 мкл/лунку) 96-луночного прозрачного микротитровального планшета с половинным объемом лунок (Greiner 675061) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки трижды промывали 150 мкл TBS+ и добавляли 150 мкл блокирующего буфера (TBS+с 1% бычьего сывороточного альбумина, Sigma А7906). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем трижды промывали буфером TBS+. Рекомбинантный интегрин человека α5β1 (R&D Systems, 3230-А5) разбавляли до 0,1 мкг/мл в TBS+/0,1% бычьего сывороточного альбумина. Соединения разбавляли 1:100 в раствор интегрина и затем добавляли 50 мкл в пустые лунки промытого планшета, покрытого фибронектином, в соответствии со стандартной матрицей, причем каждый образец повторяли трижды. После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре планшет трижды промывали 150 мкл буфера TBS+. В каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного анти-α5 антитела (R&D Systems, BAF1864) с концентрацией 0,5 мкг/мл в TBS+/0,1% BSA и планшет покрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки планшета 150 мкл буфера TBS+ в лунки добавляли 50 мкл конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (R&D Systems, DY998), разбавленной в блокирующем буфере TBS+, и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшет трижды промывали буфером TBS+, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (Sigma, Т444) комнатной температуры и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали посредством колориметрического детектирования при длине волны 650 нм с помощью ридера для планшетов Tecan Safire II. Кривые концентрация-эффект строили методом нелинейного регрессионного анализа (наилучшее приближение) и рассчитывали значения IC₅₀ для каждого соединения.

2. Твердофазный рецепторный анализ (SPRA) функции αvβ1

Очищенный фибронектин человека (R&D Systems, 1918-FN), разбавленный до 5 мкг/мл в буфере TBS+ (25 мМ Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ MnCl₂), добавляли в лунки (50 мкл/лунку) 96-луночного прозрачного микротитровального планшета с половинным объемом лунок (Greiner 675061) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки трижды промывали 150 мкл TBS+ и добавляли 150 мкл блокирующего буфера (TBS+ с 1% бычьего сывороточного альбумина, Sigma А7906). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем трижды промывали буфером TBS+. Рекомбинантный интегрин человека αvβ1 (R&D Systems. 6579-AV) разбавляли до 2,0 мкг/мл в TBS+/0,1% бычьего сывороточного альбумина. Соединения разбавляли 1:100 в раствор интегрина и добавляли 50 мкл в пустые лунки промытого планшета, покрытого фибронектином, в соответствии со стандартной матрицей, причем каждый образец повторяли трижды. После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре планшет трижды промывали 150 мкл буфера TBS+. В каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного анти-αv антитела (R&D Systems, BAF1219) с концентрацией 1 мкг/мл в TBS+/0,1% BSA и планшет покрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки планшета 150 мкл буфера TBS+ в лунки добавляли 50 мкл конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (R&D Systems, DY998), разбавленной в блокирующем буфере TBS+, и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшет трижды промывали буфером TBS+, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (Sigma, Т444) и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали посредством колориметрического детектирования при длине волны 650 нм с помощью ридера для планшетов Tecan Safire II. Кривые концентрация-эффект строили методом нелинейного регрессионного анализа (наилучшее приближение) и рассчитывали значения IC₅₀ для каждого соединения.

3. Твердофазный рецепторный анализ (SPRA) функции αvβ3

Рекомбинантный витронектин человека (R&D Systems, 2308-VN), разбавленный до 1 мкг/мл в буфере TBS+ (25 мМ Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂ 1 мМ MnCl₂), добавляли в лунки (50 мкл/лунку) 96-луночного прозрачного микротитровального планшета с половинным объемом лунок (Greiner 675061) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки трижды промывали 150 мкл TBS+ и добавляли 150 мкл блокирующего буфера (TBS+ с 1% бычьего сывороточного альбумина, Sigma А7906). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем трижды промывали буфером TBS+. Рекомбинантный интегрин человека αvβ3 (R&D Systems, 3050-AV) разбавляли до 1 мкг/мл в TBS+/0,1% бычьего сывороточного альбумина. Соединения разбавляли 1:100 в раствор интегрина и затем добавляли 50 мкл в пустые лунки промытого планшета, покрытого витронектином, в соответствии со стандартной матрицей, причем каждый образец повторяли трижды. После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре планшет трижды промывали 150 мкл буфера TBS+. В каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного анти-αv антитела (R&D Systems, BAF1219) с концентрацией 0,5 мкг/мл в TBS+/0,1% BSA и планшет покрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки планшета 150 мкл буфера TBS+ в лунки добавляли 50 мкл конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (R&D Systems, DY998), разбавленной в блокирующем буфере TBS+, и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшет трижды промывали буфером TBS+, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (Sigma, Т444) и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали посредством колориметрического детектирования при длине волны 650 нм с помощью ридера для планшетов Tecan Safire II. Кривые концентрация-эффект строили методом нелинейного регрессионного анализа (наилучшее приближение) и рассчитывали значения IC₅₀ для каждого соединения.

4. Твердофазный рецепторный анализ (SPRA) функции αvβ5

Рекомбинантный витронектин человека (R&D Systems, 2308-VN) с концентрацией 0,25 мкг/мл в буфере TBS+ (25 мМ Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ MnCl₂) добавляли в лунки (50 мкл/лунку) 96-луночного прозрачного микротитровального планшета с половинным объемом лунок (Greiner 675061) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки трижды 150 мкл TBS+ и добавляли 150 мкл блокирующего буфера (TBS+ с 1% бычьего сывороточного альбумина, Sigma А7906). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем трижды промывали буфером TBS+. Рекомбинантный интегрин человека αvβ5 (R&D Systems, 2528-AV) разбавляли до 1 мкг/мл в TBS+/0,1% бычьего сывороточного альбумина. Соединения разбавляли 1:100 в раствор интегрина и затем добавляли 50 мкл в пустые лунки промытого планшета, покрытого витронектином, в соответствии со стандартной матрицей, причем каждый образец повторяли трижды. После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре планшет трижды промывали 150 мкл буфера TBS+. В каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного анти-αv антитела (R&D Systems, BAF1219) с концентрацией 0,5 мкг/мл в TBS+/0,1% BSA с концентрацией 0,5 мкг/мл и планшет покрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки планшета 150 мкл буфера TBS+ в лунки добавляли 50 мкл конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (R&D Systemsm DY998), разбавленной в блокирующем буфере TBS+, и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшет трижды промывали буфером TBS+, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (Sigma Т444) и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали посредством колориметрического детектирования при длине волны 650 нм с помощью ридера для планшетов Tecan Safire II. Кривые концентрация-эффект строили методом нелинейного регрессионного анализа (наилучшее приближение) и рассчитывали значения IC₅₀ для каждого соединения.

5. Твердофазный рецепторный анализ (SPRA) функции αvβ6

Рекомбинантный LAP человека (R&D Systems, 246-LP), разбавленный до 0,25 мкг/мл в буфере TBS+ (25 мМ Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ MnCl₂), добавляли в лунки (50 мкл/лунку) 96-луночного прозрачного микротитровального планшета с половинным объемом лунок (Greiner 675061) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки трижды промывали 150 мкл TBS+ и добавляли 150 мкл блокирующего буфера (TBS+ с 1% бычьего сывороточного альбумина, Sigma А7906). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем трижды промывали буфером TBS+. Рекомбинантный интегрин человека αvβ6 (R&D Systems, 3817-AV) разбавляли до 1 мкг/мл в TBS+/0,1% бычьего сывороточного альбумина. Соединения разбавляли 1:100 в раствор интегрина и затем добавляли 50 мкл в пустые лунки промытого планшета, покрытого LAP, в соответствии со стандартной матрицей, причем каждый образец повторяли трижды. После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре планшет трижды промывали 150 мкл буфера TBS+. В каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного анти-αv антитела (R&D Systems, BAF1219) с концентрацией 0,5 мкг/мл в TBS+/0,1% BSA и планшет покрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки планшета 150 мкл буфера TBS+ в лунки добавляли 50 мкл конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (R&D Systems, DY998), разбавленной в блокирующем буфере TBS+, и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшет трижды промывали буфером TBS+, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (Sigma Т444) и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали посредством колориметрического детектирования при длине волны 650 нм с помощью ридера для планшетов Tecan Safire II. Кривые концентрация-эффект строили методом нелинейного регрессионного анализа (наилучшее приближение) и рассчитывали значения IC₅₀ для каждого соединения.

6. Твердофазный рецепторный анализ (SPRA) функции αvβ8

Рекомбинантный белок LAP человека (R&D Systems, Inc, 246-LP), разбавленный до 0,5 мкг/мл в буфере TBS+ (25 мМ Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, ₁ мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ MnCl₂), добавляли в лунки (50 мкл/лунку) 96-луночного прозрачного микротитровального планшета с половинным объемом лунок (Greiner 675061) и инкубировали в течение ночи при 4°С.Лунки трижды промывали 150 мкл TBS+ и добавляли 150 мкл блокирующего буфера (TBS+ с 1% бычьего сывороточного альбумина, Sigma А7906). Планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°С и затем трижды промывали TBS+. Рекомбинантный интегрин человека αvβ8 (R&D Systems, 4135-AV) разбавляли до 1 мкг/мл в TBS+/0,1% бычьего сывороточного альбумина. Соединения разбавляли 1:100 в раствор интегрина и добавляли 50 мкл в пустые лунки промытого планшета, покрытого LAP, в соответствии со стандартной матрицей, причем каждый образец повторяли трижды. После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре планшет трижды промывали 150 мкл TBS+. В каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного анти-αv антитела (R&D Systems, BAF1219) с концентрацией 1 мкг/мл в TBS+/0,1% BSA и планшет покрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки планшета 150 мкл буфера TBS+ в лунки добавляли 50 мкл конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (R&D Systems, DY998), разбавленной в блокирующем буфере TBS+, и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшет трижды промывали TBS+, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (Sigma Т444) и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали посредством колориметрического детектирования при длине волны 650 нм с помощью ридера для планшетов Tecan Safire II. Кривые концентрация-эффект строили методом нелинейного регрессионного анализа (наилучшее приближение) и рассчитывали значения IC₅₀ для каждого соединения.

7. Твердофазный рецепторный анализ (SPRA) функции α8β1

Рекомбинантный белок нефронектин мыши (R&D Systems, Inc, 4298-NP), разбавленный до 1 мкг/мл в буфере TBS+(25 мМ Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ MnCl₂), добавляли в лунки (50 мкл/лунку) 96-луночного прозрачного микротитровального планшета с половинным объемом лунок (Greiner 675061) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки трижды промывали 150 мкл TBS+ и добавляли 150 мкл блокирующего буфера (TBS+ с 1% бычьего сывороточного альбумина, Sigma А7906). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем трижды промывали TBS+. Рекомбинантный интегрин человека α8β1 (R&D Systems, предварительный выпуск) разбавляли до 0,25 мкг/мл в TBS+/0,1% бычьего сывороточного альбумина. Соединения разбавляли 1:100 в раствор интегрина и добавляли 50 мкл в пустые лунки промытого планшета, покрытого нефронектином, в соответствии со стандартной матрицей, причем каждый образец повторяли трижды. После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре планшет трижды промывали 150 мкл TBS+. В каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного анти-β1 антитела (R&D Systems, BAF1778) с концентрацией 0,5 мкг/мл в TBS+/0,1% BSA и планшет покрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки планшета 150 мкл буфера TBS+ в лунки добавляли 50 мкл конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (R&D Systems, DY998), разбавленной в блокирующем буфере TBS+, и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшет трижды промывали TBS+, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (Sigma Т444) и инкубировали планшет в течение 20 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали посредством колориметрического детектирования при длине волны 650 нм с помощью ридера для планшетов Tecan Safire II. Кривые концентрация-эффект строили методом нелинейного регрессионного анализа (наилучшее приближение) и рассчитывали значения IC₅₀ для каждого соединения.

D. Фармакокинетический анализ

1. Материалы

Минимальный достаточный объем диметилсульфоксида (ДМСО) добавляли к каждому исследуемому соединению для достижения солюбилизации. Затем для внутривенной (в/в) доставки из соединений получали растворы в глицеролформале : физиологическом растворе (20:80 или 40:60 об./об.) (Sigma Chemicals, Сент-Луис). Для перорального (п/о) введения соединения смешивали с 0,5% метилцеллюлозы. Пять-шесть растворов соединений объединяли в отдельный смешанный раствор для в/в и п/о кассетного введения с конечными концентрациями ДМСО <0,6% или <1,2% для в/в и п/о кассет соответственно. Аналиты обнаруживали в тестовых образцах с помощью системы ЖХ/МС/МС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия), состоящей из насоса LC-20AD (Shimadzu, Киото, Япония), автоматического дозатора НТС PAL (Leap technologies, Каррборо, Северная Каролина) и масс-спектрометра Sciex API-4000 в режиме ЭСИ (электроспрея) (АВ Sciex, Фостер Сити, Калифорния). Для хроматографического разделения использовали колонку с обращенной фазой Amour C₁₈ (Analytical Sales and Services, Помптон Плейнс, Нью-Джерси).

2. Протоколы экспериментов

В фармакокинетических (ФК) исследованиях, проведенных в Сент-Луисском университете, использовали самцов крыс линии Спрег-Доули с первоначальной массой тела от 200 до 220 г. В/в ФК исследования проводили со следующими соединениями: примерами 1-3 и 5-17 и соединениями сравнения С12-С18, С29 и С30. Животным давали свободный доступ к пище и воде. Крыс индивидуально размещали и присоединяли катетеры яремной вены. Каждый кассетный состав вводили внутривенно двум крысам (1 мл/кг массы тела). Каждый кассетный состав содержал 5-6 соединений с концентрацией 1 мг/кг в 20:80 или 40/60 глицеролформале/физиологическом растворе (об./об.). Кровь брали вручную через катетер в пробирки с литий-гепарином через 0,017, 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 6 и 24 часа после введения дозы. В конце эксперимента животные были подвергнуты эвтаназии с помощью CO₂.

Пероральные ФК исследования проводили со следующими соединениями: соединениями примеров 1-3 и 5-17 и сравнительными соединениями С12, С14-16 и С29-30. П/о кассетные составы, содержащие 5-6 соединений на кассету, вводили через желудочный зонд двум крысам (10 мл/кг массы тела). Вводимая пероральная доза составляла 2 мг/кг/соединения в 0,5% метилцеллюлозы. Кровь брали через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6 и 24 часа после введения дозы в пробирки с литий-гепарином. В конце эксперимента животные были подвергнуты эвтаназии с помощью CO₂.

Ко всем образцам добавляли внутренний стандарт в концентрации 200 нг/мл (окончательной), а также 150 мкл ацетонитрила. Образцы плазмы (общим объемом 50 мкл) разбавляли необходимым количеством контрольной плазмы крови не подвергавшихся воздействию крыс, чтобы привести измерение образца к линейному динамическому диапазону градуировочной кривой. Образцы закрывали и перемешивали на многопланшетной вихревой мешалке в течение 5 минут и центрифугировали в течение 5 минут при 3200 об/мин. Супернатант переносили в 96-луночный планшет для образцов и закрывали для анализа с помощью ЖХ/МС/МС. Соединения оптимизировали и контролировали их соответствующие MRM (в режиме масс-селективной регистрации) переходы. Подвижные фазы состояли из 0,1% муравьиной кислоты (водной) и 100% ацетонитрила (органического) с колонкой с обращенной фазой Amour C₁₈ (2,1×30 мм, 5 мкм) со скоростью потока 0,35 мл/мин. Начальная фаза представляла собой 10% ацетонитрила в течение 0,9 мин, а затем повышалась до 90% ацетонитрила в течение 0,4 мин и поддерживалась в течение еще 0,2 мин перед возвращением к 10% ацетонитрила в течение 0,4 мин. 10% ацетонитрила выдерживали в течение еще 1,6 мин. Площади пиков интегрировали с помощью Analyst 1.5.1 (АВ Sciex, Фостер Сити, Калифорния).

Аналогичные ФК исследования на крысах для соединений сравнения С19-С28 проводила компания PRESCOS, LLC (Сан-Диего, Калифорния). Использовались самки крыс линии Спрег-Доули с первоначальной массой тела от 195 до 220 г. Кассетные составы с 1 мг/кг/соединение в 40/60 глицеролформале/физиологическом растворе внутривенно вводили трем крысам. Объем дозы для каждого животного составлял 5 мл/кг массы тела. Образцы крови брали через катетер яремной вены через 0,017, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 и 8 ч после введения дозы в пробирки с К₂-ЭДТА (двухзамещенная калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). В конце эксперимента животные были подвергнуты эвтаназии с помощью CO₂. Обработку образцов и измерение соединений с помощью ЖХ/МС/МС выполняла компания НТ Laboratories (Сан-Диего, Калифорния).

AUC соединений примеров, описанных в настоящем документе, и выбранных соединений сравнения определяли после разового перорального (п/о) введения дозы 2 мг/кг крысе, демонстрируя улучшенную концентрация соединений примеров согласно настоящему изобретению в плазме крови.

Все соединения, композиции и способы, раскрытые и заявленные в настоящем документе, могут быть получены и выполнены без проведения излишних экспериментов в свете настоящего изобретения. Хотя соединения, композиции и способы согласно настоящему изобретению были описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники будет очевидно, что композиции и способы, а также стадии или последовательность стадий способов, описанных в настоящем документе, могут включать вариации без отступления от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые агенты, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены агентами, описанными в настоящем документе, и при этом будут достигнуты одинаковые или схожие результаты. Все таковые схожие замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

ЦИТИРУЕМЫЕ ИСТОЧНИКИ

Следующие цитируемые источники в той степени, в которой они предоставляют примеры методических или другие подробностей, дополняющие приведенные в настоящем документе, непосредственно включены в настоящий документ посредством ссылки.

Патент США №6013651

Патент США №6028223

Adachi et al., Clin. Cancer Res., 6(1):96-101, 2000.

Asano et al., J. Immunol, 175(11):7708-7718, 2005.

Avraamides et al., Nat. Rev. Cancer, 8(8):604-617, 2008.

Bax et al., J. Biol. Chem., 278(36):34605-34616, 2003.

Becker et al., Tetrahedron, 39:4189-4192, 1983.

Bhaskar et al., J. Transl Med., 5:61, 2007.

Blase et al., Int. J. Cancer, 60(6):860-866, 1995.

Bouzeghrane, et al., J. Mol. Cell. Cardiology, 36:343-353, 2004.

Clark, et al., Organic Process Research & Development, 8:51-61, 2004.

Clark, et al., Organic Process Research & Development, 8:571-575, 2004.

Collo, J. CellScL, 112(Pt 4):569-578, 1999.

Danen et al., Histopathology, 24(3):249-256, 1994.

Edward, Curr. Opin. Oncol, 7(2): 185-191, 1995.

Engleman et al., J. Clin. Invest, 99(9):2284-2292, 1997.

Faulconbridge et al., Tetrahedron Lett., 41:2679-2681, 2000.

Ferrari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(46): 17260-17265, 2006.

Gao and Brigstock, Gut, 55:856-862, 2006.

Girsch et al., J. Med. Chem., 50:1658-1667, 2007.

Girsch et al., J. Med. Chem., 51:6752-6760, 2008.

Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley, 1999.

Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use, Stahl and Wermuth (Eds.), Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002.

Henderson, et al., Nat. Med., 19:1617-1624, 2013.

Herlt, et al., Austr. J. Chem., 34(6):1319-1324, 1981.

Horan et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 177(1):56-65, 2008.

Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc, 124(42):12557-12565, 2002.

Kim et al., Am. J. Pathol, 156(4): 1345-1362, 2000.

Landis et al., Organic Process Research & Development, 6:539-546, 2002.

Levine, et al., Am. J. Pathol, 156:1927-1935, 2000.

Li et al., Invest. Ophthalmol Vis. Sci., 50(12):5988-5996, 2009.

Livant et al., J. Clin. Invest., 105(11):1537-1545, 2000.

Lobert et al. Dev. Cell, 19(1):148-159, 2010.

Lu, et al., J. Cell Sci., 115:4641-4648, 2002.

Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 2007.

Melton et al., J. Clin. Invest., 120(12):4436-4444, 2010.

Millard et al., Theranostics, 1:154-88, 2011.

Mu et al., Cell Biol, 157(3):493-507, 2002.

Munger et al., Cell, 96(3):319-328, 1999.

Munger et al., Mol. Biol Cell, 9:2627-2638, 1998.

Nishimura, Am. J. Pathol, 175(4):1362-1370, 2009.

Perdih, Curr. Med. Chem., 17(22):2371-2392, 2010.

Popov et al., J. Hepatol, 48(3):453-464, 2008.

Reagan-Shaw et al., FASEBJ., 22(3):659-661, 2008

Scotton et al., J. Clin. Invest., 119(9):2550-2563, 2009.

Suehiro et al., J. Biochem., 128(4):705-710, 2000.

Sun, et al., Am. J. Therapeutics, 2014.

Wipff et al., J. Cell Biol, 179(6):1311-1323, 2007.

Yang et al., Development, 119(4):1093-1105, 1993.

Yoshimura, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 350:127-147, 2011.

Zahn et al., Arch. Ophthalmol, 127(10):1329-1335, 2009.

Zahn et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 51(2):1028-1035, 2010

1. Соединение формулы:

(I),

где:

А представляет собой C-OH или N;

R′ представляет собой водород или алкил_(C1-8); и

каждый из X и Y независимо представляет собой галоген, фторалкокси_(С1-2), алкил_(С1-2) или фторалкил_(С1-2), при условии, что X и Y одновременно не представляют собой алкил_(С1-2);

или фармацевтически приемлемая соль вышеуказанной формулы.

2. Соединение по п. 1, где А представляет собой N.

3. Соединение по п. 1, где А представляет собой C-OH.

4. Соединение по любому из пп. 1-3, где R' представляет собой водород.

5. Соединение по любому из пп. 1-4, где Х представляет собой галоген.

6. Соединение по п. 5, где X представляет собой -F, -Cl или -Br.

7. Соединение по п. 6, где X представляет собой -F.

8. Соединение по п. 6, где X представляет собой -Cl.

9. Соединение по п. 6, где X представляет собой -Br.

10. Соединение по любому из пп. 1-4, где Х представляет собой фторалкокси_(С1-2).

11. Соединение по п. 10, где X представляет собой -OCF₃.

12. Соединение по любому из пп. 1-4, где Х представляет собой фторалкил_(С1-2).

13. Соединение по п. 12, где X представляет собой -CHF₂.

14. Соединение по п. 12, где X представляет собой -CF₃.

15. Соединение по любому из пп. 1-4, где Х представляет собой алкил_(С1-2).

16. Соединение по п. 15, где X представляет собой -CH₃.

17. Соединение по любому из пп. 1-16, где Y представляет собой галоген.

18. Соединение по п. 17, где Y представляет собой -F, -Cl или -Br.

19. Соединение по п. 17, где Y представляет собой -F.

20. Соединение по п. 17, где Y представляет -Cl.

21. Соединение по п. 17, где Y представляет собой -Br.

22. Соединение по любому из пп. 1-16, где Y представляет собой фторалкокси_(С1-2).

23. Соединение по п. 22, где Y представляет собой -OCF₃.

24. Соединение по любому из пп. 1-16, где Y представляет собой фторалкил_(С1-2).

25. Соединение по п. 24, где Y представляет собой -CHF₂.

26. Соединение по п. 24, где Y представляет собой -CF₃.

27. Соединение по любому из пп. 1-14, где Y представляет собой алкил_(С1-2).

28. Соединение по п. 27, где Y представляет собой -CH₃.

29. Соединение по любому из пп. 1-4, где каждый из X и Y независимо выбран из групп, состоящих из -F, -Cl, -Br, -OCF₃, -CH₃, -CHF₂ и -CF₃, при условии, что X и Y одновременно не представляют собой -CH₃.

30. Соединение по любому из пп. 1-29, где атом углерода, отмеченный β, находится в S-конфигурации.

31. Соединение по п. 1, дополнительно определенное как:

, , , , , , , , , , , , , , или ,

или фармацевтически приемлемая соль любой из вышеуказанных формул.

32. Соединение по любому из пп. 1-31, эффективное для ингибирования трех или более RGD-интегринов, выбранных из группы, состоящей из α5β1, αvβ1, α8β1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8, где эффективность соединения соответствует значению IC₅₀ менее 10 нМ для каждого из трех или более RGD-интегринов при измерении с помощью твердофазного рецепторного анализа (SPRA) в отношении функции соответствующего интегрина.

33. Соединение по любому из пп. 1-31, имеющее пролонгированный период полувыведения из плазмы, составляющий по меньшей мере 2 часа, при измерении у крысы с применением в/в болюса, содержащего 1 мг соединения на кг массы крысы.

34. Фармацевтическая композиция для опосредования патологических процессов ангиогенеза и фиброза, содержащая:

а) терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп. 1-33; и

b) эксципиент.

35. Способ лечения и/или предотвращения заболевания или расстройства у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту соединения по любому из пп. 1-33 в терапевтически эффективном количестве, где заболевание или расстройство связано с ангиогенезом и/или фиброзом.

36. Способ по п. 35, где указанное заболевание или расстройство связано с ангиогенезом.

37. Способ по п. 35, где указанное заболевание или расстройство связано с фиброзом.

38. Способ по любому из пп. 35-37, где указанное заболевание или расстройство представляет собой фиброз легких, печени, почек, миокарда и поджелудочной железы, склеродермию, рубцевание, рак, аутоиммунные заболевания и инфекцию.

39. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой фиброз легких.

40. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой фиброз печени.

41. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой фиброз миокарда.

42. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой фиброз почек.

43. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой фиброз поджелудочной железы.

44. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой склеродерму.

45. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой рубцевание.

46. Способ по п. 45, где указанное рубцевание представляет собой рубцевание кожи.

47. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой рак.

48. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой аутоиммунное заболевание.

49. Способ по п. 48, где указанное аутоиммунное расстройство представляет собой рассеянный склероз.

50. Способ по п. 38, где указанное заболевание или расстройство представляет собой инфекцию.