Способ скрининга агрессивного изолята возбудителя фомоза подсолнечника (phomamacdonaldii boerema)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий сбор фрагментов растений и семянок подсолнечника с признаками поражения фомозом в разные фазы развития растений, выделение культур возбудителя фомоза из собранных объектов, получение моноспоровых культур изолятов возбудителя фомоза и определение их видовой принадлежности, посев в теплице семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, и получение 10-дневных растений, рассев моноспоровых культур изолятов в чашки Петри с обеспечением равномерного распределения пикноспор по поверхности питательной среды в них, заражение 14-дневной культурой каждого изолята отсеченных семядолей и фрагментов гипокотелей 10-дневных растений подсолнечника, учет степени поражения семядольных листьев и фрагментов гипокотилей, использование смеси агрессивных изолятов в качестве инокулюма при искусственном заражении растений в селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу. Изобретение позволяет отобрать наиболее агрессивные изоляты Phona для искусственного заражения подсолнечника фомозом в селекции на устойчивость к этому патогену. 4 з.п. ф-лы, 1 пр.

 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и фитопатологии и может быть использовано для получения инфекционного материала фитопатогенных грибов с целью искусственного заражения растений подсолнечника для получения высокоустойчивых к фомозу его генотипов.

Грибы рода Phoma относятся к факультативным паразитам, которые до середины прошлого столетия не привлекали особого внимания, как возбудители болезней растений из-за низкой вредоносности. Однако в 70-е годы XX века паразитические свойства некоторых представителей данного рода усилились и в настоящее время виды Phoma с выраженными паразитическими свойствами широко встречаются, как возбудители болезней многих сельскохозяйственных культур, в том числе и подсолнечника. Фомоз подсолнечника быстро и глобально распространился в последние 10-15 лет и перешел в разряд экономически значимых болезней этой культуры. В России фомоз на подсолнечнике занимает лидирующее положение по распространенности среди других болезней. Широкое распространение болезни может быть связано с ввозом инфицированных семян из стран импортеров.

Болезнь вызывает угнетение роста растений, утончение стебля, почернение его сердцевины и преждевременное созревание. У сильно восприимчивых генотипов на поздних этапах развития растений поражается центральная часть стебля, что приводит к его перелому. Потери урожая при таком поражении составляют более 30%. Гибель растений при поражении корневой системы фомозом в полевых условиях учесть практически невозможно, т.к. подобные симптомы могут вызывать и другие возбудители болезней. Основным и наиболее эффективным способом контроля фомоза является селекция устойчивых и толерантных гибридов подсолнечника.

Результативность селекции на устойчивость зависит от подбора инокулята для искусственного заражения растений. В качестве инокулята необходимо использовать изоляты с высокой агрессивностью. Поэтому скрининг наиболее агрессивных изолятов возбудителя этой болезни для использования их в качестве инфекционного фона при селекции устойчивых к фомозу форм подсолнечника - очень актуальная задача.

Известны способы получения инфекционного материала грибов на твердом субстрате, на зерновом материале, например на пшене (гриб Thielaviopsisbasicola), пропитанном в соотношении 1:1 раствором, содержащим ферментативные гидролизаты казеина, дрожжей и/или крови в количестве 100-150 мг% аминного азота и дрожжевой экстракт в количестве 0,05-0,1% к весу пшена (а.с. СССР №676610, C12K 1/01, опубл. 1979 г.) - с целью искусственного заражения с/х растений для получения высокоустойчивых сортов путем создания инфекционного фона.

Известен способ получения препарата для оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили (а.с. СССР №1691392, C12N 1/14, А 01N 63/04, опубл. 1991 г.), с целью создания искусственного инфекционного фона при селекции хлопчатника на устойчивость к этому патогену. Известный способ включает выращивание гриба Thielaviopsisbasicola на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, картофель, капусту, глицерин, щавелевокислый калий, фосфорнокислый однозамещенный калий, сернокислый магний, воду. Питательную среду засеивают культурой гриба Т. Basicola - возбудителя черной корневой гнили хлопчатника - и культивируют при 26°С в течение 4 суток. Биомассу отделяют и смешивают с двуокисью кремния и каолином. Полученным препаратом обрабатывают семена хлопчатника перед высевом с целью оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили.

Недостаток известных способов состоит в том, что они не эффективны для гриба PhomamacdonaldiiBoerema.

Задачей заявляемого изобретения является создание эффективного способа подбора инокулята для искусственного заражения подсолнечника фомозом для использования в селекции на устойчивость к этому патогену.

Цель изобретения - отобрать из изолятов PhomamacdonaldiiBoerema. наиболее агрессивные и использовать их смесь в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу.

Технический результат достигается тем, что способ скрининга агрессивного изолята фомоза подсолнечника (PhomamacdonaldiiBoerema) включает: сбор фрагментов растений и семянок подсолнечника с признаками поражения фомозом в разные фазы развития растений и выделение культур возбудителя фомоза, получение моноспоровых культур изолятов возбудителя фомоза и определение их видовой принадлежности, посев семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, рассев культур моноспоровых изолятов в чашки Петри с обеспечением равномерного распределения пикноспор по поверхности питательной среды, заражение отсеченных семядолей и фрагментов гипокотилей 10-дневных растений подсолнечника 14-дневной культурой каждого изолята в чашках Петри, учет степени поражения семядольных листьев и фрагментов гипокотиля через 2 суток совместного культивирования, выделение агрессивных изолятов по большему проценту пораженной поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотиля, использование смеси агрессивных изолятов в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу, при этом в качестве фрагментов растений подсолнечника с признаками поражения фомозом используют корни, стебли, черешки, листья, выделение возбудителя фомоза из них осуществляют по общепринятой методике экспериментальной микологии на овсяной агаризированной среде, видовую принадлежность моноспоровых культур изолятов определяют по систематике Boeremaet.al на такой же среде, а для получения 10-дневных растений подсолнечника используют семена его нескольких линий, сортов и гибридов.

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы не выявили технических решений, имеющих существенные признаки заявляемого способа, касающиеся определения видовой принадлежности моноспоровых культур изолятов, использования для посева семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, и др. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критериям патентоспособности «НОВИЗНА» и «ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ». Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности «ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ», т.к. оно может быть использовано в сельском хозяйстве для получения высокоустойчивых к фомозу генотипов подсолнечника. Сущность заявляемого технического решения достаточно раскрыта в описании изобретения.

Способ осуществляется следующим образом. В течение вегетационного периода на полях подсолнечника осуществляют сбор фрагментов растений и семянок подсолнечника с признаками поражения фомозом, из них выделяют изоляты возбудителя фомоза, получают моноспоровые культуры изолятов и определяют их видовую принадлежность, осуществляют посев семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, осуществляют рассев моноспоровых культур изолятов в чашки Петри с обеспечением равномерного распределения пикноспор по поверхности питательной среды в них, заражают 14-дневной культурой каждого изолята отсеченные семядольные листья и фрагменты гипокотилей 10-дневных растений подсолнечника, учитывают степень поражения семядольных листьев и фрагментов гипокотилей через 2 суток после заражения, выделяют агрессивные изоляты по большему проценту пораженной поверхности, используют смесь агрессивных изолятов в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции на устойчивость к фомозу, при этом при сборе фрагментов растений подсолнечника с признаками поражения фомозом используют пораженные корни, стебли черешки, листья, выделение возбудителя фомоза из фрагментов растений и семянок подсолнечника осуществляют с использованием общепринятой методики экспериментальной микологии, определение видовой принадлежности моноспоровых культур изолятов проводят на овсяной агаризованной (OA) среде по систематике Boeremaet.al, а для получения 10-дневных растений подсолнечника используют совместный посев семян нескольких его линий, сортов и гибридов.

Пример.

Для осуществления заявляемого способа скрининга агрессивного изолята фомоза подсолнечника поступали так. В течение вегетационного периода на селекционных полях ВНИИМК (Краснодарский край) с посевами подсолнечника осуществляли сбор пораженных фомозом корней, листьев, черешков, стеблей вегетирующих растений этой культуры (всего 600 образцов) и выделяли изоляты возбудителя фомоза по общепринятой методике. Согласно ей для поверхностной стерилизации пораженных фрагментов растений объект выдерживали в 2%-ном растворе марганцевокислого калия в течение 1-5 мин и многократно промывали стерильной водой. Пораженные части растения до 1,0 см стерилизовали в 96% спирте, обжигали и высевали на питательную среду. Первичное выделение культур возбудителя фомоза, как и посевы исследуемых грибов, производили на питательной среде «овсяной агар»(ОА) с рН 6,0 с добавлением антибиотиков с широким спектром противобактериального действия (стрептомицина, биомицина и др.). Питательную среду OA готовили следующим образом: 150 г овсяных зерен варили в 1 л воды в течение 20 мин, сцеживали отвар, добавляли в него 20 г глюкозы и 20 г агара. Автоклавировали 30 мин при 1,2 атм и разливали в чашки Петри. Выращивали культуры возбудителя фомоза при температуре 20-25°С. Изучали морфологокультуральные характеристики выделенных изолятов на питательной среде OA на 3,5,7,10 и 14-й день. Идентификацию гриба проводили по систематике Boerema. Изоляты были идентифицированы как Phomamacdonaldii. Для определения агрессивности поступали так: изоляты гриба выращивали на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Питательную среду готовили следующим образом: 200 г очищенного картофеля варили в 1 л воды в течение 20 мин, сцеживали отвар, добавляли в него 20 г глюкозы и 20 г агара. Автоклавировали 30 мин при 1,2 атм и разливали в чашки Петри. Посев моноспоровых культур изолятов проводили следующим образом. Отделяли одну пикниду с вышедшим эксудатом стерильной иглой и помещали в стаканчик со стерильной водой объемом 25 мл, тщательно размешивали и наносили 2 капли на поверхность 9 см чашки Петри, равномерно распределяли шпателем. Выращивали культуры гриба 5 суток при оптимальной для гриба температуре 23-25°С. Через это время образуются равномерно распределенные по всей поверхности пикниды. Осуществляли посев семян подсолнечника двух линий ВК 653 и ВК 680, одного сорта ВНИИМК 8883 и одного гибрида Альтаир в сосуды и выращивали в теплице при оптимальных режимах освещения, температуры и влажности. Для заражения брали 10-дневные растения восприимчивых к фомозу линий ВК 653 и ВК 680, сорта ВНИИМК 8883 и гибрида Альтаир подсолнечника, отсекали семядольные листья и фрагменты гипокотилей и раскладывали их на культуры гриба по 9-10 шт в чашки с 14-дневной культурой каждого изолята. Через 2 суток контакта совместного культивирования учитывали размер пораженной поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотилей. Об агрессивности изолятов гриба судили по размеру колонизированной поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотилей. По большему проценту пораженной поверхности семядолей и гипокотилей двух линий, сорта и гибрида подсолнечника были выделены 4 изолята. Смесь этих изолятов можно использовать в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу.

Таким образом, совокупность существенных признаков заявляемого способа скрининга агрессивного изолята фомоза подсолнечника необходима и достаточна для достижения поставленной цели и решения поставленной задачи.

Способ скрининга агрессивных изолятов возбудителя фомоза подсолнечника (Phoma macdonaldii Boerema), включающий сбор пораженных фомозом частей растений подсолнечника, выделение из последних возбудителя фомоза по общепринятой методике экспериментальной микологии, получение моноспоровых культур изолятов возбудителя фомоза, определение видовой принадлежности изолятов по систематике Boerema на овсяной агаризованной среде, посев в теплице семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, и их выращивание, заражение каждого генотипа подсолнечника каждым выделенным изолятом возбудителя фомоза, учет степени поражения, отбор наиболее агрессивных изолятов возбудителя фомоза, отличающийся тем, что получение моноспоровых культур изолятов возбудителя фомоза осуществляют путем рассева изолятов в чашки Петри с обеспечением равномерного распределения пикноспор по поверхности питательной среды КГА, заражение каждого генотипа подсолнечника каждым выделенным изолятом фомоза осуществляют путем отсечения семядольных листьев и фрагментов гипокотиля у здоровых 10-дневных растений подсолнечника и раскладывания их на культуры гриба в чашки Петри с 14-дневной культурой каждого изолята, учет степени поражения ведут через 2 суток их совместного контакта, об агрессивности изолятов фомоза судят по размеру колонизированной поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотиля, отбор наиболее агрессивных изолятов возбудителя фомоза осуществляют по большему проценту пораженной ими поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотиля генотипов подсолнечника.