Микроноситель для клеток на основе натурального шелка и способ его получения
Владельцы патента RU 2732598:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к микроносителю для культивирования клеток и для доставки клеток в область повреждения ткани млекопитающего. Способ включает измельчение волокон фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori, получая частицы длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм. Изобретение позволяет получить биосовместимые носители для клеток регулируемого размера и формы без использования токсичных реагентов и значительных временных затрат. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.
Группа изобретений относится к области регенеративной медицины и тканевой инженерии, может быть использована для получения микроносителей для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани для восстановления поврежденных тканей и органов.
Известен микроноситель, представляющий собой упругоэластичную двухкомпонентную массу, полученную из двух источников коллагена, содержащий в составе компонент в виде микросфер размером 100-300 мкм (RU 2249462, С1).
Недостатки этого микроносителя заключаются в том, что он представляет собой неоднородную двухкомпонентную систему в виде геля, содержащего микросферы с малым диапазоном размера, что значительно сужает сферу применения подобных носителей. Кроме того, при его получении используются токсичные реагенты (такие как 0,3 М уксусная кислота) и специфические животные источники коллагена, а в ходе получения невозможно задавать форму и размер микроносителя для конкретной задачи.
Известен способ получения микроносителей, включающий в себя получение трехмерных матриксов на основе фиброина шелка путем замораживания-оттаивания смеси водного раствора фиброина шелка с ДМСО с последующим криоизмельчением трехмерных матриксов с помощью диспергатора (RU 2644633, С1).
Недостатки этого способа заключаются в его низкой производительности, большом количестве манипуляций с исходным материалом, многостадийности способа получения, что влечет за собой значительные временные затраты на изготовление микроносителя, а также в том, что при получении данного микроносителя используется токсичный реагент - ДМСО.
Техническая проблема заключается в получении калиброванных биосовместимых носителей для клеток при минимальном воздействии на исходный материал за короткое время.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в получении биосовместимых носителей для клеток регулируемого размера и формы без использования токсичных реагентов и значительных временных затрат.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Технический результат достигается тем, что микроноситель для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани представляет собой измельченные волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Существует вариант, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Предлагается также способ получения данного микроносителя для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани, в котором волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori измельчают, получая частицы длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Существует вариант получения данного микроносителя, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Существует также вариант, в котором перед измельчением производят отмывание волокон фиброина шелка водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 минут при температуре 60-100°С, а затем производят их отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 часов.
Существует вариант, в котором измельчение волокон производят в гомогенизаторе, или при помощи ступки и пестика, или при помощи микротома.
Существует вариант, в котором перед измельчением волокна замораживают в жидком азоте.
Существует вариант, в котором перед замораживанием волокна инкубируют в 3-30% водном растворе глицерина в течение 5-120 мин.
Существует вариант, в котором после измельчения волокон их обрабатывают раствором, по меньшей мере, одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества.
Существует вариант, в котором обработку волокон после измельчения проводят при перемешивании со скоростью 100-800 об\мин.
Изобретения поясняются следующими фигурами.
На фиг. 1 представлено изображение микроносителя на основе фиброина шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori, полученного при криоизмельчении. Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение х700.
На фиг. 2 представлено изображение микроносителя на основе фиброина шелка из нитей шелка тутового шелкопряда Bombyx mori, полученного при помощи микротома. Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение х1500.
На фиг. 3 представлены изображения микроносителей на основе фиброина шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori, полученных при криоизмельчении, с культивированными мышиными фибробластами линии 3Т3, окрашенными флуоресцентным красителем DAPI. Изображение получено методом световой микроскопии, увеличение х100, изображение на фиг. 3А получено в режиме «просвет», изображение на фиг. 3Б получено в режиме флуоресцентной микроскопии с использованием фильтра DAPI.
На фиг. 4 представлены изображения микроносителей на основе фиброина шелка ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori плотностью 15 гр/м2, полученных при криоизмельчении, с культивированными мышиными фибробластами линии 3Т3, окрашенными флуоресцентным красителем DAPI. Изображение получено методом световой микроскопии в режиме флуоресцентной микроскопии с использованием фильтра DAPI, увеличение х100.
На фиг. 3Б и 4 мышиные фибробласты 3Т3 обозначены позицией 1, волокна микроносителя - позицией 2.
Способ получения микроносителей реализуется следующим образом.
В одном из вариантов микроноситель для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани представляет собой измельченные волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Кроме этого существует вариант, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Кроме этого существует вариант, в котором волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori измельчают, получая частицы длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Кроме этого существует вариант, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Кроме этого существует вариант, в котором перед измельчением производят отмывание волокон фиброина шелка водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 минут при температуре 60-100°С, а затем производят их отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 часов. Для этого волокна фиброина шелка помещают в пробирку с дистиллированной водой. Указанный температурный режим поддерживают с помощью термостата в течение указанного времени.
Кроме этого существует вариант, в котором измельчение волокон производят в гомогенизаторе, или при помощи ступки и пестика, или при помощи микротома. Для измельчения в гомогенизаторе волокна помещают в гомогенизатор и измельчают при 15000-25000 об/мин в течение 1-15 минут до указанного размера. Для измельчения при помощи ступки и пестика волокна помещают в ступку и измельчают пестиком до указанного размера. Для измельчения при помощи микротома волокна обезвоживают и обезжиривают с помощью гистологической проводки с этиловым спиртом и ксилолом, затем пропитывают парафином, заключают в парафин и измельчают на микротоме до указанного размера.
Кроме этого существует вариант, в котором перед измельчением волокна замораживают в жидком азоте. Для этого волокна помещают в жидкий азот до полного замерзания.
Кроме этого существует вариант, в котором перед замораживанием волокна инкубируют в 3-30% водном растворе глицерина в течение 5-120 мин. Для этого волокна помещают в пробирку с 3-30% водным раствором глицерина и инкубируют в течение указанного времени.
Кроме этого существует вариант, в котором после измельчения волокон их обрабатывают раствором, по меньшей мере, одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества. Для этого волокна помещают в пробирку с раствором этого вещества, например, фибронектина, желатина, коллагена и инкубируют. Длительность инкубации зависит от конкретного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего и от его концентрации.
Например, для раствора фибронектина с концентрацией 10 мкг/мл время инкубации составляет 12 часов, для раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл время инкубации составляет 2 часа, для раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл время инкубации составляет 4 часа.
Кроме этого существует вариант, в котором обработку волокон после измельчения, по меньшей мере, одним веществом, способствующим адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества проводят при перемешивании со скоростью 100-800 об/мин. Для этого волокна помещают в пробирку с раствором этого вещества (например, фибронектина, желатина, коллагена) и инкубируют в течение указанного времени (например, для раствора фибронектина с концентрацией 10 мкг/мл время инкубации составляет 12 часов, для раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл время инкубации составляет 2 часа, для раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл время инкубации составляет 4 часа) при перемешивании, например, на магнитной мешалке или лабораторном шейкере.
В качестве примера реализации предлагаемого способа представлены изображения микроносителей, полученные методом сканирующей электронной микроскопии.
Микроноситель на фиг. 1 получали следующим образом. В качестве источника волокон фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали коконы тутового шелкопряда Bombyx mori. Волокна кокона предварительно были отмыты водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 2,5 мг/мл при температуре 100°С, а затем отмыты дистиллированной водой в течение 60 минут и высушены на воздухе при комнатной температуре. Далее волокна помещали в 10% водный раствор глицерина, инкубировали 30 минут и замораживали в жидком азоте. В данном примере волокна измельчали при помощи ступки и пестика до размера частиц 100-2000 мкм.
Микроноситель на фиг. 2 получали следующим образом. В качестве источника фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали нити шелка диаметром 4-0 (Моснитки, Россия). Нити предварительно были отмыты водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 2,5 мг\мл при температуре 100°С, а затем отмыты дистиллированной водой в течение 60 минут и высушены на воздухе при комнатной температуре. Далее нити заключали в парафин, после чего получали срезы образца на микротоме. В данном примере толщина среза составляла 40 мкм. Затем срезы помещали в пробирку и отмывали от парафина путем 10 последовательных инкубаций в ксилоле по 10 минут, а затем переводили в 96% этанол. В данном примере средняя длина частиц составила 2-100 мкм.
Микроноситель на фиг. 3 получали следующим образом. В качестве источника волокон фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали коконы тутового шелкопряда Bombyx mori. Волокна кокона предварительно были отмыты водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1 мг\мл при температуре 60°С, а затем отмыты дистиллированной водой в течение 12 часов и высушены на воздухе при комнатной температуре. Далее волокна помещали в 3% водный раствор глицерина, инкубировали 120 минут и замораживали в жидком азоте, после чего волокна измельчали при помощи ступки и пестика до размера частиц 20-500 мкм. Культивирование клеток на микроносителе проводили следующим образом. Полученный микроноситель отмывали от глицерина путем инкубации в пяти сменах дистиллированной воды по 20 минут каждая при комнатной температуре, затем стерилизовали в 70% этаноле и отмывали от этанола в трех сменах фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 15 минут каждая при комнатной температуре. Затем микроноситель помещали в среду инкубации на 30 минут. Мышиные фибробласты 3Т3, культивированные в чашках Петри в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа, снимали с поверхности чашек Петри при помощи раствора трипсина-Версена, после чего ресуспендировали в среде инкубации и центрифугировали в течение 5 минут при 900 g. Осадок, содержащий мышиные фибробласты 3Т3, ресуспендировали в среде инкубации из расчета 1500 клеток/мл. Полученную суспензию смешивали с микроносителем в объемном соотношении 1:1 и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 24 часов. После этого для регистрации ядер клеток, адгезированных на микроносителе, в суспензию вносили водный раствор флуоресцентного красителя DAPI в концентрации 2 мкг/мл и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 5 минут. Затем микроноситель отмывали от несвязавшегося красителя трехкратной сменой фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 5 минут каждая при комнатной температуре. На Фиг. 3Б показано, что мышиные фибробласты 3Т3 (1) адгезировали на волокна (2). Возможность использования микроносителя для доставки клеток проверяли в модельной системе. Мышиные фибробласты 3Т3 в количестве 10000 клеток вносили в чашку Петри и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 72 часов. Затем в эти чашки Петри вносили полученный микроноситель с адгезированными мышиными фибробластами 3Т3 из расчета 500 мкл суспензии микроносителя на чашку Петри для доставки клеток.
Микроноситель на фиг. 4 получали следующим образом. В качестве источника волокон фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали ткань из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori плотностью 15 гр/м2. Ткань предварительно была отмыта водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 3 мг\мл при температуре 100°С, а затем отмыта дистиллированной водой в течение 60 часов и высушена на воздухе при комнатной температуре. Далее ткань помещали в 30% водный раствор глицерина, инкубировали 5 минут и замораживали в жидком азоте, после чего ткань измельчали при помощи ступки и пестика до размера частиц 20-500 мкм. Культивирование клеток на полученном микроносителе проводили следующим образом. Полученный микроноситель отмывали от глицерина путем инкубации в пяти сменах дистиллированной воды по 20 минут каждая при комнатной температуре, затем стерилизовали в 70% этаноле и отмывали от этанола в трех сменах фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 15 минут каждая при комнатной температуре. Затем микроноситель помещали в среду инкубации на 30 минут. Мышиные фибробласты 3Т3, культивированные в чашках Петри в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа снимали с поверхности чашек Петри при помощи раствора трипсина-Версена, после чего ресуспендировали в среде инкубации и центрифугировали в течение 5 минут при 900 g. Осадок, содержащий мышиные фибробласты 3Т3, ресуспендировали в среде инкубации из расчета 1500 клеток/мл. Полученную суспензию смешивали с микроносителем в объемном соотношении 1:1 и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 24 часов. После этого для регистрации ядер клеток, адгезированных на микроносителе, в суспензию вносили водный раствор флуоресцентного красителя DAPI в концентрации 2 мкг/мл и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 5 минут. Затем микроноситель отмывали от несвязавшегося красителя трехкратной сменой фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 5 минут каждая при комнатной температуре. На Фиг. 4 показано, что мышиные фибробласты 3Т3 (1) адгезировали на волокна (2). Возможность использования микроносителя для доставки клеток проверяли в модельной системе. Мышиные фибробласты 3Т3 в количестве 10000 клеток вносили в чашку Петри и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 72 часов. Затем в эти чашки Петри вносили полученный микроноситель с адгезированными мышиными фибробластами 3Т3 из расчета 500 мкл суспензии микроносителя на чашку Петри для доставки клеток.
1. Микроноситель для культивирования клеток и для доставки клеток в область повреждения ткани млекопитающего, характеризующийся тем, что он содержит измельченные волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
2. Микроноситель по п. 1, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
3. Способ получения микроносителя по п. 1, характеризующийся тем, что измельчают волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori, получая частицы длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
4. Способ получения микроносителя по п. 3, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
5. Способ получения микроносителя по п. 3, отличающийся тем, что перед измельчением производят отмывание волокон фиброина шелка сначала водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 минут при температуре 60-100°С, а затем дистиллированной водой в течение 12-60 часов.
6. Способ получения микроносителя по п. 3, отличающийся тем, что измельчение волокон производят в гомогенизаторе, или при помощи ступки и пестика, или при помощи микротома.
7. Способ получения микроносителя по п. 3, характеризующийся тем, что перед измельчением волокна замораживают в жидком азоте.
8. Способ получения микроносителя по п. 7, характеризующийся тем, что перед замораживанием волокна инкубируют в 3-30% водном растворе глицерина в течение 5-120 мин.
9. Способ получения микроносителя по п. 3, характеризующийся тем, что после измельчения волокон их обрабатывают раствором, по меньшей мере, одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества.
10. Способ получения микроносителя по п. 9, характеризующийся тем, что обработку волокон после измельчения проводят при перемешивании со скоростью 100-800 об/мин.
