Новый fab-фрагмент антитела к человеческому ngf

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен улучшенный Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, а также предложены композиции и способы лечения послеоперационной боли при помощи такого фрагмента антитела. Указанный Fab-фрагмент сохраняет высокую нейтрализующую активность и уменьшает системные побочные эффекты, возникающие из-за системного воздействия, с одновременным проявлением местного лекарственного воздействия. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому Fab-фрагменту антитела к человеческому NGF. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, который содержит последовательность оснований, кодирующую Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, экспрессирующему вектору, включающему полинуклеотид, и клетке-хозяину, трансформированной экспрессирующим вектором, и к способу получения Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF. Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, и к способу лечения послеоперационной боли с использованием Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фактор роста нервов (NGF) является одним из гуморальных факторов, как правило, называемых "нейротрофические факторы", и играет важную роль в образовании и дифференцировке нейронов и в поддержании функций нейронов в организме. Высокоаффинный trkA (тропомиозин-рецепторная киназа A) и низкоаффинный p75NTR (рецептор p75 нейротрофина) известны в качестве рецепторов NGF. Относительно них, есть данные, в которых сообщают, что p75NTR связывается со всеми нейротрофическими факторами и участвует в апоптозе в процессе образования нейронов. Однако, роль p75NTR еще недостаточно объяснена. Кроме того, известно, что мыши, нокаутные по NGF и trkA, экспрессируют такой же фенотип (NPL1), и считается, что физиологическое действие NGF выражается, в основном, через trkA.

Сообщалось, что введение NGF вызывает боль у крыс (NPL 2), и что внутривенное введение NGF человеку вызывает мышечную боль во всем теле, а местное нанесение NGF вызывает гипералгезию и аллодинию в месте введения NGF, а также боль во всем теле (NPL 3). Известно, что количество NGF, экспрессирующегося у животных, повышается, когда ткани повреждены при рассечении мышечной ткани (NPL 4) и кожной ткани (NPL 5) у животных, таких как крысиные модели послеоперационной боли. Что касается патологического состояния боли у человека, было подтверждено, что экспрессия NGF и trkA ускоряется в суставном хряще при остеоартрите (OA) (NPL6), что уровень NGF повышается в экссудатах из участка разреза, когда проводят кесарево сечение (NPL 7), и что уровень NGF повышается у пациентов с ревматоидным артритом (NPL 8) или интерстициальным циститом (NPL 9).

К настоящему времени сообщалось, что боль подавляется у различных моделей боли на животных, когда ингибируется сигнал NGF (NPL 10, PTL с 1 до 3).

До настоящего времени были описаны антитела к NGF человека, REGN475 (PTL 2), 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG (PTL 3), фультранумаб (PTL 4), и MEDI-578 (PTL 5) в качестве полностью человеческих антител к NGF человека, и танезумаб (PTL 6) и PG110 (PTL 7) в качестве гуманизированных антител к NGF человека. Относительно них описано, что подкожное введение танезумаба в дополнение к его внутривенному введению демонстрирует распространенное анальгетическое воздействие на боль, такую как артралгия, сопровождающая остеоартрит, хроническая позвоночная боль, и цисталгия, сопровождающая интерстициальный цистит (NPL с 11 до 13) в клинических условиях.

Было описано, что множество медицинских препаратов демонстрирует побочные эффекты, и антитела к NGF не являются исключением. В связи с клиническим исследованием танезумаба (NPL 11) сообщалось о побочных явлениях, связанных с введением человеку антитела к NGF, таких как головные боли, инфекция верхних дыхательных путей, и парестезия; в связи с клиническим исследованием фульранумаба (NPL 14 - восприятие нарушение, головные боли и ринофарингит; и артралгия, гиперестезия, мышечная боль, периферический отек, и суставная грыжа в связи с клиническим исследованием REGN475 (NPL 15).

В общих чертах, когда лекарственно средство воздействует на ткани, иные, чем ткань-мишень, оно вызывает нежелательные для организма человека побочные эффекты в тканях.

Обычно разрабатывают фармацевтические средства для местного введения для профилактики или снижения побочных эффектов за счет повышения концентрации в ткани в месте введения и за счет снижения воздействия на другие ткани посредством системного кровотока из-за непосредственного введения в ткань-мишень.

Есть много терапевтических антител, которые можно вводить подкожно или внутримышечно в дополнение к антителам, которые вводят путем внутрисосудистого введения в вены и т.д. После подкожного или внутримышечного введения, антитела сразу же переносятся в кровь через лимфатическую систему, а затем циркулируют на всем протяжении тела. Многие терапевтические антитела после переноса в кровь циркулируют в кровотоке для доставки в ткань-мишень, где они проявляют фармакологические эффекты. Дополнительно, многие терапевтические антитела демонстрируют преобладающее распределение в крови, и низкое проникновение в ткань-мишень (соотношение концентраций в ткани/крови). Таким образом, высокая концентрация многих терапевтических антител в крови должна быть существенной для поддержания эффективной концентрации в ткани-мишени (NPL 16). Кроме того, многие терапевтические антитела имеют полувыведение в крови в диапазоне от нескольких суток до месяца, и поддерживают долгосрочную устойчивую концентрацию в крови для сохранения фармакологического воздействия в течение длительного периода. Таким образом, даже если обычное терапевтическое антитело вводят местно, как подкожное или внутримышечное введение, оно все еще будет производить системное фармакологическое воздействие/побочный эффект, оставаясь в крови и циркулируя по всему телу.

Мультимеризация, включая димеризацию, становится серьезной проблемой при попытке гарантировать стабильное и однородное качество в области биологических препаратов, таких как терапевтические антитела.

Известно, что F(ab')₂, который является димером Fab', имеет фармакокинетику, отличающуюся от Fab' (NPL 17 и 18).

Сообщалось, что природное антитело против F(ab')₂, который является димером Fab', вызывает удаление антитела (NPL 19). Этот тип реакции антиген-антитело нарушает фармакокинетику фармацевтического средства таким образом, что антитело удаляется гораздо быстрее, и также создает риски реакции анафилаксии, и т.д. Как можно видеть, существуют некоторые риски, связанные с F(ab')₂.

СПИСОК ССЫЛОК

ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА PTL 1: WO 2013/183032

PTL 2: WO 2009/023540

PTL 3: WO 2013/022083

PTL 4: WO 2005/019266

PTL 5: WO 2006/077441

PTL 6: WO 2004/058184

PTL 7: патент США № 8435523

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

NPL 1: «Reviews in the Neurosciences», 1997, Vol.8, p.13-27

NPL 2: «The Journal of Neuroscience», 1993, Vol.13, p.2136-2148

NPL 3: «Annals of Neurology», 1994, Vol.36, p.244-246

NPL 4: «Anesthesiology», 2009, Vol.110, p.140-149

NPL 5: «Pain», 2005, Vol.117, p. 68-76

NPL 6: «Rheumatology», 2002, Vol.41, p. 1413-1418

NPL 7: «The Journal of Pain», 2008, Vol.9, p.650-657

NPL 8: «Clinical and Experimental Rheumatology», 1997, Vol.15, p.433-438

NPL 9: «British Journal of Urology», 1997, Vol.79, p.572-577

NPL 10: «Trends in Pharmacological Sciences», 2006, Vol.27, p.85-91

NPL 11: «The New England Journal of Medicine», 2010, Vol.363, p.1521-1531

NPL 12: «The Journal of Urology», 2011, Vol.185, p.1716-1721

NPL 13: «Pain», 2011, Vol.152, p.2248-2258

NPL 14: «Pain», 2013, Vol.154, p.1910-1919

NPL 15: «Pain», 2014, Vol.155, p.1245-1252

NPL 16: «Bioanalysis», 2013, Vol.5, p.2003-2014

NPL 17: «The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics», 1997, Vol.281, p. 1-8

NPL 18: «Cancer Research», 1986, Vol.46, p.3969-3978

NPL 19: «European Journal of Immunology», 1995, Vol.25, p.3128-3133

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Целью настоящего изобретения является создание лучшего Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, который сохраняет высокую нейтрализующую активность, и который снижает системные побочные эффекты, возникающие из-за системного воздействия, с одновременной демонстрацией местного фармакологического воздействия.

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ

Настоящее изобретение относится к следующим изобретениям, относящимся к продуктам и способам, которые имеют медицинскую и промышленную применимость.

Другими словами, вариант осуществления настоящего изобретения может быть в следующей форме:

(1) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, выбранный из группы, состоящей из (a) и (b) ниже:

(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; и,

(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, полученный путем посттрансляционной модификации Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF из (a).

(2) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF согласно (1), содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и фрагмент легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8.

(3) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по п. (1), где указанная посттрансляционная модификация представляет собой пироглутаминирование на N-конце вариабельной области тяжелой цепи.

(4) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF согласно (1), содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, где глутамин в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 5 модифицирован в пироглутаминовую кислоту, и фрагмент легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8.

(5) Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи из Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF согласно (1).

(6) Экспрессирующий вектор, выбранный из группы, состоящей из (a) и (b), показанных ниже:

(a) экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF согласно (1), и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь указанного Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF; и

(b) экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF согласно (1).

(7) Клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором согласно (6).

(8) Клетка-хозяин по п. (7), выбранная из группы, состоящей из (a) и (b), показанных ниже:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF согласно (1), и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь указанного Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF; и

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF согласно (1), и экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь указанного Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF.

(9) Способ для получения Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, включающий культивирование клетки-хозяина согласно (8) для экспрессии Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF.

(10) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, способный производиться по способу согласно (9).

(11) Фармацевтическая композиция, содержащая Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по любому из (1)-(4) и (10) и фармацевтически приемлемый носитель.

(12) Фармацевтическая композиция согласно (11), которая представляет собой фармацевтическую композицию для местного введения для лечения послеоперационной боли.

(13) Фармацевтическая композиция, содержащая Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF согласно (2), Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF согласно (4), и фармацевтически приемлемый носитель.

(14) Фармацевтическая композиция согласно (13), которая представляет собой фармацевтическую композицию для местного введения для лечения послеоперационной боли.

(15) Применение Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по любому из (1)-(4) и (10) для получения фармацевтической композиции для местного введения для лечения послеоперационной боли.

(16) Применение Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по любому из (1)-(4) и (10) для лечения послеоперационной боли путем местного введения.

(17) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по любому из (1)-(4) и (10) для применения для местного введения для лечения послеоперационной боли.

(18) Способ лечения послеоперационной боли, включающий местное введение индивидууму эффективного количества Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по любому из (1)-(4) и (10).

ПОЛЕЗНЫЙ ЭФФЕКТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению эффективен для лечения послеоперационной боли, которая как патологическое состояние развивается под влиянием человеческого NGF. Таким образом, характеризуемый Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению отличается превосходной фармакокинетикой, такой как высокая нейтрализующая активность и местное удержание, а также быстрым удалением из крови, что, таким образом, снижает дозу и продляет действие лекарственного средства, а также снижает системные побочные эффекты от системного воздействия и, таким образом, ожидается, что будет обеспечивать заметное улучшение как воздействия, так и безопасности лекарственного средства для клинического применения. Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению вносит значительный вклад в лечение послеоперационной боли, которая связана с человеческим NGF.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение далее описано подробно, но эти описания не ограничивают объем изобретения. Если в настоящем описании не определено иное, научные термины и технические термины, применяемые в связи с настоящим изобретением, имеют значение, как правило, понимаемое специалистом в данной области. Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования того, как получить антитела к человеческому NGF или их антигенсвязывающие фрагменты, и успешно получили превосходный Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, который сохранял высокую нейтрализующую активность, а также демонстрировал местное воздействие лекарственного средства, с одновременным снижением системных побочных эффектов, возникающих из-за системного воздействия.

Основная структура молекулы антитела широко распространена среди соответствующих классов антител и состоит из тяжелых цепей с молекулярной массой от 50000 до 70000 и легких цепей с молекулярной массой от 20000 до 30000. Тяжелая цепь, как правило, состоит из полипептидной цепи, включающей приблизительно 440 аминокислот, и каждый класс имеет свою характерную структуру. Тяжелые цепи называются цепями γ, μ, α, δ, и ε, соответствующими IgG, IgM, IgA, IgD, и IgE. Кроме того, IgG имеет подклассы, такие как IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4, и эти цепи называются γ1, γ2, γ3, и γ4, соответственно. Легкая цепь, как правило, состоит из полипептидной цепи, включающей приблизительно 220 аминокислот, и известны два типа легкой цепи, включающие L-тип и K-тип, которые называются цепями λ и κ, соответственно. Что касается строения пептида основной структуры молекулы, две гомологичных тяжелых цепи и две гомологичных легких цепи связаны дисульфидными связями (связями S-S) и нековалентными связями, и их молекулярная масса составляет от 150000 до 190000. Два типа легких цепей могут быть спарены с любой тяжелой цепью. Каждая молекула антитела всегда состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.

Существуют четыре внутрицепочечные связи S-S в тяжелой цепи (пять связей для цепей μ и ε) и две - в легкой цепи. Одна петля образована из 100-110 аминокислотных остатков, и эта стерическая структура сходна среди соответствующих петель и называется структурная единица или домен. Как для тяжелых цепей, так и для легких цепей, аминокислотная последовательность домена, расположенного на их N-конце, не является постоянной, даже в референсном стандарте из того же самого класса (подкласса) того же самого вида животного, и это домен называется вариабельной областью. Каждый из доменов называется вариабельной областью тяжелой цепи (VH) и вариабельной областью легкой цепи (VL), соответственно. Поскольку аминокислотная последовательность C-концевой стороны от вариабельной области практически постоянна в каждом классе или подклассе, эта область называется константной областью, и каждый из доменов описывается как CH1, CH2, CH3 и CL, соответственно.

Участок антигенной детерминанты антитела состоит из VH и VL, и специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого участка. С другой стороны, виды биологической активности, такие как связывание с комплементом или различными клетками отражают различия в структуре константной области среди различных классов Ig. Известно, что изменчивость в вариабельных областях тяжелой цепи и легкой цепи преимущественно ограничена тремя небольшими гипервариабельными областями, присутствующими на обеих цепях, и эти область называются определяющими комплементарность областями (CDR; CDR1, CDR2 и CDR3, начиная с N-концевого участка). Оставшаяся часть вариабельной области называется каркасной областью (FR) и является относительно постоянной.

Область между доменом CH1 и доменом CH2 константной области тяжелой цепи антитела называется шарнирной областью. Эта область содержит множество остатков пролина и имеет множество межцепочечных связей S-S, соединяющих две тяжелые цепи. Например, каждая шарнирная область человека IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4 включает 2, 4, 11, и 2 цистеиновых остатка, соответственно, которые составляют связи S-S между тяжелыми цепями. Шарнирная область представляет собой область с высокой чувствительностью к протеолитическому ферменту, такому как папаин или пепсин. Когда антитело расщепляют папаином, его тяжелая цепь расщепляется в положении, которое расположено ближе к N-концевой стороне, чем к связи S-S между тяжелыми цепями в шарнирной области, посредством чего антитело разделяется на два Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-фрагмент состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, включая вариабельную область тяжелой цепи (VH), домен CH1 и часть шарнирной области. Когда антитело расщепляют пепсином, его тяжелая цепь расщепляется в положении, которое расположено ближе к С-концевой стороне, чем к связи S-S между тяжелыми цепями в шарнирной области, посредством чего получают F(ab')₂-фрагменты. F(ab')₂-фрагмент представляет собой фрагмент с димерной структурой, в котором два фрагмента Fab' связаны друг с другом при помощи связи S-S между тяжелыми цепями в шарнирной области. Фрагмент Fab' состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, включая вариабельную область тяжелой цепи (VH), домен CH1 и часть шарнирной области. Остатки цистеина, составляющие связь S-S между тяжелыми цепями, включены в часть шарнирной области. Все из Fab-фрагмента, F(ab')₂-фрагмента, и фрагмента Fab' включают вариабельную область и имеют антигенсвязывающую активность.

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, успешно полученный авторами настоящего изобретения, представляет собой Fab-фрагмент со следующими характеристиками: Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8.

Конкретно, авторы настоящего изобретения модифицировали 1-15 (N52D-A)-Fab'-фрагмент человеческого антитела к NGF человека(PTL 3; который также называется «1-15 (N52D-A)-Fab'» в указанном документе) и путем скрининга антител при помощи различных тестов на биологическую активность и физические свойства успешно идентифицировали Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению в качестве Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, который является стабильным и сохраняет высокую нейтрализующую активность и местное накопление.

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению может быть легко получен специалистом в данной области с использованием общеизвестного способа на основании информации о последовательности, раскрытой в настоящем описании. Например, Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению можно получать путем синтеза полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую его фрагмент тяжелой цепи, и полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую его легкую цепь, и соединения их с подходящими экспрессирующими векторами. Затем, экспрессирующие векторы вводят в культуру клеток. Наконец, когда клетки культивируют, специалист в данной области может получать моноклональные Fab-фрагменты из культурального супернатанта.

Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента по настоящему изобретению можно синтезировать, например, на основании последовательности оснований, сконструированной в соответствии с аминокислотными последовательностями фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи с использованием способов синтеза генов, общеизвестных в данной области. Например, в качестве таких способов синтеза генов можно использовать способ синтеза генов антитела, изложенный в WO 90/07861, и другие способы, общеизвестные специалисту в данной области.

В одном из вариантов осуществления в качестве полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к NGF человека, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, для примера можно указать полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, показанную в SEQ ID NO: 1. В качестве полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к NGF человека, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8, для примера можно указать полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, показанную в SEQ ID NO: 4.

Процессы после получения полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента по настоящему изобретению, и полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента по настоящему изобретению, такие как введение полинуклеотида в экспрессирующий вектор, введение экспрессирующего вектора в культуру клеток, инкубация культуры клеток и очистка Fab-фрагмента, можно проводить при помощи различных способов, общеизвестных в данной области.

Экспрессирующие векторы, которые можно использовать, включают, например, векторы GS pEE6.4 или pEE12ю4 (Lonza), без конкретных ограничений при условии, что вектор способен экспрессировать полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента по настоящему изобретению, и/или полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента по настоящему изобретению, и, таким способом, способен производить кодируемые ими полипептиды.

Вышеописанные экспрессирующие векторы вводят в культуру клеток такими способами, как трансфекция при помощи фосфата кальция или электропорация.

Культивируемые клетки, в которые можно вводить экспрессирующие векторы, могут быть, например, клетками CHO-K1SV, клетками CHO-DG44, и клетками 293, и их можно культивировать путем общепринятого способа.

После вышеуказанного культивирования, Fab-фрагменты, накопившиеся в культуральном супернатанте, можно очищать различными способами хроматографии на колонках, такими как способы с использованием KappaSelect.

Пример Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению относится к антителу h1f.6, описанному в разделе Примеры далее.

Когда антитело экспрессируется в клетках, известно, что антитело подвергается посттрансляционным модификациям. Пример посттрансляционных модификаций включает расщепление лизина на C-конце тяжелой цепи посредством карбоксипептидазы, модификацию глутамина или глутаминовой кислоты на N-конце тяжелой цепи или легкой цепи пироглутаминовой кислоты путем пироглутаминирования, гликозилирование, окисление, деамидирование, гликирование, и т.п. В данной области известно, что такие посттрансляционные модификации происходят с различными антителами (J. Pharm. Sci., 2008, Vol.97, p.2426-2447).

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению может включать Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, который подвергается посттрансляционной модификации/модификациям. Пример Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, который может подвергаться посттрансляционной модификации/модификациям, включает Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, у которого N-конец вариабельной области тяжелой цепи пироглутаминирован. Такая посттрансляционная модификация путем пироглутаминирования на N-конце известна в данной области, как не влияющая на активность антитела (Anal. Biochem., 2006, Vol.348, p.24-39).

Например, Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению относится к следующему Fab-фрагменту антитела к человеческому NGF:

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, где глутамин в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO:5 модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8.

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению связывается с NGF человека. Активность связывания полученного Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF с NGF человека можно измерять путем ELISA, FACS, и т.д. Например, при использовании ELISA, человеческий NGF иммобилизируют на планшете для ELISA и добавляют в этот планшет для ELISA Fab-фрагмент, а после этого добавляют вторичное антитело, такое как антитело к каппа, меченое биотином, и т.д. и стрептавидин, меченый щелочной фосфатазой добавляют. Затем измеряют активность с использованием реагента для детекции активности (например, хемилюминесцентный субстрат для щелочной фосфатазы для меток с щелочной фосфатазой) для выявления связывания вторичного антитела. Кроме того, Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению может связываться с другим NGF, полученным от животного (например, мышиным NGF) в дополнение к человеческому NGF, и также можно измерять активность связывания с этими белками.

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению имеет нейтрализующую активность против человеческого NGF. Как применяют в настоящем описании, термин "нейтрализующая активность" Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF относится к активности, которая ингибирует любую биологическую активность, индуцируемую посредством человеческого NGF, путем связывания с человеческим NGF, и ее можно оценивать при помощи одного или нескольких видов биологической активности человеческого NGF в качестве показателя. Такая нейтрализующая активность включает, например, ингибирование связывания между человеческим NGF и его рецептором человеческим trkA, и ее можно оценивать с использованием способов, описанных в разделе Примеры далее.

Для того чтобы оценить воздействие Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению более подробно, также возможно проводить исследование in vivo. Например, возможно проводить, как показано далее в разделе ПРИМЕРЫ, исследование обезболивающих эффектов с использованием крысиной модели послеоперационной боли после подошвенного разреза, для оценки in vivo воздействия лекарственного средства с Fab-фрагментом антитела к человеческому NGF. Также возможно подтверждать фармакологическую активность Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF в ткань, проводя исследование для оценки активности связывания NGF или исследование для оценки ингибирования связывания между человеческим NGF и его рецептором trkA, с использованием гомогенат ткани, полученного после местного введения Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF в бедренную мышцу крыс. Дополнительно, также возможно проводить исследование для оценки концентрации Fab-фрагмента в плазме или тканях для оценки сохранения локального уровня воздействия Fab-фрагмента, а также снижения системного воздействия в крови.

В качестве другого способа, способы для оценки стабильности Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению (например, термостабильность, стабильность при длительном хранении, и стабильность высокой концентрации) включают способ, который измеряет агрегацию во время хранения при помощи гель-фильтрационной хроматографии.

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению можно формулировать путем общепринятого способа после очистки, проводимой по мере необходимости, для использования для лечения послеоперационной боли.

Термин "послеоперационная боль" относится к боли, которая вызвана или возникает в результате травматических повреждений таких как резаная рана, колотая рана, рассечение, рваная рана или повреждения ткани индивидуума (включая повреждения, вызванные всеми видами хирургического лечения, инвазивного или неинвазивного). Термин «послеоперационная боль», применяемый в настоящем описании, не включает боль, возникающую без какого-либо физического повреждения от внешних причин (т.е., боль, которая не вызвана повреждением или не является результатом повреждения). Послеоперационная боль представляет собой внутреннюю или внешнюю (в том числе, периферическую) боль, и рана, резаная рана, повреждение, рваная рана или разрез могут быть причинены случайно (в случае внешнего повреждения/раны) или намеренно (в случае разреза или операции). Боль можно оценивать объективно или субъективно при помощи шкалы боли и других способов, хорошо известных в данной области. Послеоперационная боль, как применяют в настоящем описании, включает аллодинию (т.е., как правило, повышение величины ответа на неболевой стимул) и гиперпатию (т.е., как правило, повышение величины ответа на болевой или неприятный стимул), и они могут быть термальной или механической природы. Боли характеризуются термочувствительностью, чувствительностью к механическому стимулу и/или болью в покое. Послеоперационная боль включает боль, индуцируемую механическим стимулом, и боль в покое.

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению можно использовать в качестве терапевтического средства для послеоперационной боли. Примеры состава терапевтического средства включают парентеральные средства, такие как инъекции, капли и препараты пролонгированного действия, и предпочтительным является введение путем внутримышечной инъекции или подкожных инъекций в локальную ткань-мишень. Также возможно при формировании фармацевтического состава использовать носители и добавки, которые подходят для состава при условии, что они являются фармацевтически приемлемыми.

Количество Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, которое добавляют при составлении вышеуказанного фармацевтического состава, варьирует в зависимости от степени симптома и возраста пациента, используемой формы фармацевтического состава, или валентности антитела, но можно использовать количество приблизительно от 0,001 мг/кг до 100 мг/кг.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемые носители или добавки. Такие фармацевтически приемлемые носители или добавки конкретно не ограничены, и можно использовать носители или добавки, хорошо известные специалисту в данной области. Настоящее изобретение также относится к Fab-фрагменту антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению для применения для лечения послеоперационной боли и к применению Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции для лечения послеоперационной боли. Настоящее изобретение также относится к способу лечения послеоперационной боли, включающему местное введение индивидууму эффективного количества Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению. Следует отметить, что «индивидуум» является человеком или другими млекопитающими, которым необходимо лечение, и один из вариантов осуществления является человеком, которому необходимо лечение. Эффективное количество Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF в способе лечения по настоящему изобретению может являться количеством, аналогичным количеству Fab-фрагмента, добавленного при формировании фармацевтического состава, как указано выше. Кроме того, фармацевтическая композиция для местного применения по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, которую вводят или применяют на участке, требующем лечения, или участках, прилегающих к этому участку, в частности, на ткани-мишени, такой как ткань, рассеченная в хирургической операции или на окружающей области. Например, фармацевтическую композицию можно вводить путем внутримышечной инъекции или подкожных инъекций местно в ткань-мишень, как указано выше. Настоящее изобретение относится к случаю, когда Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению сохраняется в локальной ткани-мишени в течение определенного времени, предпочтительно, 72 часа, и, более предпочтительно, 24 часа.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать множество типов Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, который не подвергается посттрансляционной модификации и Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, полученный путем посттрансляционной модификации.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает фармацевтическую композицию, содержащую Fab-фрагменты антитела к человеческому NGF, как показано в (a) и (b) ниже:

(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; и

(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, полученный путем посттрансляционной модификации Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF из (a).

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает фармацевтическую композицию, содержащей Fab-фрагменты антитела к человеческому NGF, как показано в (a) и (b) ниже:

(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; и

(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, где глутамин в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO:5 модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и фрагмент легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, и к полинуклеотиду, содержащему последовательность оснований, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению (которые могут далее совместно обозначаться в настоящем документе как «полинуклеотид по настоящему изобретению»), и к экспрессирующему вектору, содержащему один или оба таких полинуклеотида (который может далее в настоящем документе обозначаться как «экспрессирующий вектор по настоящему изобретению»).

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению не ограничен конкретным типом при условии, что он экспрессирует полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению и/или полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, в различных клетках-хозяевах, которые представляют собой прокариотические клетки и/или эукариотические клетки, и способен производить полипептид(-ы), кодируемые указанным нуклеотидом/нуклеотидами. Примеры экспрессирующих векторов, которые можно использовать, включают плазмидный вектор, вирусный вектор (например, аденовирусный, ретровирусный), например, можно использовать вектор GS pEE6.4 и pEE12.4 (Lonza). В одном из вариантов осуществления экспрессирующий вектор по настоящему изобретению представляет собой экспрессирующий вектор, который включает полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления экспрессирующий вектор по настоящему изобретению представляет собой экспрессирующий вектор, который включает полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь такого Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF.

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Промоторы, которые позволяют экспрессироваться гену, кодирующему Fab-фрагмент по настоящему изобретению или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи в бактерии, включают промотор Trp, промотор lac, промотор recA, промотор λPL, промотор lpp, и промотор tac, когда бактерия-хозяин относится к роду Escherichia. Промоторы, которые позволяют экспрессироваться в дрожжах, включают, например, промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP, и промотор ADH, и промоторы, которые позволяют экспрессироваться в бактерии рода Bacillus, включают промотор SL01, промотор SP02, и промотор penP. Промоторы для клетки-хозяина, которая является эукариотической клеткой, такой как клетки млекопитающих, включают промотор, полученный из SV40, промотор ретровируса или промотор теплового шока.

Когда в качестве клетки-хозяина используют бактерию, в частности, E. coli, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может дополнительно содержать кодон инициации, стоп-кодон, кодон терминации и репликативную единицу. Когда в качестве хозяина используют дрожжи, клетку животного или клетку насекомого, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может включать кодон инициации и стоп-кодон. В этом случае, он может включать энхансерную последовательность, нетранслируемые области на 5'-конце и 3'-конце гена, который кодирует Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, сигнальная последовательность для секреции, точку сплайсинга, область полиаденилирования, репликативную единицу или т.п. Также, он может включать селективный маркер, который широко используется (например, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину, ген редуктазы дигидрофолиевой кислоты), в соответствии с предполагаемым применением.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной экспрессирующим вектором по настоящему изобретению. Клетка-хозяин, которую используют для получения трансформанта, не ограничена конкретным типом при условии, что она соответствует указанному выше экспрессирующему вектору и ее можно трансформировать; примеры клетки-хозяина включают различные клетки, такие как природные клетки или клетки, полученные искусственным путем, которые широко используются в области техники по настоящему изобретению (например, бактерии (бактерии рода Escherichia, бактерии рода Bacillus), дрожжи (рода Saccharomyces, рода Pichia и т.п.), клетки животных (клетка CHO-K1SV, клетка CHO-DG44, клетка 293 и т.п.) или клетки насекомых (например, Sf9) и т.п. Трансформацию как таковую можно проводить любым известным способом.

Клетка-хозяин по настоящему изобретению включает следующие (a) и (b):

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотид, который содержит последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, и полинуклеотид, который содержит последовательность оснований, кодирующих легкую цепь указанного Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF; и

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотид, который содержит последовательность оснований, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотид, который содержит последовательность оснований, кодирующую легкую цепь указанного Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF.

Настоящее изобретение также относится к способу получения Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, включающему этапы культивирования клетки-хозяина по настоящему изобретению и экпрессирования Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF. Предпочтительно, клетка-хозяин, которую используют в вышеуказанном способе, включает указанную выше клетку-хозяина (a) и (b) по настоящему изобретению.

Для получения Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, трансформированную клетку-хозяина можно культивировать в питательной среде. Питательная среда предпочтительно содержит источник углерода и источник неорганического азота или источник органического азота, который необходим для роста клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал, сахарозу и т.п.; примеры источника неорганического азота или источника органического азота включают аммонийные соли, нитраты, аминокислоты, жидкий кукурузный экстракт, пептон, казеин, мясной экстракт, соевый жмых, картофельный экстракт и т.п. При желании, можно включать другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрогенфосфат натрия, хлорид магния), витамины, и т.п.), антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин, канамицин и т.п.).

Клетку-хозяина культивируют общеизвестным способом. Условия культивирования, например, температуру, pH среды, и время культивирования подбирают соответствующим образом. Например, когда хозяином является клетка животного, в качестве среды можно использовать среду MEM, содержащую приблизительно от 5% до 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Science, Vol.122, p.501, 1952), среду DMEM (Virology, Vol.8, p.396, 1959), среду RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), среду 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950) и т.п. pH среды предпочтительно составляет приблизительно от 6 до 8, культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 30°C до 40°C в течение приблизительно от 15 до 72 часов, и можно проводить по мере необходимости аэрацию или перемешивание. Когда хозяином является клетка насекомого, можно использовать, например, среду Грейса, содержащую эмбриональную телячью сыворотку (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) и т.п., и pH среды предпочтительно составляет приблизительно от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20°C до 40°C в течение от 15 до 100 часов, и можно проводить по мере необходимости аэрацию или перемешивание. Когда хозяином является бактерия, актиномицет, дрожжи, или нитевидный гриб, подходящей является, например, жидкая среда, содержащая вышеуказанные источники питательных веществ. Предпочтительной является среда с pH от 5 до 8. Когда хозяином является E. coli, предпочтительные примеры среды включают среду LB, среду M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) и т.п. В этом случае, культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 14°C до 43°C в течение приблизительно от 3 до 24 часов, при этом аэрацию или перемешивание проводят по мере необходимости. Когда хозяином является бактерия рода Bacillus, культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 30°C до 40°C в течение приблизительно от 16 до 96 часов, при этом аэрацию или перемешивание проводят по мере необходимости. Когда хозяином являются дрожжи, примеры среды включают минимальную среду Буркхолдер (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980), и pH среды желательно составляет от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20°C до 35°C в течение приблизительно от 14 до 144 часов, и аэрацию или перемешивание можно проводить по мере необходимости.

Способ получения Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению дополнительно включает, в дополнение к стадиям культивирования клетки-хозяина по настоящему изобретению и экспрессирования Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, стадию выделения, и предпочтительно, выделения и очистки, Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF из указанной клетки-хозяина. Примеры способа выделения и очистки включают способы, основанные на различиях в растворимости, такие как высаливание и осаждение растворителем; способы, основанные на различиях в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация, и электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS); способы, основанные на различиях в электрическом заряде, такие как ионообменная хроматография и хроматография с гидроксилапатитом; способы, основанные на специфической аффинности, такие как аффинная хроматография; способы, основанные на различиях в гидрофобности, такие как обратно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; способы, основанные на различиях в изоэлектрическойая точке, так как изоэлектрофокусирование; и т.п.

Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению также включает Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, который можно получать способом для получения Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению.

Хотя настоящее изобретение в основном было описано выше, конкретные примеры приведены в настоящем документе только для лучшего понимания настоящего изобретения. Эти примеры предназначены только для иллюстративных целей и не ограничивают объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

На стадиях с использованием коммерчески доступного набора или реагента, эксперименты проводили в соответствии с прилагаемыми протоколами, если не указано иное.<ПРИМЕР 1: Получение Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF>

Три типа генетических фрагментов амплифицировали при помощи ДНК-полимеразы Phusion High-Fidelity (Finnzymes, F-530L) с использованием в качестве матрицы экспрессирующего вектора, который включал полипептид, кодирующий тяжелую цепь из 1-15 (N52D) Fab'-фрагмента (PTL 3), и праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать каждый из трех типов генетических фрагментов от области VH до шарнирной области (SEQ ID NO: 1, 2 и 3). Амплифицированные области содержали HindIII на 5'-конце и EcoRI на 3'-конце. Полученные генетические фрагменты тяжелой цепи расщепляли HindIII и EcoRI (оба фермента от NEB) и вставляли в экспрессирующий вектор pEE6.4.

Эти экспрессионные плазмиды вводили в E.coli общепринятым способом для получения трансформированных клонов, и использовали систему для очистки ДНК Wizard Plus SV Minipreps (Promega, A1460) для выделения плазмидной ДНК. При этом, ген легкой цепи имел такую же последовательность оснований (SEQ ID NO: 4), что и ген легкой цепи из 1-15 (N52D) Fab'-фрагмента, и аминокислотная последовательность, кодируемая геном, представляет собой SEQ ID NO:8. Использовали pEE12.4, кодирующий фрагмент гена легкой цепи.

Вектор GS (pEE6.4), кодирующий фрагмент гена тяжелой цепи из Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, и вектор GS (pEE12.4), кодирующий фрагмент гена легкой цепи из Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF, расщепляли рестрикционными ферментами NotI и PvuI (оба от NEB). Затем проводили лигирование с использованием DNA Ligation Mix (Takara Bio Inc., 6023) для конструирования векторов GS, кодирующих генетические фрагменты и тяжелой цепи, и легкой цепи из Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF. Полученную плазмидную ДНК использовали в качестве матриц для реакций секвенирования, и и продемонстрировали, что плазмидная ДНК содержит последовательности оснований клонированной тяжелой цепи от области VH до шарнирной области и легкой цепи от области VL до области CL. Последовательности оснований от области VH до шарнирной области из трех типов тяжелых цепей показаны в виде SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. Кроме того, аминокислотные последовательности, кодируемые этими последовательностями оснований, показаны в виде SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно. Три типа Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF получали путем сочетания тяжелой цепи из SEQ ID NO: 1 и легкой цепи из SEQ ID NO: 4, тяжелой цепи из SEQ ID NO: 2 и легкой цепи из SEQ ID NO: 4, и тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3 и легкой цепи из SEQ ID NO: 4, и обозначали их как антитело h1f.6, антитело h1f.7 и антитело h1f.8, соответственно.

Fab-фрагменты антитела к человеческому NGF экспрессировали двумя способами транзиторной экспрессии и конститутивной экспрессии с использованием векторов GS. Для транзиторной экспрессии векторами GS трансфицировали клетки CHO-K1SV (Lonza), культивируемые в среде CD-CHO (Invitrogen), с использованием способа электропорации MaxCyte (MaxCyte), а затем инкубировали в течение 7 суток. Fab-фрагменты антитела к человеческому NGF выделяли из культуральных супернатантов с использованием KappaSelect (GE Healthcare, 17-5458-02). Для конститутивной экспрессии, векторами GS, расщепленными рестрикционным ферментом PvuI трансфицировали клетки CHO-K1SV клетки с использованием способа электропорации способ для экспрессии Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF. Fab-фрагменты антитела к человеческому NGF выделяли из культуральных супернатантов с использованием KappaSelect и подтверждали гель-фильтрационной хроматографией и электрофорезом в полиакриламидном геле с SDS. Для подтверждения посттрансляционной модификации очищенного антитела h1f.6 проводили масс-спектрометрию. В результате для большинства антител получали пик, который рассматривали как N-концевое пироглутаминирование.

<ПРИМЕР 2: Оценка активности, ингибирующей связывание, для Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF против человеческого NGF

Для оценки активности, ингибирующей связывание, для Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF против человеческого NGF, проводили конкурентный анализ ELISA для человеческого NGF-trkA, который направлен на ингибирование связывания между человеческим NGF и его рецептором trkA в качестве индикатора. Человеческий trkA (R&D Systems, 175-TK-050), разведенный фосфатно-солевым буфером (PBS) до концентрации 2000 нг/мл добавляли в белый 96-луночный планшет Nunc MaxiSorp (Nunc, 436110) по 50 мкл/лунку и иммобилизовывали инкубированием в течение ночи при 4°C. Раствор человеческого trkA удаляли центрифугированием в перевернутом виде и добавляли Blocker Caseine в TBS (Thermo, 37532) по 200 мкл/лунку. После этого планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, Blocker Caseine в TBS удаляли центрифугированием в перевернутом виде. Очищенные образцы антител, разведенные в 7-11 этапов приблизительно от 200000 нг/мл до приблизительно 2 нг/мл при помощи PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), смешивали с 700 нг/мл биотинилированного человеческого NGF в равных количествах, инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, и полученные образцы добавляли по 100 мкл/лунку. Биотинилированный человеческий NGF, применяемый в настоящем документе, получали путем биотинилирования человеческого NGF (R&D Systems, 256-GF-100/CF) при помощи EZ-Link NHS-PEG4-Biotine (Thermo Scientific, 21329). Биотинилирование человеческого NGF проводили, добавляя 1,25 мкл 5 мМ раствора NHS-PEG4-Biotine к 250 мкл 0,4 мг/мл человеческого NGF, инкубируя в течение 2 часов на льду в темноте, и заменяя раствор реакционной смеси на PBS с использованием Amicon Ultra 3K на 0,5 мл (Millipore, UFC500324) дважды в соответствии с руководством. PBS, содержащий 0,1% BSA, получали в качестве контроля. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, планшет отмывали три раза раствором для отмывания (физиологический раствор, забуференный Трис (TBS) и содержащий 0,05% Tween-20) и добавляли 100 мкл на лунку разведенного в 1000 раз и меченого щелочной фосфатазой стрептавидина (Thermo, 21324) в разведенном в 20 раз Blocking One (NacalaiTesque Inc., 03953-95) в PBS. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, планшет отмывали раствором для отмывания три раза и добавляли 100 мкл/лунку разведенного в 5 раз субстрата для щелочной фосфатазы (Хемилюминесцентный субстрат для ЩФ для микролунок/мембран, суперчувствительный, 450 нм; SurModics, APU4-0100-01) в 2 мМ буфере Трис (pH 9,8), содержащем 0,1 мМ хлорид магния. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, величину сигнала измеряли счетчиком EnVision (Perkin Elmer).

Тесты для 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмента, антитела h1f.6, антитела h1f.7, и антитела h1f.8 проводили дважды. Для расчета уровня ингибирования связывания человеческого NGF-trkA для каждого антитела, измеренную величину для PBS, содержащего 0,1% BSA, принимали за 0% и измеренную величину максимальной концентрации каждого антитела принимали за 100%. Анализировали рассчитанный уровень ингибирования связывания человеческого NGF-trkA и величину IC₅₀ для антитела рассчитывали при помощи алгоритма подбора с трех- или четырехпараметрической логистической кривой. Рассчитывали геометрические средние для значений IC₅₀ для двух повторов, значения IC₅₀ для 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмента, антитела h1f.6, антитела h1f.7, и антитела h1f.8 для ингибирования связывания человеческого NGF-trkA составили 0,30 мкг/мл, 0,32 мкг/мл, 0,30 мкг/мл, и 0,28 мкг/мл, соответственно, показывая, что их активность ингибирования человеческого NGF-trkA была приблизительно одинаковой.

<ПРИМЕР 3: Оценка образования димеров Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF после инкубации в течение 14 суток при 50°C>

Растворы 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмента, антитела h1f.6, антитела h1f.7, и антитела h1f.8 заменяли на буферы с pH 5, 6 и 7 (20 мМ лимонной кислоты/120 мМ NaCl в pH 5 или 6, PBS в pH 7), и корректировали до 10 мг/мл, затем инкубировали в течение 14 суток при 50°C для оценки стабильности.

Образование димеров до и после инкубирования в течение 14 суток при 50°C оценивали при помощи LC1100 (Agilent Technologies) с гель-фильтрационной хроматографией с гелем TSK Super Sw3000 (TOSOH, 2 мм ID×300 мм). Измерение проводили с раствором подвижной фазы из 0,1 M динатрия гидрофосфата и 0,2 M кислой соли L(+)-аргинина с pH, скорректированным до 6,8 при помощи соляной кислоты, скорость потока 0,075 мл/мин при 25°C, с детекцией длины волны 280 нм и референсной длиной волны 360 нм. Измерение проводили дважды для получения арифметического среднего, и уровень роста димеров получали путем вычитания уровня роста димеров до инкубации из уровня роста димеров после инкубации. Таким образом, уровни роста димеров 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмента при pH 5, 6 и 7 составили 5,4%, 17,0% и 18,2%, соответственно, демонстрируя, что в этих условиях образовалось значительное количество димеров. Уровни роста димеров антитела h1f.6 при pH 5, 6 и 7 составили 0,1%, 0,3% и 0,5%, соответственно, для антитела h1f.7 при pH 5, 6 и 7 составили 0,1%, 0,3% и 0,4%, соответственно, и для h1f.8 при pH 5, 6 и 7 составили 0,1%, 0,5% и 0,7%, соответственно. Таким образом, показано, что антитело h1f.6, антитело h1f.7, и антитело h1f.8 имели значительно более низкий уровень образования димеров и были более стабильны, чем 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмент.

<ПРИМЕР 4: Оценка активности, ингибирующей связывание, Fab-фрагментов антитела к человеческому NGF против человеческого NGF после инкубации в течение 14 суток при 50°C>

Оценивали изменение активности, ингибирующей связывание, для 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмента, антитела h1f.6, антитела h1f.7, и антитела h1f.8 против человеческого NGF после инкубации в течение 14 суток при pH 6 и 50°C при помощи конкурентного ELISA с человеческим NGF-trkA, описанного в примере 2. Рассчитывали геометрические средние для значений IC₅₀ для двух повторов, величина IC₅₀ для 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмента, антитела h1f.6, антитела h1f.7, и антитела h1f.8 относительно ингибирования связывания человеческого NGF-trkA составила 0,47 мкг/мл, 0,38 мкг/мл, 0,56 мкг/мл, и 0,47 мкг/мл, соответственно, после инкубации в течение 14 суток при 50°C. Уровень роста значения IC₅₀ для антител после инкубации в течение 14 суток при 50°C по отношению к значению до инкубации составил 59%, 21%, 87% и 68%, соответственно.

Согласно результатам, антитело h1f.6, антитело h1f.7, и антитело h1f.8 представляют собой Fab-фрагменты антитела к NGF, которые имеют значительно более низкий уровень роста димеров, чем 1-15 (N52D-A) Fab'-фрагмент после инкубации в течение 14 суток при 50°C. Показано, что антитело h1f.6 имело только незначительное снижение активности, ингибирующей связывание, во время инкубации и сохраняет высокую стабильность.

<ПРИМЕР 5: Оценка при помощи ELISA активности связывания для антител к человеческому NGF с человеческим NGF>

Анализ ELISA применяли для измерения активности связывания антигена для антитела h1f.6. Для оценки связывающей способности антител к человеческому NGF, проводили тест с использованием планшета с иммобилизованным человеческим NGF. В качестве констроля использовали антитело сравнения Танезумаб.

Человеческий NGF (R&D Systems, 256-GF-100/CF), разведенный PBS до концентрации 1000 нг/мл добавляли в белый 96-луночный планшет Nunc MaxiSorp (Nunc, 436110) по 100 мкл/лунку и иммобилизовывали инкубированием в течение ночи при 4°C. Раствор человеческого NGF удаляли центрифугированием в перевернутом виде и добавляли по 200 мкл/лунку Blocker Caseine в TBS (Thermo, 37532), и планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Blocker Caseine в TBS удаляли центрифугированием в перевернутом виде и очищенные образцы антитела, разведенные в 11 этапов от 1000 нг/мл до 0,01 нг/мл при помощи PBS, содержащего 0,1% BSA, добавляли по 100 мкл/лунку, и планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. PBS, содержащий 0,1% BSA, получали в качестве контроля. Планшет отмывали три раза раствором для отмывания (TBS, содержащий 0,05% Tween-20), добавляли на лунку 100 мкл разведенного в 1000 раз биотинилированного антитела к человеческой легкой цепи каппа (IBL, 17249) в разведенном в 20 раз Blocking One (Nacalai Tesque, Inc., 03953-95) в PBS, и планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшет отмывали три раза раствором для отмывания, и добавляли 100 мкл на лунку разведенного в 1,000 раз и меченого щелочной фосфатазой стрептавидина (Thermo, 21324) в разведенном в 20 раз Blocking One в PBS, и планшет инкубировали в течение 0,5 часа при комнатной температуре. Планшет отмывали раствором для отмывания три раза и добавляли 100 мкл/лунку разведенного в 5 раз субстрата для щелочной фосфатазы (Хемилюминесцентный субстрат для ЩФ для микролунок/мембран, суперчувствительный, 450 нм; SurModics, APU4-0100-01) в 2 мМ буфере Трис (pH 9,8), содержащем 0,1 мМ хлорид магния. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, величину сигнала измеряли счетчиком EnVision (Perkin Elmer).

Тесты для каждого антитела проводили дважды и получали арифметическое среднее. Для расчета уровня ингибирования человеческого NGF для каждого антитела, измеренную величину для PBS, содержащего 0,1% BSA, принимали за 0% и измеренную величину максимальной концентрации каждого антитела принимали за 100%. Анализировали рассчитанный уровень ингибирования связывания человеческого NGF-trkA и величину EC₅₀ для антитела рассчитывали при помощи алгоритма подбора с трехпараметрической логистической кривой. Рассчитывали геометрические средние для значений EC₅₀ для двух повторов, значение EC₅₀ для антитела h1f.6 составило 73,0 нг/мл, в то время как значение EC₅₀ Танезумаба составило 146 нг/мл.

<ПРИМЕР 6: Оценка активности, ингибирующей связывание, антител к человеческому NGF против человеческого NGF>

Конкурентный анализ ELISA, использованный в примере 2 для оценки ингибирования связывания NGF-trkA, применяли для измерения активности, ингибирующей связывание, антитела h1f.6 против человеческого NGF. В качестве контроля использовали антитело сравнения Танезумаб.

Тест проводили четыре раза для антитела h1f.6 и три раза для танезумаба, и брали геометрические средние рассчитанных значений IC₅₀. В результате, значение IC₅₀ для антитела h1f.6 относительно ингибирования связывания человеческого NGF-trkA составило 0,31 мкг/мл, в то время как значение IC₅₀ для Танезумаба относительно ингибирования связывания человеческого NGF-trkA составило 0,86 мкг/мл.

<ПРИМЕР 7: Оценка антитела на местное удержание в ткани, активность связывания с человеческим NGF, и активность, связанную с функциональным ингибированием человеческого NGF>

После местного введения антитела h1f.6 оценивали концентрацию антитела в ткани, в которую вводили, для оценки местного удержания. Антитело h1f.6 местно вводили в бедренную мышцу здоровых крыс в дозах 0,3 и 3 мг/кг с n=4 для каждой дозы, и измеряли концентрации антитела в бедренной мышце через 6 часов после введения при помощи электрохемилюминисцентного анализа (ECL). Местное введение проводили путем инъекции антитела в бедренную мышцу с объемной дозой 0,2 мл/кг с использованием PBS в качестве растворителя.

Гомогенат бедренной мышцы получали, добавляя 2,5-кратный объем раствора для гомогената ткани (10 мМ Трис, 137 мМ NaCl, cOmplete, Mini (Roche), pH 8,0) к собранной ткани бедренной мышцы. Два типа антител к 1-15, АНК-IBL-13A и биотинилированное АНК-IBL-52A, которые получали при иммунизации мышь антителом 1-15 (PTL 3), полученным при иммунизации мыши VelocImmune человеческим NGF, использовали для измерения в анализе ECL. В дополнение, получали биотинилированное АНК-IBL-52A путем биотинилирования АНК-IBL-52A в соответствии с техническим руководством для Biotin Labeling Kit-NH2 (Dojindo Laboratories, LK03).

Способ анализа ECL показан далее. Антитело к 1-15, АНК-IBL-13A, разбавляли TBS до концентрации 1000 нг/мл и добавляли к 96-луночному планшету Multi-array (Meso Scale Discovery, L15XA-6) по 25 мкл/лунку. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы иммобилизовать АНК-IBL-13A. Раствор АНК-IBL-13A удаляли центрифугированием в перевернутом виде, планшет отмывали три раза раствором для отмывания (TBS, содержащий 0,05% Tween-20), и добавляли по 150 мкл/лунку Blocker Caseine в TBS (Thermo, 37532). После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, Blocker Caseine в TBS удаляли центрифугированием в перевернутом виде, и планшет отмывали три раза, затем добавляли 25 мкл/лунку разведенного в 100 раз гомогената бедренной мышцы в разбавителе (Blocker Caseine в TBS, содержащем 0,05% Tween-20) и, для образцов, которые нужно было развести дополнительно, разведенного разбавителем, содержащим 1% гомогената бедренной мышцы без антитела, чтобы попасть в диапазон калибровочной кривой. Для получения калибровочной кривой гомогената бедренной мышцы, антитело h1f.6, разведенное в 10 этапов в диапазоне от 10000 нг/мл до 0,51 нг/мл с использованием разбавителя, было разведено в 100 раз разбавителем, содержащим 1% гомогената бедренной мышцы без антитела. Разбавитель, содержащий 1% гомогената бедренной мышцы без антитела, использовали в качестве контроля. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, раствор удаляли центрифугированием в перевернутом виде, планшет отмывали три раза раствором для отмывания, и добавляли в лунку 25 мкл биотинилированного АНК-IBL-52A, разведенного до 300 нг/мл разбавителем. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, раствор удаляли центрифугированием в перевернутом виде, планшет отмывали три раза раствором для отмывания, и добавляли в лунку 25 мкл стрептавидина MSD SULFO-TAG (Meso Scale Discovery, R32AD-1), разведенного до 1000 нг/мл разбавителем. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, раствор удаляли центрифугированием в перевернутом виде и планшет отмывали три раза раствором для отмывания. После этого добавляли в лунку 150 мкл MSD Read Buffer T(4x) с поверхностно-активным веществом (Meso Scale Discovery, R92TC-2), разведенного в два раза ультрачистой водой (MilliQ (зарегистрированная торговая марка), Merck), электрохемилюминисценцию образцов измеряли при помощи SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery).

Была построена калибровочная кривая для расчета концентрации антитела. Уравнение регрессии анализировали при помощи алгоритма подбора с четырехпараметрической логистической кривой. С использованием калибровочной кривой рассчитывали концентрации антитела в бедренной мышце для каждой точки. Каждый тест проводили в двух повторениях, и рассчитывали арифметическое среднее концентраций.

После местного введения антитела h1f.6 по 0,3 и 3 мг/кг в бедренную мышцу, концентрации в бедренной мышце составили 2,66 мкг/мл и 67,9 мкг/мл, соответственно, через 6 часов после введения.

Для оценки количества антитела h1f.6, которое имеет активность связывания с человеческим NGF, в бедренной мышце, проводили анализ связывания с человеческим NGF при помощи ELISA.

Человеческий NGF (R&D Systems, 256-GF/CF), разведенный PBS до концентрации 1000 нг/мл добавляли в белый 384-луночный планшет Nunc MaxiSorp (Nunc, 460372) по 20 мкл/лунку и иммобилизовали путем инкубации в течение ночи при 4°C. Раствор ого NGF удаляли центрифугированием в перевернутом виде, в планшет добавляли по 80 мкл/лунку Blocking One (Nacalai Tesque, Inc., 03953-95), и планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет отмывали три раза раствором для отмывания (TBS, содержащий 0,05% Tween-20), и добавляли в лунку по 20 мкл гомогената бедренной мышцы из группы с введением 0,3 мг/кг и группы с введением 3 мг/кг, которые разбавляли в 10 и 100 раз, соответственно, с разведенным в 10 раз Blocking One в TBS, содержащем 0,05% Tween-20.

Для построения калибровочной кривой для гомогената бедренной мышцы из группы с введением 0,3 мг/кг и группы с введением 3 мг/кг, антитела h1f.6 разбавляли в 11 этапов в диапазоне от 3000 нг/мл до 0,03 нг/мл разбавителем, приготовленным путем добавления гомогената бедренной без антитела в концентрации 10% и 1%, соответственно, к Blocking One, который был разведен в 10 раз TBS, содержащим 0,05% Tween-20, и добавляли по 20 мкл/лунку.

После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, планшет отмывали три раза раствором для отмывания и добавляли в лунку 20 мкл разведенного в 2500 раз биотинилированного антитела к человеческой легкой цепи каппа (IBL, 17249) в разведенном в 10 раз Blocking One в TBS, содержащем 0,05% Tween-20. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, планшет отмывали три раза раствором для отмывания, добавляли в лунку 20 мкл разведенного в 8000 раз высокочувствительного стрептавидина-HRP (Thermo, 21130) в разведенном в 10 раз Blocking One в TBS, содержащем 0,05% Tween-20, и планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет отмывали три раза раствором для отмывания и добавляли в лунку 20 мкл хемилюминесцентного вещества (BM Chemiluminescence ELISA Substrate (POD); Roche, 11582950001), затем измеряли величину сигнала при помощи счетчика EnVision (Perkin Elmer). Каждый тест проводили в двух повторениях, и построили калибровочную кривую, чтобы рассчитать количество антитела h1f.6, которое имеет активность связывания с человеческим NGF. Уравнение регрессии анализировали при помощи алгоритма подбора с четырехпараметрической логистической кривой, и рассчитывали количество антитела, которое имеет активность связывания с человеческим NGF, для каждой точки на основании калибровочнойая кривой. Количество антитела h1f.6, которое имеет активность связывания с человеческим NGF, в бедренной мышце рассчитывали, умножая полученные значения для группы с введением 0,3 мг/кг и группы с введением 3 мг/кг на 35 и 350, соответственно, и получали арифметическое среднее.

Таким образом, количество антитела h1f.6, которое имеет активность связывания с человеческим NGF, для группы с введением 0,3 мг/кг составило 2,12 мкг/мл и для группы с введением 3 мг/кг составило 77,9 мкг/мл.

Эти результаты, которые относятся к концентрации антитела h1f.6 и количеству антитела h1f.6, имеющему активность связывания с человеческим NGF, в бедренной мышце, показали, что почти все антитело, находящееся в бедренной мышце, является антителом, которое имеет активность связывания с человеческим NGF.

Далее, для оценки активности, связанной с ингибированием связывания относительно человеческого NGF в бедренной мышце, проводили конкурентный анализ ELISA с человеческим NGF-trkA, который направлен на ингибирование связывания между человеческим NGF и его рецептором trkA в качестве индикатора.

Человеческий trkA (R&D Systems, 175-TK-050), разведенный PBS до концентрации 2000 нг/мл, добавляли в белый 384-луночный планшет Nunc MaxiSorp по 20 мкл/лунку и иммобилизовывали инкубированием в течение ночи при 4°C. Раствор человеческого trkA удаляли центрифугированием в перевернутом виде и добавляли Blocker Caseine в TBS по 80 мкл/лунку, и планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшет отмывали три раза раствором для отмывания (TBS, содержащий 0,05% Tween-20) для удаления Blocker Caseine в TBS. Гомогенат бедренной мышцы крысы, разведенный в 5 раз для группы с введением 0,3 мг/кг и разведенный в 50 раз для группы с введением 3 мг/кг при помощи PBS, содержащего 0,1% BSA, смешивали каждый с 0,4 мкг/мл биотинилированного человеческого NGF в равных количествах, и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, и добавляли полученные образцы по 20 мкл/лунку. Поскольку собранные мышечные ткани разбавляли раствором для гомогената ткани, который в 2,5 раза превышал количество мышечных тканей, концентрации антитела в бедренной мышце для группы с введением 0,3 мг/кг и группы с введением 3 мг/кг оценивали с использованием растворов с разведением в 35 раз и 350 раз, соответственно.

Биотинилированный человеческий NGF, применяемый в настоящем документе, получали путем биотинилирования человеческого NGF (R&D Systems, 256-GF-100/CF) при помощи EZ-Link NHS-PEG4-Biotine (Thermo Scientific, 21329). Биотинилирование человеческого NGF проводили, добавляя 5 мкл 5 мМ раствора NHS-PEG4-Biotine к 1 мл 0,4 мг/мл человеческого NGF, инкубируя в течение 2 часов на льду в темноте, и заменяя раствор реакционной смеси на PBS с использованием Amicon Ultra 3K на 0,5 мл (Millipore, UFC500324) дважды в соответствии с руководством.

PBS, содержащий 0,1% BSA, и 10 мкг/мл антитела h1f.6, разведенного PBS, содержащим 0,1% BSA, использовали в качестве контроля. Контрольные образцы для группы с введением 0,3 мг/кг и группы с введением 3 мг/кг разбавляли PBS, содержащим 0,1% BSA, который содержал 10% и 1% гомогената бедренной мышцы без антитела, соответственно. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, планшет отмывали три раза раствором для отмывания и добавляли в лунку 20 мкл разведенного в 1000 раз и меченого щелочной фосфатазой стрептавидина (Thermo, 21324) в разведенном в 20 раз Blocking One в TBS, содержащем 0,05% Tween-20. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, планшет отмывали три раза раствором для отмывания и и добавляли 20 мкл/лунку субстрата для щелочной фосфатазы (Хемилюминесцентный субстрат для ЩФ для микролунок/мембран, суперчувствительный, 450 нм; SurModics, APU4-0100-01), смешанного в соотношении 1:1 с разведенным в 10 раз раствором 200 мМ буфера Трис (pH 9,8), содержащем 10 мМ хлорида магния. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, величину сигнала измеряли счетчиком EnVision (Perkin Elmer).

Для расчета активности антитела, связанной с ингибированием связывания человеческого NGF для каждой концентрации, измеренную величину для PBS, содержащего 0,1% BSA, принимали за 0% и измеренную величину максимальной концентрации каждого антитела принимали за 100%. Тест проводили в двух повторениях (с 4 или 8 лунками для контроля), и получали арифметическое среднее.

Таким образом, группа с введением 0,3 мг/кг показала активность, связанную с ингибированием связывания, 21,2% даже в условиях, когда концентрация антитела в бедренной мышце разведена в 35 раз. Далее, группа с введением 3 мг/кг показала активность, связанную с ингибированием связывания, 59,9% в условиях, когда концентрация антитела в бедренной мышце разведена в 350 раз. Это подтверждет, что в тканях бедренной мышцы в группах, где антитело h1f.6 вводят по 0,3 мг/кг и 3 мг/кг, антитело имеет активность, связанную с ингибированием связывания против человеческого NGF путем ингибирования связывания между человеческим NGF и его рецептором trkA.

Вышеуказанное ясно демонстрирует, что Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, антитело h1f.6, сохраняет свою концентрацию в ткани-мишени и активность связывания с человеческим NGF при местном введении, и, таким образом, ингибирует связывание между человеческим NGF и его рецептором. Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, антитело h1f.6, обладает высоким потенциалом для обеспечения превосходного лекарственного средства, которое проявляет желательные эффекты лекарственного средства для местного воздействия в ткани-мишени с меньшим уровнем местной дозы.

<ПРИМЕР 8: Оценка анальгетических эффектов на модели послеоперационной боли у крыс после рассечения подошвы>

Анальгетические воздействия антитела h1f.6 на послеоперационную боль при местном введении в участок операции оценивали на крысиной модели послеоперационной боли с рассечением подошвы (Banik RK et al. Pain 2005; 117. p.68-76), которая рассматривается как отражение послеоперационной боли у кдинической модели. Патентный документ 3 показывает, что системное внутривенное введение полностью человеческого антитела 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG к человеческому NGF демонстрирует анальгетический эффект на этой модели. В этом исследовании, 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG применяли для сравнения послеоперационной боли при местном и системном введении для оценка анальгетических эффектов при местном введении антитела h1f.6.

Конкретно, всего было пять групп, каждая группа с операцией включала 10 крыс, и каждая группа без операции включала 5 крыс, группы представляли собой группу без операции, группу с растворителем (20 мМ цитрата, 120 мМ NaCl, pH6), группу, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, группу, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и группу, которой вводили 1 мг/кг of 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно. Местное введение в подошву проводили, имплантируя в разрезанную часть подошвенной мышцы кусочек листа Spongel (зарегистрированная торговая марка) (Astellas Pharma) приблизительно в 2 мг, который был смочен и пропитан 30 мкл 30 мг/мл раствора антитела. Группе с растворителем и группе, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно, имплантировали листы Spongel, которые были смочены и пропитаны растворителями. В этой оценке, подошва левой задней лапы была разрезана приблизительно на 10 мм в длину прямой линией, которая начиналась от точки приблизительно на 5 мм от конца пятки в направлении к пальцам, под анестезией изофлураном, и открывшаяся подошвенная мышца была разрезана вертикально перед возвращением мышцы в ее положение и имплантацией листа Spongel, затем мышца была сшита матрасным швом в двух точках с использованием нейлоновой нити. Болевой порог измеряли через 24 часа, 48 часов и 72 часа после операции. Болевой порог исследовали с использованием динамического подошвенного эстезиометра (Ugo Basile) для измерения давления, указывающего на поведение для избежания давления на крысиную подошву.

В качестве болевого порога рассчитывали арифметическое среднее трех значений порога давления, которые вызывали поведение избегания у отдельных крыс в каждой группе, и степень улучшения болевого порога в каждой группе, которой вводили фармацевтическое средство, рассчитывали, устанавливая болевой порог в группе без операции как 100%, и болевой порог в группе с растворителем как 0%. В результате, через 24 часа после операции, уровни улучшения болевого порога в группе, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, в группе, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и в группе, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно, составили 34%, 49%, и 46%, соответственно, и болевой порог в каждой группе, которой вводили фармацевтическое средство, показал значимое улучшение с p<0,05 с t-критерием Стъюдента по сравнению с группой с растворителем. Дополнительно, через 48 часов после операции, уровни улучшения болевого порога в группе, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, в группе, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и в группе, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно, составили 38%, 31%, и 34%, соответственно, и болевой порог в каждой группе, которой вводили фармацевтическое средство, показал значимое улучшение с p<0,05 с t-критерием Стъюдента по сравнению с группой с растворителем. Дополнительно, через 72 часа после операции, уровни улучшения болевого порога в группе, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, в группе, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и в группе, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно, составили 26%, 33%, и 28%, соответственно, и болевой порог в каждой группе, которой вводили фармацевтическое средство, показал значимое улучшение с p<0,05 с t-критерием Стъюдента по сравнению с группой с растворителем. Когда проводили тест множественных сравнений Тьюки, никаких значимых отличий с p<0,05 не наблюдали в болевом пороге в трех группах, а именно, в группе, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, в группе, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и в группе, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно, ни через 24 часа, ни через 48 часов, ни через 72 часа после операции. Это показывает, что анальгетические эффекты, наблюдаемые между этими тремя группами, являются фармакологически равными через 24 часа, 48 часов и 72 часа после операции, соответственно.

<ПРИМЕР 9: Оценка концентрации лекарственного средства в плазме или ткани при местном введении>

Для оценки концентрации каждого антитела в подошвенной мышце или в плазме из оценки в примере 8, группу, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, группу, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и группу, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно выделяли у крыс с n=3 способом, аналогичным способу в примере 8, и измеряли концентрацию антител в подошвенной мышце или в плазме через 24 часа после операции при помощи электрохемилюминисцентного анализа (ECL). Местное введение в подошву проводили аналогично примеру 8, имплантируя в разрезанную часть подошвенной мышцы кусочек листа Spongel (зарегистрированная торговая марка) (Astellas Pharma) приблизительно в 2 мг, который был смочен и пропитан 30 мкл 30 мг/мл раствора антитела.

Концентрацию антител в подошвенной мышце получали, измеряя концентрацию образцов, которые были гомогенизированы с 9-кратным объемом раствора гомогената подошвенной ткани (10 мМ Трис, 137 мМ NaCl, 1% тритон X-100, 10% глицерин, cOmplete, Mini (Roche), pH 8,0), и умножая эту концентрацию на 10. Измерение при помощи анализа ECL проводили с использованием двух типов антител к 1-15, АНК-IBL-13A и биотинилированного АНК-IBL-52A. Кроме того, биотинилированное АНК-IBL-52A получали путем биотинилирования АНК-IBL-52A в соответствии с техническим руководством для Biotin Labeling Kit-NH2 (Dojindo Laboratories, LK03).

Способ анализа ECL показан далее. Антитело к 1-15, АНК-IBL-13A, разбавленное TBS до концентрации 5000 нг/мл, добавляли к 96-луночному планшету Multi-array (Meso Scale Discovery, L15XA-6) по 25 мкл/лунку. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы иммобилизовать АНК-IBL-13A. Раствор АНК-IBL-13A удаляли центрифугированием в перевернутом виде, планшет отмывали три раза раствором для отмывания (TBS, содержащий 0,05% Tween-20), и добавляли по 150 мкл/лунку Blocker Caseine в TBS (Thermo, 37532). После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, Blocker Caseine в TBS удаляли центрифугированием в перевернутом виде. Планшет отмывали три раза раствором для отмывания, затем добавляли 25 мкл/лунку разведенного в 10 раз образца плазмы гомогената подошвенной мышцы в разбавителе (Blocker Caseine в TBS, содержащем 0,05% Tween-20).

Для получения калибровочной кривой для образца плазмы, получали антитело h1f.6 и 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG, разведенные в 10 этапов в диапазоне от 333 нг/мл до 0,017 нг/мл разбавителем, содержащим 10% плазму без антитела, и разбавитель, содержащий 10% плазму без антитела, использовали в качестве контроля. Для получения калибровочной кривой для гомогената подошвенной мышцы, антитело h1f.6 и 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG разведенные в 10 этапов в диапазоне от 333 нг/мл до 0,017 нг/мл разбавителем, содержащим 10% гомогенат подошвенной мышцы без антитела. Разбавитель, содержащий 10% гомогенат подошвенной мышцы без антитела, использовали в качестве контроля. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре, раствор удаляли центрифугированием в перевернутом виде. Планшет отмывали три раза раствором для отмывания, и добавляли в лунку 25 мкл биотинилированного АНК-IBL-52A, разведенного до 1000 нг/мл разбавителем, и планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Раствор удаляли центрифугированием в перевернутом виде, планшет отмывали три раза раствором для отмывания, и добавляли в лунку 25 мкл стрептавидина MSD SULFO-TAG (Meso Scale Discovery, R32AD-1), разведенного в 500 раз разбавителем. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, раствор удаляли центрифугированием в перевернутом виде, и планшет отмывали три раза раствором для отмывания. После этого добавляли в лунку 150 мкл MSD Read Buffer T(4x) (Meso Scale Discovery, R92TC-1), разведенного в два раза ультрачистой водой (MilliQ (зарегистрированная торговая марка), Merck), электрохемилюминисценцию образцов измеряли при помощи SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery).

Была построена калибровочная кривая для расчета концентрации антитела. Уравнение регрессии анализировали при помощи алгоритма подбора с четырех- или пятипараметрической логистической кривой, концентрации антитела в плазме и подошвенной мышце рассчитывали для каждой точки. Каждый тест проводили в трех повторах, и получали арифметическое среднее рассчитанных концентраций. Предел определения антитела h1f.6 в этом тесте составил 0,2 нг/мл для концентрации в плазме, и 2 нг/мл для концентрации в подошвенной мышце, и предел определения полностью человеческого антитела к NGF 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG составил 0,5 нг/мл для концентрации в плазме, и 2 нг/мл для концентрации в подошвенной мышце.

Концентрация в подошвенной мышце в группе, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, группе, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и группе, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно, через 24 часа после введения составила 132 нг/мл, 46,2 нг/мл, и 24,1 нг/мл, соответственно. Концентрация в подошвенной мышце была наибольшей для введения антитела h1f.6 в подошву. С другой стороны, концентрация в плазме через 24 часа после введения была менее чем 0,230 нг/мл (из трех примеров, один был 0,230 нг/мл, и два были менее чем 0,2 нг/мл), 65,1 нг/мл, 396 нг/мл, соответственно, и концентрация в плазма была наиболее низкой для местного введения антитела h1f.6 в подошву.

На основании концентрации каждого антитела в подошвенной мышце и в плазме, рассчитывали соотношения концентраций в подошвенной мышце/плазме через 24 часа после введения для группы, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, группы, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и группы, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно. Концентрация в плазме через 24 часа после введения для индивидуумов, которым вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву была назначена величиной предела определения, 0,2 нг/мл, поскольку она была ниже предела определения в этих условиях.

Соотношения концентраций в подошвенной мышце/плазме через 24 часа после введения для группы, которой местно вводили 900 мкг антитела h1f.6 в подошву, группы, которой местно вводили 900 мкг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG в подошву, и группы, которой вводили 1 мг/кг 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG внутривенно, составили 628, 0,71, и 0,061, соответственно. Соотношение концентраций в подошвенной мышце/плазме для 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG, которое вводили в подошву, было более чем в 10 раз выше, чем для внутривенного введения. Антитело h1f.6 продемонстрировало соотношение концентраций в подошвенной мышце/плазме более чем в 800 раз высокое, чем 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG, при сравнении их местного введения в подошву.

Вышеописанные результаты указывают на то, что местное введение антитела h1f.6, которое представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, может снижать концентрацию лекарственного средства в системном кровотоке, с одновременным сохранением концентрации лекарственного средства в целевом местном очаге, и дополнительно демонстрируют, что оно снижает концентрацию лекарственного средства в системном кровотоке с одновременным сохранением концентрации лекарственного средства в целевом местном очаге более эффективно чем полностью человеческое антитело к NGF 1-15 (N52D-A)-Fab'-10k PEG. Как таковой, Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, обладает высоким потенциалом для обеспечения превосходного лекарственного средства, которое снижает системные побочные эффекты, одновременно проявляя желаемые эффекты лекарственного средства в местном очаге.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Ожидается, что Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению будет полезным для лечения послеоперационной боли. Ожидается, что Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению будет особенно полезным в качестве улучшенного фармацевтического средства, которое снижает системные побочные эффекты от системного воздействия в крови, одновременно проявляя желаемые эффекты лекарственного средства в местном очаге.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В СВОБОДНОЙ ФОРМЕ

Объяснения приведены для «Искусственной Последовательности», описанной для каждого числового показателя <223> из списка последовательностей, показанного далее. Конкретно, последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, представляет собой последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи из антитела h1f.6, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:5 из списка последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO:1. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, представляет собой последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи из антитела h1f.7, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:6 из списка последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO:2. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO:3 из списка последовательностей, представляет собой последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи из антитела h1f.8, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:7 из списка последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO:3. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO:4 из списка последовательностей, представляет собой последовательность оснований легкой цепи из 1-15(N52D-A) Fab'-фрагмента, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:8 из списка последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи, кодируемую SEQ ID NO:4. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO:9 из списка последовательностей, представляет собой последовательность оснований вариабельной области тяжелой цепи из Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:10 из списка последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO:9. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO:11 из списка последовательностей, представляет собой последовательность оснований вариабельной области легкой цепи из Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по настоящему изобретению, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:12 из списка последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую SEQ ID NO:11.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Astellas Pharma Inc.

<120> НОВЫЙ FAB-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ NGF

<130> FA1535-16021

<150> JP2015-104806

<151> 2015-05-22

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 675

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи h1f.6

<400> 1

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300

cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgac 675

<210> 2

<211> 672

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи h1f.7

<400> 2

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300

cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gt 672

<210> 3

<211> 678

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи h1f.8

<400> 3

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300

cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgcagcc 678

<210> 4

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая легкую цепь 1-15(N52D-A)-Fab'-фрагмента

<400> 4

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gattcaacta tttgggttgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac tctgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657

<210> 5

<211> 225

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент тяжелой цепи h1f.6

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp

225

<210> 6

<211> 224

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фоагмент тяжелой цепи h1f.7

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 7

<211> 226

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент тяжелой цепи h1f.8

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Ala Ala

225

<210> 8

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь 1-15(N52D-A)-Fab'-фрагмента

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ген VH антитела к человеческому NGF

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(363)

<400> 9

cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag 48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac 96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

tac tgg agc tgg gtc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att 144

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

ggg gaa atc gac cat agt gga agc acc aac aac aac ccg tcc ctc aag 192

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

agt cga gtc acc ata tca gta ggc acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt tcg 288

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

aga gat ggg ggc ccc gaa tcg ggg atg ggg gct ttt gat atc tgg ggc 336

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

caa ggg aca atg gtc acc gtc tcc tca 363

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ген VL антитела к человеческому NGF

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(339)

<400> 11

gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat agt 96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

aat gga ttc aac tat ttg ggt tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt act ctg aaa atc 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

cta caa act ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 336

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

cgg 339

Arg

<210> 12

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая конструкция

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<---

1. Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, выбранный из группы, состоящей из (a) и (b) ниже:

(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; и

(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, где глутамин в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 5 модифицирован в пироглутаминовую кислоту, и фрагмент легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8.

2. Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по п.1, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и фрагмент легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8.

3. Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по п.1, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, где глутамин в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 5 модифицирован в пироглутаминовую кислоту, и фрагмент легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8.

4. Фармацевтическая композиция для лечения послеоперационной боли, содержащая эффективное количество Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по п.2, Fab-фрагмент антитела к человеческому NGF по п.3 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, которая представляет собой фармацевтическую композицию для местного введения для лечения послеоперационной боли.

6. Применение Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по любому из пп.1-3 для получения фармацевтической композиции для местного введения для лечения послеоперационной боли.

7. Применение Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по любому из пп.1-3 для лечения послеоперационной боли путем местного введения.

8. Способ лечения послеоперационной боли, включающий местное введение индивидууму эффективного количества Fab-фрагмента антитела к человеческому NGF по любому из пп.1-3.