Композиция для лечения заболеваний, связанных с ил-6

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, связанного с ИЛ-6, где фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента антитело к рецептору ИЛ-6. Фармацевтическую композицию вводят в стандартной дозе 120 мг на введение антитела с четырехнедельными интервалами после кратковременного периода введения дозы, когда дозу, аналогичную стандартной дозе, вводят многократно с двухнедельными интервалами. Изобретение обеспечивает снижение иммуногенности и побочных эффектов, а именно подавление образования анти-антител за счет введения фармацевтической композиции в указанной дозе и согласно указанному способу введения. 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 пр., 3 ил.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям или к схеме лечения, используемым для лечения заболеваний, связанных с ИЛ-6.

Предпосылки создания настоящего изобретения

Интерлейкин-6 (ИЛ-6) представляет собой цитокин, который также называют фактором стимуляции В-клеток (BSF2) или интерфероном β2. ИЛ-6 был открыт как фактор дифференцировки, принимающий участие в активации В лимфоцитов (непатентный документ 1), а позднее было показано, что он является многофункциональным цитокином, который влияет на функции различных клеток (непатентный документ 2). Было установлено, что ИЛ-6 индуцирует созревание Т лимфоцитов (непатентный документ 3).

ИЛ-6 проявляет свою биологическую активность с помощью белков двух типов, расположенных на клетках. Одним из них является рецептор ИЛ-6, который является лиганд-связывающим белком с молекулярной массой приблизительно 80 кДа, с которым связывается ИЛ-6 (непатентные документы 4 и 5). Рецептор ИЛ-6 существует в виде растворимого рецептора ИЛ-6, который в основном состоит из внеклеточной области, а также из связанной с мембраной формы, которая экспрессируется на клеточной мембране и проникает через клеточную мембрану.

Другой белок представляет собой мембранный белок gp130 с молекулярной массой приблизительно 130 кДа, который принимает участие в передаче нелигандсвязывающего сигнала. Биологическая активность ИЛ-6 передается в клетку за счет образования комплекса ИЛ-6/рецептор ИЛ-6 с участием ИЛ-6 и рецептора ИЛ-6 с последующим связыванием комплекса с gp130 (непатентный документ 6).

Ингибиторами ИЛ-6 являются соединения, которые ингибируют передачу биологической активности ИЛ-6. В настоящее время известны антитела к ИЛ-6 (антитела анти-ИЛ-6), антитела к рецептору ИЛ-6 (антитела антирецептор-ИЛ-6), антитела к gp130 (антитела анти-gp130), варианты ИЛ-6, частичные пептиды ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6.

В литературе известно несколько обзоров, посвященных антителам к рецептору ИЛ-6 (непатентные документы 7 и 8 и патентные документы 1-3). Одним из них является гуманизированное антитело РМ-1, которое получают перенесением определяющей комплементарность области (CDR) антитела мыши РМ-1 (непатентный документ 9) в антитело человека (патентный документ 1).

Тоцилизумаб, который является антителом к рецептору ИЛ-6, в настоящее время используют для лечения воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и болезнь Кастельмана (непатентный документ 10), и его эффективность подтверждена при лечении заболеваний, таких нейромиелит зрительного нерва (NMO) (непатентный документ 11).

Описаны также благоприятные действия антител к ИЛ-6 при лечении тяжелой псевдопаралитической миастении (непатентный документ 12).

Гуманизированные антитела, такие как тоцилизумаб, являются лекарственными препаратами на основе антител первого поколения. В настоящее время разрабатывают лекарственные препараты на основе антител второго поколения с целью улучшения эффективности лекарственного средства, удобства использования и стоимости лекарственных препаратов на основе антител первого поколения (патентный документ 2). В качестве лекарственного средства на основе антител второго поколения был разработан препарат SA237, новое антитело к рецептору ИЛ-6 за счет применения улучшенных технологий, таких как улучшение эффекторной функции, антиген-связывающей способности, фармакокинетики и стабильности, или методов, снижающих иммуногенные риски, и этот препарат уже находится в стадии клинических испытаний.

Несмотря на применение в настоящее время множества схем лечения антителами, для алемтузумаба было подтверждено снижение эффективности лечения в связи с формированием анти-антител. Сообщалось, что для предотвращения такого снижения оказалось эффективным вводить не связывающийся с клетками мутант, который можно вводить в высоких дозах, вместо индукции иммунологической переносимости за счет введения высокой дозы алемтузумаба (непатентный документ 13).

Документы предшествующего уровня техники, относящиеся к настоящему изобретению, приведены ниже.

Документы, описывающие предшествующий уровень техники (Непатентные документы)

[Непатентный документ 1] Hirano, Т. и др., Nature 324, 73-76 (1986)

[Непатентный документ 2] Akira S. и др., Adv. in Immunology 54, 1-78 (1993)

[Непатентный документ 3] Lotz М. и др., J. Exp. Med. 167, 1253-1258 (1988)

[Непатентный документ 4] Taga Т. и др., J. Exp. Med. 166, 967-981 (1987)

[Непатентный документ 5] Yamasaki К. и др., Science 241, 825-828 (1988)

Непатентный документ 6] Taga Т. и др., Cell 58, 573-581 (1989)

[Непатентный документ 7] Novick D. и др., Hybridoma 10, 137-146 (1991)

[Непатентный документ 8] Huang Y. W. и др., Hybridoma 12, 621-630 (1993)

[Непатентный документ 9] Hirata Y. и др., J. Immunol. 143, 2900-290 (1989)

[Непатентный документ 10] Nishimoto N. и др., Blood. 106(8):2627-32 (2005)

[Непатентный документ 11] Araki и др., Mod. Rheumatol. 23(4), 827-831 (2013)

[Непатентный документ 12] Aricha R. и др., J. Autoimmun. 36(2), 135-141 (2011)

[Непатентный документ 13] Charlotte L. и др., Nature Reviews Rheumatology 6, 558-559 (2010)

(Патентные документы)

[Патент 1] Публикация заявки на выдачу международного патента WO 92-19759

[Патент 2] Публикация заявки на выдачу международного патента WO 2010/035769

Краткое описание настоящего изобретения

(Задачи, решаемые в настоящем изобретении)

Даже в случае SA237 (антитела, содержащего последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 4), которое получают по стандартным технологиям для снижения иммуногенности в ходе клинических испытаний (SA-001JP) в фазе I, при подкожном введении однократной дозы 120 мг SA237 здоровым взрослым субъектам мужского пола образуются антитела анти-SA237 в 54,2% случаев (39 из 72 случаев) и возникала иммуногенная проблема. Целью настоящего изобретения является подавление образования анти-антител и разработка более эффективных фармацевтических композиций или схемы лечения, используемых при лечении заболеваний, связанных с ИЛ-6.

Средства решения задач

Для решения упомянутых выше задач внимание авторов настоящего изобретения было направлено на иммунологическую переносимость, и впервые было установлено, что можно подавить образование анти-антител за счет введения фармацевтической композиции в предварительно определенной дозе и согласно предварительно определенному способу введения.

Более подробно, в настоящем изобретении впервые предлагается подавление образования анти-антител при использовании фармацевтической композиции в предварительно определенной дозе и согласно предварительно определенному способу введения для лечения заболеваний, связанных с ИЛ-6.

Более подробно, в настоящем изобретении предлагаются следующие объекты:

[1] Фармацевтическая композиция, используемая при лечении заболевания, связанного с ИЛ-6, включающая ингибитор ИЛ-6 в качестве активного ингредиента, при этом фармацевтическую композицию вводят стандартным способом после кратковременного периода введения дозы, когда дозу, аналогичную стандартной дозе, вводят многократно через более короткий интервал по сравнению со стандартным интервалом введения дозы.

[2] Фармацевтическая композиция по п. [1], стандартный интервал введения которой составляет от 3 до 5 недель.

[3] Фармацевтическая композиция по п. [1], стандартный интервал введения которой составляет 4 недели.

[4] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[3], где интервал введения дозы в течение кратковременного периода введения, когда дозу вводят многократно через более короткий интервал по сравнению со стандартным интервалом введения, составляет от одной до двух недель.

[5] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[3], где интервал введения дозы в течение кратковременного периода введения, когда дозу вводят многократно через более короткий интервал по сравнению со стандартным интервалом введения, составляет две недели.

[6] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[5], где кратковременный интервал введения дозы составляет четыре недели после первичного введения.

[7] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[6], где стандартная доза составляет от 50 до 800 мг в составе однократной дозы.

[8] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[7], где стандартная доза составляет 120 мг в составе однократной дозы.

[9] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[8], где ингибитором ИЛ-6 является антитело к рецептору ИЛ-6.

[10] Фармацевтическая композиция по п. [9], где антителом к рецептору ИЛ-6 является химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

[11] Фармацевтическая композиция по п. [9], где антитело к рецептору ИЛ-6 включает вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2.

[12] Фармацевтическая композиция по п. [9], где антитело к рецептору ИЛ-6 включает тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 3, и легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 4.

[13] Фармацевтическая композиция по п. [9], где антителом к рецептору ИЛ-6 является SA237.

[14] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[13], где заболеванием, связанным с ИЛ-6, является ревматоидный артрит, юношеский идиопатический артрит, ювенильный идиопатический артрит с системным началом, болезнь Кастельмана, системная красная волчанка (SLE), волчаночный нефрит, болезнь Крона, лимфома, язвенный колит, анемия, васкулит, болезнь Кавасаки, болезнь Стилла, амилоидоз, рассеянный склероз, трансплантация, возрастная макулярная дистрофия, анкилозирующий спондилоартрит, псориаз, псориатический артрит, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), первичная нефропатия IgA-типа, остеоартрит, астма, диабетическая нефропатия, реакция отторжения трансплантата (ТПХ), эндометриоз, гепатит (неалкогольный стеатогепатит), инфаркт миокарда, артериосклероз, сепсис, остеопороз, диабет, множественная миелома, рак предстательной железы, рак почки, В-клеточная неходжкинская лимфома, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак пищевода, рак ободочной кишки, раковая кахексия, инвазия раковых нервных клеток, инфаркт миокарда, миопическая хориоидальная неоваскуляризация, идиопатическая хориоидальная неоваскуляризация, увеит, хронический тироидит, замедленная гиперчувствительнотсь, контактный дерматит, атопический дерматит, мезотелиома, полимиозит, дерматомиозит, панувеит, передний увеит, средний увеит, воспаление склеры, воспаление роговицы, орбитальный воспалительный синдром, неврит зрительного нерва, диабетическая ретинопатия, пролиферативная витреоретинопатия, синдром сухого глаза, послеоперационный воспалительный синдром, нейромиелит зрительного нерва, тяжелая псевдопаралитическая миастения или легочная гипертензия.

[15] Фармацевтическая композиция по любому из п.п. [1]-[14], где фармацевтической композицией является состав для подкожного введения.

[16] Способ лечения заболевания, связанного с ИЛ-6, включающий введение ингибитора ИЛ-6, где ингибитор ИЛ-6 вводят стандартным способом через кратковременный интервал введения дозы, когда аналогичную дозу вводят многократно через более короткий интервал по сравнению со стандартным интервалом введения дозы.

[17] Ингибитор ИЛ-6 для лечения заболевания, связанного с ИЛ-6, при этом ингибитор ИЛ-6 вводят стандартным способом через кратковременный интервал введения дозы, когда аналогичную дозу вводят многократно через более короткий интервал по сравнению со стандартным интервалом введения дозы.

[18] Применение ингибитора ИЛ-6 для получения лекарственного препарата, предназначенного для лечения заболевания, связанного с ИЛ-6, при этом ингибитор ИЛ-6 вводят стандартным способом через кратковременный интервал введения дозы, когда аналогичную дозу вводят многократно через более короткий интервал по сравнению со стандартным интервалом введения дозы.

Сущность настоящего изобретения

Фармацевтическая композиция или схема лечения по настоящему изобретению способны исключить иммуногенную проблему формирования антител к лекарственному средству и обеспечить фармацевтическую композицию с меньшей нагрузкой на организм пациента за счет введения пациенту меньших доз.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлены изменения средней величины (и стандартное отклонение) концентрации SA237 в сыворотке. На фиг. 1а представлены изменения концентрации SA237 в течение периода первичной оценки, на фиг. 1б показаны изменения концентрации SA237 в течение более продолжительного периода и на фиг. 1в показаны изменения концентрации SA237 в сыворотке в течение периода до 8 недель.

На фиг. 2 представлены изменения средней величины (и стандартное отклонение) концентрации sИЛ-6R в сыворотке, который является фармакодинамическим маркером SA237. На фиг. 2а представлены изменения концентрации sИЛ-6R в течение периода первичной оценки, на фиг. 2б показаны изменения концентрации sИЛ-6R в сыворотке в течение более продолжительного периода.

На фиг. 3 представлены изменения средней величины (и стандартное отклонение) концентрации CRP в сыворотке, который является фармакодинамическим маркером SA237. На фиг. 3а представлены изменения концентрации CRP в течение периода первичной оценки, на фиг. 3б показаны изменения концентрации CRP в сыворотке в течение более продолжительного периода.

Способ осуществления настоящего изобретения

Ниже приведено подробное описание настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям или схеме лечения, используемым для лечения заболеваний, связанных с ИЛ-6.

"Ингибиторы ИЛ-6" по настоящему изобретению представляют собой вещества, блокирующие передачу сигнала ИЛ-6 и ингибирующие биологическую активность ИЛ-6. Ингибиторами ИЛ-6 предпочтительно являются соединения, ингибирующие связывание с одним из белков: ИЛ-6, рецептор ИЛ-6 и gp130.

Примеры ингибиторов ИЛ-6 по настоящему изобретению включают, но не ограничиваясь только ими, антитела к ИЛ-6, антитела к рецептору ИЛ-6, антитела к gp130, варианты ИЛ-6, растворимые варианты рецептора ИЛ-6 или частичные пептиды ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6 и низкомолекулярные соединения, характеризующиеся аналогичной активностью. Примеры ингибитора ИЛ-6 по настоящему изобретению предпочтительно включают антитела, распознающие рецептор ИЛ-6.

Источник антител по настоящему изобретению особо не ограничен, но предпочтительно они являются антителами млекопитающих и более предпочтительно антителами человека.

Антитела к ИЛ-6 по настоящему изобретению можно получать как в виде поликлональных или моноклональных антител с использованием стандартных методик. В качестве антител к ИЛ-6 по настоящему изобретению предпочтительно использовать моноклональные антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, полученные методом гибридом, и антитела, полученные из организма-хозяина, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген антитела, с использованием генно-инженерных методов. Такое антитело за счет связывания с ИЛ-6 ингибирует связывание ИЛ-6 с рецептором ИЛ-6 и блокирует передачу сигнала биологической активности ИЛ-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитела МН166 (Matsuda Т. и др., Eur. J. Immunol. 18, 951-956 (1988)) и антитела SK2 (Sato K. и др., The abstracts of the 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology 21, 166 (1991)).

Обычно, гибридомы, которые продуцируют антитела к ИЛ-6, можно получать по стандартным методикам, как описано ниже. Более подробно, гибридомы получают при осуществлении иммунизации стандартным методом с использованием ИЛ-6 в качестве сенсибилизирующего антигена, при слиянии полученных иммунных клеток с известными клетками-предшественниками по стандартной методике слияния клеток с последующим скринингом на наличие клеток, продуцирующих моноклональные антитела по стандартной методике скрининга.

Более подробно, антитела к ИЛ-6 можно получать, как описано ниже. Антитела к ИЛ-6 человека, предназначенные для применения в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител, можно получать, например, с использованием гена ИЛ-6 и/или аминокислотных последовательностей, описанных в работах Eur. J. Biochem 168, 543-550 (1987), J. Immunol. 140, 1534-1541 (1988) и Agr. Biol. Chem. 54, 2685-2688 (1990).

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной системой вектора экспрессии, которая включена в последовательность гена ИЛ- 6, целевой белок ИЛ-6 очищают от внутреннего содержимого клетки-хозяина или от супернатанта культуры, использованной в известном методе. Такой очищенный белок ИЛ-6 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. В другом варианте в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать гибридный белок, содержащий белок ИЛ-6 и другой белок.

Антитела к рецептору ИЛ-6 по настоящему изобретению можно получать как в виде поликлональных или моноклональных антител с использованием стандартных методик. В качестве антител к рецептору ИЛ-6 по настоящему изобретению предпочтительно использовать моноклональные антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и антитела, полученные из организма-хозяина, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген антитела, с использованием генно-инженерных методов. Такое антитело за счет связывания с ИЛ-6 ингибирует связывание ИЛ-6 с рецептором ИЛ-6 и блокирует передачу сигнала биологической активности ИЛ-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитела MR16-1 (Tamura Т. и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11924-11928 (1993)), антитела PM-1 (Hirata Y. и др., J. Immunol. 143, 2900-2906 (1989)), антитела AUK12-20, антитела AUK64-7 и антитела AUK146-15 (публикация заявки на выдачу международного патента № WO 92-19759). Антитела РМ-1 перечислены в качестве примера предпочтительных моноклональных антител к рецептору ИЛ-6 человека, а антитела MR16-1 приведены в качестве примера предпочтительных моноклональных антител к рецептору ИЛ-6 мыши.

Обычно гибридомы, которые продуцируют антитела к рецептору ИЛ-6, можно получать по стандартным методикам, как описано ниже. Более подробно, гибридомы получают при осуществлении иммунизации по стандартному методу с использованием рецептора ИЛ-6 в качестве сенсибилизирующего антигена, при слиянии полученных иммунных клеток с известными клетками-предшественниками по стандартной методике слияния клеток с последующим скринингом на наличие клеток, продуцирующих моноклональные антитела по стандартной методике скрининга.

Более подробно, антитела к рецептору ИЛ-6 получают, как описано ниже. Рецептор ИЛ-6 человека или рецептор ИЛ-6 мыши, предназначенный для применения в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител, можно получать, например, с использованием последовательностей гена рецептора ИЛ-6 и/или аминокислотных последовательностей, описанных, соответственно, в публикациях на выдачу европейского патента №325474 и японского патента Kokai № (JP-A) Н03-155795 (опубликованная японская заявка, не прошедшая экспертизу).

Существует 2 типа рецептора ИЛ-6: один экспрессируется на клеточной мембране, а другой отделяется от нее (растворимый рецептор ИЛ-6) (Yasukawa K. и др., J. Biochem. 108, 673-676 (1990)). Растворимый рецептор ИЛ-6 в основном состоит из внеклеточного участка рецептора ИЛ-6, связанного с клеточной мембраной, и отличается от связанного с мембраной рецептора ИЛ-6 тем, что в нем отсутствует трансмембранный участок или отсутствуют оба участка: трансмембранный участок и внеклеточный участок. Любой рецептор ИЛ-6 можно использовать в качестве рецептора ИЛ-6 при условии, что его можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител к рецептору ИЛ-6 по настоящему изобретению.

После трансформации соответствующей клетки-предшественника известной системой вектора экспрессии, которая включена в последовательность гена рецептора ИЛ-6, целевой рецептор ИЛ-6 очищают от внутреннего содержимого клетки-хозяина или от супернатанта культуры, использованной в известном методе. Такой очищенный рецептор ИЛ-6 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. В другом варианте в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать гибридный белок, содержащий рецептор ИЛ-6 и другой белок.

Антитела к gp130 по настоящему изобретению можно получать в виде поликлональных или моноклональных антител с использованием стандартных методик. В качестве антител к gp130 по настоящему изобретению предпочтительно использовать моноклональные антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и антитела, полученные из организма-хозяина, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген антитела, с использованием генно-инженерных методов. Такое антитело за счет связывания с gp130 ингибирует связывание комплекса ИЛ-6/рецептор ИЛ-6 и блокирует передачу сигнала биологической активности ИЛ-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитела АМ64 (патент JP-A (Kokai) Н03-219894), антитела 4В11 и антитела 2Н4 (патент US 5571513), а также антитела B-S12 и В-Р8 (патент JP-A (Kokai) Н08-291199).

В основном, гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела к gp130, можно получать по стандартным методикам, как описано ниже. Более подробно, гибридомы получают при осуществлении иммунизации по стандартному методу с использованием gp130 в качестве сенсибилизирующего антигена, при слиянии полученных иммунных клеток с известными клетками-предшественниками по стандартной методике слияния клеток с последующим скринингом на наличие клеток, продуцирующих моноклональные антитела по стандартной методике скрининга.

Более подробно, моноклональные антитела можно получать, как описано ниже. Например, gp130, предназначенный для применения в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител, можно получать, например, с использованием последовательностей гена рецептора gp130 и/или аминокислотных последовательностей, описанных в публикации заявки на выдачу европейского патента № ЕР 411946.

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной системой вектора экспрессии, которая включена в последовательность гена gp130, целевой белок gp130 очищают от внутреннего содержимого клетки-хозяина или от супернатанта культуры, использованной в известном методе. Такой очищенный белок gp130 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. В другом варианте клетку, экспрессирующую gp130, или гибридный белок, содержащий белок gp130 и другой белок, можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена.

Млекопитающие, предназначенные для иммунизации сенсибилизирующим антигеном, особо не ограничены, но их предпочтительно выбирают с учетом совместимости с клетками-предшественниками, которые используют для слияния клеток. Обычно используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомяки.

Животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном по стандартным методикам. Обычно иммунизацию проводят, например, внутрибрюшинной или подкожной инъекцией сенсибилизирующего антигена млекопитающему. Более подробно, предпочтительным является разбавление или суспендирование сенсибилизирующего антигена в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ), физиологическом солевом растворе, до необходимого объема, смешивание его с соответствующим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, при необходимости, эмульгирование и затем введение млекопитающему несколько раз каждые 4-21 дней. Для иммунизации сенсибилизирующим антигеном можно использовать соответствующий носитель.

После иммунизации млекопитающего таким способом и подтверждения повышения уровня требуемых антител в сыворотке иммунизированные клетки удаляют из организма млекопитающего и подвергают слиянию с клетками. Наиболее предпочтительными клетками для слияния с иммунизированными клетками являются клетки селезенки.

Клетки миеломы млекопитающих используют в качестве клеток-предшественников для слияния с иммунизированными клетками. Обычно используют различные известные клеточные линии, такие как P3X63Ag8.653 (Kearney J.F. и др., J. Immunol 123, 1548-1550 (1979)), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1-7 (1978)), NS-1 (Kohler G. и Milstein C, Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)), MPC-11 (Margulies D. H. и др., Cell 8, 405-415 (1976)), SP2/0 (Shulman M. и др., Nature 276, 269-270 (1978)), F0 (de St. Groth S. F. и др., J. Immunol. Methods 35, 1-21 (1980)), S194 (Trowbridge I. S., J. Exp. Med. 148, 313-323 (1978)) и R210 (Galfre G. и др., Nature 277, 131-133 (1979)).

В основном слияние упомянутых выше иммунизированных клеток с клетками миеломы можно проводить по стандартным методикам, таким как методика, описанная в работе Milstein и др. (Kohler G. и Milstein С., Methods Enzymol. 73, 3-46 (1981)).

Более подробно, слияние клеток проводят, например, в стандартной питательной культуральной среде в присутствии промотера слияния клеток. Например, в качестве промотера слияния используют полиэтиленгликоль (ПЭГ) или вирус Сендая, и при необходимости можно также добавлять адъювант, такой как диметилсульфоксид, для улучшения эффективности слияния.

Используемое соотношение иммунизированных клеток и клеток миеломы составляет, например, от 1 до 10 иммунизированных клеток на каждую клетку миеломы. Культуральной средой, пригодной для слияния клеток, является, например, культуральная среда RPMI1640 или MEM, пригодная для пролиферации клеточных линий миеломы. Можно также использовать другие стандартные культуральные среды, используемые для клеточной культуры данного типа. Более того, в комбинации можно также использовать сывороточные среды, такие как эмбриональная телячья сыворотка.

Для слияния клеток исследуемые гибридные клетки (гибридомы) получают при интенсивном перемешивании предварительно определенных количеств упомянутых выше иммунизированных клеток и клеток миеломы в упомянутой выше культуральной среде, добавлении раствора ПЭГ (например, раствора ПЭГ со средней молекулярной массой приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретого до температуры приблизительно 37°С, обычно при концентрации от 30% до 60% (мас./об.) с последующим перемешиванием. Затем агенты слияния клеток и агенты, непригодные для роста гибридом, можно удалять при повторении последовательных операций: добавление соответствующей культуральной среды и удаление супернатанта при центрифугировании.

Гибридомы выбирают при культивировании в общей культуральной среде для селекции, например, в культуральной среде HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в культуральной среде HAT продолжают в течение достаточного периода, обычно от нескольких дней до нескольких недель, для лизиса клеток, отличающихся от исследуемых гибридом (неслитые клетки). Затем выполняют стандартный метод серийных разведений для скрининга и клонирования гибридом, которые продуцируют исследуемые антитела.

Кроме получения гибридом с использованием иммунизации антигеном животных нечеловеческого происхождения, можно получать требуемые антитела человека со связывающей активностью с требуемым антигеном или экспрессирующие антиген клетки с использованием сенсибилизации лимфоцитов человека требуемыми белками-антигенами или экспрессирующие антиген клетки in vitro, и при слиянии сенсибилизированного лимфоцита В с клетками миеломы человека, такими как U266 (см. заявку на выдачу патента Японии Kokoku № (JP-B) Н01-59878 (прошедшую экспертизу заявку на выдачу патента Японии, опубликованную для опротестования)). Кроме того, антиген или экспрессирующую антиген клетку можно вводить трансгенному животному с репертуаром генов антител человека и затем получать требуемые антитела человека по вышеупомянутой методике (см. публикации на выдачу международного патента №№ WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Гибридомы, полученные таким образом, которые продуцируют моноклональные антитела, можно пересеивать в стандартной культуральной среде и хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

Для получения моноклональных антител из гибридом можно использовать следующие методы: культивирование гибридом по стандартным методикам и получение антител в виде культурального супернатанта или пролиферация гибридом при введении их в совместимые организмы млекопитающих и получение антител из асцита, и т.п. Первый способ является пригодным для получения антител высокой чистоты, а последний - для получения антител в препаративном количестве.

Например, гибридомы, которые продуцируют антитела к рецептору ИЛ-6, можно получать с использованием метода, описанного в патенте Японии JP-A (Kokai) Н03-139293. Такое получение можно осуществить при введении гибридом, продуцирующих антитела РМ-1, в брюшную полость мыши BALB/c, при этом образуется асцитная жидкость, с последующим выделением антител РМ-1 из асцитной жидкости, или при культивировании гибридом в соответствующей среде (такой как среда RPMI 1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim), или среда для гибридом SFM (GIBCO-BRL) или среда PFHM-II (GIBCO-BRL)) с последующей очисткой антител РМ-1 из культурального супернатанта.

Рекомбинантные антитела можно использовать в качестве моноклональных антител по настоящему изобретению, при этом рекомбинантные антитела получают с использованием методов рекомбинантных ДНК при клонировании гена антител из гибридомы, включении гена в соответствующий вектор и включении вектора в клетку-хозяина (см., например, книгу Borrebaeck С.А.K. и Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, изд. Великобритании MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

Более подробно, мРНК, кодирующую вариабельные области (V) антител, можно выделять из клеток, продуцирующих исследуемые антитела, такие как гибридомы. мРНК можно выделять из общей РНК по стандартным методикам, таким как метод ультрацентрифугирования в присутствии гуанидина (Chirgwin J.М. и др., Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)) и метод ВГПХ (Chomczynski, Р. и др., Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)), и получением мРНК с использованием набора для очистки мРНК (Pharmacia) и т.п. В другом варианте мРНК можно получать напрямую с использованием набора для очистки QuickPrep mRNA (Pharmacia).

кДНК областей V антител синтезируют из полученных мРНК с использованием обратной транскриптазы. кДНК можно синтезировать с использованием набора для синтеза одноцепочечной кДНК (AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis) и т.п. Кроме того, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать способ 5'-RACE (Frohman М.А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002 (1988); Belyavsky А. и др., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932 (1989)) с использованием набора 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) и ПЦР. Требуемый фрагмент ДНК очищают от полученных продуктов ПЦР и затем лигируют в вектор ДНК. Затем получают рекомбинантный вектор с использованием описанного выше способа и вводят в бактерии Escherichia coli и т.п., и затем проводят селекцию колоний для получения требуемого рекомбинантного вектора. Нуклеотидную последовательность требуемой ДНК подтверждают стандартным способом, таким как дидезокси-метод.

После получения ДНК, кодирующей области V требуемого антитела, ДНК лигируют в ДНК, кодирующую консервативную область (область С) требуемого антитела, и вставляют в вектор экспрессии. В другом варианте ДНК, кодирующую область V антитела, можно вставить в вектор экспрессии, включающий ДНК области С антитела.

Для получения антитела, предназначенного для применения в настоящем изобретении, ген антитела вводят в вектор экспрессии таким образом, чтобы он экспрессировался под контролем области, регулирующей экспрессию, такой как энхансер или промотер, как описано ниже. Затем антитело можно экспрессировать при трансформации клетки хозяина данным вектором экспрессии.

В настоящем изобретении можно использовать искусственно модифицированные рекомбинантные антитела, например, химерные антитела, гуманизированные антитела или антитела человека, например, для снижения гетероантигенности в отношении человека. Такие модифицированные антитела можно получать с использованием стандартных методов.

Химерное антитело можно получить лигированием ДНК, кодирующей область V антитела, полученной, как описано выше, с ДНК, кодирующей область С антитела человека, включением его в вектор экспрессии и введением вектора в организм хозяина (см. публикацию заявки на выдачу Европейского патента № ЕР 125023 и публикацию заявки на выдачу международного патента № WO 92-19759). Данный стандартный способ можно использовать для получения химерных антител, пригодных для настоящего изобретения.

Гуманизированные антитела называют также реконструированными антителами человека или антителами человеческого типа. Их получают трансплантацией определяющих комплементарность областей антитела (CDR), из млекопитающих не человеческого происхождения (например, из мыши) в CDR антитела человека. Известны общие методы рекомбинации генов (см. публикацию заявки на выдачу Европейского патента № ЕР 125023 и публикацию заявки на выдачу международного патента № WO 92-19759).

Более подробно, последовательности ДНК, сконструированные для лигирования CDR антител мыши с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезировали методом ПЦР нескольких олигонуклеотидов, содержащих перекрывающиеся участки в их концевых фрагментах. Полученную ДНК лигировали в ДНК, кодирующую область С антитела человека, включали в вектор экспрессии и вектор экспрессии включали в организм хозяина, при этом получали гуманизованное антитело (см. публикацию заявки на выдачу Европейского патента № ЕР 239400 и публикацию заявки на выдачу международного патента № WO 92-19759).

Области FR антител человека, предназначенные для лигирования через области CDR, выбирали таким образом, чтобы CDR образовывали пригодные участки связывания с антигеном. Аминокислоту(ы) в каркасных областях вариабельных областей антител можно замещать при необходимости таким образом, чтобы CDR реконструированного антитела человека образовывали пригодные участки связывания с антигеном (Sato K. и др., Cancer Res. 53, 851-856 (1993)).

Области С антител человека используют для получения химерных и гуманизованных антител. Примеры областей С антител человека включают участки Сγ, например, можно использовать участки С1γ, С2γ, С3γ и С4γ. Кроме того, для улучшения стабильности антител или их продуцирования можно модифицировать области С антител человека.

Химерные антитела содержат вариабельную область антител млекопитающих не человеческого происхождения и область С антитела человека, и гуманизованные антитела содержат CDR антител млекопитающих нечеловеческого происхождения, области С антитела человека и каркасные области. Их антигенность в организме человека снижена и, таким образом, их можно использовать в качестве антител для применения по настоящему изобретению.

Предпочтительные конкретные примеры гуманизованных антител по настоящему изобретению включают гуманизованные антитела РМ-1 (см. публикацию заявки на выдачу международного патента № WO 92-19759).

Более того, кроме описанных выше способов получения антител человека, описаны способы получения антител человека с использованием пэннинга библиотек антител человека. Например, вариабельную область антитела человека можно экспрессировать на поверхности фага в качестве одноцепочечного антитела (scFv) с использованием способа фагового дисплея, и затем можно выбрать антиген-связывающие фаги. При анализе генов выбранных фагов можно определить последовательность ДНК, кодирующей вариабельную область антитела человека, которая связывается с антигеном человека. После обнаружения последовательности ДНК scFv, которая связывается с антигеном, можно получить соответствующий вектор экспрессии для получения антитела человека. Такие способы уже описаны и публикации №№ WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388 можно использовать в качестве ссылок.

Ген антитела, сконструированный, как описано выше, можно экспрессировать с использованием стандартных методов. При использовании клетки млекопитающего ген антитела можно экспрессировать с использованием ДНК, в которой функционально соединены стандартный эффективный ген промотера, ген антитела, предназначенный для экспрессии и сигнал полиА на 3' конце (с уменьшением активности) гена антитела или с использованием вектора, включающего ДНК. Примеры промотера/энхансера включают прямой ранний промотер/энхансер цитомегаловируса человека.

Кроме того, другие промотеры/энхансеры, которые можно использовать для экспрессии антител по настоящему изобретению, включают промотеры/энхансеры из ретровирусов, вирусов полиомы, аденовирусов, вируса обезьяны 40 (SV40) и т.п., и промотеры/энхансеры из клеток млекопитающих, такие как фактор элонгации человека 1α (HEF1α).

Экспрессию можно проводить простым методом, например, с использованием метода, описанного в статье (Mulligan R.С. и др., Nature, 277, 108-114 (1979)) и промотера/энхансера SV40 или метода, описанного в статье (Mizushima S., Nagata S., Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990)) и промотера/энхансера HEF1α.

При использовании E.coli ген антитела можно экспрессировать при функциональном связывании стандартного эффективного гена промотера, сигнальной последовательности для секреции антител и гена антитела, предназначенного для секреции. Примеры промотеров включают промотеры lacZ и araB. Промотер lacZ можно использовать в соответствии с методом, описанным в статье (Ward Е.S. и др., Nature 341, 544-546 (1989), Ward, Е.S. и др., FASEB J. 6, 2422-2427 (1992)), и промотер araB можно использовать в соответствии с методом, описанным в статье (Better М. и др., Science 240, 1041-1043 (1988)).

При продуцировании антител в периплазму Е. coli сигнальную последовательность pel В (Lei S.Р. и др., J. Bacteriol. 169, 4379-4383 (1987)) можно использовать в качестве сигнальной последовательности для секреции антител. Антитела, продуцированные в периплазму, выделяют и затем структуру антитела, которое будет использовано, подвергают соответствующему рефолдингу (см., например, заявку WO 96/30394).

В качестве источника репликации можно использовать источники из вирусов SV40, полиомиелита, аденовируса, вируса папилломы быка (BPV) и т.п. Кроме того, для увеличения числа копий гена в клетке хозяина вектор экспрессии может включать ген аминогликозид-фосфотрансферазы (АРН), ген тимидин киназы (TK), ген ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы Е. coli (Ecogpt), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и т.п., в качестве маркера селекции.

Для получения антител по настоящему изобретению можно использовать любую систему продуцирования. Системы для продуцирования антител включают системы для продуцирования in vitro и in vivo. Системы продуцирования in vitro включают системы, использующие эукариотические клетки или прокариотические клетки.

При использовании эукариотических клеток системы продуцирования включают системы, использующие клетки животных, растений или грибов. Такие клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, COS, миеломы, почки новорожденного хомяка (ВНК), HeLa и Vero, (2) клетки амфибий, такие как ооциты Xenopus и (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21 и Tn5. Известные клетки растений включают клетки из Nicotiana tabacum, которые можно культивировать в каллюсе. Известные клетки грибов включают дрожжи, такие как Saccharomyces (например, Saccaromyces cerevisiae) и плесневые грибы, такие как Aspergillus (например, Aspergillus niger).

При использовании прокариотических клеток системы продуцирования включают системы, использующие клетки бактерий. Известные клетки бактерий включают Е. coli и Bacillus subtilis.

Антитела можно получать при включении гена требуемого антитела в такие клетки для трансформации с последующим культивированием трансформированных клеток in vitro. Клетки культивируют согласно стандартным методикам. Например, в качестве культуральной среды можно использовать DMEM, MEM, RPMI 1640 или IMDM, и в комбинации можно использовать сывороточные среды, такие как эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС). В другом варианте, клетки, вводимые с геном антитела, можно переносить в брюшную полость таких животных для продуцирования антител in vivo.

Системы продуцирования in vivo включают системы, использующие животных или растения. Системы продуцирования, использующие животных, включают системы, использующие млекопитающих или насекомых.

Млекопитающие, которых можно использовать, включают коз, свиней, овец, мышей и крупный рогатый скот (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Кроме того, насекомые, которых можно использовать, включают тутовых шелкопрядов. При использовании растений можно использовать табак и т.п.

Ген антитела включают в указанных животных или растения, и антитела продуцируют в организме животных или растений с последующим выделением этих антител. Например, ген антитела можно получить в виде гибридного гена при включении его в середину гена, кодирующего белок, который содержится только в молоке, такой как козий β-казеин. Фрагменты ДНК, содержащие гибридный ген, включающий вставленный ген антитела, вводят в эмбрионы коз и эмбрионы вводят самкам коз. Требуемые антитела получают из молока коз, рожденных козами с такими эмбрионами или их потомством. При необходимости трансгенные козы могут получать гормоны для повышения объема молока, содержащего требуемые антитела, которые они продуцируют (Ebert K.М. и др., Bio/Technology 12, 699-702 (1994)).

При использовании тутовых шелкопрядов их инфицируют бакуловирусом, содержащим ген требуемого антитела, и требуемые антитела получают из биологических жидкостей указанных тутовых шелкопрядов (Maeda S. и др., Nature 315, 592-594 (1985)). Кроме того, при использовании табака ген требуемого антитела вводят в вектор экспрессии растения, такого как pMON530, и вектор включают в бактерию, такую как Agrobacterium tumefaciens. Эту бактерию используют для инфицирования табака, такого как Nicotiana tabacum, и затем требуемое антитело получают из листьев табака (Julian K.-С. Ма и др., Eur. J. Immunol. 24, 131-138 (1994)).

При получении антител с использованием систем продуцирования in vitro или in vivo, как описано выше, ДНК, кодирующие тяжелую цепь (цепь Н) и легкую цепь (цепь L) антитела, можно включать в отдельные векторы экспрессии, и затем совместно трансформировать организм хозяина указанными векторами. В другом варианте ДНК, кодирующую цепь Н, и ДНК, кодирующую цепь L, можно включать в один вектор экспрессии для трансформации организма-хозяина (см. публикацию заявки на выдачу международного патента № WO 94-11523).

Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой фрагменты антител или их модифицированные продукты при условии, что они являются пригодными для применения в настоящем изобретении. Например, фрагменты антител включают Fab, F(ab')₂, Fv и одну цепь Fv (scFv), в которых фрагменты Fv цепей Н и L соединены через соответствующий линкер.

Более подробно, фрагменты антител получают при обработке антител ферментами, такими как папаин или пепсин, или в другом варианте при конструировании генов, кодирующих такие фрагменты антител, и затем при включении их в векторы экспрессии с последующей экспрессией векторов в соответствующих клетках-хозяина (см., например Со М.S. и др., J. Immunol. 152, 2968-2976 (1994), Better М. & Horwitz А.Н., Methods in Enzymology 178, 476-496 (1989), Plueckthun A. & Skerra, A., Methods in Enzymology 178, 497-515 (1989), Lamoyi E., Methods in Enzymology 121, 652-663 (1989), Rousseaux J. и др., Methods in Enzymology 121, 663-666 (1989) и Bird R.E. и др., TIBTECH 9, 132-137 (1991)).

Фрагмент scFv можно получить при соединении области V цепи Н и области L цепи L антитела. В таком scFv область V цепи Н и область L цепи L соединены через линкер, предпочтительно через пептидный линкер (Huston J. S. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883 (1988)). Области V цепей H и L в scFv можно получить из любых описанных в данном контексте антител. Пептидные линкеры для соединения областей V включают, например, произвольно выбранный одноцепоченый пептид, содержащий от 12 до 19 аминокислотных остатков.

ДНК, кодирующую scFv, можно получить при амплификации участка ДНК, кодирующего требуемую аминокислотную последовательность в матричных последовательностях с использованием ПЦР и пары праймеров, которые определяют концевой участок, при этом ДНК, кодирующую цепь Н или область V цепи Н, и ДНК, кодирующую цепь L или область V цепи L, упомянутых выше антител, используют в качестве матриц, с последующей амплификацией амплифицированного участка ДНК с использованием ДНК, кодирующей участок пептидного линкера и пары праймеров, которые определяют оба конца линкера таким образом, чтобы он был присоединен к каждой из цепей Н и L.

После получения ДНК, кодирующей scFv, можно получить вектор экспрессии, включающий ДНК, и организм-хозяина, трансформированный вектором экспрессии, по стандартным методикам. Кроме того, scFv можно получить по стандартным методикам с использованием организма-хозяина.

Аналогично описанному выше, фрагменты антител можно получить при получении их генов, при их экспрессии и затем при использовании организма-хозяина. Термин «антитело», использованный в данном контексте, включает такие фрагменты антител.

В качестве модифицированных антител можно также использовать антитела, присоединенные к различным молекулам, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Термин «антитело», использованный в данном контексте, включает такие модифицированные антитела. Эти модифицированные антитела можно получать при химической модификации полученных антител. Таким методики известны в данной области техники.

Антитела, продуцированные и экспрессированные, как описано выше, можно выделять из внутреннего или внешнего пространства клеток или из клеток-хозяина и затем получать их в гомогенном виде. Антитела по настоящему изобретению можно выделять и очищать аффинной хроматографией. Колонки, используемые для аффинной хроматографии, включают колонки с иммобилизованным белком А и колонки с иммобилизованным белком G. Носители, используемые для колонок с иммобилизованным белком А, включают HyperD, POROS и Sepharose F.F. Для выделения и/или очистки стандартных белков можно также использовать другие методы, которые не ограничены.

Например, антитела по настоящему изобретению можно выделять и очищать при использовании выбранных соответствующим образом методов хроматографии и при комбинировании других видов хроматографии, отличающихся от описанной выше аффинной хроматографии, а также методов фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.п. Примеры других хроматографий включают ионно-обменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и гель-фильтрацию. Такие виды хроматографии можно использовать в комбинации с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). В другом варианте можно использовать обращенно-фазную ВЭЖХ.

Концентрацию антител, полученных, как описано выше, можно определять по оптической плотности, с использованием метода ИФА и т.п. Более подробно, при использовании измерения оптической плотности концентрацию можно определять при соответствующем разбавлении раствора антитела фосфатно-солевым буферным раствором, измерении его оптической плотности при 280 нм и расчете концентрации с использованием коэффициента 1,35 ОЕ/1 мг/мл. В другом варианте при использовании ИФА концентрацию можно определять, как описано ниже. Более подробно, 100 мкл антитела козы к IgG человека(TAG), разбавленного до 1 мкг/мл 0,1 М бикарбонатным буферным раствором (рН 9,6), добавляют в лунки 96-луночного планшета (Nunc) и инкубируют в течение ночи при 4°С для иммобилизации антител. После блокирования добавляют 100 мкл соответственно разбавленного антитела по настоящему изобретению или соответственно разбавленного образца, содержащего антитело, или IgG человека (CAPPEL) в качестве стандарта и планшет инкубируют в течение 1 ч при КТ.

После промывки добавляли 100 мкл разбавленного в 5000 раз меченного щелочной фосфатазой IgG человека (BIO SOURCE) и планшет инкубировали в течение 1 ч при КТ. После еще одной промывки добавляли раствор субстрата, планшет инкубировали и оптическую плотность измеряли при 405 нм с использованием ридера Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad) для расчета концентрации требуемого антитела.

Варианты ИЛ-6, используемые в настоящем изобретении, представляют собой соединения, обладающие связывающей активностью в отношении рецептора ИЛ-6, и не передают сигнал биологической активности ИЛ-6. Таким образом, варианты ИЛ-6 конкурируют с ИЛ-6 за связывание с рецептором ИЛ-6, но не передают сигнал его биологической активности, и, таким образом, блокируют опосредованную ИЛ-6 передачу сигнала.

Варианты ИЛ-6 получают при включении мутации(ий) для замены аминокислотного остатка(ов) в аминокислотной последовательности ИЛ-6. Можно использовать любые ИЛ-6, из которых были получены варианты ИЛ-6, но предпочтительным является ИЛ-6 человека, с учетом его антигенности, и т.п.

Более подробно, замены аминокислот осуществляют с учетом предсказания вторичной структуры ИЛ-6 на основе аминокислотной последовательности ИЛ-6 с использованием стандартных программ молекулярного моделирования, таких как WHATIF (Vriend и др., J. Mol. Graphics 8, 52-56 (1990)) с последующей оценкой влияния замененного аминокислотного остатка(ов) на молекулу в целом. После определения подлежащего замене аминокислотного остатка(ков), вводят мутацию(и) с использованием стандартного метода ПЦР и вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую ген ИЛ-6 человека, в качестве матрицы для осуществления замены аминокислот, при этом получают ген, кодирующий вариант ИЛ-6. При необходимости этот ген включают в соответствующий вектор экспрессии и вариант ИЛ-6 можно получить с использованием выше описанных методов экспрессии, продуцирования и очистки рекомбинантных антител.

Конкретные примеры вариантов ИЛ-6 описаны в работах Brakenhoff и др., J. Biol. Chem. 269, 86-93 (1994), Savino и др., EMBO J. 13, 1357-1367 (1994), WO 96-18648 и WO 96-17869.

Частичные пептиды ИЛ-6 и рецептора ИЛ-6 по настоящему изобретению представляют собой вещества, проявляющие связывающую активность в отношении рецептора ИЛ-6 или ИЛ-6, соответственно, но не передают сигнал биологической активности ИЛ-6. Таким образом, частичные пептиды ИЛ-6 и рецептора ИЛ-6 связываются с рецептором ИЛ-6 или ИЛ-6 и блокируют их, и, таким образом, специфично ингибируют связывание с ИЛ-6 или с рецептором ИЛ-6. В результате сигнал биологической активности ИЛ-6 не передается и, таким образом, блокируется передача сигнала, опосредованная ИЛ-6.

Частичные пептиды ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6 являются пептидами, которые состоят из полной аминокислотной последовательности области ИЛ-6 или аминокислотной последовательности рецептора ИЛ-6 или их частей, принимают участие в связывании ИЛ-6 с рецептором ИЛ-6. Такие пептиды обычно включают от 10 до 80, предпочтительно от 20 до 50 и более предпочтительно от 20 до 40 аминокислотных остатков.

Частичные пептиды ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6 можно получать при определении области аминокислотной последовательности ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6, принимающих участие в связывании ИЛ-6 с рецептором ИЛ-6, с последующим получением полной аминокислотной последовательности определенного участка или его части с помощью стандартных методов, таких как методы генной инженерии и пептидного синтеза.

Для получения частичного пептида ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6 с использованием генно-инженерных методов последовательность ДНК, кодирующую требуемый пептид, вставляют в вектор экспрессии и затем пептид можно получить с использованием описанных выше методов для экспрессии, продуцирования и очистки рекомбинантных антител.

Для получения частичного пептида ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6 с использованием методов пептидного синтеза обычно используют методы пептидного синтеза, такие как твердофазный и жидкофазный метод.

Более подробно, пептиды можно синтезировать согласно методу, описанному в статье "The sequel of Development of Pharmaceuticals (Zoku Iyakuhin no Kaihatsu), Vol. 14, Peptide Synthesis (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)". В случае твердофазного метода синтеза можно использовать следующую методику: связывание аминокислоты, соответствующей С-концевому аминокислотному остатку пептида, который предстоит синтезировать, с подложкой, нерастворимой в органических растворителях, с последующим удлинением пептидной цепи при поочередном повторении (1) реакции конденсации аминокислот, при этом α-аминокислотные функциональные группы и боковые цепи защищены соответствующими защитными группами, в направлении от С-конца к N-концу, и (2) реакции удаления защитных групп с α-аминогрупп связанных со смолой аминокислот или пептидов. В широком смысле твердофазный пептидный синтез классифицируют как Вос-метод и Fmoc-метод в зависимости от типа защитных групп.

После синтеза исследуемого пептида, как описано выше, проводят реакцию удаления защитных групп и реакцию отщепления пептидной цепи от подложки. Для реакции отщепления пептидной цепи обычно используют фтористый водород или трифторметансульфокислоту для удаления Вос-групп и ТФУ обычно используют для удаления Fmoc-групп. При использовании Вос-групп, например, смолу, связанную с защищенным пептидом, обрабатывают фтористым водородом в присутствии анизола. Затем получают пептид при удалении защитных групп и при отщеплении пептида от подложки. Полученный пептид лиофильно высушивают и получают неочищенный пептид. В случае использования Fmoc-групп реакцию удаления защитных групп и реакцию отщепления пептидной цепи от подложки можно проводить в ТФУ с использованием методик, аналогичных описанным выше.

Полученные неочищенные пептиды можно разделять и очищать с использованием ВЭЖХ. Элюцию пептидов можно проводить в оптимальных условиях с использованием системы растворителей вода-ацетонитрил, которую обычно используют для очистки белков. Фракции, соответствующие пикам на графике хроматографического разделения, собирают и высушивают лиофильно. Пептидные фракции, очищенные таким способом, идентифицируют по молекулярной массе, определенной методом масс-спектрометрии, анализа аминокислотного состава, анализа аминокислотной последовательности и т.п.

Конкретные примеры частичных пептидов ИЛ-6 или рецептора ИЛ-6 приведены в японских патентах JP-A (Kokai) Н02-188600, JP-A (Kokai) Н07-324097, JP-A (Kokai) H08-311098 и публикации патента США № US 5210075.

Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой конъюгаты антител, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), радиоактивные соединения и токсины. Такие конъюгаты антител можно получать при химической модификации полученных антител. Способы модификации антител хорошо известны в данной области техники. Соответственно, термин «антитело», используемый в данном контексте, включает такие конъюгаты антител.

Термин «заболевание, связанное с ИЛ-6», используемый в настоящем изобретении, означает заболевание, связанное с ИЛ-6, и примеры включают ревматоидный артрит, юношеский идиопатический артрит, ювенильный идиопатический артрит с системным началом, болезнь Кастельмана, системную красную волчанку (SLE), волчаночный нефрит, болезнь Крона, лимфому, язвенный колит, анемию, васкулит, болезнь Кавасаки, болезнь Стилла, амилоидоз, рассеянный склероз, трансплантацию, возрастную макулярную дистрофию, анкилозирующий спондилоартрит, псориаз, псориатический артрит, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), первичную нефропатию IgA-типа, остеоартрит, астму, диабетическую нефропатию, реакцию отторжения трансплантата (ТПХ), эндометриоз, гепатит (неалкогольный стеатогепатит), инфаркт миокарда, артериосклероз, сепсис, остеопороз, диабет, множественную миелому, рак предстательной железы, рак почки, В-клеточную неходжкинскую лимфому, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак пищевода, рак ободочной кишки, раковую кахексию, инвазию раковых нервных клеток, инфаркт миокарда, миопическую хориоидальную неоваскуляризацию, идиопатическую хориоидальную неоваскуляризацию, увеит, хронический тироидит, замедленную гиперчувствительнотсь, контактный дерматит, атопический дерматит, мезотелиому, полимиозит, дерматомиозит, панувеит, передний увеит, средний увеит, воспаление склеры, воспаление роговицы, орбитальный воспалительный синдром, неврит зрительного нерва, диабетическую ретинопатию, пролиферативную витреоретинопатию, синдром сухого глаза, послеоперационный воспалительный синдром, нейромиелит зрительного нерва, тяжелую псевдопаралитическую миастению или легочную гипертензию.

Термин «стандартный интервал дозировки», использованный в настоящем изобретении, означает интервал дозировки, который обычно используют для упомянутых выше лекарственных средств (фармацевтических композиций по настоящему изобретению), например, интервал дозировки для стандартного введения, который может быть описан на вложенной в упаковку инструкции как «последовательные дозы следует вводить с интервалом в 4 недели» и т.п. Стандартный интервал дозировки по настоящему изобретению практически не ограничен, но примеры включают интервалы от 1 дня до 24 недель, предпочтительно от 2 недель до 8 недель, более предпочтительно от 3 до 5 недель и даже более предпочтительно 4 недели. Стандартные интервалы дозировки могут находиться в определенном интервале.

Термин «стандартная доза», используемый в настоящем изобретении, означает дозу, которую обычно используют для описанных выше лекарственных средств (фармацевтических композиций по настоящему изобретению), например, обычно вводимую дозу, которая может быть описана на вложенной в упаковку инструкции как «обычно однократная доза составляет 8 мг на кг массы тела». Стандартная доза по настоящему изобретению практически не ограничена, но доза для введения может составлять, например, от 2 до 20 мг ингибитора ИЛ-6 на кг массы тела (2-20 мг/кг) или от 50 мг до 800 мг ингибитора ИЛ-6, предпочтительно от 2 до 8 мг ингибитора ИЛ-6 на кг массы тела (2-8 мг/кг) или от 80 до 160 мг ингибитора ИЛ-6 или более предпочтительно 8 мг ингибитора ИЛ-6 на кг массы тела (8 мг/кг) или 120 мг ингибитора ИЛ-6.

Термин «кратковременный интервал дозировки», использованный в настоящем изобретении, означает период введения для индукции иммунологической переносимости в отношении лекарственных средств (фармацевтических композиций по настоящему изобретению) для подавления образования антител к лекарственным средствам вследствие иммуногенности. Кратковременный период дозировки по настоящему изобретению означает период, в течение которого вводят дозу, аналогичную стандартной, несколько раз в течение более короткого интервала по сравнению со стандартным интервалом дозировки. Несмотря на то, что кратковременный интервал практически не ограничен при условии, что он включает период, в течение которого происходит индукция иммунологической переносимости, при этом период предпочтительно составляет от 1 до 8 недель после первого введения, и более предпочтительно 4 недели после первого введения. Термин «доза, аналогичная стандартной дозе» означает дозы, которые обеспечивают аналогичную концентрацию в крови ингибитора ИЛ-6, как и при введении стандартной дозы. Термин «более короткий интервал по сравнению со стандартным интервалом дозировки» практически не ограничен при условии, что он меньше стандартного интервала дозировки, и предпочтительно составляет половину стандартного интервала дозировки, например, 2 недели при стандартном интервале в 4 недели. Например, кратковременный интервал дозировки может находиться в определенном интервале, таком как от 1 до 2 недель. Термин «многократное введение» означает 2 или более раз, включая исходное введение, и предпочтительно составляет от 2 до 5 раз, включая исходное введение, более предпочтительно 3 раза, включая исходное введение. Индукцию иммунологической переносимости можно определить при наблюдении подавления образования антител к лекарственному средству.

Термин «стандартное введение», использованный в настоящем изобретении, означает стандартное введение описанных выше лекарственных средств (фармацевтических композиций по настоящему изобретению), например, введение описанной выше cтандартной дозы и через стандартный интервал дозировки.

Предпочтительные примеры "антитела к рецептору ИЛ-6" по настоящему изобретению включают тоцилизумаб, гуманизированное антитело IgG1 к рецептору ИЛ-6, и гуманизированные антитела к рецептору ИЛ-6, полученные при модификации вариабельных и консервативных областей тоцилизумаба, более подробно, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2. Более предпочтительным примером является антитело, содержащее тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 3 (тяжелая цепь SA237) и легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 4 (легкая цепь SA237). Прежде всего предпочтительным является SA237.

Такие антитела можно получать по методикам, описанным в заявках WO 2010/035769, WO 2010/107108, WO 2010/106812 и т.п. Более подробно, антитела можно получать с использованием генно-рекомбинантных методик, известных специалистам в данной области техники, на основе последовательности упомянутого выше антитела к рецептору ИЛ-6 (см., например Borrebaeck САК и Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Рекомбинантные антитела можно получать при клонировании ДНК, кодирующей антитело, из гибридомы или клеток, продуцирующих антитела, таких, как сенсибилизированные лимфоциты, продуцирующие антитела, при включении ДНК в соответствующий вектор и включении вектора в клетку хозяина для продуцирования антител.

Такие антитела можно выделять и очищать с использованием методов выделения и очистки, которые обычно используют для очистки антител, не ограничиваясь перечисленными методами. Например, антитела можно выделять и очищать с использованием выбранных соответствующим образом следующих методов и их комбинаций: колоночная хроматография, фильтрация, ультрафильтрация, высаливание, осаждение растворителем, экстракция растворителем, перегонка, иммуноосаждение, электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, диализ, перекристаллизация и т.п.

Согласно настоящему изобретению период стандартного введения начинается после последнего введения во время краткосрочного интервала дозировки. Более подробно, после последнего введения во время краткосрочного интервала дозировки начинается стандартный интервал дозировки, и затем проводят первое введение в ходе стандартного интервала дозировки.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию, дозу ингибитора ИЛ-6 в составе которой, аналогичную стандартной дозе, вводят от 2 до 5 раз с интервалом от 1 до 3 недель после исходного введения в ходе краткосрочного периода дозировки, и затем ингибитор ИЛ-6 вводят с интервалом от 2 до 8 недель после последнего введения во время краткосрочного интервала дозировки с использованием стандартной дозы от 50 до 800 мг в составе однократной дозы, или более предпочтительно фармацевтическую композицию, содержащую SA237, вводят три раза в дозе, аналогичной стандартной дозе, с интервалом от 2 до 8 недель после исходного введения в ходе краткосрочного интервала дозировки (то есть, в неделю 0, в неделю 2 и в неделю 4), и затем SA237 вводят стандартным способом с интервалом 8 недель, начиная после последнего введения в ходе краткосрочного интервала дозировки (то есть, в неделю 12, неделю 20, неделю 28 и т.д. с интервалами 8 недель, начиная от исходного введения в ходе краткосрочного интервала дозировки) с использованием стандартной дозы 120 мг на 1 введение.

Предпочтительную схему введения ингибитора ИЛ-6 можно подбирать, например, продлевая интервал дозировки при мониторинге симптомов заболевания и изменений результатов анализа крови.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, предназначенные для лечебных и профилактических целей, можно получать в виде лиофильно высушенных составов или составов в виде раствора при смешивании, при необходимости, с фармацевтически пригодными носителями, наполнителями и т.п. Пригодные фармацевтически приемлемые носители и наполнители включают, например, стерильную воду, физиологический солевой раствор, стабилизаторы, эксципиенты, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота), буферные вещества (такие как фосфаты, цитраты, гистидин и другие органические кислоты), антисептики, ПАВ (такие как ПЭГ и твин), хелатирующие агенты (такие как ЭДТУ) и связующие. Можно также использовать другие низкомолекулярные полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулины, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, метионин, аргинин и лизин, сахара и углеводы, такие как полисахариды и моносахариды, и альдиты, такие как маннит и сорбит. При приготовлении водного раствора для инъекции можно использовать физиологический солевой раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит, и хлорид натрия, а также в комбинации можно использовать соответствующие солюбилизирующие агенты, такие как спирт (например, этанол), полиспирты (такие как пропиленгликоль и ПЭГ) и неионные ПАВ (такие как полисорбат 80, полисорбат 20, полоксамер 188 и НСО-50). При добавлении в состав гиалуронидазы можно вводить больший объем жидкости подкожно (Expert Opin. Drug Deliv. Jul; 4(4): 427-440 (2007)). Кроме того, можно использовать шприцы, предварительно заполненные фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Составы растворов можно получать с использованием метода, описанного в заявке WO 2011/090088.

При необходимости фармацевтическими композициями по настоящему изобретению можно заполнять микрокапсулы (например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы, желатина и полиметилметакрилата), или включать их в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы из альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) (см., например, "Remington's Pharmaceutical Science 16-е изд.", Oslo Ed. (1980)). Известны также способы получения фармацевтических агентов с контролируемым высвобождением, и такие способы можно применить к фармацевтическим композициям по настоящему изобретению (Langer и др., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277 (1981), Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982), патент США №3773919, публикация заявки на выдачу европейского патента № ЕР 58481, Sidman и др., Biopolymers 22: 547-556 (1983) и ЕР №133988).

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить пациенту стандартным способом. Например, ее можно вводить пациенту внутривенно струйным или непрерывным вливанием, внутримышечно, внутрибрюшинно, цереброспинально, чрезкожно, подкожно, внутрисуставно, подъязычно, в синовиальную полость, перорально, ингаляцией, местно или на внешние поверхности, в течение определенного периода времени. Предпочтительным является внутривенное или подкожное введение.

Все документы из предшествующего уровня техники, цитированные в данном контексте, включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Примеры

Настоящее изобретение будет подробно описано ниже со ссылкой на примеры, которые не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1

Получение ингибиторов ИЛ-6

SA237, антитела к рецептору ИЛ-6, описанные в патенте WO 2010/035769 (антитела, содержащие тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 26, описанные в WO 2010/035769 (SEQ ID NO: 3, как описано в данном контексте) и легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 29, как описано в WO 2010/035769 (SEQ ID NO: 4, как описано в данном контексте), как описано в WO 2010/035769), получали согласно методу, описанному в вышеупомянутом документе. Полученные антитела использовали для получения составов для подкожного введения с использованием способа, описанного в патенте WO 2011/090088.

Пример 2

Испытания при однократном подкожном введении здоровым мужчинам: японцу и европейцу (SA001JP)

Оценивали безопасность, переносимость, фармакокинетику и биодоступность препарата SA237 при подкожном введении здоровым японцу и европейцу. При проведении данных испытаний препарат SA237 вводили подкожно или внутривенно при капельном вливании 48 японцам и подкожно 24 европейцам. Безопасность и переносимость при однократном введении SA237 оказались в основном удовлетворительными в 24 случаях. Абсолютная величина биодоступности SA237 при подкожном введении 60 мг и 120 мг составила 64,6% и 69,4%, соответственно. Формирование антител к SA237 наблюдали у 39 субъектов из 72 субъектов, которым вводили SA237.

Пример 3

Сравнительные испытания при многократном подкожном введении японским пациентам, страдающим от ревматоидного артрита (SA-105JP), в параллельных группах с открытой этикеткой

В качестве субъектов выбирали пациентов, удовлетворявших следующим критериям:

(1) установлен диагноз ревматоидного артрита (РА) согласно критериям американского ревматологического колледжа (АРК) 1987 года,

(2) продолжительность заболевания РА в течение 6 месяцев или более,

(3) уровень С-реактивного белка (CRP) превышает верхний предел стандартного интервала по данным лабораторного анализа, выполненного за 2 недели до начала введения исследуемого медицинского продукта (ИМП),

(4) возраст пациентов составлял 20 лет или более в момент установления диагноза,

(5) пациентом подписана форма информированного согласия,

(6) пациент не проходил курс лечения метотрексатом (МТ) за 16 недель или более до начала введения ИМП,

(7) пациент не проходил курс лечения лефлуномидом (МТ) за 12 недель или более до начала введения ИМП (или за 4 недели или более до начала введения ИМП, если проводили стандартное лечение холестирамином или выводили лекарственное средство с использованием активированного угля),

(8) пациент не проходил курс лечения препаратом DMARD или иммунодепрессантами, отличающимися от описанных выше, за 4 недели или более до начала введения ИМП и

(9) пациент не проходил курс лечения дозами, превышающими эквивалент преднизолона на 10 мг/сутки или за 2 недели до начала введения ИМП.

Субъектов рандомизовали в 3 группы (группы А, В и С) согласно централизованной регистрации и проводили параллельные сравнительные испытания с открытой этикеткой (см. табл. 1). Пациентов распределяли с учетом массы тела. Настоящие клинические испытания включали первичный период оценки, продолжительный период и период пострегистрационных исследований.

Во время первичного оценочного периода 120 мг препарата SA237 вводили в неделю 0, неделю 2 и неделю 4, и 60 и 30 мг SA237 вводили группам А, В и С, соответственно, через 4-недельные интервалы начиная с недели 8 до недели 16. Затем пациентов групп А, В и С обследовали вплоть до неделей 32, 28 и 24, соответственно, когда ожидалось, что концентрации SA237 в сыворотке будут снижаться до неопределяемого уровня в каждой группе (обследование включало измерение антител к SA237).

Во время продолжительного периода 120 мг SA237 вводили в неделю 0, неделю 2 и неделю 4, и 120 мг SA237 вводили начиная с недели 8 до недели 20 через 4-недельные интервалы, и обследование продолжали вплоть до недели 32.

Исследуемое лекарственное средство представляло собой раствор в объеме 1,0 мл, содержащий 120 мг SA237, которым заполняли флакон. Раствор в качестве добавок содержал L-гистидин, L-аргинин, L-аспарагиновую кислоту, полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) гликоль, и рН раствора доводили до 5,5-6,5. Лекарственное средство вводили подкожно в брюшную полость.

При проведении фармакокинетических и фармакодинамических исследований и оценке эффективности (при проведении анализа с полной выборкой (FAS)) и безопасности повторно вводимого SA237 пациентам с ревматоидным артритом возраст субъектов в группах по 11 человек (всего 33 случая), составлял от 59,0 до 65,0 (средняя величина для каждой группы, также для всех групп, указанных ниже), а масса тела составляла от 50,30 до 57,90 кг. Процент женщин в каждой группе был высоким, 81,8% в группе А (9 из 11 человек), 90,9% в группе В (10 из 11 человек) и 63,6% в группе С (7 из 11 человек). Число пациентов, которым вводили исследуемый агент до завершения испытаний, составляло: 10 из 11 человек в группе А (90,9%), 10 из 11 человек в группе В (90,9%) и 9 из 11 человек в группе С (81,8%), а число пациентов, которых обследовали в течение всего периода испытаний (первичный оценочный период и продолжительный период), составляло 10 из 11 человек в группе А (90,9%), 7 из 11 человек в группе В (63,6%) и 7 из 11 человек в группе С (63,6%.

(1) Фармакокинетика

Метод оценки: обследование, анализы и испытания проводили, как описано в табл. 2 и 3. Если не указано иное, оценку осуществляли перед введением исследуемого агента. Даже если первичный оценочный период не был завершен, при проведении оценки в день первого введения в продолжительный период или на следующий день, последующие обследования и анализы в течение первичного оценочного периода являлись необязательными. Периоды испытаний определены ниже.

Первичный оценочный период: в основном период обследовании и оценки, начинается с первого дня введения исследуемого агента до недели 32, 28 и 24 для групп А, В и С, соответственно, по истечении которых предполагается, что концентрация SA237 в сыворотке будет значительно снижаться. Однако в случае, когда неопределяемый уровень концентрации SA237 в сыворотке подтвердился и введение во время продолжительного периода началось до завершения указанного выше периода, первичным оценочным периодом будет считаться период обследований и анализов до первого введения во время продолжительного периода.

Продолжительный период: начинается с первого введения во время продолжительного периода после завершения первичного оценочного периода, и заканчивается обследованиями и анализами в неделю 24 продолжительного периода.

Пострегистрационный период: начинается после обследования и анализов в неделю 24 продолжительного периода и завершается в неделю 32.

Результаты: на фиг. 1 представлены графики оценки фармакокинетики в ходе настоящих испытаний. Минимальные остаточные уровни концентрации SA237 в сыворотке оставались примерно постоянными, начиная с недели 4 во время первичного оценочного периода для группы А и во время продолжительного периода. С другой стороны, концентрации SA237 в сыворотке в группах В и С во время первичного оценочного периода уменьшались, начиная с недели 8. Поскольку концентрации SA237 в сыворотке и AUC_0-2W во время первичного оценочного периода и продолжительного периода в значительной степени не изменяются, то при прекращении введения SA237 и последующем возобновлении фармакокинетика не изменяется.

(2) Оценка фармакодинамики

Результаты: На фиг. 2 и 3 показаны графики оценки фармакодинамики в ходе настоящих испытаний. Концентрация SA237 в сыворотке поддерживались на постоянном уровне и концентрация sИЛ-6R в сыворотке также поддерживалась примерно на постоянном уровне с недели 8 до недели 20 в группе А во время первичного оценочного периода и с недели 8 до недели 24 во время продолжительного периода. С другой стороны, начиная с недели 8 в группах В и С во время первичного оценочного периода концентрация sИЛ-6R в сыворотке, который является фармакодинамическим маркером ингибирования ИЛ-6, снижается одновременно со снижением концентрации SA237.

Во время первичного оценочного периода содержание С-реактивного белка, который является фармакодинамическим маркером ингибирования ИЛ-6, оказывается за пределами нижнего предела количественного определения (0,005 мг/дл) в интервале от недели 4 до недели 20 приблизительно у половины субъектов в группе А, и средняя величина также сохраняется на уровне менее приблизительно 0,01 мг/дл. Величина увеличивается до 0,1 мг/дл или более, начиная с недели 16 в группе В и с недели 8 в группе С. Нормализация С-реактивного белка в процентах (0,3 мг/дл или менее) также характеризовалась тенденцией, аналогичной изменению средней величины. Нормализация в неделю 4 для каждой из групп составляла от 81,2 до 90,9%, и, соответственно, при сравнении нормализации в неделю 20 с нормализацией в неделю 8, в группе А не наблюдалось изменений от 100%, в группе В наблюдались изменения от 81,8 до 80,0% и были примерно аналогичными, а в группе С наблюдалось снижение с 90,9 до 33,3%. У большинства субъектов и в большинстве моментов времени уровень С-реактивного белка снижался по сравнению с базовым уровнем одновременно с сохранением измеряемой концентрации SA237 в сыворотке (0,2 мкг/мл).

(3) Эффективность

Метод оценки: DAS28 (модифицированный индекс активности заболевания на основании 28 болезненных суставов) представлял собой показатель для оценки активности ревматоидного артрита, который рассчитывается с использованием следующего уравнения с учетом числа болезненных суставов (TJC) и числа опухших суставов (SJC) для 28 суставов, СОЭ и "общей оценки активности заболевания пациентом". Исследовали изменение показателя DAS28 от начала введения до последнего дня обследования. Итоговую статистику (среднюю величину, стандартное отклонение, медианную величину, минимальную величину и максимальную величину оценивали для каждой группы и для каждого периода. Кроме того, рассчитывали процент пациентов, выходящих в клиническую ремиссию.

28 суставов, исследованных с использованием показателя DAS28

Индекс активности заболевания заболевания на основании 28 болезненных суставов = DAS28

, "GH" - общее состояние здоровья

Критерии улучшения американского колледжа ревматологии ACR 20%, 50% и 70% (ACR20, ACR50 и ACR70) оценивали, как описано ниже.

Критерии улучшения АСР

Среди 7 параметров, приведенных ниже, АКР20 является положительным при достижении ≥20% улучшений в болезненных и опухших суставах, а также при ≥20% улучшений трех из 5 других параметров. АКР50 и АКР70 являются положительными при достижении 50% и 70% улучшений описанных выше параметров для АКР20, соответственно.

(1) Число опухших суставов (66 суставов)

(2) Число болезненных суставов (68 суставов)

(3) Ощущение боли пациентом

(4) Общее состояние здоровья по ощущениям пациента

(5) Общее состояние здоровья пациента по оценке врача

(6) Оценка повседневной деятельности пациента (японский опросный лист состояния здоровья (JHAO)

(7) С - реактивный белок или СОЭ.

Результаты: зависимость индекса DAS28 от времени в ходе первичного оценочного периода, которая указывает на эффективность данных испытаний, показана ниже в табл. 4.

Оценка индекса DAS28 указывает на улучшение в неделю 8. После начала введения различных доз (в неделю 8) во время первичного оценочного периода, в группе наблюдалось улучшение индекса DAS28, в группе В значительных улучшений не наблюдалось, а в группе С наблюдалась тенденция сохранения базового (исходного) индекса.

Частота 20%-ного улучшения по критерию АСР составила от 70,0% до 81,8% в каждой группе в неделю 8, частота 50%-ного улучшения составила от 40,0% до 50,0% и частота 70%-ного улучшения составила от 18,2% до 30,0%. При сравнении недели 20 с неделей 8 частота 20%-ного улучшения осталась постоянной в группах А и В, но уменьшалась в группе С. Частота 50%-ного и 70%-ного улучшения в неделю 20 в группе А увеличилась до 72,7% (8 из 11 случаев) и 54,5% (6 из 11 случаев), соответственно, по сравнению с величинами в неделю 8, однако в группах В и С значительных изменений не наблюдалось.

(4) Иммуногенность и фармакокинетика, оценка фармакодинамики, эффективность и безопасность для серопозитивных пациентов

Антитела к SA237 были выявлены у двух субъектов, по одному из групп В и С, то есть в 2 случаях из 33. В этих двух случаях концентрация SA237 в сыворотке во время продолжительного периода после обнаружения антител к SA237 находилась за пределами нижнего предела определения, и начиная со времени обнаружения антител увеличения, концентрации растворимого рецептора ИЛ-6 (sИЛ-6R) и уменьшения концентрации С-реактивного белка за счет введения SA237 не наблюдали, в то время как индексы DAS28, CDAI и SDAI увеличивались. Побочное действие, которым оказался диабет в легкой степени, наблюдали у одного из этих двух субъектов после обнаружения антител. Данный побочный эффект не являлся аллергической реакцией, а представлял собой обострение осложнения. При многократном введении SA237 обоим субъектам после обнаружения антител проблемы с безопасностью не наблюдались.

(5) Выводы

При введении 120 мг SA237 пациентам с ревматоидным артритом три раза с двухнедельными интервалами с последующим введением 120 мг три раза с четырехнедельными интервалами, начиная с недели 8, в сыворотке поддерживалась стабильная концентрация лекарственного средства после последнего введения в неделю 4 в течение 4 недель. Такая схема введения приводила к высокой концентрации sИЛ-6R в сыворотке, низкой концентрации С-реактивного белка и стабильному улучшению всех параметров оценки эффективности, включая DAS28. Было установлено, что частота выявления антител к SA237 на протяжении всего периода клинических испытаний составила 6,1% (2 случая из 33), и в случаях обнаружения антител концентрация SA237 в сыворотке уменьшалась после обнаружения антител SA237, но проблем с безопасностью не наблюдалось и иммуногенность была признана приемлемой. Соответственно при такой схеме введения проблемы с безопасностью отсутствовали.

Промышленное применение

Фармацевтические композиции или схема лечения по настоящему изобретению могут решить проблему иммуногенности, связанную с формированием антител к лекарственному средству, снизить побочные эффекты и получить фармацевтическую композицию, которая обеспечивает более высокий лечебный эффект и снижает нагрузку на организм пациентов за счет снижения доз.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЧУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ

<120>Композиции для лечения заболеваний, связаных с IL-6

<130> C1-A1503P

<150> JP 2015-037933

<151> 2015-02-27

<160> 4

<170>PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Искусственно синтезированная полипептидная последовательность

<400> 1

Gln Val GlnLeuGlnGluSerGly Pro GlyLeu Val Lys Pro SerGlu

1 5 10 15

ThrLeuSerLeuThrCys Ala Val SerGly His Ser Ile Ser His Asp

20 25 30

His Ala TrpSerTrp Val ArgGln Pro ProGlyGluGlyLeuGluTrp

35 40 45

Ile GlyPhe Ile Ser Tyr SerGly Ile ThrAsn Tyr Asn Pro SerLeu

50 55 60

GlnGlyArg Val Thr Ile SerArg Asp AsnSer Lys AsnThrLeu Tyr

65 70 75 80

LeuGln Met AsnSerLeuArg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala ArgSerLeu Ala ArgThrThr Ala Met Asp Tyr TrpGlyGluGly

100 105 110

ThrLeu Val Thr Val SerSer

115

<210> 2

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Искусственно синтезированная полипептидная последовательность

<400> 2

Asp Ile Gln Met ThrGlnSer Pro SerSerLeuSer Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Thr Ile ThrCysGln Ala SerThr Asp Ile SerSer His

20 25 30

LeuAsnTrp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Lys Ala Pro GluLeuLeu Ile

35 40 45

Tyr TyrGlySer His LeuLeuSerGly Val Pro SerArgPheSerGly

50 55 60

SerGlySerGlyThr Asp PheThrPheThr Ile SerSerLeuGlu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala AlaThr Tyr TyrCysGlyGlnGlyAsnArgLeu Pro Tyr

85 90 95

ThrPheGlyGlnGlyThr Lys Val Glu Ile Glu

100 105

<210> 3

<211> 443

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Искусственно синтезированная полипептидная последовательность

<400> 3

Gln Val GlnLeuGlnGluSerGly Pro GlyLeu Val Lys Pro SerGlu

1 5 10 15

ThrLeuSerLeuThrCys Ala Val SerGly His Ser Ile Ser His Asp

20 25 30

His Ala TrpSerTrp Val ArgGln Pro ProGlyGluGlyLeuGluTrp

35 40 45

Ile GlyPhe Ile Ser Tyr SerGly Ile ThrAsn Tyr Asn Pro SerLeu

50 55 60

GlnGlyArg Val Thr Ile SerArg Asp AsnSer Lys AsnThrLeu Tyr

65 70 75 80

LeuGln Met AsnSerLeuArg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala ArgSerLeu Ala ArgThrThr Ala Met Asp Tyr TrpGlyGluGly

100 105 110

ThrLeu Val Thr Val SerSer Ala SerThr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro SerSer Lys SerThrSerGlyGlyThr Ala AlaLeu

130 135 140

GlyCysLeu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val SerTrp

145 150 155 160

AsnSerGly Ala LeuThrSerGly Val His ThrPhe Pro Ala Val Leu

165 170 175

GlnSerSerGlyLeu Tyr SerLeuSerSer Val ValThr Val Pro Ser

180 185 190

SerAsnPheGlyThrGlnThr Tyr ThrCysAsn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

SerAsnThr Lys Val Asp Lys Thr Val GluArg Lys SerCys Val Glu

210 215 220

Cys Pro ProCys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val PheLeu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp ThrLeu Met Ile SerArgThr Pro Glu

245 250 255

Val ThrCys Val ValVal Asp Val SerGlnGlu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

PheAsnTrp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro ArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArg Val ValSer Val Leu

290 295 300

Thr Val Val His Gln Asp TrpLeuAsnGly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val SerAsn Lys GlyLeu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys GlyGln Pro ArgGlu Pro Gln Val Tyr ThrLeu Pro ProSer

340 345 350

GlnGluGlu Met Thr Lys AsnGln Val SerLeuThrCysLeu Val Lys

355 360 365

GlyPhe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val GluTrpGluSerAsnGlyGln

370 375 380

Pro GluAsnAsn Tyr Lys ThrThr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

SerPhePheLeu Tyr Ser Lys LeuThr Val Asp Lys SerArgTrpGln

405 410 415

GluGlyAsn Val PheSerCysSer Val Met His Glu Ala Leu His Ala

420 425 430

His Tyr ThrGln Lys SerLeuSerLeuSer Pro

435 440

<210> 4

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Искусственно синтезированная полипептидная последовательность

<400> 4

Asp Ile Gln Met ThrGlnSer Pro SerSerLeuSer Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Thr Ile ThrCysGln Ala SerThr Asp Ile SerSer His

20 25 30

LeuAsnTrp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Lys Ala Pro GluLeuLeu Ile

35 40 45

Tyr TyrGlySer His LeuLeuSerGly Val Pro SerArgPheSerGly

50 55 60

SerGlySerGlyThr Asp PheThrPheThr Ile SerSerLeuGlu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala AlaThr Tyr TyrCysGlyGlnGlyAsnArgLeu Pro Tyr

85 90 95

ThrPheGlyGlnGlyThr Lys Val Glu Ile GluArgThr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProSer Asp GluGlnLeu Lys SerGly

115 120 125

Thr Ala Ser Val ValCysLeuLeuAsnAsnPhe Tyr Pro ArgGlu Ala

130 135 140

Lys Val GlnTrp Lys Val Asp Asn Ala LeuGlnSerGlyAsnSerGln

145 150 155 160

GluSer Val ThrGluGln Asp Ser Lys Asp SerThr Tyr SerLeuSer

165 170 175

SerThrLeuThrLeuSer Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala CysGlu Val Thr His GlnGlyLeuSerSer Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

PheAsnArgGlyGluCys

210

<---

1. Применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, связанного с ИЛ-6, где фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента антитело к рецептору ИЛ-6, содержащее тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 3 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 4, при этом фармацевтическую композицию вводят в стандартной дозе 120 мг на введение антитела с четырехнедельными интервалами после кратковременного периода введения дозы, когда дозу, аналогичную стандартной дозе, вводят многократно с двухнедельными интервалами.

2. Применение по п. 1, где кратковременный интервал введения дозы составляет четыре недели после первичного введения.

3. Применение по п. 1 или 2, где антителом к рецептору ИЛ-6 является химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

4. Применение по п. 1 или 2, где антителом к рецептору ИЛ-6 является SA237.

5. Применение по п. 1 или 2, где заболеванием, связанным с ИЛ-6, является ревматоидный артрит, юношеский идиопатический артрит, ювенильный идиопатический артрит с системным началом, болезнь Кастельмана, системная красная волчанка (SLE), волчаночный нефрит, болезнь Крона, лимфома, язвенный колит, анемия, васкулит, болезнь Кавасаки, болезнь Стилла, амилоидоз, рассеянный склероз, трансплантация, возрастная макулярная дистрофия, анкилозирующий спондилоартрит, псориаз, псориатический артрит, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), первичная нефропатия IgA-типа, остеоартрит, астма, диабетическая нефропатия, реакция отторжения трансплантата (ТПХ), эндометриоз, гепатит (неалкогольный стеатогепатит), инфаркт миокарда, артериосклероз, сепсис, остеопороз, диабет, множественная миелома, рак предстательной железы, рак почки, В-клеточная неходжкинская лимфома, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак пищевода, рак ободочной кишки, раковая кахексия, инвазия раковых нервных клеток, инфаркт миокарда, миопическая хориоидальная неоваскуляризация, идиопатическая хориоидальная неоваскуляризация, увеит, хронический тироидит, замедленная гиперчувствительность, контактный дерматит, атопический дерматит, мезотелиома, полимиозит, дерматомиозит, панувеит, передний увеит, средний увеит, воспаление склеры, воспаление роговицы, орбитальный воспалительный синдром, неврит зрительного нерва, диабетическая ретинопатия, пролиферативная витреоретинопатия, синдром сухого глаза, послеоперационный воспалительный синдром, нейромиелит зрительного нерва, тяжелая псевдопаралитическая миастения или легочная гипертензия.

6. Применение по п. 1 или 2, где фармацевтической композицией является состав для подкожного введения.