Мат-направляемые химерные антигенные рецепторные системы для сортировки/истощения сконструированных иммунных клеток

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен химерный антигенный рецептор (CAR), предназначенный для истощения нацеленных на CAR иммунных клеток. CAR содержит внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный VH-цепью и VL-цепью, CD8 альфа шарнир, трансмембранный домен, содержащий трансмембранную область/области CD8 альфа, и внутриклеточный домен, включающий CD3 зета сигнальный домен и костимуляторный домен из 4-1ВВ. Указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп. Также изобретение относится к получению CAR, к получению и использованию сконструированной Т-клетки или NK-клетки, экспрессирующей на своей клеточной поверхности CAR по изобретению. Изобретение обеспечивает эффективное МАт-направляемое истощение Т-клеток, экспрессирующих указанные CAR. 7 н. и 23 з.п. ф-лы, 22 ил., 4 табл., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к улучшенным химерным антигенным рецепторам (CAR), предназначенным для применения в иммунотерапии, внеклеточные связывающие домены (scFv) которых модифицированы путем встраивания МАт-специфического эпитопа для обеспечения возможности сортировки и/или истощения иммунных клеток, наделенных указанными CAR. Настоящее изобретение относится также к иммунным клеткам, экспрессирующим указанные CAR, к способам in vivo истощения и/или in vitro сортировки указанных экспрессирующих CAR иммунных клеток, и оно направлено на их терапевтическое применение.

Предпосылки создания изобретения

Адаптивная иммунотерапия, в которой применяют перенос аутологичных антигенспецифических Т-клеток, созданных ex vivo, представляет собой перспективную стратегию для лечения вирусных инфекций и рака. Т-клетки, применяемые для адаптивной иммунотерапии, можно создавать либо путем размножения антигенспецифических Т-клеток, либо посредством перенаправления Т-клеток с помощью методов генетической инженерии (Park, Rosenberg и др., 2011). Перенос Т-клеток, специфических в отношении вирусных антигенов, является хорошо зарекомендовавшей себя процедурой, которую применяют для лечения ассоциированных с трансплантацией вирусных инфекций и редких связанных с вирусами злокачественных заболеваний. Продемонстрировано также, что выделение и перенос опухольспецифических Т-клеток приводит к успеху при лечении меланомы.

В Т-клетках были успешно созданы новые специфичности посредством генетического переноса трансгенных Т-клеточных рецепторов или химерных антигенных рецепторов (CAR) (Jena, Dotti и др., 2010). CAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие из «нацеливающего» фрагмента, ассоциированного с одним или несколькими сигнальными доменами в одной слитой молекуле. В целом, связывающий фрагмент CAR состоит из антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), который содержит вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела, соединенные гибким линкером. Успешно применяли также связывающие фрагменты на основе доменов рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первого поколения CAR получали из цитоплазматической области дзета-цепей CD3 или гамма-цепей Fc-рецептора. Было продемонстрировано, что первое поколение CAR позволяло успешно перенаправлять Т-клеточную цитотоксичность, однако для них не удалось обеспечить пролонгированное размножение и противоопухолевую активность in vivo. Для повышения выживаемости и усиления пролиферации модифицированных с помощью CAR Т-клеток осуществляли добавление сигнальных доменов из костимуляторных молекул, включая CD28, ОХ-40 (CD134), ICOS и 4-1ВВ (CD137), по отдельности (второе поколение) или в комбинации (третье поколение). CAR позволяли успешно перенаправлять Т-клетки на антигены, экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток при различных злокачественных заболеваниях, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena, Dotti и др., 2010)

Однако, несмотря на их беспрецедентную эффективность в отношении искоренения опухолей in vivo, экспрессирующие CAR Т-клетки (CAR-T-клетки) могут стимулировать острые нежелательные явления после переноса в организм пациентов. К хорошо известным нежелательным явлениям относятся реакция «трансплантат против хозяина» (GvHD), активность в отношении мишени, не относящейся к опухоли (так называемый «on-target off-tumor»-эффект) или патологическая лимфопролиферативная способность, обусловленная вызываемым вектором инсерционным мутагенезом. Таким образом, существует необходимость в создании систем для специфического клеточного истощения, предназначенных для предупреждения возникновения таких вредных явлений in vivo.

В настоящее время проводятся многочисленные исследования по разработке безопасной иммунотерапии на основе CAR, например, на основе ингибирующих сигналов, относящихся к иммунным контрольным точкам (таким как CTLA-4 или PD-1), которые имеют решающее значение для поддержания аутотолерантности и также для ограничения опосредуемого иммунной системой побочного повреждения ткани (Dolan и др., 2014). В последние годы были сконструированы ингибирующие химерные антигенные рецепторы (iCAR) с целью затормаживания Т-клеточной функции после контакта с клетками, не являющимися мишенями (Federov и др., 2013). Другая система описана у Budde с соавторами (2013), в ней химерный антигенный рецептор для CD20 объединен с «переключателем» на суицид, представляющим собой ген индуцибельной каспазы 9 (iC9). В заявке US 2014/0286987 указано, что последний ген становится функциональным в присутствии пролекарства АР1903 (такролимус) в результате связывания с мутантным FK506-связывающим белком (FKBP1). В настоящее время проводится клинический опыт, спонсируемый компанией Bellicum, в котором с использованием указанной выше технологии на основе каспазы (CaspaCIDe™) конструируют нацеленные на GD2 CAR-T-клетки третьего поколения. Сходная система индукции апоптоза на основе мультимеризующего агента описана в заявке WO 2014/152177.

Philip с соавторами (2014) описали систему RQR8, которую применяют в виде компактного маркера/гена суицида, позволяющую осуществлять отбор трансдуцированных клеток. RQR8 получают из комбинации эпитопов-мишеней как антигена CD34, так и антигена CD20. Эта конструкция позволяет осуществлять отбор с использованием разрешенной для клинического применения системы CliniMACS CD34 (фирма Miltenyi). Кроме того, указанная конструкция RQR8 связывается с широко применяемым фармацевтическим антителом ритуксимабом, в результате чего обеспечивается избирательная элиминация экспрессирующих трансген клеток. В этой системе RQR8 совместно экспрессируют с CAR в ретровирусном векторе с использованием пептида 2А вируса ящура, в результате чего имеет место экспрессия 2 независимых трансгенов (RQR8 и CAR) на поверхности Т-клеток. Эта система имеет некоторые ограничения с точки зрения перспективы промышленного применения, во-первых, она требует клонирования больших ретровирусных вставок, и, во-вторых, для того, чтобы гарантировать, что трансформированные клетки экспрессируют оба полипептида RQR8 и CAR, необходимо элиминировать возможные «ложно-позитивные» варианты, т.е. Т-клетки, которые не могут экспрессировать оба полипептида, прежде всего, ген суицида RQR8, позволяющий истощать сконструированные иммунные клетки в случае нежелательных воздействий.

Концепцию истощения Т-клеток в контексте аутоиммунного заболевания и трансплантации в течение десятилетий успешно воплощали на практике в клинических условиях. Для истощения клеточного иммунитета, включая Т-клетки, широко применяют иммунодепрессанты, такие как глюкокортикоиды или цитостатики, такие как алкилирующие агенты (циклофосфамид, нитрозомочевины, соединения платины, …) или антиметаболиты (метотрексат, азатиоприн, фторурацил, …). Однако, несмотря на их эффективность в качестве иммунодепрессантов, эти лекарственные средства не обладают избирательностью, поскольку воздействуют на пролиферацию всех Т- и В-клеток. Для предупреждения острых реакций отторжения, а также для направленного лечения лимфопролиферативных или аутоиммунных нарушений, в качестве быстрой и сильной иммуносупрессорной терапии иногда применяют антитела, в частности, моноклональные антитела к CD20. Элиминацию субпопуляций Т-клеток in vivo Benjamin и Waldmann (1986) применяли для определения роли CD4⁺-Т-клеток в создании гуморальных ответов на растворимые белки, a Cobbold с соавторами (1986) для определения роли CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток в отторжении аллотрансплантатов костного мозга и ткани. Широко применяли истощение in vivo для изучения различных аспектов, включая контроль противовирусных ответов цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) (Buller и др., 1987). Однако, антитела, которые применяли до настоящего времени на Т-клетках, направлены на антигены (CD3, CD4, CD52), которые все повсеместно присутствуют на покоящихся или активированных Т-клетках, а также на других типах клеток. Поэтому применение таких антител не может позволить осуществлять избирательное элиминирование сконструированных иммунных клеток, наделенных CAR.

Как представлено ниже в настоящем описании, при создании изобретения была создана система «все-в одном» («all-in-one»), которая позволяет осуществлять оптимизированную сортировку in vitro экспрессирующих CAR иммунных клеток путем снижения количества «ложно-позитивных» (клеток), позволяя при этом осуществлять in vivo истощение иммунных клеток, экспрессирующих указанные CAR, в случае нежелательного клинического явления.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), внеклеточный связывающий домен (scFv) которых модифицирован таким образом, чтобы можно было осуществлять как сортировку клеток, так и истощение клеток (см. фиг. 2, на которой проиллюстрирован вариант осуществления изобретения). Указанную структуру, обозначенную как МАт-направляемая система сортировки/истощения, создают путем встраивания отобранного эпитопа в scFv; указанный эпитоп имеет специфичность, распознаваемую специфическим антителом (предпочтительно МАт). Учитывая тот факт, что для включения эпитопа модифицируют главным образом внешний лигандсвязывающий домен CAR, можно рассматривать различные архитектуры CAR: одноцепочечную или многоцепочечную. Сам химерный scFv, предлагаемый в изобретении, который образован полипептидами VH и VL и специфическим(ими) эпитопом(ами), может иметь различные структуры в зависимости от положения, в которое встраивают эпитоп, и от применения линкеров. Настоящее изобретение относится также к разработанному на этой основе способу сортировки и/или истощения сконструированных иммунных клеток, наделенных модифицированными CAR.

Для создания такой системы можно применять несколько конъюгатов эпитоп-МАт; в частности, те, которые уже разрешены для клинического применения, такие, например, как (но не ограничиваясь только им) CD20/ритуксимаб.

Для дальнейшего повышения цитотоксичности сконструированных иммунных клеток эпитопспецифическое антитело можно конъюгировать с цитотоксическим лекарственным средством. Можно также усиливать CDC-цитотоксичность путем применения сконструированных антител, на которые «привит(ы)» компонент(ы) системы комплемента.

И, наконец, под объем изобретения подпадают терапевтические способы, в которых активацию сконструированных иммунных клеток, наделенных CAR, модулируют путем истощения клеток с использованием антитела, которое направлено на внешний лигандсвязывающий домен указанных CAR.

В целом, под объем изобретения подпадают следующие объекты:

1. Полипептид, который кодирует химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, специфическими в отношении антигена, где указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп.

2. Полипептид по п. 1, в котором указанный МАт-специфический эпитоп локализован между VH-цепью и VL-цепью.

3. Полипептид по п. 1 или п. 2, в котором указанные VH- и VL-цепи и МАт-специфический эпитоп связаны друг с другом с помощью по меньшей мере одного линкера и с трансмембранным доменом указанного CAR с помощью шарнира.

4. Полипептид по п. 3, в котором МАт-специфический эпитоп соединен с VH- и VL-цепями с помощью двух линкеров.

5. Полипептид по одному из п.п. 1-3, в котором МАт-специфический эпитоп представляет собой эпитоп, предназначенный для связывания эпитоп-специфическим МАт для in vitro сортировки клеток и/или in vivo клеточного истощения Т-клеток, экспрессирующих CAR, который содержит такой эпитоп.

6. Полипептид по одному из п.п. 1-5, в котором полипептид содержит один внеклеточный связывающий домен, где указанный внеклеточный связывающий домен дополнительно содержит шарнир, и где указанный полипептид дополнительно содержит

- трансмембранный домен, и

- внутриклеточный домен.

7. Полипептид по одному из п.п. 1-6, в котором внеклеточный связывающий домен содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 МАт-специфических эпитопов.

8. Полипептид по одному из п.п. 1-7, в котором внеклеточный связывающий домен содержит 1, 2, 3 или 4 МАт-специфических эпитопа.

9. Полипептид по одному из п.п. 1-8, в котором внеклеточный связывающий домен содержит 2, 3 или 4 МАт-специфических эпитопа.

10. Полипептид по одному из п.п. 1-9, в котором внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_xэпитоп3-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_x-;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₂;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂; или

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

где

V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_h или V₁ обозначает V_h и V₂ обозначает V_L;

L₁ обозначает линкер, пригодный для связывания V_H-цепи с V_L-цепью;

L обозначает линкер, содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L, присутствующего в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

x обозначает 0 или 1 и каждый из присутствующих x выбирают независимо от других; и

эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 представляют собой МАт-специфические эпитопы, и они могут быть идентичными или различными.

11. Полипептид по п. 10, в котором внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; эпитоп1-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3 или эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4,

где

V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_H или V₁ обозначает V_h и V₂ обозначает V_L;

L₁ обозначает любой линкер, который можно применять для связи V_H-цепи с V_L-цепью;

L обозначает линкер, содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 представляют собой МАт-специфические эпитопы, и они могут быть идентичными или различными.

12. Полипептид по п. 10, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин.

13. Полипептид по п. 12, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в которой n обозначает 1, 2, 3, 4 или 5, или линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly₄Ser)₄ или (Gly₄Ser)₃.

14. Полипептид по одному из п.п. 10-13, в котором L обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин.

15. Полипептид по п. 14, в котором L обозначает линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS или SGGGGSGGGGS.

16. Полипептид по п. 14, в котором L обозначает SGGGG, GGGGS или SGGGGS.

17. Полипептид по одному из п.п. 10-16, в котором эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4 независимо выбирают из МАт-специфических эпитопов, которые специфически распознаются ибритумомабом, тиоксетаном, муромонабом-CD3, тозитумомабом, абциксимабом, базиликсимабом, брентуксимаба ведотином, цетуксимабом, инфликсимабом, ритуксимабом, алемтузумабом, бевацизумабом, цертолизумаба пеголом, даклизумабом, экулизумабом, эфализумабом, гемтузумабом, натализумабом, омализумабом, паливизумабом, ранибизумабом, тоцилизумабом, трастузумабом, ведолизумабом, адалимумабом, белимумабом, канакинумабом, деносумабом, голимумабом, ипилимумабом, офатумумабом, панитумумабом, QBEND-10 или устекинумабом.

18. Полипептид по одному из п.п. 10-16, в котором эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4 независимо выбраны из МАт-специфических эпитопов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 144 или SEQ ID NO: 174.

19. Полипептид по одному из п.п. 10-18, в котором эпитоп 1 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

20. Полипептид по одному из п.п. 10-19, в котором эпитоп 2 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

21. Полипептид по одному из п.п. 10-20, в котором эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 144.

22. Полипептид по одному из п.п. 10-21, в котором эпитоп 4 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

23. Полипептид по п. 22, в котором эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 4 представляют собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, а эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.

24. Полипептид по одному из п.п. 1-9, в котором МАт-специфический эпитоп получен из полипептида, выбранного из полипептидов, которые перечислены в таблице 1.

25. Полипептид по одному из п.п. 1-9, в котором МАт-специфический эпитоп выбран из МАт-специфических эпитопов, которые специфически распознаются ибритумомабом, тиоксетаном, муромонабом-CD3, тозитумомабом, абциксимабом, базиликсимабом, брентуксимаба ведотином, цетуксимабом, инфликсимабом, ритуксимабом, алемтузумабом, бевацизумабом, цертолизумаба пеголом, даклизумабом, экулизумабом, эфализумабом, гемтузумабом, натализумабом, омализумабом, паливизумабом, ранибизумабом, тоцилизумабом, трастузумабом, ведолизумабом, адалимумабом, белимумабом, канакинумабом, деносумабом, голимумабом, ипилимумабом, офатумумабом, панитумумабом, QBEND-10 или устекинумабом.

26. Полипептид по одному из п.п. 1-9, в котором МАт-специфический эпитоп выбран из МАт-специфического эпитопа, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 144 или SEQ ID NO: 174.

27. Полипептид по одному из п.п. 1-9, в котором МАт-специфический эпитоп имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

28. Полипептид по одному из п.п. 1-27, в котором указанные VH- и VL-цепи имеют последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90% и более предпочтительно более чем на 95% последовательности антигена-мишени SEQ ID NO: 43 (антиген CD 19), SEQ ID NO: 44 (антиген CD38), SEQ ID NO: 45 (антиген CD123), SEQ ID NO: 46 (антиген CS1), SEQ ID NO: 47 (антиген BCMA), SEQ ID NO: 48 (антиген FLT-3), SEQ ID NO: 49 (антиген CD33), SEQ ID NO: 50 (антиген CD70), SEQ ID NO: 51 (антиген EGFR-3v) и SEQ ID NO: 52 (антиген WT1).

29. Полипептид по одному из п.п. 1-27, где указанный антиген представляет собой антиген-маркер клеточной поверхности.

30. Полипептид по одному из п.п. 1-27, где указанный антиген представляет собой ассоциированный с опухолью поверхностный антиген.

31. Полипептид по одному из п.п. 1-27, где указанный антиген выбран из ErbB2 (HER2/neu), карциноэмбрионального антигена (СЕА), молекулы адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), варианта III EGFR (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, дисиалоганглиозида GD2, GD3, лектинподобной молекулы-1 С-типа (CLL-1), дуктально-эпителиального муцина, gp36, TAG-72, гликосфинголипидов, глиома-ассоциированного антигена, β-субъединицы человеческого хорионического гонадотропина, альфафетопротеина (AFP), лектин-реактивной фракции AFP, тироглобулина, RAGE-1, MN-CA IX, человеческой теломеразной обратной транскриптазы, RU1, RU2 (AS), кишечной карбоксилэстеразы, mut hsp70-2, М-CSF, простазы, простатспецифического антигена (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1а, р53, простеина, PSMA, сурвивина и теломеразы, антигена-1 карциномы простаты (РСТА-1), MAGE, ELF2M, эластазы нейтрофилов, эфрина В2, CD22, инсулинподобного фактора роста (IGF1)-I, IGF-II, рецептора IGFI, мезотелина, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), презентирующей опухольспецифический пептидный эпитоп, 5Т4, ROR1, Nkp30, NKG2D, антигенов стромы опухоли, экстрадомена A (EDA) и экстрадомена В (EDB) фибронектина и домена А1 тенасцина-С (TnC А1) и фибробласт-ассоциированного белка (fap), LRP6, меланома-ассоциированного хондроитинсульфатпротеогликана (MCSP), CD38/CS1, MARTI, WT1, MUC1, LMP2, идиотипа, NY-ESO-1, мутанта Ras, gp100, протеиназы 3, bcr-abl, тирозиназы, hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, андрогенного рецептора; линиеспецифического дифференцировочного или тканеспецифического антигена, такого как CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD70, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD133, CD138, CTLA-4, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), эндоглина, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), ВСМА (CD269, TNFRSF 17) или FLT-3.

32. Полипептид по одному из п.п. 1-27, в котором VH и VL выбраны из VH, имеющей SEQ ID NO: 65, и VL, имеющей SEQ ID NO: 66; VH, имеющей SEQ ID NO: 67, и VL, имеющей SEQ ID NO: 68; VH, имеющей SEQ ID NO: 69, и VL, имеющей SEQ ID NO: 70; VH, имеющей SEQ ID NO: 71, и VL, имеющей SEQ ID NO: 72; VH, имеющей SEQ ID NO: 77, и VL, имеющей SEQ ID NO: 78; VH, имеющей SEQ ID NO: 79, и VL, имеющей SEQ ID NO: 80; VH, имеющей SEQ ID NO: 81, и VL, имеющей SEQ ID NO: 82; VH, имеющей SEQ ID NO: 83, и VL, имеющей SEQ ID NO: 84; VH, имеющей SEQ ID NO: 85, и VL, имеющей SEQ ID NO: 86; VH, имеющей SEQ ID NO: 87, и VL, имеющей SEQ ID NO: 88; VH, имеющей SEQ ID NO: 89, и VL, имеющей SEQ ID NO: 90; VH, имеющей SEQ ID NO: 91, и VL, имеющей SEQ ID NO: 92; VH, имеющей SEQ ID NO: 93, VL, имеющей SEQ ID NO: 94; VH, имеющей SEQ ID NO: 95, VL, имеющей SEQ ID NO: 96; VH, имеющей SEQ ID NO: 97, и VL, имеющей SEQ ID NO: 98; VH, имеющей SEQ ID NO: 99, и VL, имеющей SEQ ID NO: 100; VH, имеющей SEQ ID NO: 101, и VL, имеющей SEQ ID NO: 102; VH, имеющей SEQ ID NO: 103, и VL, имеющей SEQ ID NO: 104; VH, имеющей SEQ ID NO: 105, и VL, имеющей SEQ ID NO: 106; VH, имеющей SEQ ID NO: 107, и VL, имеющей SEQ ID NO: 108; VH, имеющей SEQ ID NO: 109, и VL, имеющей SEQ ID NO: 110; VH, имеющей SEQ ID NO: 111, и VL, имеющей SEQ ID NO: 112; VH, имеющей SEQ ID NO: 113, и VL, имеющей SEQ ID NO: 114; VH, имеющей SEQ ID NO: 115, и VL, имеющей SEQ ID NO: 116; VH, имеющей SEQ ID NO: 117, и VL, имеющей SEQ ID NO: 118; VH, имеющей SEQ ID NO: 119, и VL, имеющей SEQ ID NO: 120; VH, имеющей SEQ ID NO: 121, и VL, имеющей SEQ ID NO: 122; или VH, имеющей SEQ ID NO: 123, и VL, имеющей SEQ ID NO: 124, VH, имеющей SEQ ID NO: 170, и VL, имеющей SEQ ID NO: 171; VH, имеющей SEQ ID NO: 172, и VL, имеющей SEQ ID NO: 173; или VH, имеющей SEQ ID NO: 174, и VL, имеющей SEQ ID NO: 175.

33. Полипептид по одному из п.п. 2-32, в котором шарнир представляет собой шарнир PD-1, шарнир IgG4, шарнир CD8альфа или шарнир FcγIIIальфа.

34. Полипептид по одному из п.п. 2-33, в котором трансмембранный домен содержит трансмембранную(ые) область(и) альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, PD-1, 4-1ВВ, ОХ40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2В4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154.

35. Полипептид по одному из п.п. 2-33, в котором трансмембранный домен содержит трансмембранную(ые) область(и) PD-1 или CD8альфа.

36. Полипептид по одному из п.п. 2-33, в котором трансмембранный домен содержит трансмембранную(ые) область(и) CD8альфа.

37. Полипептид по одному из п.п. 2-36, в котором внутриклеточный домен содержит сигнальный домен CD3дзета.

38. Полипептид по одному из п.п. 2-37, в котором внутриклеточный домен содержит домен 4-1ВВ.

39. Полипептид по одному из п.п. 1-38, в котором CAR представляет собой одноцепочечный CAR.

40. Полипептид по п. 1, где указанный полипептид идентичен более чем на 80%, более чем на 90%, более чем на 95% или полностью идентичен SEQ ID NO: 1-10, SEQ ID NO: 125-141 или SEQ ID NO: 145-150, или SEQ ID NO: 152-169.

41. Полипептид по одному из п.п. 1-38, в котором CAR представляет собой многоцепочечный CAR.

42. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по одному из п.п. 1-41.

43. Полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по одному из п.п. 1-41, где указанный CAR содержит сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.

44. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 42 или п. 43.

45. Сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая на своей клеточной поверхности полипептид по одному из п.п. 1-41.

46. Сконструированная иммунная клетка по п. 45, где указанная клетка получена из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов.

47. Сконструированная иммунная клетка по п. 45 или п. 46, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства.

48. Способ конструирования иммунной клетки по одному из п.п. 45-47, включающий:

(а) получение иммунной клетки;

(б) интродукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего химерный антигенный рецептор по одному из п.п. 1-41.

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

49. Способ конструирования иммунной клетки по п. 48, в котором иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

50. Способ in vitro сортировки сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид, который содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, по одному из п.п. 1-41, включающий

- приведение в контакт популяции иммунных клеток, содержащей указанные сконструированные иммунные клетки, с моноклональным антителом, специфическим в отношении МАт-специфического эпитопа;

- отбор клеток, которые связываются с моноклональным антителом, для получения популяции клеток, обогащенной сконструированными иммунными клетками.

51. Способ по п. 50, в котором моноклональное антитело, специфическое в отношении МАт-специфического эпитопа, конъюгируют с флуорофором и стадию отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, осуществляют с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS).

52. Способ по п. 50, в котором моноклональное антитело, специфическое в отношении МАт-специфического эпитопа, конъюгируют с магнитной частицей и стадию отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, осуществляют с помощью клеточного сортера с магнитной активацией (MACS).

53. Способ по одному из п.п. 50-52, в котором полипептид содержит МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и моноклональное антитело представляет собой ритуксимаб.

54. Способ по одному из п.п. 50-52, в котором полипептид содержит МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, и антитело, применяемое для контакта с популяцией иммунных клеток, представляет собой QBEND-10.

55. Способ по одному из п.п. 50-54, в котором популяция клеток, обогащенная сконструированными иммунными клетками, содержит по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% экспрессирующих CAR иммунных клеток.

56. Способ in vivo истощения сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих на своей поверхности полипептид, который содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, по одному из п.п. 1-41, в организме пациента, включающий приведение в контакт указанной сконструированной иммунной клетки по меньшей мере с одним эпитоп-специфическим в отношении эпитопа МАт.

57. Способ по п. 56, в котором МАт-специфический эпитоп представляет собой эпитоп или мимеотоп CD20 и специфическое в отношении эпитопа МАт представляет собой ритуксимаб.

58. Способ по п. 57, в котором МАт-специфический эпитоп имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

59. Способ по одному из п.п. 56-58, в котором специфическое в отношении эпитопа МАт конъюгировано с молекулой, обладающей способностью активировать систему комплемента.

60. Способ по одному из п.п. 56-59, в котором цитотоксическое лекарственное средство конъюгировано со специфическим в отношении эпитопа МАт.

61. Способ in vivo истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид, который содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, по одному из 1-41, в организме пациента, включающий приведение в контакт указанной сконструированной иммунной клетки с биспецифическим МАт (BsAb), обладающим способностью связываться и с МАт-специфическим эпитопом, присутствующим на указанной клетке, и с поверхностным антигеном, присутствующим на эффекторной (и цитотоксической) клетке.

62. Способ по одному из п.п. 48-61, в котором указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

Краткое описание чертежей и таблиц

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схематическое изображение структуры системы МАт-направляемой сортировки/истощения, предлагаемой в изобретении, в данном случае основанной на использовании в качестве каркаса одноцепочечного CAR; представлены несколько конфигураций химерного scFv с различными положениями VH-, VL-цепей и МАт-специфического эпитопа;

на фиг. 2 - схема процедур клеточной сортировки и истощения клеток, осуществляемых с использованием МАт-направляемой системы, предлагаемой в изобретении. Добавление специфического МАт (± комплемент) позволяет осуществлять очистку CAR⁺-T-клеток путем распознавания их эпитопа в химерном scFv. В процессе осуществления стадии истощения клеток то же самое специфическое МАт (± комплемент) в результате его связывания с его специфическим эпитопом, присутствующем в химерном scFv, индуцирует специфический лизис CAR⁺-T-клеток;

на фиг. 3 - схема процедуры истощения клеток с использованием биспецифического антитела. Посредством связывания как с экспрессирующей CAR иммунной клеткой, так и с эффекторной клеткой, рассматриваемая система позволяет осуществлять рекрутмент эффекторных клеток на поверхность экспрессирующей CAR иммунной клетки и инициирует их специфическое истощение in vivo;

на фиг. 4 - архитектура CAR для 10 экспрессирующих CAR анти-CD123 scFv с мимеотопом(ами) CD20, которые применяли в примерах 1-2. Создавали серию из 10 химерных scFv, в которые встраивали одну или две копии мимеотопов CD20 (черный прямоугольник, обозначенный как «мимеотоп») между анти-CD123 scFv и шарниром. Как проиллюстрировано на фиг. 4, все 10 CAR имели одинаковый шарнир (шарнир CD8), трансмембранный домен (ТМ CD8), костимуляторный домен (4-1ВВ) и стимуляторный домен (ITAM CD3дзета). Последовательности SEQ ID NO: 1-10 содержат лидерную последовательность MALPVTALLLPLALLLHAARP, которая присутствует, когда CAR экспрессируется впервые, но которая не является частью CAR, экспрессируемого на поверхности клетки.

В зависимости от положения мимеотопа(ов) относительно scFv, создавали 3 серии CAR (анти-CD123 №1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, соответствующие SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 соответственно):

- первая серия: SEQ ID NO: 1-2 и SEQ ID NO: 3-4 соответствуют конформациям, в которых один и два мимеотоп(а) CD20 соответственно встроен(ы) между анти-CD123 scFv и шарниром; в SEQ ID NO: 2 GS-линкер соединяет мимеотоп CD20 с шарниром. В SEQ ID NO: 3-4, GS-линкер разположен между двумя мимеотопами, а в SEQ ID NO: 4 присутствует еще один GS-линкер между мимеотопами и шарниром;

- вторая серия: SEQ ID NO: 5-6 соответствуют коформациям, в которых одна копия мимеотопа CD20 встроена в анти-CD123 scFv; разница в последовательсностях обусловлена присутствием короткого GS-линкера (SEQ ID NO: 5) и длинного GS-линкера (SEQ ID NO: 6) соответсвенно, расположенного с обеих сторон;

- третья серия: SEQ ID NO: 7-10 соответствуют коформациям, в которых анти-CD123 scFv расположен между мимеотопом(ами) CD и шарниром. В SEQ ID NO: 7-8 и SEQ ID NO: 9-10 встроены одна копия и две копии мимеотопа CD20 соответственно. GS-линкер встроен между 2 мимеотопами CD20, а в случае SEQ ID NO: 10 дополнительный GS-линкер соединяет мимеотопы с анти-CD123 scFv;

на фиг. 5 - проиллюстрирована цитолитическая активность Т-клеток, экспрессирующих анти-CD123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 1-4 или 142, или контрольной Т-клетки, не экспрессирующей никакой анти-CD123 CAR (Т-клетка-«пустышка» - стадию трансфекции осуществляли без какой-либо мРНК). Цитолитическую активность оценивали по частоте специфического лизиса клеток, как подробно описано в примере 1;

на фиг. 6 - результат анализа CDC, в котором Т-клетки, экспрессирующие анти-CD123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 1-4, или контрольную Т-клетку, не экспрессирующую никакой анти-CD123 CAR (Т-клетка-«пустышка» (стадию трансфекции осуществляли без какой-либо мРНК)) инкубировали с ритуксимабом (RTX) и комплементом детеныша кролика (BRC). Результаты выражали в виде относительной частоты встречаемости жизнеспособных клеток среди анти-CD123 CAR-позитивных Т-клеток (по сравнению с результатами контрольного эксперимента), как подробно описано в примере 3;

на фиг. 7А, 7Б и 7В - общая структура CAR, имеющих SEQ ID NO: 125-141, которые конструировали и тестировали как описано в примерах 4-6. Во всех указанных CAR применяли анти-ВСМА scFV. Один, два, три или четыре эпитопа, выбранные из мимеотопа CD20 (черный прямоугольник, обозначенный как «мимеотоп») и/или эпитопа CD34 (серый прямоугольник, обозначенный как «CD34») встраивали в различные положения, а именно, в прямом направлении относительно scFv, в обратном направлении относительно scFv или между вариабельными цепями (обозначены как V1 и V2). Как продемонстрировано на фиг. 7, все CAR имели одинаковый шарнир (шарнир CD8), трансмембранный домен (ТМ CD8), костимуляторный домен (4-1ВВ) и стимуляторный домен (ITAM CD3дзета);

на фиг. 8А и 8Б - результат анализа CDC, в котором Т-клетки, экспрессирующие анти-ВСМА CAR, имеющий SEQ ID NO: 125 или 130-141, инкубировали с RTX и BRC. Результаты выражали в виде относительной частоты встречаемости жизнеспособных клеток среди анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток (по сравнению с результатами контрольного эксперимента), как подробно описано в примере 4;

на фиг. 9 - цитолитическая активность Т-клеток, экспрессирующих анти-ВСМА CAR, имеющий SEQ ID NO: 125 или 130-139, или контрольной Т-клетки, не экспрессирующей никакой анти-ВСМА CAR (Т-клетка). Цитолитическую активность выражали в виде частоты встречаемости жизнеспособных Н929-клеток как подробно описано в примере 4;

на фиг. 10А - частота встречаемости Т-клеток, которые экспрессируют CAR, имеющий SEQ ID NO: 128, содержащий эпитоп CD34 и два мимеотопа CD20, до или после очистки с использованием набора CD34 MicroBead®, или в проточной фракции;

на фиг. 10Б - количество Т-клеток, которые экспрессируют CAR, имеющий SEQ ID NO: 128, содержащий эпитоп CD34, до или после очистки с использованием набора CD34 MicroBead®, или в проточной фракции;

на фиг. 11 - концентрация INFгамма, продуцируемого Т-клеткой, которая экспрессирует анти-ВСМА CAR, имеющий SEQ ID NO: 125 или 130-139, в присутствии RTX, фитогемагглютинина (РНА) или в отсутствии и RTX и РНА;

на фиг. 12 - частота встречаемости CAR-позитивных Т-клеток, полученная путем обнаружения Т-клеток, которые экспрессируют CAR, имеющие SEQ ID NO: 125 или 130-139, с использованием слитого белка BCMA-Fc и меченого антитела к Fc или RTX и меченого антитела к Fc;

на фиг. 13 - частота встречаемости CAR-позитивных Т-клеток, полученная путем обнаружения Т-клеток, которые экспрессируют CAR, имеющие SEQ ID NO: 128, с использованием RTX и меченого антитела к Fc или меченого антитела QBEND-10;

на фиг. 14А и 14Б - результаты обнаружения Т-клеток, которые экспрессируют ВСМА CAR, имеющие SEQ ID NO: 145 (ВС30, дикий тип), 146 (LM), 147 (LML), 148 (LMLM) и 149 (LMLML), которые содержат мимеотопы CD20, с помощью проточной цитометрии. CAR-T-клетки обнаруживали с помощью проточной цитометрии с использованием либо растворимого биотинилированного белка ВСМА и затем конъюгированного с РЕ стрептавидина (sBCMA-биотин (РЕ)), либо антитела к CD20 ритуксимаба и затем конъюгированного с ФИТЦ античеловеческого IgG (ритуксимаб (ФИТЦ));

на фиг. 15 - результаты обнаружения Т-клеток, не трансдуцированных, трансдуцированных лентивирусом для совместной экспрессии анти-ВСМА CAR, имеющего SEQ ID NO: 145, и RQR8 (SEQ ID NO: 150) (BC30-RQR8), или ВСМА CAR, имеющих SEQ ID NO: 149, который содержит мимеотопы CD20, с помощью проточной цитометрии. CAR-T-клетки обнаруживали с помощью проточной цитометрии с использованием либо растворимого биотинилированного белка ВСМА и затем конъюгированного с РЕ стрептавидина (sBCMA-биотин (РЕ)), либо антитела к CD20 ритуксимаба и затем конъюгированного с ФИТЦ антитела к человеческому IgG (ритуксимаб (ФИТЦ));

на фиг. 16 - результат анализа CDC, в котором Т-клетки, экспрессирующие анти-ВСМА CAR, котгорый имеет SEQ ID NO: 149 (BC30-R2), анти ВСМА CAR, который имеет SEQ ID NO: 145, или совместно экспрессирующие анти-ВСМА CAR, который имеет SEQ ID NO: 145, и RQR8 (SEQ ID NO: 150) (BC30-RQR8), инкубировали с RTX и BRC. Процент цитотоксичности определяли с помощью анализа методом проточной цитометрии с использованием биотинилированного белка ВСМА. Результаты выражали в виде частоты клеточного лизиса в популяции анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток по сравнению с контролем (с клетками, инкубированными только с BRC);

на фиг. 17 - цитолитическая активность Т-клеток, которые экспрессируют анти-ВСМА CAR, имеющий SEQ ID NO: 149 (BC30-R2), или совместно экспрессируют анти-ВСМА CAR, имеющий SEQ ID NO: 145 (ВС30), и RQR8 (SEQ ID NO: 150) (BC30-RQR8), в присутствии/отсутствии RTX. Цитолитическую активность выражали в виде процента лизиса клеток, рассчитанного как описано в примере 7.5, и ее определяли при различных соотношениях эффекторные клетки (CAR-T-клетки):клетки-мишени (клетки MM1S, экспрессирующие ВСМА);

на фиг. 18 - процент активированных Т-клеток, которые экспрессируют анти-ВСМА CAR, имеющий SEQ ID NO: 149, в присутствии ЗФР (контроль), антитела к CD3 OKT3 (αCD3) или ритуксимаба (RTX). Активацию Т-клеток оценивали путем измерения экспрессии маркеров активации CD25 и CD69 с помощью проточной цитометрии.

В таблице 1 представлен перечень разрешенных для фармацевтических целей МАт и их антигенов-мишеней. Представлены последовательности последних, а также эпитопа(ов) некоторых из них;

В таблице 2 представлен перечень некоторых мимеотопов и эпитопов, соответствующих им МАт, которые представлены в примере 2;

В таблице 3 представлен перечень VH- и VL-цепей scFv, мишенью которых являются антигены CD19, CD33, 5Т4, ROR1, EGFRvIII, ВСМА, CS1 и CD123;

В таблице 4 представлены примеры последовательности компонентов CAR.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к полипептиду, который кодирует химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, которые являются специфическими в отношении антигена, предпочтительно антигена-маркера клеточной поверхности, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп. В одном из вариантов осуществления изобретения МАт-специфический эпитоп представляет собой эпитоп, предназначенный для связывания со специфическим в отношении эпитопа МАт, для осуществления in vitro клеточной сортировки и/или in vivo клеточного истощения Т-клеток, которые экспрессируют CAR, содержащий такой эпитоп.

Изобретение относится к полипептиду, который кодирует химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, которые являются специфическими в отношении антигена-маркера клеточной поверхности, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, предназначенный для связывания специфическим в отношении эпитопа МАт, для осуществления in vitro клеточной сортировки и/или in vivo клеточного истощения Т-клеток, которые экспрессируют указанный CAR.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к CAR, который содержит

- внеклеточный домен, содержащий

- по меньшей мере один, предпочтительно один, внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, которые являются специфическими в отношении антигена, предпочтительно антигена-маркера клеточной поверхности, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, и

- шарнир,

- трансмембранный домен и

- внутриклеточный домен.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к CAR, который содержит

- внеклеточный домен, содержащий

- по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, которые являются специфическими в отношении антигена-маркера клеточной поверхности, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, предназначенный для связывания специфическим в отношении эпитопа МАт, для осуществления in vitro клеточной сортировки и/или in vivo клеточного истощения Т-клеток, которые экспрессируют указанный CAR, и

- шарнир,

- трансмембранный домен и

- внутриклеточный домен.

В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретение содержит один внеклеточный связывающий домен.

Понятие «химерный scFv» обозначает полипептид, который соответствует одноцепочечному вариабельному фрагменту, состоящему из тяжелой и легкой цепей (V_h и V_l соответственно) и эпитопа, который исходно не был включен в указанные V_h- и V_l-цепи. Указанный эпитоп обозначают как «МАт-специфический эпитоп», когда он обладает способностью специфически связываться антителом, в частности, моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения МАт-специфический эпитоп не представляет собой эпитоп, распознаваемый scFv. В некоторых вариантах осуществления изобретения МАт-специфический эпитоп не происходит из внеклеточного домена CAR. Компоненты указанного химерного scFv (т.е. вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепи лигандсвязывающего домена и МАт-специфический эпитоп) могут быть соединены друг с другом с помощью по меньшей мере одного линкера, как правило, гибкого линкера. Эти компоненты, как правило, соединены с трансмембранным доменом CAR с помощью шарнира.

Конформации химерного scFv

Химерный scFv, предлагаемый в изобретении, может иметь различную структуру в зависимости от положения его основных компонентов (V_h и V_l и МАт-специфического эпитопа), что проиллюстрировано на фиг. 1.

Химерный scFv, предлагаемый в изобретении, может иметь несколько конформаций, по меньшей мере 9, если учитывать количество возможных перестановок одного V_h, одного V_l и одного эпитопа.

Предпочтительно каждый компонент (VH, VL и эпитоп) соединен с его соседом(ами) с помощью по меньшей мере одного гибкого линкера из числа описанных выше. Пригодные согласно изобретению комбинации представляют собой комбинации, которые обеспечивают хорошую аффинность/специфичность связывания в двух областях: между МАт-специфическим эпитопом и введенным путем инфузии МАт, и между VH- и VL-цепями химерного scFv и антигеном лиганда клетки-мишени.

В одном из вариантов осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен CAR содержит по меньшей мере два линкера, которые оба соединяют эпитоп с VH- и VL-цепями; и шарнир, соединяющий scFv-эпитоп с трансмембранным доменом CAR.

Например, если спроектированная конформация CAR такова, что МАт-специфический эпитоп расположен рядом с VH- и VL-цепями, то скрининг проводят путем осуществления экспрессии CAR и тестирования в отношении цитотоксичности и/или истощения МАт.

Когда МАт-специфический эпитоп предполагают помещать между VH- и VL-цепями, то скрининг можно осуществлять с помощью фагового дисплея перед осуществлением тестирования и/или кратковременной экспрессии конструкции CAR. Это можно достигать путем трансфекции мРНК, что является достаточным для первичного тестирования цитотоксичности и/или истощения с использованием МАт.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 МАт-специфических эпитопов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 МАт-специфических эпитопов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит 1, 2 или 3 МАт-специфических эпитопа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда внеклеточный связывающий домен содержит несколько МАт-специфических эпитопов, все МАт-специфические эпитопы являются идентичными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда внеклеточный связывающий домен содержит несколько МАт-специфических эпитопов, МАт-специфические эпитопы не являются идентичными. Например, внеклеточный связывающий домен может содержать три МАт-специфических эпитопа, два из которых являются идентичными, а третий отличным от них.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит VH, VL и один или несколько МАт-специфических эпитопов, предпочтительно 1, 2 или 3, более предпочтительно 2 или 3 МАт-специфических эпитопа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность (N-конец находится слева):

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x; V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x; V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x; (L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂; (L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x-V₁-L₁-V₂; (L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_x; (L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x; (L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_x; (L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x; (L)_х-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_x; V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂; V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x; V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x; V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_x; (L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_х-эпитоп2-(L)_x-V₂; (L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_х-эпитоп2-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L;

V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; эпитоп1-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3 или эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4.

где

V₁ и V₂ обозначают V_h и V_l ScFv (т.е. V_L обозначает V_L и V₂ обозначает V_h или V₁ обозначает V_h и V₂ обозначает V_l);

L₁ обозначает любой линкер, пригодный для связывания V_H-цепи с V_L-цепью в ScFv;

L обозначает линкер, предпочтительно содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L, присутствующего в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

x обозначает 0 или 1 и каждый из присутствующих x выбирают независимо от других; и

эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 представляют собой МАт-специфические эпитопы, и они могут быть идентичными или различными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточные связывающие домены содержат следующую последовательность (N-конец находится слева):

V_H-L₁-V_L-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L; L-эпитоп1-L-V_H-L-эпитоп2-L-V_L-L-эпитоп3-L; V_L-L¹-V_H-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L; или L-эпитоп1-L-V_L-L-эпитоп2-L-V_H-L-эпитоп3-L,

где L, L₁, эпитоп1, эпитоп2 и эпитоп3 имеют указанные выше значения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L₁ обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин. В некоторых вариантах осуществления изобретения L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в которой n обозначает 1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения L₁ обозначает (Gly₄Ser)₄ or (Gly₄Ser)₃.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L обозначает гибкий линкер, предпочтительно содержащий глицин и/или серин. В некоторых вариантах осуществления изобретения L имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS или SGGGGSGGGGS предпочтительно SGG, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS или SGGGGSGGGGS. В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда внеклеточный связывающий домен содержит несколько L, все L являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда внеклеточный связывающий домен содержит несколько L, не все L являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления изобретения L обозначает SGGGGS. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит несколько L и все L обозначают SGGGGS.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 являются идентичными или различными, и их выбирают из МАт-специфических эпитопов, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 144 или SEQ ID NO: 174.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 являются идентичными или различными и их выбирают из МАт-специфических эпитопов, которые специфически распознаются ибритумомабом, тиоксетаном, муромонабом-CD3, тозитумомабом, абциксимабом, базиликсимабом, брентуксимаба ведотином, цетуксимабом, инфликсимабом, ритуксимабом, алемтузумабом, бевацизумабом, цертолизумаба пеголом, даклизумабом, экулизумабом, эфализумабом, гемтузумабом, натализумабом, омализумабом, паливизумабом, ранибизумабом, тоцилизумабом, трастузумабом, ведолизумабом, адалимумабом, белимумабом, канакинумабом, деносумабом, голимумабом, ипилимумабом, офатумумабом, панитумумабом, QBEND-10 или устекинумабом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 1 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 2 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 4 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 2 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один из следующих эпитопов: эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4 представляет собой эпитоп CD34, предпочтительно эпитоп, имеющий SEQ ID 144. В некоторых вариантах осуществления изобретения один из следующих эпитопов: эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4 представляет собой эпитоп CD34, предпочтительно эпитоп, имеющий SEQ ID 144, а другие МАт-специфические эпитопы представляют собой мимеотопы CD20, предпочтительно мимеотоп, имеющий SEQ ID NO: 35.

Встроенный МАт-специфический эпитоп

Согласно изобретению эпитоп, предназначенный для встраивания в химерный scFv, является специфическим для моноклонального антитела (МАт), которое применяют для осуществления процессов клеточной сортировки и/или истощения клеток.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения интродуцированный в химерный scFv эпитоп выбирают в качестве компонента пары МАт-специфический эпитоп/специфическое в отношении эпитопа МАт с учетом разрешения Национальных агентств здравоохранения (National Health Agencies) на их применение исходя из нормативных требований/безопасности. Такие пары представлены в приведенной ниже таблице 1.

Таблица 2: Примеры МАт-специфических эпитопов (и соответствующих им МАт), которые можно применять во внеклеточном связывающем домене CAR, предлагаемого в изобретении, такие, например, как мимеотопы и эпитоп с соответствующими им МАт, которые применяли в Примерах 1-2

В предпочтительном варианте осуществления изобретения эпитоп, интродуцированный в химерный scFv представляет собой эпитоп антигена CD20, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 35, а вводимое путем инфузии МАт, которое применяют для нацеливания на него для цели(ей) сортировки и/или истощения, представляет собой ритуксимаб.

В некоторых вариантах осуществления изобретения МАт-специфический эпитоп имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 144 или SEQ ID NO: 174.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен CAR, предлагаемого в изобретении, содержит один МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 35, два МАт-специфических эпитопа, имеющих SEQ ID NO: 35, три МАт-специфических эпитопа, имеющих SEQ ID NO: 35, один МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 35 и один МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 144, два МАт-специфических эпитопа, имеющих SEQ ID NO: 35, и один МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 144, три МАт-специфических эпитопа, имеющих SEQ ID NO: 35, и один МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 144.

Согласно другому варианту осуществления изобретения эпитоп представляет собой мимеотоп. В качестве макромолекулы, часто пептида, который имитирует структуру эпитопа, преимуществом мимеотопа является меньший по сравнению с обычным эпитопом размер, и это является ценным для неконформационной последовательности и повышает простоту воспроизводства в длинном полипептиде, таком как CAR. Для некоторых МАт, разрешенных для применения в качестве фармацевтических средств, мимеотопы являются известными, например, два состоящих из 10 аминокислот пептида для цетуксимаба (Riemer и др., 2005), или состоящий из 24 ак пептид для паливизумаба (Arbiza и др., 1992). Поскольку эти мимеотопы можно идентифицировать с помощью фагового дисплея, то можно использовать некоторые из них для получения последовательности, которая не нарушают scFv этого же МАт. Кроме того, их применение может повышать комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

scFv

Понятие «внеклеточный лигандсвязывающий домен» в контексте настоящего описания обозначает олиго- или полипептид, который обладает способностью связываться с лигандом. Предпочтительно указанный домен должен обладать способностью взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, можно выбирать внеклеточный лигандсвязывающий домен для распознавания лиганда, который действует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Так, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут действовать в качестве лигандов, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками. В частности, внеклеточный лигандсвязывающий домен может содержать антигенсвязывающий домен, полученный из антитела к антигену мишени. Примером антигена мишени может служить (но не ограничиваясь только им) описанный выше опухоль-ассоциированный поверхностный антиген. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен представляет собой описанный выше внеклеточный лигандсвязывающий домен. Согласно настоящему изобретению указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), содержащий вариабельный фрагмент легкой (V_L) и тяжелой (V_H) цепи специфического в отношении антигена-мишени моноклонального антитела, и МАт-специфический эпитоп антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), содержащий вариабельный фрагмент легкой (V_L) и тяжелой (V_H) цепи специфического в отношении поверхностного антигена клетки-мишени моноклонального антитела.

Можно применять также связывающий домен, отличный от scFv, для заранее определенного нацеливания лимфоцитов, например (но не ограничиваясь только ими), фрагменты однодоменных верблюжьих антител, рецепторные лиганды типа полипептида сосудистого эндотелиального фактора роста, интегринсвязывающий пептид, херегулин или мутеин IL-13, антителосвязывающие домены, гипервариабельные петли или CDR антитела.

В другом варианте осуществления изобретения указанный внеклеточный связывающий домен может представлять собой DARPin (сконструированный белок с анкириновыми повторами). DARPin представляют собой сконструированные методами генной инженерии белки-миметики антитела, как правило, обладающие высокой специфичностью и высокой аффинностью связывания с белками-мишенями. Их получают из встречающихся в естественных условиях анкириновых белков, и они содержат по меньшей мере три, как правило, четыре или пять повторяющихся мотивов указанных белков. DARPin представляют собой малые однодоменные белки, которые можно отбирать так, чтобы они связывались с любым рассматриваемым белком-мишенью с высокой аффинностью и специфичностью (Ера, Dolezal и др. 2013; Friedrich, Hanauer и др. 2013; Jost, Schilling и др. 2013). Согласно настоящему изобретению DARPin можно создавать так, чтобы они содержали несколько сайтов распознавания антигена. Таким образом, указанные DARPin можно применять для распознавания серии последовательных различных антигенов, а также одного антигена. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу, включающему получение иммунной клетки и экспрессию на поверхности указанной иммунной клетки химерного антигенного рецептора, который содержит сконструированный белок, содержащий анкириновые повторы, который обладает способностью распознавать по меньшей мере один специфический лиганд, предпочтительно два специфических лиганда.

Примерами лиганда мишени или антигена, распознаваемого внеклеточным связывающим доменом, предпочтительно scFv, могут служить (но не ограничиваясь только ими) ассоциированный с опухолью поверхностный антиген, такой как ErbB2 (HER2/neu), карциноэмбриональный антиген (СЕА), молекула адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), вариант III EGFR (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, дисиалоганглиозид GD2, GD3, лектинподобная молекула-1 С-типа (CLL-1), дуктально-эпителиальный муцин, gp36, TAG-72, гликосфинголипиды, глиома-ассоциированный антиген, β-субъединица человеческого хорионического гонадотропина, альфафетопротеин (AFP), лектин-реактивная фракция AFP, тироглобулин, RAGE-1, MN-CA IX, человеческая теломеразная обратная транскриптаза, RU1, RU2 (AS), кишечная карбоксилэстераза, mut hsp70-2, М-CSF, простаза, простатспецифический антиген (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, р53, простеин, PSMA, сурвивин и теломераза, антиген-1 карциномы простаты (РСТА-1), MAGE, ELF2M, эластаза нейтрофилов, эфрин В2, CD22, инсулинподобный фактор роста (IGF1)-I, IGF-II, рецептор IGFI, мезотелин, молекула главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), презентирующая опухольспецифический пептидный эпитоп, 5Т4, ROR1, Nkp30, NKG2D, антигены стромы опухоли, экстрадомен A (EDA) и экстрадомен В (EDB) фибронектина и домен А1 тенасцина-С (TnC А1) и фибробласт-ассоциированный белок (fap), LRP6, меланома-ассоциированный хондроитинсульфатпротеогликан (MCSP), CD38/CS1, MARTI, WT1, MUC1, LMP2, идиотип, NY-ESO-1, мутант Ras, gp100, протеиназа 3, bcr-abl, тирозиназа, hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, андрогенный рецептор; линиеспецифический дифференцировочный или тканеспецифический антиген, такой как CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD70, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD133, CD138, CTLA-4, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), эндоглин, молекула главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), ВСМА (CD269, TNFRSF 17) или FLT-3, или вирус-специфический поверхностный антиген, такой как HIV-специфический антиген (такой как HIV gp120); EBV-специфический антиген, CMV-специфический антиген, HPV-специфический антиген, специфический в отношении вируса Ласса антиген, специфический в отношении вируса гриппа антиген, а также любое производное или вариант этих поверхностных маркеров. В конкретных случаях лиганд, который распознает химерный антигенный рецептор, присутствует на поверхности клетки-мишени, в частности, раковой клетки или вирусной клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганд, который распознает химерный антигенный рецептор, присутствует в микроокружении опухоли. В некоторых объектах изобретения лиганд, который распознает химерный антигенный рецептор, представляет собой фактор роста.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанные VH- и VL-цепи имеют последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90% и более предпочтительно более чем на 95% последовательности антигена-мишени SEQ ID NO: 43 (антиген CD 19), SEQ ID NO: 44 (антиген CD38), SEQ ID NO: 45 (антиген CD123), SEQ ID NO: 46 (антиген CS1), SEQ ID NO: 47 (антиген ВСМА), SEQ ID NO: 48 (антиген FLT-3), SEQ ID NO: 49 (антиген CD33), SEQ ID NO: 50 (антиген CD70), SEQ ID NO: 51 (антиген EGFR-3v), SEQ ID NO: 52 (антиген WT1).

В одном из более предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанные VH- и VL-цепи имеют последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90% и более предпочтительно более чем на 95% последовательности антигена-мишени SEQ ID NO: 53-64 (антиген CD19), SEQ ID NO: 65-76 (антиген CD33), SEQ ID NO: 77-84 (антиген 5T4), SEQ ID NO: 85-90 (антиген ROR1), SEQ ID NO: 91-94 (антиген EGFRvIII), SEQ ID NO: 95-102 (антиген ВСМА), SEQ ID NO: 103-112 (антиген CS1) и SEQ ID NO: 113-124 (антиген CD123), указанные в таблице 3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген, распознаваемый внеклеточным связывающим доменом, предпочтительно ScFv, выбирают из SEQ ID NO: 43 (антиген CD19), SEQ ID NO: 44 (антиген CD38), SEQ ID NO: 45 (антиген CD123), SEQ ID NO: 46 (антиген CS1), SEQ ID NO: 47 (антиген ВСМА), SEQ ID NO: 48 (антиген FLT-3), SEQ ID NO: 49 (антиген CD33), SEQ ID NO: 50 (антиген CD70), SEQ ID NO: 51 (антиген EGFR-vIII) или SEQ ID NO: 52 (антиген WT1).

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит:

- VH, имеющую SEQ ID NO: 65, и VL, имеющую SEQ ID NO: 66; VH, имеющую SEQ ID NO: 67, и VL, имеющую SEQ ID NO: 68; VH, имеющую SEQ ID NO: 69, и VL, имеющую SEQ ID NO: 70; VH, имеющую SEQ ID NO: 71, и VL, имеющую SEQ ID NO: 72; VH, имеющую SEQ ID NO: 77, и VL, имеющую SEQ ID NO: 78; VH, имеющую SEQ ID NO: 79, и VL, имеющую SEQ ID NO: 80;

- VH, имеющую SEQ ID NO: 81, и VL, имеющую SEQ ID NO: 82; VH, имеющую SEQ ID NO: 83, и VL, имеющую SEQ ID NO: 84; VH, имеющую SEQ ID NO: 85, и VL, имеющую SEQ ID NO: 86; VH, имеющую SEQ ID NO: 87, и VL, имеющую SEQ ID NO: 88; VH, имеющую SEQ ID NO: 89, и VL, имеющую SEQ ID NO: 90; VH, имеющую SEQ ID NO: 91, и VL, имеющую SEQ ID NO: 92; VH, имеющую SEQ ID NO: 93, и VL, имеющую SEQ ID NO: 94; VH, имеющую SEQ ID NO: 95, и VL, имеющую SEQ ID NO: 96; VH, имеющую SEQ ID NO: 97, и VL, имеющую SEQ ID NO: 98; VH, имеющую SEQ ID NO: 99, и VL, имеющую SEQ ID NO: 100; VH, имеющую SEQ ID NO: 101, и VL, имеющую SEQ ID NO: 102; VH, имеющую SEQ ID NO: 103, и VL, имеющую SEQ ID NO: 104; VH, имеющую SEQ ID NO: 105, и VL, имеющую SEQ ID NO: 106; VH, имеющую SEQ ID NO: 107, и VL, имеющую SEQ ID NO: 108; VH, имеющую SEQ ID NO: 109, и VL, имеющую SEQ ID NO: 110; VH, имеющую SEQ ID NO: 111, и VL, имеющую SEQ ID NO: 112; VH, имеющую SEQ ID NO: 113, и VL, имеющую SEQ ID NO: 114; VH, имеющую SEQ ID NO: 115, и VL, имеющую SEQ ID NO: 116; VH, имеющую SEQ ID NO: 117, и VL, имеющую SEQ ID NO: 118; VH, имеющую SEQ ID NO: 119, и VL, имеющую SEQ ID NO: 120; VH, имеющую SEQ ID NO: 121, и VL, имеющую SEQ ID NO: 122; VH, имеющую SEQ ID NO: 123, и VL, имеющую SEQ ID NO: 124; VH, имеющую SEQ ID NO: 170, и VL, имеющую SEQ ID NO: 171; VH, имеющую SEQ ID NO: 172, и VL, имеющую SEQ ID NO: 173; или VH, имеющую SEQ ID NO: 174, и VL, имеющую SEQ ID NO: 175.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные VH- и VL-цепи имеют в качестве последовательности эпитопа-мишени последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90%, и более предпочтительно более чем на 95% SEQ ID NO: 11 (антиген CD20).

Внеклеточный лигандсвязывающий домен может содержать также пептид, связывающий антиген мишени, пептид или белок, связывающий антитело, которое связывается с антигеном мишени, пептид или белок лиганда, такой как фактор роста, цитокин или гормон в качестве примеров (но не ограничиваясь только ими) лиганда, связывающегося с рецептором на мишени, или домен, полученный из рецептора, такого как рецептор фактора роста, цитокиновый рецептор или рецептор гормона в качестве примеров (но не ограничиваясь только ими) рецептора, связывающегося с пептидом или белком лиганда на мишени. Предпочтительно мишень представляет собой клетку или вирус.

Антигенсвязывающий домен CAR может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном клетки-мишени, включая (но не ограничиваясь только ими) моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело и их функциональные фрагменты.

Гуманизированное антитело можно получать с помощью различных методов, известных в данной области, включая (но не ограничиваясь только ими) трансплантацию CDR (см., например, европейский патент ЕР 239400; международную публикацию WO 91/09967; и US №№5225539, 5530101 и 5585089, каждый из указанных документов полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки), «облицовку» или «нанесение покрытия» (см, например, европейский патент ЕР 592106 и ЕР 519596; Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5), 1991, сс. 489-498; Studnicka и др., Protein Engineering, 7(6), 1994, сс. 805-814; и Roguska и др., PNAS, 91, 1994, сс. 969-973, каждый из указанных документов полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки), перестановку цепи (см., например, US №5565332, который полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки) и методы, описанные, например, в публикации заявки на патент США US №2005/0042664, публикации заявки на патент США US 2005/0048617, патентах US №6407213, US №5766886, публикации международной заявки на патент WO 9317105, Tan и др., J. Immunol., 169, 2002, сс. 1119-1125, Caldas и др., Protein Eng., 13(5), 2000, сс. 353-360, Morea и др., Methods, 20(3), 2000, сс. 267-279, Васа и др., J. Biol. Chem., 272(16), 1997, сс. 10678-10684, Roguska и др., Protein Eng., 9(10), 1996, сс. 895-904, Couto и др., Cancer Res., 55 (приложение 23), 1995, сс. 5973-5977, Couto и др., Cancer Res., 55(8), 1995, сс. 1717-1722, Sandhu J.S., Gene, 150(2), 1994, сс. 409-410 и Pedersen и др., J. Mol. Biol., 235(3), 1994, сс. 959-973, каждый из указанных документов полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки. Часто каркасные остатки в каркасных областях требуется заменять на соответствующие остатки из CDR донорского антитела для изменения, например, для улучшения, связывания с антигеном. Такие замены в каркасном участке идентифицируют с помощью методов, хорошо известных в данной области, например, путем моделирования взаимодействий остатков CDR и каркасного участка с целью идентификации остатков каркасного участка, важных для связывания с антигеном, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркасного участка в определенных положениях (см., например, Queen и др., US №5585089; и Riechmann и др., Nature, 332, 1988, с. 323, указанные документы включены в настоящее описание в качестве ссылки).

Согласно изобретению scFv могут представлять собой нанотела (встречающиеся в естественных условиях однодоменные антитела), которые можно получать путем иммунизации одногорбых верблюдов, верблюдов, лам, альпак или акул.

Линкеры, применяемые в химерном scFv

Свойство гибкости конструирования scFv-линкера можно объединять с быстротой и адаптируемостью, присущими взаимодействиям поверхностных молекул (например, электростатическим, водородным связям или ковалентному присоединению). Пептидные линкеры могут иметь различную длину от 10 до 25 аминокислот и, как правило, но не всегда, они состоят и гидрофильных аминокислот, таких как глицин (G) и серии (S). Можно применять также более короткие пептидные линкеры (состоящие из 0-4 аминокислот). Однако scFv, несущие более короткие линкеры, могут образовывать мультимеры. Как правило, в качестве пептидного линкера в scFv применяют пептид (GGGGS)₃. Эту последовательность состоящего из 15 аминокислот линкера [обозначенную как (GGGGS)₃-линкер] применяют в системе для экспонирования рекомбинантных антител на фаге (Recombinant Phage Antibody System) (набор для RPAS), поступающей в продажу от фирмы Amersham. В предыдущем исследовании было продемонстрировано, что scFv (ММ ~27000), содержащие связывающие металл аминокислоты (т.е. цистеин или гистидин) в пептидном линкере scFv, могут быть иммобилизованы непосредственно на золотой поверхности в предпочтительной для связывания с антигеном ориентации с высокой плотностью, что значительно, в 3-5 раз, повышает чувствительность анализа по сравнению с применением полноразмерного IgG или Fab-фрагментов антитела соответственно (Shen Z., Mernaugh R.L., Yan Н., Yu L., Zhang Y., Zeng X., Anal. Chem.; 77, 2005, cc. 6834-6842; Shen Z., Stryker G.A., Mernaugh R.L., Yu L., Yan H., Zeng X., Anal. Chem.; 77, 2005, cc. 797-805).

К другим линкерам, которые можно применять согласно настоящему изобретению, относится 15-мерный пептидный линкер (RGRGRGRGRSRGGGS) (Zhihong Shen, Heping Yan, Ying Zhang, Raymond L. Mernaugh и Xiangqun Zeng, Anal Chem. 80(6), 2008, cc. 1910-1917).

В некоторых вариантах осуществления изобретения понятие «линкер» в контексте scFv относится к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как остатки глицина и/или серина, которые используют индивидуально или в комбинации, предназначенному для соединения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения гибкий полипептидный линкер представляет собой глицин/сериновый линкер, и он содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в которой n обозначает положительное целое число, равное или превышающее 1. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В одном из вариантов осуществления изобретения гибкие полипептидные линкеры представляют собой (но не ограничиваясь только ими) (Gly₄Ser)₄ или (Gly₄Ser)₃. В другом варианте осуществления изобретения линкеры включают несколько повторов (Gly_xSer)_n, где х=1, 2, 3, 4 или 5 и n обозначает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, например, несколько повторов (GlySer), (Gly₂Ser) или (Gly₅Ser). Под объем изобретения подпадают также линкеры, описанные в WO 2012/138475, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Химерный антигенный рецептор (CAR)

CAR, предлагаемые в изобретении, предназначены для того, чтобы давать возможность сконструированным иммунным клеткам инициировать деструкцию патологических клеток, в частности, злокачественных клеток. Их можно создавать в форме одноцепочечных и многоцепочечных конструкций. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен присутствуют в одном полипептиде, т.е. в одной цепи. Многоцепочечные конструкции описаны более подробно в WO 2014039523.

Многоцепочечный CAR, как правило, состоит из различных полипептидов, таких как:

один трансмембранный полипептид, содержащий по меньшей мере один внеклеточный лигандсвязывающий домен, и;

один трансмембранный полипептид, содержащий по меньшей мере один домен трансдукции сигнала.

Сигнальный полипептид ответствен за активацию по меньшей мере одной из нормальных функций сконструированной иммунной клетки. Например, функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Так, понятие «сигнальный белок» относится к белку, который трансдуцирует функциональный сигнал трансмиттерного домена и направляет клетку на выполнение специализированной функции. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный трансмиттерный домен может представлять собой сигнальный белок. Трансмиссия сигналов может происходить вследствие белок/белковых взаимодействий, взаимодействий белок/ДНК, взаимодействий белок/РНК, взаимодействий белок/малая молекула, посттрансляционной модификации белка, конформационного изменения, субклеточной релокализации.

Сигнальный белок может активировать ген в ядре. Примерами сигнального белка могут служить представители семейства факторов транскрипции NFAT, представляющие собой индуцибельный фактор, который может связывать промотор интерлейкина-2 в активированных Т-клетках. В регуляции белков NFAT участвуют метаболиты и белки, такие как кальций, кальциневрин и каркасные белки Homer. Указанный сигнальный белок может представлять собой активированную сконструированную форму NFAT, не требующую регуляции кальциневрином и белками Homer. Указанный сигнальный белок может представлять собой NF-κВ, сконструированный таким образом, чтобы избежать секвестрации в цитоплазме в результате воздействия Iκb, что позволяет активировать Т-клетки. В качестве указанного сигнального белка могут служить также три субъединицы IKK (IKKα, IKKβ, IKKγ). Восстановленный IKK-комплекс активирует путь NF-κВ путем «запуска» убиквитинизации IκВ. Активация передачи сигнала JNK может запускаться также непосредственно экспрессией сигнального белка АР-1 (фактор транскрипции). Указанный сигнальный белок может представлять собой сконструированный активатор транскрипции, такой как эффекторный (TALE) связывающий домен, который специфически воздействует и активирует тот же самый ген, что и NFAT и NF-kb.

Согласно изобретению указанный сигнальный белок может ингибировать сигнальный путь посредством белок-белкового взаимодействия или может активировать ген в ядре, приводя к ингибированию сигнального пути. Указанный сигнальный белок может представлять собой белок, родственный белкам H1 вируса коровьей оспы (VHR), представитель семейства фосфатаз митоген-активируемых протеинкиназ (MKP), который дефосфорилирует и инактивирует сигнальные белки внеклеточных сигнал-регулируемых киназ (ERK).

Согласно изобретению домен трансдукции сигнала, предназначенный для применения в CAR, может представлять собой цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора и корецепторов, которые действуют совместно, инициируя трансдукцию сигнала после контакта антигена с рецептором, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую синтетическую последовательность, обладающую такой же функциональной способностью. Домен трансдукции сигнала может содержать два различных класса цитоплазматической последовательности, а именно, те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию, и те, которые действуют независимым от антигена образом, вызывая вторичный или костимуляторный сигнал.

В конкретном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит костимуляторную сигнальную молекулу. Костимуляторная молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или лигандов, которая требуется для эффективного иммунного ответа.

Понятие «костимуляторный лиганд» относится к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывается с когнатной костимуляторной молекулой на Т-клетке, создавая тем самым сигнал, который, в дополнение к первичному сигналу, создаваемому, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, опосредует Т-клеточный ответ, включая (но не ограничиваясь только ими) активацию пролиферации, дифференцировку и т.п. Понятие «костимуляторная молекула» относится к когнатному связывающему партнеру, присутствующему на Т-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимуляторный ответ клетки, такой как (но не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы включают (но не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толл-рецептора.

Например, многоцепочечный CAR можно получать на основе структуры Fc-рецептора, предпочтительно FcεRI, и он содержит по меньшей мере два из следующих компонентов:

а) один полипептид, содержащий трансмембранный домен альфа-цепи FcRI, слитый с внеклеточным лигандсвязывающим доменом,

б) один полипептид, содержащий часть N- и С-концевого цитоплазматического «хвоста», слитую с трансмембранным доменом бета-цепи FcRI, и/или

в) два дополнительных полипептида, каждый из которых содержит часть внутрицитоплазматического «хвоста» и/или трансмембранного домена гамма-цепи FcRI

Как правило, эти различные полипептиды спонтанно мультимеризуются друг с другом, образуя димерные, трехмерные или четырехмерные структуры, которые возникают на клеточной поверхности в близком к мембране положении.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к иммунной клетке, содержащей одноцепочечный CAR, подробно описанный в прототипах, а также в любом из US 7446190, WO 2008/121420, US 8252592, US 20140024809, WO 2012/079000, WO 2014153270, WO 2012/099973, WO 2014/011988, WO 2014/011987, WO 2013/067492, WO 2013/070468, WO 2013/040557, WO 2013/126712, WO 2013/126729, WO 2013/126726, WO 2013/126733, US 8399645, US 20130266551, US 20140023674, WO 2014039523, US 7514537, US 8324353, WO 2010/025177, US 7446179, WO 2010/025177, WO 2012/031744, WO 2012/136231A1, WO 2012/050374 A2, WO 2013074916, WO 2009/091826A3, WO 2013/176915 или WO 2013/059593.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к CAR, который содержит

- внеклеточный домен, содержащий

- по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, специфическими в отношении антигена предпочтительно антигена-маркера клеточной поверхности, где указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, и

- шарнир,

- трансмембранный домен и

- внутриклеточный домен.

В одном из вариантов осуществления изобретения трансмембранный домен содержит трансмембранную(ые) область(и) альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, PD-1, 4-1ВВ, ОХ40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2В4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154.

В другом варианте осуществления изобретения шарнир представляет собой шарнир IgG4 или шарнир CD8альфа, предпочтительно шарнир CD8альфа.

Отличительными особенностями соответствующих трансмембранных доменов являются способность экспрессироваться на поверхности клетки, согласно настоящему изобретению предпочтительно на поверхности иммунной клетки, прежде всего лимфоцитов или естественных клеток-киллеров (NK), и взаимодействовать друг с другом, направляя клеточный ответ иммунной клетки на заранее определенную клетку-мишень. Трансмембранный домен можно получать как из встречающегося в естественных условиях, так и из синтетического источника. Трансмембранный домен можно получать из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Примерами трансмембранных полипептидов могут служить (но не ограничиваясь только ими) субъединица Т-клеточного рецептора, такая как α, β, γ или ζ, полипептид, образующий комплекс с CD3, р55 (α-цепь), р75 (β-цепь) или γ-цепь рецептора IL2, цепь субъединицы Fc-рецепторов, в частности, Fcγ-рецептора III, или CD-белки. Альтернативно этому, трансмембранный домен может быть синтетическим, и он может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный трансмембранный домен получают из альфа-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1). Указанный трансмембранный домен может представлять собой также трансмембранный домен CD8 (альфа- и бета-цепи). Указанный трансмембранный домен можно конструировать так, чтобы обязательно образовывались гетеро- или гомодимеры. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные CAR могут содержать трансмембранные домены или внутриклеточные домены, которые могут димеризоваться только после распознавания лиганда. Другим примером трансмембранного домена может служить рецептор NKG2-D. NKG2D (естественная клетка-киллер группы 2D) представляет собой лектин-подобный рецептор С-типа, который экспрессируется на NK-клетках, γδ-TcR⁺-Т-клетках и CD8⁺αβ-TcR⁺-T-клетках (Bauer, Groh и др., Science 285(5428), 1999, сс. 727-729). NKG2D ассоциирован с трансмембранным адаптерным белком DAP10 (Wu, Song и др., Science 285(5428), 1999, сс. 730-732), цитоплазматический домен которого связывается с р85-субъединицей киназы PI-3.

Указанный трансмембранный домен может также представлять собой интегрин. Интегрины представляют собой гетеродимерные интегральные мембранные белки, состоящие из α- и β-цепей, которые соединены друг с другом с образованием LFA-1 (интегрин, представляющий собой ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген-1), который экспрессируется на всех лейкоцитах. LFA-1 играет центральную роль во внутриклеточной адгезии лейкоцитов посредством взаимодействия с его лигандом, ICAM 1-3 (молекулы внутриклеточной адгезии 1-3), и играет также важную роль в костимуляторной передаче сигналов лимфоцитов (Chen и Flies, Nat Rev Immunol 13(4), 2013, cc. 227-242). Молекулярные особенности связывания LAF-1 с его иммуноглобулином ICAM-1 достаточно хорошо изучены, что позволяет осуществлять точное конструирование сайта связывания LAF-1. Аффинность α_L-домена ICAM-1 регулируют путем смещения его С-концевой спирали, которая конформационно связана с изменением специфических петель в LAF-1. Активная и слабоактивная конформации различаются в 500-10000 раз. Важно отметить также, что для LFA-1 известно два типа антагонистов и известен механизм их действия. Интегриновые рецепторы, участвующие в адгезии на клеточной поверхности, могут передавать сигнал снаружи внутрь, а также наоборот. Существуют цитоскелетные белки, такие как Talin, которые связываются с интегриновым «хвостом» LFA-1, передавая информацию изнутри наружу.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения трансмембранный домен содержит трансмембранную область PD-1 или трансмембранную(ые) область(и) CD8 альфа.

В одном из объектов изобретения трансмембранный домен присоединен к внеклеточному домену CAR посредством шарнира, например, шарнира человеческого белка. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения, шарнир может представлять собой шарнир человеческого Ig (иммуноглобулин), например, шарнир PD-1, шарнир IgG4 или шарнир CD8альфа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения шарнир CAR представляет собой шарнир человеческого иммуноглобулина.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения шарнир CAR представляет собой шарнир IgG4 или шарнир CD8 альфа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнир представляет собой шарнир FcγRIIIaльфa.

В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнир представляет собой шарнир CD8 альфа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнир представляет собой шарнир CD8 альфа, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 179, 180 или 181.

В контексте настоящего описания понятие «шарнирная область, шарнир» (в литературе обозначают также как «стеблевая область»), как правило, обозначает любой олиго- или полипептид, функция которого заключается в сцеплении трансмембранного домена с внеклеточным лигандсвязывающим доменом. В частности, стеблевую область используют для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного лигандсвязывающего домена. Стеблевая область может содержать вплоть до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот, и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот. Стеблевую область можно получать из полных встречающихся в естественных условиях молекул, или их частей, таких как полная внеклеточная область CD8, CD4, CD28 или RTK, или ее часть, или полная константная область антитела или ее часть. Альтернативно этому, стеблевая область может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует встречающейся в естественных условиях стеблевой последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую стеблевую последовательность.

Внутриклеточный домен (который в контексте настоящего описания обозначают также как «цитоплазматический сигнальный домен» или «внутриклеточный сигнальный домен») содержит функциональный сигнальный домен, полученный из стимуляторной молекулы, как описано ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения стимуляторная молекула представляет собой дзета-цепь, ассоциированную с комплексом Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или несколько функциональных сигнальных доменов, полученных из по меньшей мере одной костимуляроной молекулы, как указано ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения костимуляторную молекулу выбирают из 4-1ВВ (т.е., CD137), CD27 и/или CD28.

Понятие «стимуляторная молекула» относится к молекуле, экспрессируемой Т-клеткой, которая имеет позитивную(ые) цитоплазматическую(ие) сигнальную(ые) последовательность(и), которая(ые) регулирует(ют) позитивную активацию комплекса TCR в стимуляторном пути, по меньшей мере некоторых компонентов Т-клеточного сигнального пути. В некоторых вариантах осуществления изобретения позитивный сигнал инициируется, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, и он приводит к получению Т-клеточного ответа, включая (но не ограничиваясь только ими) пролиферацию, активацию, дифференцировку и т.п. Позитивная цитоплазматическая сигнальная последовательность (которую обозначают также как «позитивный сигнальный домен» или «позитивный внутриклеточный сигнальный домен»), которая обладает стимулирующим действием, может содержать сигнальный мотив, известный как мотив активации иммунных рецепторов на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM, содержащего позитивную цитоплазматическую сигнальную последовательность, включают (но не ограничиваясь только ими) мотивы, полученные из TCRдзета (или CD3дзета), FcRгамма, FcRбета, CD3 гамма, CD3дельта, CD3эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (известные также как «ICOS») и CD66d. В некоторых вариантах осуществления изобретения внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать сигнальный домен CD3ζ (дзета), который имеет аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ. ID NO: 175.

В некоторых объектах изобретения внутриклеточный сигнальный домен CAR генерирует сигнал, который стимулирует иммунную эффекторную функцию содержащей CAR клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например CAR-T-клетки, включают цитолитическую активность и хелперную активность, включая секрецию цитокинов.

Понятие «костимуляторная молекула» относится к когнатному связывающему партнеру, присутствующему на Т-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимуляторный ответ клетки, такой как (но не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от антигенных рецепторов или их лигандов, которые требуются для эффективного иммунного ответа. Костимуляторные молекулы включают (но не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толл-рецептора, а также ОХ40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) и 4-IBB (CD137).

Костимуляторный внутриклеточный сигнальный домен может представлять собой внутриклеточную часть костимуляторной молекулы. Костимуляторная молекула может относиться к следующим семействам белков: белки рецепторов TNF, иммуноглобулинподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM) и активирующие рецепторы NK-клеток. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1BB (CD137), ОХ40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, В7-Н3 и лиганд, который специфически связывается с CD83, и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения внутриклеточный сигнальный домен CAR, предлагаемого в изобретении, содержит аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ. ID NO: 176 и SEQ. ID NO: 177.

В таблице 4 представлены примеры последовательностей компонентов CAR

CAR и иммунные клетки, содержащие их, подробно описаны, и могут быть получены специалистом в данной области с помощью известных методов. Например, методологии получения CAR и клеток, содержащих такие CAR, описаны в US 7446190, WO 2008/121420, US 8252592, US 20140024809, WO 2012/079000, WO 2014153270, WO 2012/099973, WO 2014/011988, WO 2014/011987, WO 2013/067492, WO 2013/070468, WO 2013/040557, WO 2013/126712, WO 2013/126729, WO 2013/126726, WO 2013/126733, US 8399645, US 20130266551, US 20140023674, WO 2014039523, US 7514537, US 8324353, WO 2010/025177, US 7446179, WO 2010/025177, WO 2012/031744, WO 2012/136231 A1, WO 2012/050374 A2, WO 2013074916, WO 2009/091826 A3, WO 2013/176915 или WO 2013/059593, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Под объем настоящего изобретения подпадает конструкция рекомбинантной ДНК, содержащая последовательности, кодирующие CAR, указанный выше, где CAR содержит внеклеточный домен, такой как фрагмент антитела, который специфически связывается с антигеном клетки-мишени, и где последовательность внеклеточного домена соприкасается с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный домен и внутриклеточный домен, и находится в одной с ней рамке считывания. Например, конструкция CAR может содержать необязательную лидерную последовательность, внеклеточный связывающий антиген клетки-мишени домен, шарнир, трансмембранный домен и внутриклеточный ингибирующий сигнальный домен.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к рекомбинантным конструкциям ДНК, которые содержат последовательности, кодирующие CAR, указанный выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR содержит внеклеточный домен, содержащий

- по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, содержащий scFv, который образован по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, специфическими в отношении антигена-маркера клеточной поверхности, где указанный внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, предназначенный для связывания специфическим в отношении эпитопа МАт для осуществления in vitro клеточной сортировки и/или in vivo клеточного истощения Т-клеток, экспрессирующих указанный CAR, и содержит внеклеточный связывающий домен, и

- шарнир,

- трансмембранный домен и

- внутриклеточный домен.

Способ сортировки CAR-позитивных иммунных клеток

Один из объектов изобретения относится к способу in vitro сортировки экспрессирующей CAR иммунной клетки, включающему приведение в контакт популяции указанных сконструированных иммунных клеток с антиген-специфическим антителом (предпочтительно с моноклональными Ат) для сбора только клеток, которые экспрессируют CAR.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу in vitro сортировки экспрессирующей CAR иммунной клетки, где указанный CAR содержит по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, содержащий по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, который описан выше, включающему

- приведение в контакт популяции указанных иммунных клеток с моноклональным антителом, специфическим в отношении указанного МАт-специфического эпитопа, для сбора только указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, где указанный CAR содержит по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, содержащий по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, который описан выше, включающему

- приведение в контакт популяции указанных иммунных клеток с моноклональным антителом (специфическим в отношении эпитопа МАт), специфическим в отношении указанного МАт-специфического эпитопа,

- отбор клеток, которые связываются с моноклональным антителом,

для получения популяции клеток, обогащенных экспрессирующей CAR иммунной клеткой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное моноклональное антитело, специфическое в отношении указанного МАт-специфического эпитопа, конъюгируют с флуорофором и стадию отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, осуществляют с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS).

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное моноклональное антитело, специфическое в отношении указанного МАт-специфического эпитопа, конъюгируют с магнитной частицей и стадию отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, осуществляют с помощью клеточного сортера с магнитной активацией (MACS).

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 144.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 144, и антитело, применяемое для контакта с популяцией иммунных клеток, представляет собой QBEND-10.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАт-специфический эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 35, и антитело, применяемое для контакта с популяцией иммунных клеток, представляет собой ритуксимаб.

В некоторых вариантах осуществления изобретения популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученная с помощью способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, описанного выше, содержит по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% экспрессирующих CAR иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученная с помощью способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, описанного выше, содержит по меньшей мере 85% экспрессирующих CAR иммунных клеток.

В некоторых вариантах осуществления изобретения популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученная с помощью способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, описанного выше, обладает повышенной цитотоксической активностью in vitro по сравнению с исходной (не подвергнутой сортировке) популяцией клеток при использовании протокола, описанного в примере 7.5. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная цитотоксическая активность in vitro повышается на 10%, 20%, 30% или 50%.

Предпочтительно МАт предварительно связывают с подложкой, такой как колонка или гранулы, согласно стандартной процедуре, осуществляемой специалистом в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунные клетки представляют собой Т-клетки

Согласно изобретению клетки, подлежащие введению реципиенту, можно обогащать in vitro относительно исходной популяции.

Методы размножения исходных популяций хорошо известны в данной области, и они могут включать отбор клеток, которые экспрессируют антиген, такой как антиген CD34, с помощью комбинации таких методов, как центрифугирование в градиенте плотности, очистка с использованием иммунномагнитных гранул, аффинная хроматографии и клеточная сортировка с возбуждением флуоресценции, известных специалистам в данной области.

Проточная цитометрия

Проточную цитометрию широко применяют в данной области, она представляет собой хорошо известный обычному специалисту в данной области метод сортировки и количественной оценки специфических типов клеток в популяции клеток. В целом, проточная цитометрия представляет собой метод количественной оценки компонентов или структурных характеристик клеток в основном с помощью оптических средств. Поскольку различные типы клеток можно различать на основе количественной оценки их структурных характеристик, то проточную цитометрию и клеточную сортировку можно применять для подсчета и сортировки клеток различного фенотипа в смеси.

Анализ методом проточной цитометрии включает две основные стадии: 1) мечение выбранных типов клеток одним или несколькими мечеными маркерами и 2) определение количество меченых клеток относительно общего количества клеток в популяции.

Основной метод мечения клеточных типов заключается в связывании меченых антител с маркерами, экспрессируемыми специфическим типом клеток. Антитела метят либо непосредственно флуоресцентным соединением, либо метят косвенным образом, например, с использованием флуоресцентно меченного вторичного антитела, которое распознает первое антитело.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения метод, применяемый для сортировки Т-клеток, экспрессирующих CAR, представляет собой клеточную сортировку с магнитной активацией (MACS).

Клеточная сортировка с магнитной активацией (MACS) представляет собой метод разделения различных клеточных популяций в зависимости от их поверхностных антигенов (CD-молекул) с использованием суперпарамагнитных наночастиц и колонок. Он требует осуществления лишь небольшого количества простых стадий для получения чистых клеточных популяций. Клетки в суспензии единичных клеток магнитно метят с помощью микрогранул. Образец вносят в колонку, заполненную ферромагнитными сферами, на которые нанесено не оказывающее вредного воздействия на клетки покрытие, позволяющее осуществлять быстрое и аккуратное разделение клеток. Немеченые клетки проходят через колонку, в то время как магнитно-меченные клетки удерживаются в колонке. Прошедший через колонку продукт можно собирать в качестве немеченой клеточной фракции. После короткой стадии промывки колонку удаляют из сепаратора и магнитно-меченые клетки элюируют из колонки.

Среди других методов FACS представляет собой предпочтительный метод очистки популяций клеток с известным фенотипом, с помощью которого можно достигать очень высокой степени чистоты требуемой популяций, или когда популяция клеток-мишеней экспрессирует очень низкий уровень идентифицирующего маркера, или когда клеточные популяции требуется разделять на основе различной плотности маркера. Кроме того, FACS является единственным пригодным методом очистки для выделения клеток на основе внутреннего окрашивания или внутриклеточной экспрессии белка, такого как генетически модифицированный флуоресцентный маркерный белок. FACS позволяет осуществлять очистку индивидуальных клеток на основе размера, зернистости и флуоресценции. Для очистки представляющих интерес клеток их сначала окрашивают флуоресцентно-меченными моноклональными антителами (МАт), которые распознают специфические поверхностные маркеры на требуемой популяции клеток.

Подробное описание протокола очистки специфической популяции клеток, таких как Т-клетки, приведено у Basu S. с соавторами (2010). (Basu S., Campbell Н.М., Dittel B.N., Ray A., Purification of specific cell популяция by fluorescence activated cell sorting (FACS), J Vis Exp. (41), 2010, c. 1546).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения МАт, применяемое в методе сортировки Т-клеток, экспрессирующих CAR, выбирают из ибритумомаба, тиоксетана, муромонаба-CD3, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, алемтузумаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10 или устекинумаба.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное МАт представляет собой ритуксимаб.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное МАт представляет собой QBEND-10.

Метод истощения экспрессирующих CAR иммунных клеток

В контексте настоящего изобретения «in vivo истощение» означает введение препарата в организм млекопитающего с целью прекращения пролиферации экспрессирующих CAR иммунных клеток посредством ингибирования или элиминации.

Один из объектов изобретения относится к способу in vivo истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, который содержит описанный ранее МАт-специфический эпитоп, включающему приведение в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки по меньшей мере с одним из специфических в отношении эпитопа МАт. Другой объект изобретение относится к способу in vivo истощения экспрессирующей CAR иммунной клетки, которая содержит указанный выше химерный scFv (полученный путем инсерции МАт-специфического эпитопа), путем приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки со специфическими в отношении эпитопа антителами.

Предпочтительно указанные иммунные клетки представляют собой Т-клетки и/или антитела являются моноклональными.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения in vivo истощение сконструированной иммунной клетки осуществляют в отношении сконструированных иммунных клеток, предварительно отсортированных с использованием способа in vitro, предлагаемого в настоящем изобретении. В этом случае следует применять то же самое вводимое путем инфузии МАт.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения МАт-специфический антиген представляет собой антиген CD20, а специфическое в отношении эпитопа МАт представляет собой ритуксимаб.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу in vivo истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, который содержит ранее описанный МАт-специфический эпитоп (экспрессирующая CAR иммунная клетка), в организме пациента, включающему приведение в контакт указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки по меньшей мере с одним специфическим в отношении эпитопа МАт.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения МАт, применяемое в способе истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, выбирают из ибритумомаба, тиоксетана, муромонаба-CD3, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, алемтузумаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10 или устекинумаба.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный МАт-специфический эпитоп представляет собой эпитоп или мимеотоп CD20, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 35, а специфические в отношении эпитопа МАт представляют собой ритуксимаб.

В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки по меньшей мере с одним специфическим в отношении эпитопа МАт включает инфузию пациенту специфического в отногении эпитопа МАт, предпочтительно ритуксимаба. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество вводимого пациенту специфического в отношении эпитопа МАт является достаточным для элиминации по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% экспрессирующих CAR иммунных клеток у пациента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки по меньшей мере с одним специфическим в отношении эпитопа МАт включает введение пациенту путем инфузии 375 мг/м² ритуксимаба, один раз или несколько раз, предпочтительно один раз в неделю.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда истощают иммунные клетки, экспрессирующие CAR, которые содержит МАт-специфический эпитоп (экспрессирующие CAR иммунные клетки), то по данным анализа CDC с использованием специфического в отношении эпитопа МАт, количество жизнеспособных экспрессирующих CAR иммунных клеток снижают предпочтительно по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. Предпочтительно анализ CDC представляет собой анализ, описанный в примере 3, примере 4 или примере 7.4. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный МАт-специфический эпитоп представляет собой эпитоп или мимеотоп CD20, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 35, а специфические в отношении эпитопа МАт представляют собой ритуксимаб.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения in vivo истощение сконструированных содержащих CAR иммунных клеток осуществляют путем инфузии биспецифических антител. В контексте настоящего описания биспецифическое моноклональное антитело (BsAb) представляет собой искусственный белок, который состоит из фрагментов двух различных моноклональных антител и поэтому связывается с двумя различными типами антигена. Такие BsAbs и их применение в иммунотерапии подробно описаны у D. и Kontermann R.E., Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy, BioDrugs 24 (2), 2010, cc. 89-98.

Понятие «эффекторная клетка» включает иммунные клетки, такие как лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки, естественные клетки-киллеры (NK-клетка), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL).

Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения вводимое путем инфузии биспецифическое МАт обладает способностью связываться как с МАт-специфическим эпитопом, присутствующим на сконструированных иммунных клетках, экспрессирующих химерный scFv, так и с поверхностным антигеном на эффекторной и цитотоксической клетке. Этот аспект проиллюстрирован на фиг. 3. В этом случае истощение сконструированных иммунных клеток, инициируемое BsAb, может осуществляться посредством антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Такие конформации описаны, например, у Deo Y.М., Sundarapandiyan K., Keler Т., Wallace Р.K. и Graziano R.F., Journal of Immunology, 165 (10), 2000, cc. 5954-5961.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения с эпитоп-специфическими МАт, которые применяют для истощения экспрессирующих CAR иммунных клеток, связывают цитотоксическое лекарственное средство. Благодаря объединению способностей моноклональных антител к таргетингу со способностью к уничтожению рака, присущей цитотоксическим лекарственным средствам, конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) дает возможность с более высокой чувствительностью различать здоровую и пораженную заболеванием ткань по сравнению с применением только одного лекарственного средства. Разрешения на продажу были получены для нескольких ADC; технология их получения, прежде всего основанная на применении линкеров, подробно описана в опубликованной ранее литературе (Payne G., Cancer Cell 3, 2003, сс. 207-212; Trail и др., Cancer Immunol. Immunother. 52, 2003, cc. 328-337; Syrigos и Epenetos, Anticancer Research 19, 1999, cc. 605-614; Niculescu-Duvaz и Springer, Adv. Drug Del. Rev. 26, 1997, cc. 151-172; U.S. №4975278).

Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения эпитоп-специфическое МАт, предназначенное для инфузии, заранее конъюгируют с молекулой, обладающей способностью стимулировать комплементзависимую цитотоксичность (CDC). В этом случае система комплемента способствует или дополняет способность антител очищать организм от патогенов. При стимуляции одной из нескольких молекул запускается каскад активации в виде значительного усиления ответа и активации уничтожающего клетки мембраноатакующего комплекса.

Для конъюгации с МАт можно применять различные молекулы, такие как гликаны [Courtois A., Gac-Breton S., Berthou С, J., Bordron А. и Boisset С, Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments is acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN, 2012, cc. 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/vol15-issue5).

В некоторых вариантах осуществления изобретения специфическое в отношении эпитопа МАт, применяемое в способе сортировки и истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, является одним и тем же и его выбирают из ибритумомаба, тиоксетана, муромонаба-CD3, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, алемтузумаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10 или устекинумаба.

В некоторых вариантах осуществления изобретения для сортировки и истощения клеток применяют различные антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере один эпитоп, который специфически связывается ритуксимабом, такой как МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и по меньшей мере один эпитоп, который специфически связывается QBEND10, имеющий SEQ ID NO: 144, и МАт, применяемое для сортировки клеток представляет собой QBEND10, а МАт, применяемое для истощения клеток, представляет собой ритуксимаб.

Способы конструирования иммунных клеток

При создании изобретения были разработаны способы конструирования иммунных клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), предпочтительно описанный выше CAR, со всеми компонентами, необходимыми для таргетинга на антиген-мишень клеточной поверхности и для экспансии/амплификации. Кроме того, указанный CAR, прежде всего, должен нести химерный scFv, где scFv модифицируют для включения эпитопа, который может специфически распознаваться антителом для целей клеточного сортировки и/или истощения клеток.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ конструирования иммунной клетки с химерным антигенным рецептором (CAR), содержащим по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, специфическими в отношении антигена-маркера клеточной поверхности, и один МАт-специфический эпитоп, предназначенный для связывания со специфическим в отношении эпитопа МАт, включает:

(а) получение иммунной клетки;

(б) интродукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего указанный химерный антигенный рецептор;

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ конструирования иммунной клетки, которая экспрессирует описанный выше химерный антигенный рецептор (CAR), предпочтительно содержащий по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, специфическими в отношении антигена-маркера клеточной поверхности, и один МАт-специфический эпитоп, предназначенный для связывания со специфическим в отношении эпитопа МАт, включает:

(а) получение иммунной клетки;

(б) интродукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего указанный химерный антигенный рецептор; и

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

CAR и иммунные клетки, содержащие их, подробно описаны и они могут быть получены специалистом в данной области согласно известным методам. Например, ранее были описаны методологии получения CAR и клеток, содержащих указанные CAR. Иммунные клетки, содержащие CAR, специалист в данной области может получать согласно методологиям, описанным в указанных выше ссылках. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунные клетки, содержащие CAR, специалист в данной области может получать согласно методологиям, описанным в WO 2013/176915.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунную клетку можно получать из воспалительного Т-лимфоцита, цитотоксического Т-лимфоцита, регуляторного Т-лимфоцита или хелперного Т-лимфоцита.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, иммунную клетку получают из организма здорового донора. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунную клетку получают из организма пациента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ конструирования клетки, предлагаемой в изобретении, дополнительно включает одну или несколько дополнительных стадий геномной модификации. С помощью дополнительной стадии геномной модификации можно осуществлять интродукцию в конструируемые клетки одного или нескольких представляющих интерес белков. Указанный представляющий интерес белок может представлять собой CAR.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ конструирования Т-клеток, предлагаемых в изобретении, может включать:

(а) модификацию Т-клеток путем инактивации по меньшей мере:

- первого гена, экспрессирующего мишень для иммунодепрессанта, и

- второго гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR)

(б) размножение указанных клеток, необязательно в присутствии указанного иммунодепрессанта.

Иммунодепрессант представляет собой агент, который подавляет иммунную функцию посредством одного или нескольких механизмов действия. Иными словами, соединение, играющее роль иммунодепрессанта, характеризуется способностью уменьшать степень и/или интенсивность иммунного ответа. Примером иммунодепрессанта могут служить (но не ограничиваясь только ими) ингибитор кальциневрина, мишень рапамицина, блокатор α-цепи интерлейкина-2, ингибитор инозинмонофосфатдегидрогеназы, ингибитор редуктазы дигидрофолиевой кислоты, кортикостероид или иммуносупрессорный антиметаболит.

В конкретном варианте осуществления изобретения стадия генетической модификации в способе основана на инактивации одного гена, выбранного из группы, состоящей из CD52, GR, TCR альфа и TCR бета. В другом варианте осуществления изобретения стадия генетической модификации в способе основана на инактивации двух генов, выбранных из группы, состоящей из CD52 и GR, CD52 и TCR альфа, CDR52 и TCR бета, GR и TCR альфа, GR и TCR бета, TCR альфа и TCR бета. В другом варианте осуществления изобретения стадия генетической модификации в способе основана на инактивации более чем двух генов. Генетическую модификацию предпочтительно осуществляют ex vivo.

Редко расщепляющие эндонуклеазы, применяемые для инактивации генов в Т-клетках, предпочтительно представляют собой эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), но могут представлять собой также Cas9, связанную с РНК-гидом, что описано соответственно в WO 2013/176915 и WO 2014/191128.

Методы доставки

Различные способы, описанные выше, включают осуществление экспрессии CAR на поверхности клетки. Например, (но не ограничиваясь только этим), указанный CAR можно экспрессировать путем интродукции его в клетку. CAR можно интродуцировать в виде трансгена, кодируемого одним плазмидным вектором. Указанный плазмидный вектор может содержать также селектируемый маркер, который позволяет осуществлять идентификацию и/или отбор клеток, в которые интродуцирован указанный вектор.

Полипептиды могут синтезироваться in situ в клетке в результате интродукции в клетку полинуклеотидов, кодирующих указанные полипептиды. Альтернативно этому указанные полипептиды можно получать вне клетки и затем интродуцировать в нее. Методы интродукции полинуклеотидной конструкции в клетки известны в данной области и включают, например (но не ограничиваясь только ими), методы стабильной трансформации, при осуществлении которых полинуклеотидную конструкцию интегрируют в геном клетки, методы кратковременной трансформации, при осуществлении которых полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и опосредуемые вирусами методы. Указанные полинуклеотиды можно интродуцировать в клетку, например, с использованием рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосом и т.п. Например, методы кратковременной трансформации включают микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Указанные полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно, в плазмиды или вирусы, с целью экспрессии в клетках.

Полинуклеотиды и векторы

В одном из вариантов осуществления изобретения, указанная выделенная клетка, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, несущий химерный scFv.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, векторам, кодирующим описанный выше CAR, предлагаемый в изобретении.

Полинуклеотид может содержаться в кассете экспрессии или экспрессионном векторе (например, в плазмиде, предназначенной для интродукции в бактериальную клетку-хозяина, или в вирусном векторе, таком как бакуловирусный вектор, предназначенный для трансфекции клетки-хозяина из насекомого, или плазмиде или вирусном векторе, таком как лентивирус, предназначенной/предназначенном для трансфекции клетки млекопитающего-хозяина).

Специалистам в данной области должно быть известно, что вследствие вырожденности генетического кода могут иметь место значительные вариации в этих полинуклеотидных молекулах. Предпочтительно, нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат оптимизированные кодоны для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно для экспрессии в человеческих клетках. Оптимизация кодонов относится к замене в представляющей интерес последовательности тех кодонов, которые в целом редко встречаются в характеризующихся высоким уровнем экспрессии генах рассматриваемых видов, на кодоны, которые в целом часто встречаются в характеризующихся высоким уровнем экспрессии генах указанных видов, такие кодоны, кодирующие аминокислоты, являются кодонами, которые подлежат замене.

Терапевтические применения

В другом варианте осуществления изобретения выделенную клетку или иммунную клетку, которая экспрессирует CAR, указанный в настоящем описании, полученную различными способами, или клеточную линию, полученную из указанной выделенной клетки, описанной выше, можно применять в качестве лекарственного средства.

В другом варианте осуществления изобретения указанное лекарственное средство можно применять для лечения патологий, таких как рак, у пациента, нуждающегося в этом.

В другом варианте осуществления изобретения указанную выделенную клетку или иммунную клетку, которая экспрессирует указанный в настоящем описании CAR, предлагаемую в изобретении, или клеточную линию, полученную из указанной выделенной клетки, можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологии, такой как рак, у пациента, нуждающегося в этом.

Другой объект настоящего изобретения относится к способам лечения пациентов, нуждающихся в этом, где указанный способ включает по меньшей мере одну из следующих стадий, на которых:

(а) получают иммунную клетку, которую можно создавать с помощью одного из ранее описанных способов;

(б) вводят указанные трансформированные иммунные клетки указанному пациенту.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанную иммунную клетку, предпочтительно Т-клетки, можно подвергать интенсивному размножению Т-клеток in vivo и их можно сохранять в течение продолжительного периода времени.

Указанное лечение может быть облегчающим, излечивающим или профилактическим. Оно может представлять собой либо составную часть аутологичного иммунотерапевтического лечения, либо составную часть аллогенного иммунотерапевтического лечения. Понятие «аутологичный» означает, что клетки, клеточная линия или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, получают из организма указанного пациента или из организма совместимого по человеческому лейкоцитарному антигену (HLA) донора. Понятие «аллогенный» означает, что клетки или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, получают не из организма указанного пациента, а получают из организма донора.

Указанное лечение можно применять для лечения пациентов, у которых диагностирован рак, вирусная инфекция, аутоиммунные нарушения или реакция «трансплантат против хозяина» (GvHD). Виды рака, которые можно лечить, включают опухоли, которые не васкуляризованы или практически не васкуляризованы, а также васкуляризованные опухоли. Виды рака могут включать несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли, например, лейкозы и лимфомы) или могут включать солидные опухоли. Типы рака, которые можно лечить с применением CAR, предлагаемого в изобретение, включают (но не ограничиваясь только ими) карциному, бластому и саркому, и определенные лейкозы и лимфоидные злокачественные нарушения, доброкачественные и злокачественные опухоли, и злокачественные заболевания, например, саркомы, карциномы и меланомы. Они включают также опухоли/виды рака у взрослых и педиатрические опухоли/виды рака.

Лечение можно осуществлять в сочетании с применением одного или нескольких типов противораковой терапии, выбранных из группы, включающей терапию на основе антител, химиотерапию, цитокиновую терапию, терапию с использованием дендритных клеток, генную терапию, гормональную терапию, свето-лазерную терапию и лучевую терапию.

Введение клеток или популяции клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, можно осуществлять любым пригодным методом, включая ингаляцию аэрозоля, инъекцию, прием внутрь, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Композиции, представленные в настоящем описании, можно вводить пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, путем внутривенной или внутрилимфатической инъекции, или внутрибрюшинно. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно вводят путем внутривенной инъекции.

Введение клеток или популяции клеток может заключаться во введении 10⁴-10⁹ клеток/кг веса тела, предпочтительно от 10⁵ до 10⁶ клеток/кг веса тела, включая все целочисленные количества клеток в указанных диапазонах. Клетки или популяцию клеток можно вводить в виде одной или нескольких доз. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде однократной дозы. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде более чем одной дозы в течение некоторого периода времени. График введения находится в компетенции лечащего врача и зависит от клинического состояния пациента. Клетки или популяцию клеток можно получать из любого источника, такого как банк крови или донор. Поскольку индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств рассматриваемого типа клеток для конкретного заболевания или состояний, находится в компетенции специалиста в данной области. Эффективное количество представляет собой количество, которое обеспечивает терапевтическое или профилактическое полезное действие. Вводимая доза должна зависеть от возраста, состояния здоровья и веса реципиента, вида одновременно применяемого лечения, если это имеет место, частоты обработки и природы требуемого действия.

В другом варианте осуществления изобретения клетки или композицию, содержащую эти клетки, вводят в указанном эффективном количестве парентерально. Указанное введение может представлять собой внутривенное введение. Указанное введение можно осуществлять непосредственно путем инъекции в опухоль.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки вводят пациенту в сочетании с осуществлением (например, до, одновременно или после) любого количества соответствующих форм лечения, включая (но не ограничиваясь только ими) лечение с помощью средств противовирусной терапии, таких как цидофовир и интерлейкин-2, цитарабин (известный также под названием ARA-C), или лечение натализумабом пациентов с MS (рассеянный склероз), или лечение эфализумабом пациентов с псориазом, или другие виды лечения пациентов с PML (прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия). В других вариантах осуществления изобретения Т-клетки, предлагаемые в изобретении, можно применять в сочетании с химиотерапией, лучевой терапией, иммунодепрессантами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными агентами, такими как САМРАТН, антитела к CD3, или с другими видами терапии на основе антител, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. Эти лекарственные средства или ингибируют кальций-зависимую фосфатазу кальцинеурин (циклоспорин и FK506), или ингибируют киназу p70S6, которая важна для индуцируемой фактором роста передачи сигнала (рапамицин) (Henderson, Naya и др., Immunology 73(3), 1991, сс. 316-321; Liu, Albers и др., 31(16), 1992, сс. 3896-3901; Bierer, Hollander и др., Curr Opin Immunol 5(5), 1993, сс. 763-773). В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, Т-клеточной абляционной терапией с использованием либо химиотерапевтических средств, таких как флударабин, либо внешней лучевой терапии (XRT), циклофосфамида, либо антител, таких как OKT3 или САМРАТН. В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят после осуществления В-клеточной абляционной терапии с использованием агентов, которые взаимодействуют с CD20, таких, например, как ритуксан. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения индивидуумов можно подвергать стандартной обработке химиотерапевтическими средствами в высокой дозе с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения после трансплантации индивидуумам вводят путем инфузии размноженные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении. В еще одном варианте осуществления изобретения размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.

Другие определения

- Аминокислотные остатки в полипептидной последовательности обозначают в настоящем описании с помощью однобуквенного кода, согласно которому, например, Q обозначает Gln или остаток глутамина, R обозначает Arg или остаток аргинина и D обозначает Asp или остаток аспарагиновой кислоты.

- Нуклеотиды обозначают следующим образом: однобуквенный код используют для обозначения основания нуклеозида: а обозначает аденин, t обозначает тимин, с обозначает цитозин и g обозначает гуанин. Для вырожденных нуклеотидов r обозначает g или а (пуриновые нуклеотиды), k обозначает g или t, s обозначает g или с, w обозначает а или t, m обозначает а или с, у обозначает t или с (пиримидиновые нуклеотиды), d обозначает g, а или t, v обозначает g, а или с, b обозначает g, t или с, h обозначает a, t или с и n обозначает g, a, t или с.

- В контексте настоящего описания понятия «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотиды» относятся к нуклеотидам и/или полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, созданным с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и фрагментам, созданным путем лигирования, расщепления, обработки эндонуклеазами и обработки экзонуклеазами. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, которые являются встречающимися в естественных условиях нуклеотидами (такими как ДНК или РНК) или аналогами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов (например, энантиомерными формами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов), или представляют собой их комбинацию. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения в сахарных фрагментах и/или во фрагментах, содержащих пиримидиновые или пуриновые основания. Модификации сахаров включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп на галогены, алкильные группы, амины и азидогруппы, или сахара могут быть функционализированы до простых или сложных эфиров. Кроме того, весь сахарный фрагмент может быть заменен стерически и электронно сходными структурами, такими как аза-сахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примерами модификаций во фрагменте, представляющем собой основание, могут служить алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть сшиты фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными.

- Под химерным антигенным рецептором (CAR) подразумеваются молекулы, в которых объединены связывающий домен, направленный против компонента, который присутствует на клетке-мишени, например, происходящая из антитела специфичность в отношении требуемого антигена (например, опухолевого антигена), с активирующим Т-клетку внутриклеточным доменом с образованием химерного белка, который обладает специфической клеточной иммунной активностью против мишени. Как правило, CAR состоит из внеклеточного одноцепочечного антитела (scFv), слитого с внутриклеточным сигнальным доменом дзета-цепи из комплекса Т-клеточного рецептора антигена (scFv:ζ), и при экспрессии в Т-клетках обладает способностью перенаправлять распознавание антигена на основе специфичности моноклонального антитела.

- Под «вектором для доставки» или «векторами для доставки» понимают любой доставляющий вектор, который можно применять согласно настоящему изобретению для приведения в контакт с клеткой (т.е. для «контактирования») или доставки внутрь клеток или в субклеточные компартменты (т.е. для «интродукции») агентов/химических веществ и молекул (белков или нуклеиновых кислот), требующихся для осуществления настоящего изобретения. К ним относятся (но не ограничиваясь только ими) липосомальные векторы для доставки, вирусные векторы для доставки, векторы для доставки лекарственного средства, химические носители, полимерные носители, липоплексы, полиплексы, дендримеры, микропузырьки (ультразвуковые контрастные агенты), наночастицы, эмульсии или другие пригодные векторы для переноса. Такие векторы для доставки позволяют доставлять молекулы, химические вещества, макромолекулы (гены, белки) или другие векторы, такие как плазмиды, пептиды, разработанные фирмой Diatos. В этих случаях векторы для доставки представляют собой молекулы-носители. Под «вектором для доставки» или «векторами для доставки» понимают также методы доставки, предназначенные для осуществления трансфекции.

- Понятия «вектор» или «векторы» относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей способностью транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она сцеплена. К «векторам», применяемым согласно настоящему изобретению, относятся (но не ограничиваясь только ими) вирусный вектор, плазмида, РНКовый вектор или молекула линейной или кольцевой ДНК или РНК, которые могут состоять из хромосомальных, нехромосомальных, полусинтетических или синтетических нуклеиновых кислот. Предпочтительными векторами являются векторы, которые обладают способностью к автономной репликации (эписомальный вектор) и/или способны экспрессировать нуклеиновые кислоты, с которыми они сцеплены (экспрессионные векторы). Специалистам в данной области известно большое количество пригодных векторов, которые поступают в продажу.

К вирусным векторам относятся ретровирус, аденовирус, парвовирус (например, аденоассоциированный вирусы), коронавирус, РНК-содержащие вирусы с минус-цепью, такие как ортомиксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и вирус везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, вирус кори и вирус Сендай), РНК-содержащие вирусы с плюс-цепью, такие как пикорнавирус и альфавирус, и вирусы с двухцепочечной ДНК, включая аденовирус, вирус герпеса (например, вирус герпеса простого типов 1 и 2, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус) и вирус оспы (например, вирус коровьей оспы, вирус оспы птиц и вирус оспы канарейки). Другие вирусы включают, например, вирус Норвалк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповирус, гепаднавирус и вирус гепатита. Примерами ретровирусов являются: вирус птичьего лейкоза-саркомы, вирусы млекопитающих С-типа, В-типа, вирусы D-типа, группа HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin J.М., Retroviridae: The viruses and their replication, в: Fundamental Virology, 3-е изд., под ред. В.N. Fields и др., изд-во Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

- Под «лентивирусным вектором» подразумевают лентивирусные векторы на основе ВИЧ, которые являются очень перспективными с точки зрения доставки гена благодаря их относительно большой способности к упаковке, пониженной иммуногенности и их способности стабильно трансдуцировать с высокой эффективностью большой спектр различных типов клеток. Лентивирусные векторы, как правило, создают посредством кратковременной трансфекции клеток-продуцентов тремя (упаковывающая плазмида, оболочечная плазмида и плазмида переноса) или большим количеством плазмид. Подобно ВИЧ, лентивирусные векторы проникают в клетку-мишень посредством взаимодействия гликопротеинов вирусной поверхности с рецепторами на клеточной поверхности. После проникновения вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, опосредуемой комплексом вирусной обратной транскриптазы. Продуктом обратной транскрипции является двухцепочечная линейная вирусная ДНК, которая служит субстратом для вирусной интеграции в ДНК инфицированных клеток. Понятие «интегрирующие лентивирусные векторы (или LV)» обозначает, например (но не ограничиваясь только ими), такие векторы, которые способны интегрироваться в геном клетки-мишени. В противоположность этому, понятие «неинтегрирующие лентивирусные векторы (или NILV)» обозначает эффективные векторы для доставки генов, которые не интегрируются в геном клетки-мишени под действием вирусной интегразы.

- Векторы для доставки и векторы можно объединять или комбинировать с любыми методами клеточной пермеабилизации, такими как сонопорация или электропорация, или вариантами этих методов.

- Под «мутацией» подразумевают замену, делецию или инсерцию одного/одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, двадцати, двадцати пяти, тридцати, сорока, пятидесяти или большего количества нуклеотидов/аминокислот в полинуклеотидной (кДНК, ген) или полипептидной последовательности. Мутация может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Она может влиять также на структуру геномной последовательности или структуру/стабильность кодируемой мРНК.

- Под «функциональным вариантом» подразумевают обладающий каталитической активностью мутант белка или домена белка; такой мутант может обладать такой же активностью, что и родительский белок или домен белка, или дополнительными свойствами, или более высокой или более низкой активностью.

- Понятие «идентичность» относится к идентичности последовательностей двух молекул нуклеиновых кислот или полипептидов. Идентичность можно оценивать путем сравнения положений в каждой из последовательностей, которые можно выравнивать для целей сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято тем же самым основанием, то молекулы являются идентичными в этом положении. Степень сходства или идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в положениях нуклеотидных последовательностей. Для расчета идентичности двух последовательностей можно использовать различные алгоритмы и/или программы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, включая FASTA или BLAST, которые доступны в виде компонента пакета программ анализа последовательностей GCG (Университет Висконсина, Мэдисон, шт. Висконсин), и их можно применять, например, с использованием задаваемых по умолчанию параметров. Например, можно рассматривать полипептиды, обладающие идентичностью, составляющей по меньшей мере 70%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, с конкретными полипептидами, представленными в настоящем описании, и предпочтительно обладающие практически такими же функциями, а также полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды.

В контексте настоящего описания понятие «индивидуум» или «пациент» включает всех представителей царства животных, в том числе приматов кроме человека и человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения пациент представляет собой человека.

Помимо описанных выше признаков изобретение обладает и другими признаками, которые должны стать очевидными после ознакомления с представленными ниже примерами, в которых проиллюстрирован способ in vitro сортировки или in vivo истощения иммунных клеток, экспрессирующих CAR, для иммунотерапии, а также с прилагаемыми чертежами.

Пример 1. Создание направляемых ритуксимабом систем истощения, встроенных в анти-CD123 CAR

Все 10 CAR, имеющие различные конформации касательно химерного scFv (анти-CD123 scFv с мимеотопом(ами) CD20), представлены на фиг. 4: соответствующие им полипептидные последовательности представлены в SEQ ID NO: 1-10.

ДНК-конструкции 10 CAR транскрибировали в соответствующие мРНК посредством транскрипции in vitro и использовали для трансфекции путем электропорации первичных Т-клеток, свеже выделенных из лейкоцитарных пленок с помощью стандартной процедуры с использованием фиколла. Через 1 день после трансфекции Т-клетки выделяли и использовали для анализа цитотоксичности на основе описанного ниже метода проточной цитометрии.

Создание анти-CD123 CAR-T-клеток.

Для создания первичных Т-клеток, экспрессирующих анти-CD123 CAR, первичные Т-клетки сначала очищали из образцов лейкоцитарных пленок и активировали с использованием гранул Dynabeads® с активатором человеческих Т-клеток CD3/CD28. Через 3 дня после активации 1 млн активированных Т-клеток трансдуцировали лентивирусными векторами, несущими содержащую анти-CD123 CAR кассету экспрессии под контролем промотора Ef1α, с множественностью заражения (MOI) 1. Т-клетки поддерживали в культуре при 37°С в присутствии 5% CO₂, 20 нг/мл IL-2 (конечная концентрация) и 5% человеческой сыворотки группы АВ в среде X-vivo-15 (фирма Lonza) для дальнейшей характеризации. Через 5 дней после трансдукции клетки использовали для анализа цитотоксичности на основе метода проточной цитометрии.

Анализ цитотоксичности методом проточной цитометрии

Цитолитическую активность и специфичность анти-CD123 CAR-T-клетки оценивали с помощью стандартной процедуры анализа цитотоксичности на основе проточной цитометрии (см., например, Valton и др., Mol Ther; 23(9), 2015, сс. 1507-1518). Этот анализ заключался в следующем: метили 10⁴ CD123-позитивных опухолевых клеток и 10⁴ CD123-негативных контрольных клеток с помомщью 0,5 мМ CellTrace™ CFSE и 0,5 мМ CellTrace™ фиолетового (фирма Life Technology) и совместно инкубировали с 10⁵ эффекторных CAR-T-клеток (отношение Е/Т 10:1) в конечном объеме 100 мкл среды X-Vivo-15 в течение 5 ч при 37°С. Затем клетки выделяли и метили витальным маркером eFluor780, после чего фиксировали с использованием 4% PFA согласно описанному выше методу. После этого фиксированные клетки анализировали методом проточной цитометрии для определения их жизнеспособности. Частоту специфического лизиса клеток рассчитывали и отображали на графике следующим образом:

Частота специфического лизиса клеток = (Via CD123⁺-клетки с T/CD123^-клетки с T)/(Via CD123⁺-клетки/Via CD123^--клетки)

где Via CD123⁺ с Т и Via CD123^- с Т обозначают соответственно % жизнеспособных CD123⁺-клеток и CD123^--клеток, установленный после инкубации в течение 5 ч в присутствии CAR-T-клеток, и где Via CD123⁺-клетки и Via CD123^--клетки обозначают соответственно % CD123⁺-клеток и CD123^--клеток после инкубации в течение 5 ч в отсутствии CAR-T-клеток.

Результаты свидетельствуют о том, что Т-клетки, трансфектированные сконструированным анти-CD123-CAR, обладают способностью уничтожать клетки, моделирующие CD123-позитивные опухоли. Как продемонстрировано на фиг. 5, результаты описанного выше анализа цитотоксичности методом проточной цитометрии продемонстрировали, что Т-клетки, экспрессирующие SEQ ID 1-4, характеризовались такой же активностью, что и Т-клетки, экспрессирующие немодифицированный анти-CD123-CAR, имеющий SEQ ID 142 (фиг. 5). Эти данные позволяют предположить, что встраивание мимеотопа CD20 в последовательность анти-CD123 CAR (SEQ ID 142) не приводит к значимому ухудшению его способности специфически распознавать антиген CD123 и уничтожать экспрессирующие CD123 опухолевые клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, CAR, предлагаемые в изобретении, содержащие один из двух МАт-специфических эпитопов, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 35, обладают способностью специфически распознавать антиген, являющийся мишенью для CAR, и уничтожать клетки, экспрессирующие указанный антиген.

В соответствии с этими данными трансфектированные CAR-T-клетки анализировали в отношении их способности к дегрануляции при контакте с рекомбинантным белком CD123, иммобилизованным на 96-луночном планшете. В целом проведенные при создании изобретения эксперименты были предназначены для демонстрации того, что встраивание мимеотопа CD20 в последовательность анти-CD123 CAR не приводит к значимому ухудшению его способности специфически распознавать антиген CD123.

Для демонстрации способности ритуксимаба ингибировать цитотоксические функции Т-клеток в результате специфического распознавания мимеотопов CD20 трансфектированные Т-клетки инкубировали в присутствии CD123-позитивных опухолевых клеток, в присутствии или в отсутствии ритуксимаба и комплемента детеныша кролика. Цель состояла в том, чтобы продемонстрировать, что цитотоксическая активность и способность к дегрануляции трансфектированных Т-клеток ухудшается в присутствии ритуксимаба и комплемента детеныша кролика, что свидетельстует также о том, что эффективное распознавание сконструированного анти-CD123 CAR ритуксимабом приводит к истощению Т-клеток.

Пример 2. «Гибкость» МАт-направляемых систем истощения в анти-CD123 химерном антигенном рецепторе

Для дополнительной демонстрации «гибкости» МАт-направляемой системы истощения встраивали различные эпитопы или мимеотопы (SEQ ID NO: 35-42), специфические для таких МАт, как цетуксимаб, паливизумаб и ниволумаб, в конструкции анти-CD123 CAR с использованием таких же процедуры и архитектуры, которые применяли для мимеотопа CD20, согласно методу, описанному в примере 1. Цель исследований состояла в том, чтобы продемонстрировать, что трансфектированные Т-клетки сохраняют свою цитолитическую активность и способность к дегрануляции в отношении CD123-позитивных опухолевых клеток. Кроме того, эксперименты планировали так, чтобы продемонстрировать, что трансфектированные Т-клетки истощаются некоторыми из вышеуказанных МАт.

Пример 3. Ритуксимаб-зависимое истощение анти-CD123 CAR, содержащих МАт-направляемую систему истощения

Для изучения способности МАт-направляемой системы истощения обеспечивать истощение анти-CD123 CAR-T-клеток трансдуцированные Т-клетки, экспрессирующие CAR, имеющий SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, или немодифицированный анти-CD123 CAR (SEQ ID NO: 142), подвергали анализу с целью оценки комплементзависимой цитотоксичности (CDC).

Анализ CDC

Анализ CDC заключался в том, что 0,2×10⁶ трансдуцированных Т-клеток инкубировали либо индивидуально, либо в присутствии ритуксимаба (RTX, фирма ROCHE, 400 нг) и комплемента детеныша кролика (BRC, фирма AbD Serotec, каталожный номер С12СА, 100 мкл раствора, разведенного согласно протоколу производителя) в течение 3 ч при 37°С в конечном объеме 400 мкл среды Xvivo с 10% FBS. По окончании инкубации анти-CD123 CAR-T-клетки выделяли и метили рекомбинантным белком CD123, слитым с Fc-фрагментом (SEQ ID 143) и меченным РЕ вторичным моноклональным антителом к Fc (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный номер 115-115-164, разведенное в соотношении 1/200). Затем клетки выделяли в 4% PFA, после чего анализировали с помощью проточной цитометрии. Стратегия установки дискриминационного окна в методе проточной цитометрии заключалась в определении жизнеспособности анти-CD123 CAR-позитивных Т-клеток (РЕ-позитивные клетки) среди синглетов, обнаруженных во всей популяции клеток. Этот анализ проводили на клетках, которые инкубировали индивидуально и в присутствии RTX и BRC. Результаты выражали в виде отношения, обозначенного как «относительная частота встречаемости жизнеспособных клеток среди анти-CD123 CAR-позитивных Т-клеток (по отношению к результатам контрольного эксперимента)», представленного ниже:

(частота встречаемости жизнеспособных клеток среди анти-CD123 CAR-позитивных Т-клеток, полученная в присутствии RTX и BRC)×100/(частота встречаемости жизнеспособных клеток среди анти-CD123 CAR-позитивных Т-клеток, полученная в отсутствии RTX и BRC)

Результаты свидетельствуют о том, что все архитектуры CAR позволяют осуществлять RTX-зависимое истощение CAR-T-клеток (фиг. 6). CAR-T-клетки, экспрессирующие SEQ ID NO: 3 и 4, истощались более эффективно, чем клетки, экспрессирующие SEQ ID NO: 1 и 2, это позволяет предположить, что количество мимеотопов CD20, присутствующих в архитектуре CAR, влияет на степень и/или кинетику истощения Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR, предлагаемые в изобретении, которые имеют архитектуры, проиллюстрированные на фиг. 4, позволяют осуществлять ритуксимаб-зависимое истощение CAR-T-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR, предлагаемые в изобретении, которые содержат по меньшей мере 2 МАт-специфических эпитопа, предпочтительно имеющие архитектуру CAR, соответствующую SEQ ID NO: 3 или 4, характеризуются способность к наиболее эффективному истощению.

Пример 4. Эффективность МАт-направляемой системы истощения в клетках, экспрессирующих анти-ВСМА CAR, которые содержат одни или несколько МАт-специфических эпитопов во внеклеточном домене

Для изучения способности МАт-направляемой системы истощения обеспечивать истощение анти-ВСМА CAR-T-клеток конструировали 15 CAR с различной архитектурой (SEQ ID 125-139, фиг. 7). Указанные архитектуры создавали таким образом, чтобы они содержали 1, 2 или 3 мимеотопа CD20, находящихся в различных положениях внеклеточного домена анти-ВСМА CAR (SEQ ID NO: 125), а именно, в N-концевом домене, в линкерном домене, разделяющем V1 и V2 ScFv или в обратном направлении относительно шарнира CD8, связывающего ScFv с трансмембранным доменом CAR.

Для создания первичных Т-клеток, экспрессирующих анти-ВСМА CAR, первичные Т-клетки сначала очищали из образцов лейкоцитарных пленок и активировали с использованием гранул Dynabeads® с активатором человеческих Т-клеток CD3/CD28. Через 3 дня после активации 5 млн активированных Т-клеток трансфектировали либо 15, либо 30 мкг полиаденилированной мРНК, кодирующей анти-ВСМА CAR с различной архитектурой (SEQ ID 125-139, фиг. 7). Затем Т-клетки выдерживали в культуре при 37°С в присутствии 5% СО₂, 20 нг IL-2 (конечная концентрация) и 5% человеческой сыворотки АВ в среде X-vivo-15 (фирма Lonza) для дальнейшей характеризации. Через 1 день после трансфекции клетки подвергали анализу CDC, анализу цитотоксичности методом проточной цитометрии, анализу для обнаружения и анализу высвобождения интерферона γ (IFN γ).

Анализ CDC

Анализ CDC заключался в том, что 0,2×10⁶ трансфектированных клеток инкубировали либо индивидуально, либо в присутствии ритуксимаба (RTX, фирма ROCHE, 400 нг) и комплемента детеныша кролика (BRC, фирма AbD Serotec, каталожный номер С12СА, 100 мкл раствора, разведенного согласно протоколу производителя) в течение 2 ч при 37°С в конечном объеме 400 мкл среды Xvivo с 10% FBS. По окончании инкубации анти-ВСМА CAR-T-клетки выделяли и метили рекомбинантным белком ВСМА, слитым с Fc-фрагментом (SEQ ID 151) и меченным РЕ вторичным моноклональным антителом к Fc (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный номер 115-115-164, разведенное в соотношении 1/200). Затем клетки выделяли в 4% PFA, после чего анализировали с помощью проточной цитометрии. Стратегия установки дискриминационного окна в методе проточной цитометрии заключалась в определении жизнеспособности анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток (РЕ-позитивные клетки) среди синглетов, обнаруженных во всей популяции клеток. Этот анализ проводили на клетках, которые инкубировали индивидуально и в присутствии RTX и BRC. Результаты выражали в виде отношения, обозначенного как «относительная частота встречаемости жизнеспособных клеток среди BCMA-CAR-позитивных Т-клеток (по отношению к результатам контрольного эксперимента)», представленного ниже:

(частота встречаемости жизнеспособных клеток среди анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток, полученная в присутствии RTX и BRC)×100/(частота встречаемости жизнеспособных клеток среди анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток, полученная в отсутствии RTX и BRC)

Анализ цитотоксичности методом проточной цитометрии

Цитолитическую активность и специфичность анти-ВСМА CAR-T-клетки оценивали с помощью стандартной процедуры анализа цитотоксичности на основе проточной цитометрии (см. Valton и др., Mol Ther; 23(9), 2015, сс. 1507-1518). Этот анализ заключался в следующем: метили ВСМА-позитивные опухолевые клетки-мишени (Т, Н020) с помощью 0,5 мМ CellTrace™ CFSE (фирма Life Technology, инкубация в течение 10 мин при 37°С согласно протоколу производителя) и их совместно инкубировали с 10⁵ эффекторных (Е) анти-BCMA-CAR-T-клеток (соотношение Е/Т 10:1) в конечном объеме 100 мкл среды X-Vivo-15 в течение 5 ч при 37°С. Затем клетки выделяли и метили витальным маркером eFluor780, после чего фиксировали с использованием 4% PFA. После этого фиксированные клетки анализировали методом проточной цитометрии для определения их жизнеспособности.

Анализ высвобождения IFNγ

Для изучения аутоактивации Т-клетки, экспрессирующей различные анти-ВСМА CAR, содержащие RTX-специфические эпитопы, клинически значимой дозой RTX, инкубировали первичные Т-клетки, трансфектированные мРНК, кодирующей SEQ ID 125, 130-139, через 1 день после трансфекции в течение 72 ч в среде X-vivo-15, дополненной 5% сыворотки АВ, 20 нг/мл IL-2 в отсутствии или в присутствии 500 мкг/мл RTX в концентрации 0,1×10⁶ клеток/лунку в конечном объеме 100 мкл. Затем CAR-T-клетки осаждали центрифугированием, выделяли супернатант и анализировали методом ELISA (с использованием набора для человеческого IFNгамма Quantikine ELISA, фирма RandD systems, каталожный номер DIF50) для определения количества IFN-γ, высвободившегося в культуральную среду. В качестве положительного контроля для CAR-T-клеточной активации и высвобождения IFNγ клетки инкубировали с 10 мкг/мл фитогемагглютинина (РНА).

Очистка анти-ВСМА CAR-T-клеток с использованием набора для очистки Miltenyi CD34

Для анализа пригодности для очистки анти-ВСМА CAR с определенными архитектурами (содержащих эпитоп CD34, SEQ ID NO: 144, распознаваемый антителом QBEND10), проводили очистку 100×10⁶ первичных Т-клеток, постоянно экспрессирующих SEQ ID 128, с использованием набора CD34 MicroBead (фирма Miltenyi, каталожный номер 130-046-702) согласно протоколу производителя.

Результаты

Способность к истощению анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток

Результаты свидетельствуют о том, что Т-клетки, экспрессирующие SEQ ID 126-139, все подвергались истощению в различной степени при применении BRC и RTX в отличие от клеток, экспрессирующих немодифицированных анти-ВСМА CAR (SEQ ID NO: 125), которые не подвергались заметному истощению (фиг. 8А). Результаты свидетельствуют о том, что эффективность истощения возрастала с увеличением количества мимеотопов CD20, присутствующих в архитектуре CAR. Кроме того, результаты демонстрируют, что разделение нескольких мимеотопов CD20 доменом большего размера, чем GS-линкеры, повышает эфэфективность истощения, что видно при сравнении степени истощения, достигаемой для Т-клеток, экспрессирующих SEQ ID NO: 127 и SEQ ID NO: 137, содежащих 3 мимеотопа CD20, а также SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 136, содержащих 2 мимеотопа CD20 (фиг. 7-8А).

В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, с архитектурой CAR, представленной в SEQ ID NO: 126-139, обеспечивает зависящее от ритуксимаба истощение CAR-T-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, который имеет архитектуру CAR, представленную в SEQ ID 136, 137, 138, т.е. когда CAR содержит по меньшей мере два идентичных МАт-специфических эпитопа, разделенных одним или несколькими другими доменами (такими как VH, VL, VH-L1-VL, …), обеспечивает наиболее эффективное истощение.

Цитотоксическая активность анти-ВСМА CAR⁺-T-клеток

Результаты анализа цитотоксичности методом проточной цитометрии продемонстрировали, что все архитектуры (SEQ ID 126-139) обладали способностью распознавать и уничтожать ВСМА-экспрессирующие опухолевые клетки Н929 в степени, сопоставимой с той, которая присуща Т-клеткам, экспрессирующим анти-ВСМА CAR с немодифицированной версией архитектуры (SEQ ID NO: 125, фиг. 9). С результатами, полученными в примере 1, согласуется тот факт, что присутствие 1, 2 или 3 МАт-специфических эпитопов и, в частности, 1, 2 или 3 мимеотопов CD20 в архитектуре CAR не оказывает значимого влияния на цитолитическую активность анти-ВСМА CAR-T-клеток.

В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR, предлагаемые в изобретении, которые имеют архитектуры CAR, представленные в SEQ ID NO: 126-139, обладают цитотоксической активностью, сходной с активностью CAR без МАт-специфического эпитопа, такого как CAR, имеющий SEQ ID 125.

Сортировка анти-ВСМА-позитивных CAR-T-клеток из гетерогенной популяции клеток

Для тестирования пригодности Т-клетки, экспрессирующей анти-ВСМА CAR, имеющий SEQ ID 128 (фиг. 7А) для очистки из гетерогенной популяции клеток, проводили очистку всей состоящей из 100×10⁶ первичных Т-клеток популяции, которая содержала 31,5% CAR-позитивных клеток, с использованием набора CD34 MicroBead согласно протоколу производителя. Результаты продемонстрировали, что очищенная фракция содержала примерно 90% анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток, это свидетельствует о том, что процесс очистки был эффективным (фиг. 10). Из 31,5×10⁶ анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток примерно 20×10⁶ анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток были выделены после очистки, это свидетельствовало о том, что было потеряно менее 40% анти-ВСМА CAR-позитивных Т-клеток в процессе очистки.

Анализ высвобождения IFN-γ

Результаты анализа методом ELISA продемонстрировали, что присутствие одного или нескольких мимеотопов CD20 в архитектуре CAR не влияет на способность CAR-T-клеток к активации в присутствии RTX (фиг. 11). Фактически результаты свидетельствуют о том, что уровни высвобождения IFNγ для всех архитектур в присутствии RTX были сходными с уровнем высвобождения IFNγ в отсутствии RTX.

Пример 5. Архитектуры гибридного анти-ВСМА химерного антигенного рецептора для оптимального истощения и очистки CAR-T-клеток

Для повышения способности анти-ВСМА CAR-T-клеток к истощению и одновременно для того, чтобы иметь возможность осуществлть их сортировку, конструировали две новые архитектуры гибридного CAR, имеющие SEQ ID NO: 140 и 141 (фиг. 7В). Эти две архитектуры содержали три мимеотопа CD20, отделенные друг от друга белковыми доменами, и один эпитоп CD34. Их способность к истощению в присутствии RTX и BRC оценивали с помощью анализа CDC согласно протоколу, описанному в примере 4. Результаты продемонстрировали, что указанные две архитектуры подвергались эффективному истощению в степени, сходной со степенью истощения Т-клеток, экспрессирующих SEQ ID 137 (фиг. 8Б). Оценивали также их цитолитические свойства с применением описанного ранее анализа на основе проточной цитометрии. Результаты продемонстрировали, что они обладали цитотоксической активностью, сходной с активностью Т-клеток, экспрессирующих немодифицрованный анти-ВСМА CAR (SEQ ID NO: 125), это свидетельствует о том, что присутствие мимеотопов CD20 и эпитопа CD34 (SEQ ID NO: 35 и 144 соответственно) не оказывает негативного влияния на цитолитическую активность CAR-T-клеток.

В случае некоторых вариантов CAR, предлагаемого в изобретении, с архитектурой CAR, представленной в SEQ ID 140, 141, т.е. когда CAR содержит три идентичных МАт-специфических эпитопа, распознаваемых разрешенным к применению антителом, таким как ритуксимаб, которые можно использовать для истощения клеток, и один МАт-специфический эпитоп, который можно использовать для очистки, достигалось наиболее эффективное истощение, а также оказалось возможным осуществлять эффективную очистку.

Согласно протоколу, описанному в примере 4, осуществляли сборку дополнительных CAR на основе архитектуры, представленной в SEQ ID NO: 140 и 141, но содержащих VH и VL ScFv, специфического в отношении CD19 (CAR, имеющий SEQ ID NO: 162-163 и 168-169), CD123 (CAR, имеющий SEQ ID NO: 164-165), CD20 (CAR, имеющий SEQ ID NO: 166-167). Их способность к истощению в присутствии RTX и BRC можно оценивать с помощью анализа CDC согласно протоколу, описанному в примере 4.

Пример 6. Универсальное обнаружение CAR-T-клеток, несущих МАт-направляемую систему истощения

Мониторинг и сравнение пролиферации различных CAR-T-клеток in vivo были утомительными и трудоемкими вследствие отсутствия универсальной системы обнаружения. Возможность обнаружения CAR с различной архитектурой тестировали с помощью проточной цитометрии с использованием RTX в качестве первичного антитело и конъюгированного с ФИТЦ моноклонального антитела к Fab'2-фрагменту (фирма Life technologies, каталожный номер H10101С, разведенного в соотношении 1/200) или с использованием меченного АРС моноклонального антитела к CD34, обозначенного как QBEND10 (фирма Miltenyi Biotec, каталожный номер 130-090-954, разведенного в соотношении 1/25). Результаты сравнивали с результатами параллельного обнаружения, проводимого с использованием рекомбинантного белка ВСМА, слитого с Fc-фрагментом (SEQ ID NO: 151) и меченного РЕ вторичного моноклонального антитела к FC (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный номер 115-115-164, разведенного в соотношении 1/200).

Результаты продемонстрировали, что частота встречаемости позитивных CAR-T-клеток, экспрессирующих SEQ ID NO: 128 и 130-139, обнаруженных с использованием RTX оказалась сходной с частотой встречаемости, полученной при обнаружении с использованием рекомбинантного белка ВСМА (фиг. 12). Сходные результаты получали когда CAR-T-клетки, экспрессирующие SEQ ID NO: 128, обнаруживали с использованием QBEND10 и ритуксимаба (фиг. 13). В совокупности полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие мимеотопа CD20 или эпитопа CD34 позволяет осуществлять эффективное и универсальное обнаружение CAR с различными архитектурами.

Пример 7. Анти-ВСМА CAR-T-клетки, экспрессирующие анти-ВСМА CAR, которые содержат один, два или три МАт-специфических эпитопа

7.1. Плазмиды

Указанные ниже содержащие мимеотоп CD20 CAR подвергали оптимизации кодонов, синтезировали и субклонировали в лентивирусном векторе pLVX-EF1a-IRES-Puro (фирма Clontech) с использованием сайтов рестрикции EcoRI (5') и MluI (3') (удаляя таким образом кассету IRES-Puro). Лентивирусы получали с использованием psPAX2, упаковывающей плазмиды HIV-1 gag-pol и pMD2.G, т.е. экспрессионной плазмиды VSV-G.

ВС30 (SEQ ID NO: 145) содержал следующие домены:

лидер-ВСМА30 VH-линкер-ВСМА30 VL-шарнир CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, где VH ВСМА30 и VL ВСМА30 имели SEQ ID NO: 97 и SEQ ID NO: 98 соответственно.

BC30-LM (SEQ ID NO: 146):

лидер-ВСМА30 VH-линкер-ВСМА30 VL-линкер(L)-мимеотоп (М)-шарнир CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, где VH ВСМА30 и VL ВСМА30 имели SEQ ID NO: 97 и SEQ ID NO: 98 соответственно и мимеотоп имел последовательность SEQ ID NO: 35.

BC30-LML (SEQ ID NO: 147) содержал следующие домены:

лидер-ВСМА30 VH-линкер-ВСМА30 VL-линкер(L)-мимеотоп (М)-линкер(L)-шарнир CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, где VH ВСМА30 и VL ВСМА30 имели SEQ ID NO: 97 и SEQ ID NO: 98 соответственно и мимеотоп имел последовательность SEQ ID NO: 35.

BC30-LMLM (SEQ ID NO: 148) содержал следующие домены:

лидер-ВСМА30 VH-линкер-ВСМА30 VL-линкер(L)-мимеотоп (М)-линкер(L)-мимеотоп (М)-шарнир CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, где VH ВСМА30 и VL ВСМА30 имели SEQ ID NO: 97 и SEQ ID NO: 98 соответственно и оба мимеотопа имели последовательность SEQ ID NO: 35.

BC30-LMLML (SEQ ID NO: 149) содержал следующие домены:

лидер-ВСМА30 VH-линкер-ВСМА30 VL-линкер(L)-мимеотоп (М)-линкер(L)-мимеотоп (М)-линкер(L)-шарнир CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, где VH ВСМА30 и VL ВСМА30 имели SEQ ID NO: 97 и SEQ ID NO: 98 соответственно и оба мимеотопа имели последовательность SEQ ID NO: 35.

7.2. Т-клеточная активация и трансдукция с использованием лентивирусов

Наивные Т-клетки выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) человека с использованием набора для выделения Pan-Т-клеток (фирма Miltenyi Biotec) и активировали в течение трех дней антителами к человеческому CD2, CD3 и CD28 (набор для активации/размножения Т-клеток - фирма Miltenyi Biotec). Лентивирусные векторы (LV) получали путем кратковременной трансфекции суб-конфлюэнтных клеток HEK-293Т/17 (Американская коллекция типовых культур (АТСС)) в 6-луночных планшетах. В целом метод состоял в следующем: осуществляли трансфекцию плазмидами pLVX, psPAX2 и pMD2.G в соотношении 4:3:1 соответственно, используя липофектамин 2000 (фирма Invitrogen) согласно инструкциям производителя. На следующий день среду заменяли средой для культивирования Т-клеток (5% человеческой сыворотки АВ в среде X-vivo-15 (фирма Lonza)), и через 48 ч после трансфекции собирали содержащий LV супернатант и фильтровали через шприцевый фильтр с размером пор 0,45 мкм (фирма Millipore). Активированные Т-клетки высевали из расчета 0,25×10⁶ клеток/мл в среду для культивирования Т-клеток, содержащую 40 нг/мл IL-2, и трансдуцировали путем добавления равного объема свежего содержащего LV супернатанта. Клетки культивировали при 37°С и 5% СО₂ в течение трех дней и использовали для анализа методом проточной цитометрии или размножали в свежей среде для Т-клеток, содержащей 20 нг/мл IL-2.

7.3. Обнаружение ВСМА CAR, содержащих мимеотопы CD20, с помощью проточной цитометрии

Для тестирования пригодности присутствующих внутри CAR мимеотопов CD20 для обнаружения и отслеживания CAR-T-клеток, проводили анализ методом проточной цитометрии на трансдуцированных Т-клетках с использованием либо биотинилированного белка ВСМА, который связывается с scFV-областью CAR, и затем конъюгированного с РЕ стрептавидина, либо антитела к CD20 ритуксимаба и затем конъюгированного с ФИТЦ античеловеческого IgG (ритуксимаб (ФИТЦ)). На фиг. 14А и 14Б продемонстрировано, что Т-клетки, трансдуцированные различными содержащими мимеотоп CD20 CAR, обнаруживали с сопоставимой эффективностью с помощью проточной цитометрии с использованием биотинилированного ВСМА и затем конъюгированного с РЕ стрептавидина. Эффективность обнаружения содержащегося(ихся) внутри CAR мимеотопа(ов) CD20 с использованием ритуксимаба была слабой в клетках, трансдуцированных LM-конструкцией (15,5%), но она была очень высокой в случае всех других протестированных форматов. Например, несущий LMLML-CAR был обнаружен в 85,6% клеток, это свидетельствует о том, что данный формат позволяет идентифицировать практически все клетки, экспрессирующие CAR (фиг. 14А и 14Б). Таким образом, присутствие двух эпитопов CD20, разделенных гибкими линкерами, дает возможность более сильно связываться с ритуксимабом и обеспечивает оптимальную систему для обнаружения CAR⁺-клеток.

Функциональность присутствующих внутри CAR эпитопов CD20 для обнаружения CAR-T-клетки оценивали путем сравнения системой маркер RQR8/ген суицида (SEQ ID NO: 150), которая состоит из компактного белка, содержащего два эпитопа CD20 и эпитоп CD34, который в норме совместно экспрессируется с CAR (Philip, Blood, 2014). Для этого эксперимента Т-клетки трансдуцировали лентивирусом, что обеспечивало совместную экспрессию ВСМА30 CAR (SEQ ID NO: 145) и белка RQR8 (SEQ ID NO: 150) (конструкция BC30-RQR8). Для сравнения Т-клетки трансдуцировали конструкцией ВСМА30 LMLML-CAR (конструкция BC30-R2 - SEQ ID NO: 149) и анализировали с помощью проточной цитометрии через три дня после трансдукции. Кроме того, нетрансдуцированные (NT) Т-клетки служили в качестве отрицательного контроля. На фиг. 15 продемонстрировано, что встраивание эпитопов CD20 в молекулу CAR значительно повышает обнаружение CAR-T-клеток с использованием антитела к CD20 ритуксимаба. Кроме того, имело место повышение эффективности трансдукции и экспрессии CAR в клетках, трансдуцированных конструкцией BC30-R2, по сравнению с клетками, трансдуцированными вектором, кодирующим RQR8 и CAR, что было установлено с помощью проточной цитометрии с использованием биотинилированного ВСМА (фиг. 15). Таким образом, встраивание эпитопов CD20 в молекулу CAR позволяет усиливать трансдукцию, повышать эффективность обнаружения и обеспечивает абсолютную корреляцию между экспрессией CAR и экспрессией МАт-специфического(их) эпитопа(ов).

7.4 - Присутствующие внутри CAR эпитопы CD20 повышают чувствительность CAR-T-клеток к комплементзависимой цитотоксичности

Способность присутствующих внутри CAR эпитопов CD20 обеспечивать избирательную элиминацию CAR-T-клеток оценивали in vitro с помощью анализа CDC. Цель состояла в том, чтобы продемонстрировать, что присутствие эпитопов CD20 в молекуле CAR делает CAR-T-клетки высоко чувствительными к опосредуемому ритуксимабом истощению. Для этого эксперимента Т-клетки, трансдуцированные либо конструкцией BC30-R2, либо конструкцией ВС30-RQR8, смешивали с 25% комплемента детеныша кролика (фирма AbD serotec) в присутствии ритуксимаба (100 мкг/мл) или без него и инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 ч. Избирательную элиминацию CAR-T-клеток оценивали с помощью анализа методом проточной цитометрии с использованием биотинилированного белка ВСМА. На фиг. 16 продемонстрировано, что хотя как система, содержащая RQR8, так и система, содержащая присутствующий внутри CAR эпитоп CD20-ген суицида обеспечивали истощение CAR-T-клеток, клетки, трансдуцированные конструкцией BC30-R2, истощались более эффективно, чем клетки, экспрессирующие RQR8. Как и ожидалось, Т-клетки, экспрессирующие ВСМА30 CAR, но не имеющие эпитопы CD20 (конструкция ВС30), сохранялись. Эти различия могут быть обусловлены высоким уровнем экспрессии BC30-R2 CAR и абсолютной корреляцией между экспрессией CAR и экспрессией гена суицида.

7.5. Встраивание эпитопов CD20 в CAR не приводит к ухудшению цитолитической активности CAR-T-клеток

Для решения вопроса о том, может ли встраивание эпитопов CD20 между шарниром и областями scFv CAR ухудшать активность CAR, оценивали с помощью анализа цитотоксичности. В целом метод состоял в следующем: Т-клетки, экспрессирующие либо конструкцию BC30-R2, либо конструкцию ВС30-RQR8, инкубировали с позитивными по гену люциферазы клетками-мишенями MM1S в различных соотношениях. Для этих цитолитических анализов клетки высевали в 96-луночные белые непрозрачные планшеты для культуры тканей в конечном объеме 100 мкл в содержащую 5% человеческой сыворотки АВ среду X-vivo-15 (фирма Lonza). Через 4 ч температуру клеточной культуры доводили до комнатной и в каждую лунку добавляли один объем реагента Bright-Glo™ (фирма Promega). Люминесценцию измеряли с помощью люминометра для микропланшетов GLOMAX 96 (фирма Promega) и рассчитывали процент лизиса клеток согласно следующей формуле:

100×(1 - (лизис в образце - максимальный лизис)/(спонтанный лизис -максимальный лизис)).

Максимальный лизис определяли путем добавления 8% Тритона Х-100 (фирма Sigma) к Luc⁺-MM1S-клеткам. Для определения спонтанного лизиса клетки MM1S инкубировали в отсутствии эффекторных CAR-T-клеток.

Результаты продемонстрировали, что BC30-R2 CAR-T-клетки эффективно элиминировали экспрессирующие ВСМА клетки MM1S in vitro (фиг. 17). Кроме того, на цитолитическую активность BC30-R2 CAR-T-клеток не влиял ритуксимаб (100 мкг/мл), который добавляли к популяции эффекторных клеток за 2 ч до того, как эти клетки смешивали с клетками-мишенями (фиг. 17). Целью этого эксперимента было продемонстрировать, что встраивание эпитопов CD20 в молекулу ВС30 CAR не влияет на ее способность опосредовать цитолиз ВСМА⁺-клеток-мишеней даже в присутствии ритуксимаба.

7.6. Связывание ритуксимаба с присутствующим внутри CAR эпитопами CD20 не приводит к активации CAR-T-клеток.

Для исследования того, может ли перекрестное сшивание CAR с ритуксимабом приводить к активации Т-клеток вследствие агрегации CAR на клеточной поверхности, BC30-R2 CAR-T-клетки выращивали в присутствии ритуксимаба. Антитело к CD3 OKT3 (фирма eBioscience) вызывает перекрестное сшивание Т-клеточного рецептора (TCR), приводя к клеточной активации и пролиферации, и его применяли в качестве положительного контроля. В целом метод состоял в следующем: BC30-R2 CAR-T-клетки культивировали в среде для Т-клеток в присутствии/отсутствии ритуксимаба в течение трех дней. Затем оценивали активацию Т-клеток путем измерения экспрессии маркеров активации CD25 и CD69 методом проточной цитометрии. Это эксперимент продемонстрировал, что процент активированных Т-клеток в присутствии RTX не отличался значительно от контроля (ЗФР). Таким образом, растворимый ритуксимаб не оказывал значимого воздействия на состояние активации ВС30-R2 CAR-T-клеток (фиг. 18).

Список процитированной литературы

Arbiza J., Taylor G., J.A., Furze J., Wyld S., Whyte P., Stott E.J., Wertz G., Sullender W., Trudel M. и др., Characterization of two antigenic sites recognized by neutralizing monoclonal antibodies directed against the fusion glycoprotein of human respiratory syncytial virus, J Gen Virol.; 73 (9), 1992, cc. 2225-2234.

Benjamin RJ и Waldmann H., Induction of tolerance by monoclonal antibody therapy, Nature 520, 1986, cc. 449-451.

Boch J., H. Scholze и др., Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors, Science 326(5959), 2009, cc. 1509-1512.

Budde L.E., Berger C, Lin Y., Wang J., Lin X., Frayo S.E., Brouns S.A., Spencer D.M., Till B.G., Jensen M.C., Riddell S.R., Combining a CD20 chpmeric antigenic receptor and an inducible capsize 9 suicide switch to improve the efficacy and safety of T cell adoptive immunotherapy for lymphoma. Plops One. Dec 17;8(12), 2013, e82742.

Buller R.M., Holmes K.L., Hugging A., Fredrickson T.N., Morse H.C., Induction of catatonic T cell responses in vivo in the absence of CD4 helper cells, Nature; 328, 1987, cc. 77-79.

Cobbold S.P., Martin G., Qin S. и Waldmann H., Monoclonal antibodies to promote marrow engraftment and tissue graft rejection, Nature 323, 1986, cc. 164-166.

Dolan D.E., Gupta S., PD-1 pathway inhibitors: changing the landscape of cancer immunotherapy, Cancer Control. 21(3), 2014, cc. 231-237.

Ера V.С., O. Dolezal и др., Structural model for the interaction of a designed Ancyra Repeat Protein with the human epidermal growth factor receptor 2. Plops One 8(3), 2013, e59163.

Fedora V.D., Them Eli M. и Sade lain M., PD-1- and CTLA-4-Based Inhibitory Chimerical Antigen Receptors (vicars) Divert Off-Target Immunotherapy Responses. Sei Trans Med:5 (215), 2013, c. 15

Friedrich K., J.R. Hanauer и др., DARPin-targeting of measles virus: unique bispecificity, effective oncolysis, and enhanced safety. Mol Ther 21(4), 2013, cc. 849-859.

Jena В., G. Dotti и др., Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor, Blood 116(7), 2010, cc. 1035-1044.

Jost C., J. Schilling и др., Structural Basis for Eliciting a Cytotoxic Effect in HER2-Overexpressing Cancer Cells via Binding to the Extracellular Domain of HER2. Structure 21(11), 2013, cc. 1979-1991.

Moscou M.J. и A.J. Bogdanove, A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors, Science 326(5959), 2009, c. 1501.

Park T.S., S.A. Rosenberg и др., Treating cancer with genetically engineered T cells, Trends Biotechnol 29(11), 2011, cc. 550-557.

Philip В., Kokalaki E., Mekkaoui L., Thomas S., Straathof K., Flutter В., Marin V., Marafioti Т., Chakraverty R., Linch D., Quezada S.A., Peggs K.S., Pule M., A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy. Blood. 124(8), 2014, cc. 1277-1287.

Riemer А.В., Kurz H., Klinger M., Scheiner O., Zielinski С. и Jensen-Jarolim E., Vaccination with cetuximab mimotopes and biological properties of induced anti-epidermal growth factor receptor antibodies, J Natl Cancer Inst.; 97(22), 2005, cc. 1663-1670.

Valton J., Guyot V., Marechal A., Filhol JM., Juillerat A., Duclert A., Duchateau P., Poirot L., A multidrug resistant engineered CAR T cell for allogeneic combination immunotherapy, Mol Ther; 23(9), 2015, cc. 1507-1518/

Philip В., Kokalaki E., Mekkaoui L., Thomas S. и др., A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy, Blood; 124(8), 2014, cc. 1277-1287.

Варианты осуществления изобретения:

1. Полипептид, который кодирует химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий по меньшей мере один внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный по меньшей мере VH-цепью и VL-цепью, специфическими в отношении антигена-маркера клеточной поверхности, где указанный внеклеточный связывающий домен включает по меньшей мере один МАт-специфический эпитоп, предназначенный для связывания специфическим в отношении эпитопа МАт, для in vitro клеточной сортировки и/или in vivo клеточного истощения иммунных клеток, экспрессирующих указанный CAR.

2. Полипептид по варианту осуществления 1, в котором указанный МАт-специфический эпитоп локализован между VH- и VL-цепями.

3. Полипептид по варианту осуществления 1 или 2, в котором указанные VH- и VL-цепи и МАт-специфический эпитоп связаны друг с другом с помощью по меньшей мере одного линкера и с трансмембранным доменом указанного CAR с помощью шарнира.

4. Полипептид по варианту осуществления 3, в котором МАт-специфический эпитоп соединен с VH- и VL-цепями двумя линкерами.

5. Полипептид по одному из вариантов осуществления 1-4, в котором МАт-специфический эпитоп получают из одного из полипептидов, перечисленных в таблице 1.

6. Полипептид по одному из вариантов осуществления 1-4, в котором указанные VH- и VL-цепи имеют последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90%, и более предпочтительно более чем на 95% последовательности антигена-мишени SEQ ID NO: 43 (антиген CD 19), SEQ ID NO: 44 (антиген CD38), SEQ ID NO: 45 (антиген CD123), SEQ ID NO: 46 (антиген CS1), SEQ ID NO: 47 (антиген ВСМА), SEQ ID NO: 48 (антиген FLT-3), SEQ ID NO: 49 (антиген CD33), SEQ ID NO: 50 (антиген CD70), SEQ ID NO: 51 (антиген EGFR-3v) и SEQ ID NO: 52 (антиген WT1).

7. Полипептид по одному из вариантов осуществления 1-5, в котором указанные VH- и VL-цепи имеют последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90%, и более предпочтительно более чем на 95% последовательности антигена-мишени SEQ ID NO: 53-64 (антиген CD 19), SEQ ID NO: 65-76 (антиген CD33), SEQ ID NO: 77-84 (антиген 5T4), SEQ ID NO: 85-90 (антиген ROR1), SEQ ID NO: 91-94 (антиген EGFRvIII), SEQ ID NO: 95-102 (антиген ВСМА), SEQ ID NO: 103-112 (антиген CS1) и SEQ ID NO: 113-124 (антиген CD 123).

8. Полипептид по одному из вариантов осуществления 1-7, в котором указанные VH- и VL-цепи имеют в качестве эпитопа-мишени последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90%, и более предпочтительно более чем на 95% антигену CD20, имеющему SEQ ID NO: 11.

9. Полипептид по одному из вариантов осуществления 1-8, в котором CAR представляет собой одноцепочечный CAR.

10. Полипептид по варианту осуществления 9, в котором указанный полипептид CAR идентичен более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90%, и более предпочтительно более чем на 95% SEQ ID NO: 1-10.

11. Полипептид по одному из вариантов осуществления 1-10, в котором CAR представляет собой многоцепочечный CAR.

12. Полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-9, в котором указанный CAR содержит сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.

13. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по варианту осуществления изобретения 12.

14. Сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая на своей клеточной поверхности химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-12.

15. Сконструированная иммунная клетка по варианту осуществления изобретения 14, полученная из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов.

16. Сконструированная иммунная клетка по варианту осуществления изобретения 14 или 15, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства.

17. Способ конструирования иммунной клетки по одному из вариантов осуществления изобретения 14-16, включающий:

(а) получение иммунной клетки;

(б) интродукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-12.

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

18. Способ конструирования иммунной клетки по варианту осуществления изобретения 17, в котором иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

19. Способ сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, включающий приведение в контакт популяции иммунных клеток, сконструированных согласно одному из вариантов осуществления изобретения 14-16, с антиген-специфическими МАт для того, чтобы собирать только экспрессирующие CAR иммунные клетки.

20. Способ сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток по варианту осуществления изобретения 19, в котором МАт представляет собой ритуксимаб.

21. Способ конструирования иммунной клетки по одному из вариантов осуществления изобретения 19-20, в котором иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

22. Способ истощения иммунной клетки, сконструированной согласно одному из вариантов осуществления изобретения 14-16, или экспрессирующей CAR иммунной клетки, отсортированной согласно одному из вариантов осуществления изобретения 19-21, включающий приведение в контакт указанной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки со специфическими в отношении эпитопа МАт.

23. Способ истощения иммунной клетки или экспрессирующей CAR иммунной клетки по варианту осуществления изобретения 22, в котором указанное специфическое в отношении эпитопа МАт конъюгируют с молекулой, обладающей способностью активировать систему комплемента.

24. Способ истощения иммунной клетки или экспрессирующей CAR иммунной клетки по одному из вариантов осуществления изобретения 22-23, в котором цитотоксическое лекарственное средство связывают со специфическими в отношении эпитопа МАт.

25. Способ истощения иммунной клетки или экспрессирующей CAR иммунной клетки по одному из вариантов осуществления изобретения 22-24, в котором МАт-специфический антиген представляет собой антиген CD20 и специфическое в отношении эпитопа МАт представляет собой ритуксимаб.

26. Способ истощения иммунной клетки или экспрессирующей CAR иммунной клетки по одному из вариантов осуществления изобретения 22-25, включающий приведение в контакт указанной иммунной клетки или экспрессирующей CAR иммунной клетки с биспецифическим МАт (BsAb), обладающим способностью связываться и с МАт-специфическим эпитопом, присутствующим на указанных клетках, и с поверхностным антигеном, присутствующим на эффекторной (и цитотоксической) клетке.

27. Способ истощения иммунной клетки или экспрессирующей CAR иммунной клетки по одному из вариантов осуществления изобретения 22-26, в котором указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

28. Способ регулирования активации сконструированной иммунной клетки, включающий по меньшей мере стадию, на которой:

(I) наделяют указанную иммунную клетку CAR, внеклеточный связывающий домен которого содержит распознающий маркер клеточной поверхности scFv, сцепленный с МАт-специфическим эпитопом;

(II). размножают указанную иммунную клетку, экспрессирующую указанный CAR и указанный МАт-специфический эпитоп на ее поверхности;

(III) приводят в контакт полученные иммунные клетки с МАт, специфическим в отношении указанного эпитопа, для иммобилизации указанных иммунных клеток.

1. Химерный антигенный рецептор (CAR) для истощения иммунных клеток, наделенных указанным CAR, где CAR содержит внеклеточный связывающий домен, который содержит scFv, образованный VH-цепью и VL-цепью, специфическими в отношении антигена, CD8 альфа шарнир, трансмембранный домен, содержащий трансмембранную область/области CD8 альфа, и внутриклеточный домен, включающий CD3 зета сигнальный домен и костимуляторный домен из 4-1ВВ;

где указанный внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность:

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-;

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_х-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_х-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_х-;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₂;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_х-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)_х;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-V₂; или

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

где

V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_H или V₁ обозначает V_H и V₂ обозначает V_L;

L₁ обозначает линкер, пригодный для связывания V_H-цепи с V_L-цепью;

L обозначает линкер, содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене может быть идентичен или отличаться от другого L, присутствующего в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

х обозначает 0 или 1 и каждый из присутствующих х выбирают независимо от других; и

эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 4 представляют собой МАт-специфические эпитопы, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 144.

2. CAR по п. 1, в котором внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность:

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; эпитоп1-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3 или эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4,

где

V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_H или V₁ обозначает V_H и V₂ обозначает V_L;

L₁ обозначает любой линкер, который можно применять для связи V_H-цепи с V_L-цепью;

L обозначает линкер, содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 4 представляют собой МАт-специфические эпитопы, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 144.

3. CAR по п. 1 или 2, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин.

4. CAR по п. 3, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в которой n обозначает 1, 2, 3, 4 или 5, или линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly₄Ser)₄ или (Gly₄Ser)₃.

5. CAR по одному из пп. 1-4, в котором L обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин.

6. CAR по п. 5, в котором L обозначает линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS или SGGGGSGGGGS.

7. CAR по п. 5, в котором L обозначает SGGGG, GGGGS или SGGGGS.

8. CAR по одному из пп. 1-7, в котором эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 4 представляют собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, а эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.

9. CAR по одному из пп. 1-8, в котором указанные VH- и VL-цепи имеют последовательность, идентичную более чем на 80%, предпочтительно более чем на 90% и более предпочтительно более чем на 95% последовательности антигена-мишени SEQ ID NO: 43 (антиген CD19), SEQ ID NO: 44 (антиген CD38), SEQ ID NO: 45 (антиген CD123), SEQ ID NO: 46 (антиген CS1), SEQ ID NO: 47 (антиген BCMA), SEQ ID NO: 48 (антиген FLT-3), SEQ ID NO: 49 (антиген CD33), SEQ ID NO: 50 (антиген CD70), SEQ ID NO: 51 (антиген EGFR-3v) и SEQ ID NO: 52 (антиген WT1).

10. CAR по одному из пп. 1-8, где указанный антиген представляет собой антиген-маркер клеточной поверхности.

11. CAR по одному из пп. 1-8, где указанный антиген представляет собой ассоциированный с опухолью антиген клеточной поверхности.

12. CAR по одному из пп. 1-8, где указанный антиген выбран из ErbB2 (HER2/neu), карциноэмбрионального антигена (СЕА), молекулы адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), варианта III EGFR (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, дисиалоганглиозида GD2, GD3, лектинподобной молекулы-1 С-типа (CLL-1), дуктально-эпителиального муцина, gp36, TAG-72, гликосфинголипидов, глиома-ассоциированного антигена, β-субъединицы человеческого хорионического гонадотропина, альфафетопротеина (AFP), лектин-реактивной фракции AFP, тироглобулина, RAGE-1, MN-CA IX, человеческой теломеразной обратной транскриптазы, RU1, RU2 (AS), кишечной карбоксилэстеразы, mut hsp70-2, М-CSF, простазы, простатспецифического антигена (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1а, р53, простеина, PSMA, сурвивина и теломеразы, антигена-1 карциномы простаты (РСТА-1), MAGE, ELF2M, эластазы нейтрофилов, эфрина В2, CD22, инсулиноподобного фактора роста (IGF1)-I, IGF-II, рецептора IGFI, мезотелина, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), презентирующей опухолеспецифический пептидный эпитоп, 5Т4, ROR1, Nkp30, NKG2D, антигенов стромы опухоли, экстрадомена A (EDA) и экстрадомена В (EDB) фибронектина и домена А1 тенасцина-С (TnC А1) и фибробласт-ассоциированного белка (fap), LRP6, меланома-ассоциированного хондроитинсульфатпротеогликана (MCSP), CD38/CS1, MARTI, WT1, MUC1, LMP2, идиотипа, NY-ESO-1, мутанта Ras, gp100, протеиназы 3, bcr-abl, тирозиназы, hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, андрогенного рецептора; видоспецифического или тканеспецифического антигена, такого как CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD70, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD133, CD138, CTLA-4, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), эндоглина, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), ВСМА (CD269, TNFRSF 17) или FLT-3.

13. CAR по одному из пп. 1-8, в котором VH и VL выбраны из VH, имеющей SEQ ID NO: 65, и VL, имеющей SEQ ID NO: 66; VH, имеющей SEQ ID NO: 67, и VL, имеющей SEQ ID NO: 68; VH, имеющей SEQ ID NO: 69, и VL, имеющей SEQ ID NO: 70; VH, имеющей SEQ ID NO: 71, и VL, имеющей SEQ ID NO: 72; VH, имеющей SEQ ID NO: 77, и VL, имеющей SEQ ID NO: 78; VH, имеющей SEQ ID NO: 79, и VL, имеющей SEQ ID NO: 80; VH, имеющей SEQ ID NO: 81, и VL, имеющей SEQ ID NO: 82; VH, имеющей SEQ ID NO: 83, и VL, имеющей SEQ ID NO: 84; VH, имеющей SEQ ID NO: 85, и VL, имеющей SEQ ID NO: 86; VH, имеющей SEQ ID NO: 87, и VL, имеющей SEQ ID NO: 88; VH, имеющей SEQ ID NO: 89, и VL, имеющей SEQ ID NO: 90; VH, имеющей SEQ ID NO: 91, и VL, имеющей SEQ ID NO: 92; VH, имеющей SEQ ID NO: 93, VL, имеющей SEQ ID NO: 94; VH, имеющей SEQ ID NO: 95, VL, имеющей SEQ ID NO: 96; VH, имеющей SEQ ID NO: 97, и VL, имеющей SEQ ID NO: 98; VH, имеющей SEQ ID NO: 99, и VL, имеющей SEQ ID NO: 100; VH, имеющей SEQ ID NO: 101, и VL, имеющей SEQ ID NO: 102; VH, имеющей SEQ ID NO: 103, и VL, имеющей SEQ ID NO: 104; VH, имеющей SEQ ID NO: 105, и VL, имеющей SEQ ID NO: 106; VH, имеющей SEQ ID NO: 107, и VL, имеющей SEQ ID NO: 108; VH, имеющей SEQ ID NO: 109, и VL, имеющей SEQ ID NO: 110; VH, имеющей SEQ ID NO: 111, и VL, имеющей SEQ ID NO: 112; VH, имеющей SEQ ID NO: 113, и VL, имеющей SEQ ID NO: 114; VH, имеющей SEQ ID NO: 115, и VL, имеющей SEQ ID NO: 116; VH, имеющей SEQ ID NO: 117, и VL, имеющей SEQ ID NO: 118; VH, имеющей SEQ ID NO: 119, и VL, имеющей SEQ ID NO: 120; VH, имеющей SEQ ID NO: 121, и VL, имеющей SEQ ID NO: 122; или VH, имеющей SEQ ID NO: 123, и VL, имеющей SEQ ID NO: 124, VH, имеющей SEQ ID NO: 170, и VL, имеющей SEQ ID NO: 171; VH, имеющей SEQ ID NO: 172, и VL, имеющей SEQ ID NO: 173; или VH, имеющей SEQ ID NO: 174, и VL, имеющей SEQ ID NO: 175.

14. CAR по одному из пп. 1-13, в котором CAR представляет собой одноцепочечный CAR.

15. CAR по п. 1, где указанный CAR идентичен более чем на 80%, более чем на 90%, более чем на 95% или полностью идентичен SEQ ID NO: 1-10, SEQ ID NO: 126-141, или SEQ ID NO: 146-149, или SEQ ID NO: 152-169.

16. CAR по одному из пп. 1-13, в котором CAR представляет собой многоцепочечный CAR.

17. Полинуклеотид, кодирующий CAR по одному из пп. 1-16.

18. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 17.

19. Сконструированная Т-клетка или естественная клетка-киллер (NK), содержащая экспрессионный вектор по п. 18 и экспрессирующая на своей клеточной поверхности CAR по одному из пп. 1-16.

20. Сконструированная клетка по п. 19, где указанная клетка получена из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов.

21. Сконструированная клетка по п. 19 или 20 для применения в качестве лекарственного средства.

22. Способ конструирования клетки по одному из пп. 19 или 20, включающий:

(а) получение Т-клетки или NK-клетки;

(б) интродукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего CAR по одному из пп. 1-16.

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

23. Способ по п. 22, в котором указанная сконструированная клетка представляет собой Т-клетку.

24. Способ истощения in vivo сконструированной Т-клетки или NK-клетки, экспрессирующих на своей поверхности CAR по одному из пп. 1-16, в организме пациента, включающий приведение в контакт указанной сконструированной клетки по меньшей мере с одним специфическим в отношении эпитопа МАт, которое специфически распознает МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

25. Способ по п. 24, в котором специфическим в отношении эпитопа Мат является ритуксимаб.

26. Способ по п. 25, в котором МАт-специфический эпитоп имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

27. Способ по одному из пп. 24-26, в котором специфическое в отношении эпитопа МАт конъюгировано с молекулой, обладающей способностью активировать систему комплемента.

28. Способ по одному из пп. 24-27, в котором цитотоксическое лекарственное средство конъюгировано со специфическим в отношении эпитопа МАт.

29. Способ истощения in vivo сконструированной Т-клетки или NK-клетки, экспрессирующей на своей поверхности CAR по одному из пп. 1-16, в организме пациента, включающий приведение в контакт указанной сконструированной Т-клетки или NK-клетки с биспецифическим МАт (BsAb), обладающим способностью связываться и с МАт-специфическим эпитопом, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, присутствующим на указанной клетке, и с поверхностным антигеном, присутствующим на эффекторной (и цитотоксической) клетке.

30. Способ по одному из пп. 24-29, в котором указанная сконструированная клетка представляет собой Т-клетку.