Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана

Изобретение имеет отношение к резорбируемой сшитой формостабильной мембране для использования в полости рта и способу ее изготовления. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана содержит композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц, которые представляют собой природный костный минерал, включающий от 1,5 до 3,5 весовых частей неорганической керамики на 1 весовую часть коллагенового материала, расположенный между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала. Эластичный и предварительно растянутый коллагеновый материал представляет собой коллагеновый материал, растянутый так, что он находится в линейной/упругой области кривой напряжение-деформация и содержит 70-90 вес.% коллагена и 10-30 вес.% эластина. Способ изготовления резорбируемой сшитой формостабильной мембраны включает следующие стадии: (а) приготовление композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц и выполнение, при необходимости, сшивания этого композиционного слоя, (б) компоновку и приклеивание композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц между двумя слоями коллагенового материала, подвергнутыми растягиванию, приводящему к растяжению коллагенового материала в линейной области кривой напряжение-деформация, в результате чего композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц располагается между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, и (в) сшивание этого композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, расположенного между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, с последующей обработкой для придания гидрофильности. Технический результат - создание резорбируемой формостабильной мембраны, способной противостоять давлению, сдвигающим усилиям и изгибающим моментам и обеспечивать поддержку костеобразования, регенерации, пластики и/или замены костной ткани в области незамкнутого дефекта последней, а именно в процессе горизонтальной или вертикальной аугментации в верхней или нижней челюсти. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 пр., 6 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новой резорбируемой сшитой формостабильной мембране для использования в полости рта, к способу изготовления такой мембраны и к ее использованию в качестве импланта для поддержки костеобразования, регенерации, пластики и/или замены костной ткани при наличии незамкнутого дефекта последней в области зубов у людей или животных.

Уровень техники

Для регенерации незамкнутых дефектов костной ткани путем костеобразования, например посредством горизонтальной или вертикальной аугментации в верхней или нижней челюсти, необходима механическая стабилизация дефекта (Бендковски [Bendkowski]. "Пространство для роста". The Dentist: 3, 2005; Мерли, Мигани и др. [Merli, Migani et al.]. Int. J. Oral Maxillofac. Implants 22/3: 373-82, 2007; Бургер [Burger]. J. Oral Maxillofac. Surg. 68/7: 1656-61, 2010; Луи [Louis]. Oral Maxillofac. Surg. Clin. North Am. 22/3: 353-68, 2010). Действительно, ткани полости рта подвергаются самым разным механическим воздействиям во время пережевывания, глотания, движения языка, речи, движения зубов и ортодонтического лечения. Внутренние и внешние воздействия могут иметь место, в частности, в ходе хирургических процедур по заживлению ран, что приводит к возникновению давления, сдвигающих усилий и изгибающих моментов на средстве регенерации и вновь сформированных тканях.

Полезным средством, противостоящим этим воздействиям и обеспечивающим механическую стабилизацию, является формостабильная мембрана.

Известно использование с этой целью титановых сеток и пластинок или формостабильных мембран из усиленного титаном политетрафторэтилена (PTFE), удаляемых после регенерации костной ткани в ходе повторной хирургической операции. Примером имеющейся на рынке формостабильной мембраны, усиленной титаном, является мембрана Cytoplast®, поставляемая компанией Osteogenics. Тем не менее, сообщается о высоком риске развития дегисценции и других осложнений при использовании растягивающихся мембран, усиленных титаном (Штритцель [Strietzel]. Mund Kiefer Gesichtschir. 5/1: 28-32, 2001; Мерли, Мигани и др. - см. выше; Роккьетта, Фонтана и др. [Rocchietta, Fontana et al.]. J. Clin. Periodontol. 35/8: 203-15, 2008).

Мембраны, изготовленные из PTFE без усиления титаном, широко использовались до появления в 1996 году резорбируемых коллагеновых мембран и после этого очень быстро вышли из употребления.

Резорбируемая формостабильная мембрана представляет интерес с точки зрения исключения необходимости удаления формостабильной мембраны или сетки путем проведения повторной хирургической операции. Описан ряд резорбируемых формостабильных мембран или сеток, изготавливаемых, главным образом, из полимера молочной кислоты (PLA) или сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA). В качестве примеров можно отметить (1) "Sonic Weld RX®" и "Resorb-X®" производства компании KLS Martin, (2) "Guidor®" производства компании Sunstar Americas, (3) "Inion GTR System™" производства компании Curasan и (4) "RapidSorb®" производства компании DePuy Synthes. Недостаток этих мембран заключается в том, что в процессе их гидролитической деградации in vivo они выделяют молочную и/или гликолевую кислоту, что вызывает раздражение тканей и приводит к появлению гистологических признаков нарушения заживления ран (Кунц, Уайтмен и др. [Coonts, Whitman et al.]. Biomed. Mater. Res. 42/2: 303-11, 1998; Хайнце [Heinze]. Business briefing: Lobal Surgery: 4, 2004; Пиллинг, Мэй и др. [Pilling, Mai et al.]. Br J. Oral Maxillofac. Surg. 45/6: 447-50, 2007).

Для преодоления проблем с заживлением ран, связанных с применением PLGA/PLA, широко используются аутогенные костные блоки, взятые у пациента, и частично или полностью очищенные костные блоки, такие как, например, блок Geistlich Bio-Oss® (Geistlich Pharma A.G.) или блок Puros® Allograft (RTI Surgical Inc.). Аутогенные костные блоки имеют тот недостаток, что их забор производится с другого участка, что доставляет еще болезненные ощущения пациенту (Эспозито, Грузовин и др. [Esposito, Grusovin et al.]. Eur. J Oral Implantol. 2/3: 167-84, 2009).

Был разработан так называемый метод костного барьера, позволяющий использовать аутогенную костную стружку, получаемую во время хирургической операции и применяемую обычно в сочетании с частицами ксеногенного костного трансплантата, причем используемая аутогенная кортикальная кость берется из нижней челюсти (Хури, Хади и др. [Khoury, Hadi et al.]. "Костная аугментация в оральной имплантологии", Лондон, Quintessence, 2007). Недостатки этой процедуры заключаются в том, что она чрезвычайно зависит от квалификации врача и связана с причинением ущерба другому участку и дополнительной болезненностью. Кроме того, костные барьеры используются только латерально и поэтому не обеспечивают механическую защиту применительно к дефекту в корональном направлении. Термин "костный барьер" был использован в рекламе мембран PLA/PLGA, а также частично деминерализованных кортикальных костных пластинок (Semi-Soft и Soft Lamina Osteobiol® производства компании Tecnoss). Недостатки этого деминерализованного костного барьера заключаются в том, что изогнутые костные пластинки всегда требуют фиксации, что они имеют большую толщину по сравнению с мембранами из усиленного титаном PTFE и что они имеют только криволинейную форму со скругленными кромками в корональной области костного дефекта. Для стоматологов была бы гораздо предпочтительней плоская поверхность шириной 6-8 мм в корональной области альвеолярного гребня (Ванг и аш-Шаммари [Wang and Al-Shammari]. Int. J. Periodontics Restorative Dent. 22/4: 335-43, 2002).

Попытку объединения факторов неосложненного заживления и формостабильности представляет собой резорбируемая формостабильная коллагеновая мембрана, описанная в документе US 8353967 В2 и изготавливаемая из суспензии коллагена в 5-25%-м растворе этанола в воде, заливаемой в форму и подвергаемой сублимационной сушке и нагреву до 100-140°С. Такие мембраны производятся компанией Osseous Technologies of America и поставляются на рынок компанией Zimmer под торговым наименованием "Zimmer CurV Preshaped Collagen Membrane". Эти мембраны, присутствующие на рынке, имеют слабую формостабильность и толщину около 1,5 мм, увеличивающуюся после инкубирования в физиологическом растворе примерно до 2,3 мм, что может иметь следствием высокую степень риска развития дегисценции.

Из вышесказанного следует, что существующие технические решения не могут полностью удовлетворить ни стоматологов, ни пациентов. Это связано с необходимостью повторного хирургического вмешательства и/или высоким риском осложненного заживления ран. Решения, не связанные с высоким риском осложненного заживления ран, либо не относятся к формостабильным мембранам и требуют повторного хирургического вмешательства, либо имеют другие недостатки.

В документе US 2013/0197662 описан способ изготовления биоматериала, включающий а) соединение пористого материала на коллагеновой основе с непористым материалом на коллагеновой основе путем нанесения контролируемого количества геля, содержащего коллаген, на поверхность связывания непористого материала на коллагеновой основе и приведение в контакт поверхности пористого материала на коллагеновой основе с гелем, нанесенным на эту поверхность связывания с целью частичного гидратирования участка пористого материала на границе раздела между материалами, б) высушивание геля для связывания материалов друг с другом и в) сшивание коллагена в связываемых слоях. Полученный биоматериал объединяет пористый материал на коллагеновой основе, который может быть минерализован ([0042], [0048]), и механически прочный непористый материал на коллагеновой основе, благодаря чему образуется скаффолд для регенерации тканей, несущих нагрузку (а именно мениска, суставного хряща, сухожилий и связок), который обладает как пористостью, так и механической прочностью, то есть способен выдерживать сжимающие и растягивающие усилия. Ничего не сообщается об устойчивости к воздействию изгибающих моментов на этот комбинированный биоматериал или о составе минерализованного пористого материала на основе коллагена.

В документе US 2014/0193477 сообщается, что в процессе изготовления коллагеновых матриц из растворимого коллагена растягивание коллагена до сшивания повышает его механическую прочность, в частности предельную прочность на разрыв при растяжении, жесткость и модуль упругости (модуль Юнга) (см., в частности, [0109], [0110]).

Шари Е. Лэнгдон и др. [Shari Е. Langdon et al.] (Biomaterials, 20/2, 137-153 CODEN, 1998) и Дебби Чачра и др. [Debbie Chachra et al.] (Biomaterials, 17/19, 1865-1875 CODEN, 1996) сообщили, что растягивание мембраны, полученной из перикарда, до ее сшивания повышает ее прочность на разрыв и жесткость.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является создание резорбируемой формостабильной мембраны для использования в полости рта, свободной от вышеуказанных недостатков и способной противостоять давлению, сдвигающим усилиям и изгибающим моментам и обеспечивать поддержку костеобразования, регенерации, пластики и/или замены костной ткани в области незамкнутого дефекта последней, а именно в процессе горизонтальной или вертикальной аугментации в верхней или нижней челюсти.

Данная цель достигается посредством реализации изобретения в соответствии с приложенной формулой изобретения.

В изобретении предлагается резорбируемая сшитая формостабильная мембрана для использования в полости рта, содержащая композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц, включающий от 1,5 до 3,5 весовых частей неорганической керамики на 1 весовую часть коллагенового материала, расположенный между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, который содержит 50-100% (весовых) коллагена и 0-50% (весовых) эластина.

В контексте настоящего описания термин "коллагеновый материал" означает материал на коллагеновой основе, который содержит 50-100% (весовых) коллагена и 0-50% (весовых) эластина. Содержание эластина в данном случае измеряли путем определения десмозина/изодесмозина в соответствии с известным модифицированным методом, включающим гидролиз и обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию - ОФ-ВЭЖХ (см., например, Гуида Е. и др. [Guida Е. et al.]. "Разработка и апробация метода высокоэффективной хроматографии для определения десмозинов в тканях". Journal of Chromatography, 1990, или Родригес П. [Rodrigues Р.]. "Количественное определение эластина в легких мышей во время пренатального развития". The Open Respiratory Medicine Journal, 2008). Для определения содержания десмозина/изодесмозина в сухом эластине выполняли процедуры выделения эластина из коллагенового материала, описанные Старчером [Starcher] и Гальоне [Galione] в 1976 году ("Выделение и сравнение эластина, полученного от разных видов животных, в аналитической биохимии").

Вышеупомянутый коллагеновый материал соответствующим образом получают из тканей природного происхождения, содержащих коллаген и эластин в указанных пропорциях. Примеры таких тканей включают ткани позвоночных, в частности мембраны брюшины и перикарда (например, свиней, коров, лошадей, овец, коз, кроликов), плацентарные мембраны, подслизистый слой тонкого кишечника, кожу, твердую мозговую оболочку, связки, сухожилия, диафрагму (грудную), сальник, фасции мышц или органов млекопитающих. Предпочтительными из этих тканей являются ткани свиней, коров и лошадей. Из тканей свиней, коров и лошадей интерес представляет мембрана брюшины.

Коллаген, как правило, представляет собой коллаген I типа, коллаген III типа или их смесь. Коллаген может также включать значительную долю коллагенов II, IV, VI или VIII типа или любые комбинации этих и любых других типов.

Коллагеновый материал предпочтительно содержит 70-90% (весовых) коллагена и 30-10% (весовых) эластина.

Примером подходящего исходного сырья для приготовления такого коллагенового материала является коллагеновая мембрана, полученная из брюшины или перикарда свиней, коров и лошадей способом, аналогичным описанному в разделе "Пример" документа ЕР 1676592 В1, либо мембрана Geistlich Bio-Gide® (поставляемая компанией Geistlich Pharma AG, Швейцария), получаемая этим способом из брюшины свиней.

Коллагеновый материал предпочтительно получают из мембран брюшины и перикарда, подслизистого слоя тонкого кишечника или мышечных фасций свиней, коров и лошадей.

Коллагеновый материал в целом и предпочтительно представляет собой волокнистый материал, имеющий природную волокнистую структуру или включающий разрезанные коллагеновые волокна.

Может быть, однако, также использован неволокнистый коллагеновый материал (такой как фибриллы, восстановленные из молекул коллагена, или фрагменты сшитого коллагена, имеющие достаточную биосовместимость и резорбируемость) в композиционном слое, состоящем из коллагенового материала и неорганических керамических частиц, или в слоях эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, при условии, что коллагеновый материал обладает достаточной механической стабильностью в смысле модуля упругости и предельной прочности на разрыв при растяжении (см. ниже).

В контексте настоящего описания термин "резорбируемая" означает, что сшитая формостабильная мембрана способна рассасываться in vivo, а именно в результате воздействия коллагеназы и эластазы. Контролируемая резорбируемость in vivo сшитой формостабильной мембраны существенно важна для заживления без чрезмерного воспаления или дегисценции. Прекрасные результаты в отношении прогнозирования резорбируемости in vivo дает испытание на ферментативное расщепление (деградацию) с использованием полученной из Clostridium histolyticum коллагеназы, подробно описанное ниже (пример 4, пункт 3).

Все протестированные прототипы резорбируемой сшитой формостабильной мембраны, предлагаемой в изобретении, продемонстрировали по меньшей мере 10%-ю деградацию коллагена (оцененную посредством набора DC Protein для определения концентрации белка с использованием коллагена I типа в качестве эталона) через 4 часа, причем скорость деградации коллагена (более низкая, чем в случае мембраны Geistlich Bio-Gide®) зависела от выбранного режима сшивания.

Термин "сшитая" означает, что резорбируемая формостабильная мембрана была подвергнута сшиванию по меньшей мере на одном этапе, обычно включавшем химическое сшивание с использованием, например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлорида (EDC) или N-гидроксисукцинимида (NHS) или сшивание путем дегидротермальной обработки - DHT (от англ. dehydrothermal treatment), причем этот этап выполнялся на сформированном композиционном слое коллагенового материала и неорганических керамических частиц, расположенном между двумя слоями эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала. В некоторых вариантах осуществления изобретения сшивание (химическое или путем DHT) композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц выполняли до его окончательного формирования в составе мембраны, предлагаемой в изобретении.

Термин "формостабильная мембрана для использования в полости рта" означает, что данная резорбируемая сшитая мембрана выполнена с возможностью поддержки костеобразования, регенерации, пластики и/или замены костной ткани при наличии незамкнутого дефекта последней в области зубов у людей или животных благодаря обеспечению механической стабилизации дефекта, то есть способности противостоять давлению, сдвигающим усилиям и изгибающим моментам, возникающим в полости рта. Формостабильность мембраны, предлагаемой в изобретении, оценивалась с помощью испытания на трехточечный одноосный изгиб, подробно описанного ниже (пример 4, пункт 2). В ходе этого испытания, проводившегося аналогично методике, описанной в документах EN ISO 178 и ASTM D6272-10, мембрану, предлагаемую в изобретении, погружали в фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) при рН, равном 7,4, и температуре 37°С. Это испытание показало, что мембрана, предлагаемая в изобретении, обеспечивает существенно стабилизацию, чем конкурирующая с ней PLA-мембрана Resorb-X® (KLS Martin).

В целом, данное испытание на трехточечный одноосный изгиб показало, что резорбируемая сшитая формостабильная мембрана выдерживает усилие, составляющее по меньшей мере 0,20 Н, предпочтительно - по меньшей мере 0,30 Н, при деформации 8 мм.

Термин "слои эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала" означает, что слои коллагенового материала подвергались, до их сшивания, растягиванию, приводившему к удлинению, или растяжению, этих слоев коллагенового материала по сравнению с первоначальным размером и переходу из нижней области кривой напряжение-деформация в линейную область (называемую также областью упругости) этой кривой (см. Блайн А. Родер и др. [Blayne A. Roder et al.]. Journal of Biomechanical Engineering, 124, 214-222, в частности, фиг. 3, стр. 216, 2002, или фиг. 5 настоящей заявки). В пределах этой линейной области модуль упругости имеет максимальное значение и, следовательно, может быть достигнута максимальная жесткость. Указанное растягивание может выполняться на образцах коллагенового материала в радиальном направлении, например посредством пружин. Усилия, которые необходимо приложить в ходе такого растягивания, приводящего к удлинению, или растяжению, коллагенового материала и переходу в линейную область кривой напряжение-деформация, зависят от этого коллагенового материала. Если коллагеновый материал получен из мембран брюшины свиней, коров или лошадей, то растягивание, переводящее в линейную область кривой напряжение-деформация, может выполняться на образцах коллагенового материала в радиальном направлении посредством пружин, растягиваемых с усилием в диапазоне между 1 и 3 Н, что приводит к удлинению, или растяжению, составляющему от 40 до 100% от первоначального размера слоев коллагенового материала.

Таким образом, термин "эластичный и предварительно растянутый коллагеновый материал" относится к коллагеновому материалу, растянутому до перехода в линейную/упругую область кривой напряжение-деформация.

Модуль упругости (также называемый модулем Юнга), то есть тангенс угла наклона линейного участка кривой напряжение-деформация, выражаемый в МПа, для эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала обычно составляет от 1 до 1000 МПа, предпочтительно - от 2 до 150 МПа, в частности - от 5 до 80 МПа.

Наличие упомянутых двух слоев эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, между которыми располагается композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц, представляется необходимым для предохранения этого композиционного слоя от разрыва, когда мембрана подвергается воздействию усилий растяженния, сжатия и сдвига, а также изгибающих моментов.

Один из слоев эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала предпочтительно включает отверстия от 5 до 500 мкм. При размещении мембраны в требуемом месте этот содержащий отверстия слой эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала ориентируют в направлении костного дефекта, благодаря чему отверстия обеспечивают легкое прорастание клеток, формирующих костную ткань, в композиционный материал из неорганической керамики и коллагена.

Неорганическая керамика представляет собой биосовместимый материал (такой как гидроксиапатит, или природный костный минерал), способствующий регенерации костной ткани.

Широко известным природным костным минералом, способствующим росту костной ткани в области зубных, периодонтальных и челюстно-лицевых костных дефектов, является Geistlich Bio-Oss®, поставляемый компанией Geistlich Pharma AG. Этот костно-минеральный материал на основе гидроксиапатита изготавливается из природной костной ткани способом, описанным в патенте США US 5167961 и обеспечивающим сохранение трабекулярной архитектуры и нанокристаллической структуры этой природной костной ткани.

Неорганическая керамика предпочтительно представляет собой природный костный минерал на основе гидроксиапатита, такой как, например, Geistlich Bio-Oss®.

Неорганические керамические частицы обычно имеют размер в диапазоне от 50 до 600 мкм, предпочтительно - от 150 до 500 мкм, в частности - от 250 до 400 мкм.

Композиционный материал (композит), состоящий из коллагенового материала и частиц неорганической керамики, содержит от 1,5 до 3,5, предпочтительно от 2,0 до 3,0, весовых частей неорганической керамики на 1 весовую часть коллагенового материала.

Действительно, было неожиданно обнаружено, что в случае содержания неорганической керамики, составляющего менее 1,5 или более 3,5 весовых частей на 1 весовую часть коллагенового материала, мембрана не является формостабильной в смысле упомянутой выше оценки с помощью испытания на трехточечный одноосный изгиб, подробно описанного ниже (пример 4, пункт 2). Формостабильность является особенно высокой, когда композит, состоящий из коллагенового материала и частиц неорганической керамики, содержит от 2,0 до 3,0 весовых частей неорганической керамики на 1 весовую часть коллагенового материала.

Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана, предлагаемая в изобретении, является гидрофильной и, как правило, полностью смачивается фосфатно-солевым буферным раствором в течение 5-10 минут.

Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана, предлагаемая в изобретении, обладает свойствами клеточной адгезии, схожими с аналогичными свойствами мембраны Geistlich Bio-Gide®, которая широко известна своими высокими характеристиками в отношении заживления при низкой степени дегисценции и отсутствии чрезмерного воспаления. Это является показателем высоких характеристик в отношении заживления, протекающего без осложнений, таких как дегисценция и чрезмерное воспаление.

Такие высокие характеристики в отношении заживления наблюдались при имплантировании сшитой формостабильной мембраны, предлагаемой в изобретении, для закрытия дефекта костной ткани, созданного в черепе кролика.

Толщина резорбируемой сшитой формостабильной мембраны, предлагаемой в изобретении, обычно находится в диапазоне от 0,5 до 2,5 мм, предпочтительно - от 1,0 до 2,0 мм, в частности - от 1,2 до 1,8 мм.

Типичные формы и размеры резорбируемых сшитых формостабильных мембран, предлагаемых в изобретении, представлены на фиг. 1.

Изобретение также относится к использованию вышеупомянутой резорбируемой сшитой формостабильной мембраны в качестве импланта для поддержки костеобразования, регенерации, пластики и/или замены костной ткани при наличии незамкнутого дефекта последней в области зубов у людей или животных.

Изобретение также относится к способу изготовления вышеупомянутой резорбируемой сшитой формостабильной мембраны, содержащей композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц, расположенный между двумя слоями эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, причем способ включает следующие этапы:

(а) приготовление композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц и выполнение, в случае необходимости, сшивания этого композиционного слоя,

(б) компоновку и приклеивание композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц между двумя слоями коллагенового материала, подвергнутыми растягиванию, приводящему к растяжению коллагенового материала и переходу в линейную область кривой напряжение-деформация, в результате чего композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц располагается между двумя слоями эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, и

(в) сшивание этого композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, расположенного между двумя слоями эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, с последующей обработкой для придания гидрофильности.

Этап (а) может включать следующее:

- изготовление, в качестве неорганических керамических частиц, костно-минеральных частиц гидроксиапатита из кортикальной или трабекулярной костной ткани способом, описанным в документе US 5417975А, или, в альтернативном варианте, путем измельчения малых гранул Geistlich Bio-Oss (поставляемых компанией Geistlich Pharma AG) на более мелкие частицы с последующим просеиванием этих частиц в требуемом диапазоне (например, от 150 до 500 или от 250 до 400 мкм), в результате чего получают просеянные костно-минеральные частицы гидроксиапатита;

- приготовление тканевого коллагенового материала путем

ο получения ткани с высоким содержанием коллагена из брюшины или перикарда свиней, коров и лошадей способом, аналогичным описанному в разделе "Пример" документа ЕР 1676592 В1, либо в качестве альтернативного исходного материала, из мембраны Geistlich Bio-Gide® (поставляемой компанией Geistlich Pharma AG), получаемой этим способом из брюшины свиней, либо из промежуточного продукта, полученного до стерилизации в процессе промышленного производства мембран Geistlich Bio-Gide и называемого в данном описании нестерильной мембраной Geistlich Bio-Gide,

ο вырезания (например, ножницами) образцов полученной таким способом коллагеновой волокнистой ткани, смешивания этих вырезанных образцов коллагеновой волокнистой ткани с сухим льдом с помощью ножевой мельницы для получения обрезков коллагеновых волокон,

ο разрезания образцов коллагеновой волокнистой ткани с помощью ножевой мельницы с ситом для получения просеянной фракции фрагментов коллагеновых волокон;

- приготовление композиционного слоя волокнистого коллагенового материала и костно-минеральных частиц гидроксиапатита путем

ο перемешивания и встряхивания в фосфатно-солевом буферном растворе от 0 до 40% (весовых) обрезков коллагеновых волокон и от 60 до 100% (весовых) просеянной фракции нарезанных фрагментов коллагеновых волокон,

ο добавления от 1,5 до 3,5 весовых частей, в частности - от 2,0 до 3,0 весовых частей, просеянных костно-минеральных частиц гидроксиапатита, полученных ранее, к 1 весовой части ранее полученного волокнистого коллагена, центрифугирования при ускорении от 2000 до 6000 xg, предпочтительно - от 3000 до 5000 xg, заливки осадка, полученного после центрифугирования, в прямоугольную форму и формирования пластины с помощью шпателя. Полученный композиционный слой волокнистого коллагенового материала и костно-минеральных частиц гидроксиапатита высушивали в вакуумной печи.

Сшивание высушенного композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц в конце этапа (а) не является обязательным, но имеет то преимущество, что оно облегчает выполнение операций с этим композиционным слоем на этапе (б).

Это сшивание может быть выполнено с использованием химических реагентов или путем дегидротермальной обработки.

Сшивание с использованием химических реагентов может быть выполнено с помощью любого фармацевтически приемлемого сшивающего реагента, способного придать сшитой формостабильной мембране требуемую механическую прочность. Такие подходящие сшивающие реагенты включают глутаральдегид, глиоксаль, формальдегид, ацетальдегид, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфир (BDDGE), N-сульфасукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат, гексаметилендиизоцианат (HMDC), цианамид, дифенилфосфорилазид, генипин, 1 -этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDC) и смесь EDC и N-гидроксисукцинимида (NHS).

Сшивание с использованием химических реагентов легко выполняется с помощью смеси EDC и NHS.

В этом случае полученный ранее высушенный композиционный слой волокнистого коллагенового материала и костно-минеральных частиц гидроксиапатита может быть сшит с использованием 10-400 мМ EDC и 13-520 мМ NHS в растворе 0,1 М 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES) и 40% этанола при рН 5,5 в течение 1-3 часов при комнатной температуре. Эта реакция может быть затем остановлена путем двукратного инкубирования прототипов в буферном растворе 0,1 М Na2HP04 при рН 9,5 в течение 1-3 часов. Полярные остатки могут быть удалены путем инкубирования прототипов в течение 1 часа в растворе 1 М хлорида натрия и дважды в течение часа в растворе 2 М хлорида натрия. Химически сшитые прототипы могут промываться в дистиллированной воде в общей сложности 8 раз в течение 30-60 минут. После этого может быть проведена сушка путем в общей сложности 5-кратного погружения в этанол в течение 15 минут, последующей трехкратной обработки диэтилэфиром в течение 5 минут и высушивания при 10 мбар и 40°С в течение ночи либо путем лиофилизации (замораживания до температуры ниже -5°С и высушивания посредством проведения обычной процедуры лиофилизации).

В альтернативном варианте сшивание выполнялось путем дегидротермальной обработки при 0,1-10 мбар и 80-160°С в течение 1-4 дней. В этом случае нет необходимости в последующей сушке.

Этап (б) может включать следующее:

- приготовление клея из коллагеновых волокон путем

ο неоднократного перемешивания полученной ранее просеянной фракции нарезанных фрагментов коллагеновых волокон в водном растворе Н3РO4, имеющем рН 3,5 и концентрацию 3%, посредством гомогенизатора высокого давления при 1500-2000 бар,

ο нейтрализации полученной суспензии до рН 7,0 посредством добавления раствора гидроксида натрия, концентрирования посредством лиофилизации коллагена и гомогенизации последнего с помощью ножевой мельницы,

ο получения клея из образованной суспензии в виде 2-10%-го раствора в фосфатно-солевом буфере (PBS) с рН, равным 7,4, посредством нагревания до 60°С вплоть до исчезновения видимых частиц;

- использование, например, оборудования, аналогичного показанному на фиг. 2, с помощью которого два предварительно смоченных слоя коллагенового материала подвергают растягиванию, приводящему к растяжению коллагенового материала и переходу в линейную область кривой напряжение-деформация, в результате чего образуются два слоя смоченного, эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала,

- размещение композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, полученного на этапе (а) и пропитанного полученным ранее клеем из коллагеновых волокон, между вышеупомянутыми двумя слоями смоченного, эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала,

- вдавливание, например, с помощью оборудования, аналогичного показанному на фиг. 3, упомянутых двух слоев смоченного, эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, в упомянутый композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц, пропитанный клеем из коллагеновых волокон, и

- высушивание композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, размещенного между двумя слоями смоченного, эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, при температуре от 35 до 45°С и пониженном давлении (например, от 20 до 1 мбар).

В описанной выше процедуре один из предварительно смачиваемых слоев коллагенового материала может быть подвергнут прокалыванию иглами для образования в нем отверстий размером от 5 до 500 мкм.

На этапе (в) может быть выполнено сшивание композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, расположенного между двумя слоями эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала, с помощью химических реагентов (например, EDC и NHS) или путем дегидротермальной обработки (DHT).

Химическое сшивание может быть выполнено с помощью любого фармацевтически приемлемого сшивающего реагента, способного придать сшитой формостабильной мембране требуемую механическую прочность. Такие подходящие сшивающие реагенты включают глутаральдегид, глиоксаль, формальдегид, ацетальдегид, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфир (BDDGE), N-сульфасукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат, гексаметилендиизоцианат (HMDC), цианамид, дифенилфосфорилазид, генипин, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDC) и смесь EDC и N-гидроксисукцинимида (NHS).

Сшивание с использованием химических реагентов легко выполняется с помощью смеси EDC и NHS.

В этом случае полученный ранее высушенный композиционный слой волокнистого коллагенового материала и костно-минеральных частиц гидроксиапатита может быть сшит с использованием 10-400 мМ EDC и 13-520 мМ NHS в растворе 0,1 М 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES) и 40% этанола при рН 5,5 в течение 1-3 часов при комнатной температуре. Эта реакция может быть затем остановлена путем двукратного инкубирования прототипов в буферном растворе 0,1 М Na2HP04 при рН 9,5 в течение 1-3 часов. Полярные остатки могут быть удалены путем инкубирования прототипов в течение 1 часа в растворе 1 М хлорида натрия и дважды в течение часа в растворе 2 М хлорида натрия. Химически сшитые прототипы могут промываться в дистиллированной воде в общей сложности 8 раз в течение 30-60 минут. После этого могут быть выполнены обезвоживание и сушка путем в общей сложности 5-кратного погружения в этанол в течение 15 минут, последующей трехкратной обработки диэтилэфиром в течение 5 минут и высушивания при 10 мбар и 40°С в течение 30 минут либо путем лиофилизации (замораживания до температуры ниже -10°С и высушивания посредством проведения обычной процедуры лиофилизации) без обработки растворителем.

В альтернативном варианте сшивание выполнялось путем дегидротермальной обработки при 0,1-10 мбар и 80-160°С в течение 1-4 дней. В этом случае нет необходимости в последующей сушке.

Обработка для придания гидрофильности на этапе в) обычно включает погружение сшитого композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, размещенного между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, гидрофильного, в физиологически приемлемый солевой раствор, такой как раствор хлористого натрия, предпочтительно 100-300 г/л, в частности - 150-250 г/л раствора хлористого натрия.

Обработка для придания гидрофильности предпочтительно включает погружение сшитого композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, размещенного между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, гидрофильного, в раствор хлористого натрия.

Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана, предлагаемая в изобретении, может быть стерилизована путем облучения рентгеновским, бета- или гамма-излучением.

Краткое описание чертежей

Настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылками на иллюстративные примеры предпочтительных вариантов его осуществления и на приложенные чертежи, на которых показано:

фиг. 1 - типичные формы и размеры резорбируемых сшитых формостабильных мембран, предлагаемых в изобретении. Эти мембраны могут быть плоскими (1), (1'), U-образными прямолинейными (2), (2') или U-образными криволинейными (3), (3') и соответствовать альвеолярным пространствам 1-3 зубов (резцов, клыков, премоляров или моляров), расположенных во фронтальной части и левой или правой боковых частях зубной дуги либо в задней части последней.

Размеры изделий для переднего и заднего отделов близки друг к другу, причем радиус кривизны выбирается таким, чтобы он соответствовал кривизне альвеолярного гребня. Типичные размеры составляют: а=5-20 мм, b=8-20 мм, с=6-10 мм, d=25-40 мм, е=15 мм, f=20-40 мм.

фиг. 2 - схематическое изображение оборудования, подходящего для обеспечения растягивания слоев полимера до их компоновки в плоскую или U-образную формостабильную мембрану согласно изобретению,

фиг. 3 - компоновка плоской формостабильной мембраны, где (1) -стальная пластина, (2) - сжатая полиуретановая губка, (3) - полиамидная сетка, (4) - слой эластичного и предварительно растянутого коллагена и (5) - сшитая гидроксиапатит-коллагеновая пластина,

фиг. 4 - изменение усилия как функция деформации в процессе аналитического испытания на трехточечный изгиб резорбируемой формостабильной мембраны согласно изобретению, сшитой с помощью EDC/NHS или путем DHT, в сравнении с PLA-мембраной Resorb-X® (KLS Martin),

фиг. 5 - кривые напряжение-деформация нескольких представленных на рынке, смоченных и стерильных коллагеновых материалов, которые можно было бы использовать в слоях эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала резорбируемых сшитых формостабильных мембран согласно изобретению, а именно коллагеновой мембраны Geistlich Bio-Gide® (Geistlich Pharma AG), получаемой из брюшины свиней, коллагеновой мембраны Jason® (Biomaterials/Botiss), получаемой из перикарда свиней, и коллагеновой мембраны Dynamatrix® (Cook Biotech Inc.), получаемой из подслизистого слоя тонкого кишечника, а также коллагенового материала, получаемого из мышечных фасций. Каждая из этих кривых напряжение-деформация включает нижнюю область, характеризующуюся большими деформациями при минимальных значениях напряжения, линейную область, или область упругости, характеризующуюся линейным увеличением деформации на единицу напряжения, и область разрыва, характеризующуюся разрывом полимерных волокон. На кривых напряжение-деформация, представленных на этом графике, модуль упругости (или модуль Юнга, то есть тангенс угла наклона линейного участка кривой напряжение-деформация) равен приблизительно 8 МПа для мембраны Geistlich Bio-Gide®, приблизительно 64 МПа для мембраны Jason, приблизительно 54 МПа для мембраны Dynamatrix® и приблизительно 56 МПа для коллагенового материала, полученного из мышечных фасций.

фиг. 6 - столбиковая процентная диаграмма фибробластов десны человека, приклеившихся к мембране после инкубирования в течение 24 часов в фосфатно-солевом буферном растворе при 37°С, для коллагеновой мембраны Geistlich Bio-Gide®, прототипа предлагаемой в изобретении резорбируемой формостабильной мембраны, сшитой путем DHT (FRM), и PTFE-мембраны Cystoplast® (Keystone Dental).

Подробное описание примеров осуществления изобретения Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение без ограничения его объема.

Пример 1. Подготовка исходных материалов

Приготовление мелких частиц гидроксиапатита размером от 250 до 400 мкм (A)

Мелкие частицы костного минерала гидроксиапатита получали из кортикальной или трабекулярной костной ткани в соответствии с описанным в примерах 1-4 документа US 5417975А, используя дополнительный этап просеивания между 250 и 400 мкм.

В альтернативном варианте мелкие частицы костного минерала гидроксиапатита получали путем измельчения малых гранул Geistlich Bio-Oss® (производства компании Geistlich Pharma AG, СН-6110, Швейцария) в результате тщательного ударного дробления с помощью измельчителя и использования дополнительного этапа просеивания между 250 и 400 мкм.

Мелкие частицы костного минерала гидроксиапатита, приготовленные в соответствии с (А) и имевшие размер от 250 до 400 мкм, хранились в стеклянных бутылках вплоть до использования.

Приготовление коллагеновых волокон (Б)

В соответствии с описанным в разделе "Пример" документа ЕР 1676592 В1, мембраны, полученные из брюшины поросят, полностью очищали от мышечной ткани и жира с помощью механических средств, промывали в проточной воде и обрабатывали 2%-м раствором NaOH в течение 12 часов. Затем эти мембраны промывали в проточной воде и подкисливали 0,5%-й НСl. После окисления материала по всей его толщине (в течение приблизительно 15 минут) этот материал промывали водой до получения рН 3,5. Затем материал усаживали в 7%-м растворе хлорида натрия, выполняли нейтрализацию 1%-м раствором NaHC03 и промывку в проточной воде. После этого выполняли обезвоживание материала ацетоном, обезжиривание его н-гексаном и высушивание диэтиловым эфиром. Из полученного таким путем материала вырезали вручную с помощью ножниц образцы коллагеновых мембран размером 2×2 см.

В альтернативном варианте вырезали вручную с помощью ножниц образцы мембраны Geistlich Bio-Gide® (поставляемой компанией Geistlich Pharma AG) размером 2×2 см.

1 г образцов коллагеновых мембран размером 2×2 см, полученных ранее, смешивали с 200 мл сухого льда и перемешивали в ножевой мельнице (Retsch® Grindomix) при 5000 оборотов в минуту (об/мин) вплоть до достижения беспрепятственного вращения. Затем скорость вращения повышали до 6000, 7000, 9000 и 10000 об/мин в течение 20-30 секунд, каждый раз добавляя 50 мл сухого льда.

Сухой лед испарялся, а полученные описанным в (Б) образом коллагеновые волокна сохраняли в пластиковых пакетах Minigrip до последующего использования.

Приготовление нарезанных фрагментов коллагеновых волокон с помощью ножевой мельницы (В)

Полученные ранее образцы коллагеновой волокнистой ткани размером 2×2 см разрезали с помощью ножевой мельницы с ситом 0,8 мм при 1500 об/мин для получения просеянной фракции нарезанных фрагментов коллагеновых волокон.

Приготовление клея из коллагеновых волокон (Г)

Просеянную фракцию нарезанных фрагментов коллагеновых волокон (В) смешивали с водой для получения 3%-го раствора, доводили значение рН до 3,5 путем добавления фосфорной кислоты Н3РO4 и гомогенизировали суспензию под высоким давлением 1500-2000 бар, причем этот процесс повторяли от 3 до 5 раз.

Полученную суспензию подвергали нейтрализации до приблизительно рН 7 путем добавления раствора гидроксида натрия NaOH и загущению в течение ночи при 4°С.Коллаген подвергали концентрированию посредством лиофилизации при -10°С и 0,310 мбар после замораживания в течение 4 часов при -40°С и гомогенизации с помощью ножевой мельницы.

Клей из коллагеновых волокон получали из образованной суспензии в виде 2-10%-го раствора в фосфатно-солевом буфере с рН, равным 7,4, посредством нагревания до 60°С вплоть до исчезновения видимых частиц.

Пример 2. Изготовление гидроксиапатит-коллагеновой пластины с выполнением, в случае необходимости, сшивания

4 г коллагеновых волокон (Б) и 6 г нарезанных фрагментов коллагеновых волокон (В), приготовленных в Примере 1, смешивали со 140 г фосфатно-солевого буферного раствора и подвергали встряхиванию в коктейльном миксере. В другом примере коллагеновые волокна полностью заменяли их нарезанными фрагментами.

Добавляли 20 г мелких частиц гидроксиапатита (А), приготовленных в Примере 1, и перемешивали вручную.

34,14 г этой смеси подвергали центрифугированию при 7000 g (7000-кратном ускорении силы тяжести) в течение 2 минут.

Осадок, полученный после центрифугирования, заливали между двумя полиамидными сетками (с размером пор 21 мкм и общим объемом открытой структуры 17%) в плоскую прямоугольную форму размером 8×12 см и загущали вещество, удаляя избыточную воду лабораторной ложкой. Полученные пластины подвергали сжатию под давлением 1-1,7 кПа и сушке в вакуумной печи при 30°С/50 мбар в течение 2 часов, затем при 30°С/10 мбар в течение 8 часов. Полиамидные сетки удаляли.

Сшивание, в случае необходимости, гидроксиапатит-коллагеновой пластины

Для облегчения работы с гидроксиапатит-коллагеновой пластиной последнюю подвергали сшиванию с помощью химических реагентов или путем дегидротермальной обработки (DHT).

Химическое сшивание коллагена, выполнявшееся с помощью EDC/NHS, приводило к увеличению общей стабильности гидроксиапатит-коллагеновых пластин. Высушенные пластины подвергали сшиванию с использованием 10-400 мМ EDC и 13-520 мМ NHS в растворе 0,1 М 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES) и 40% этанола при рН 5,5 в течение 2 часов при комнатной температуре.

Эту реакцию затем останавливали путем двукратного инкубирования прототипов в буферном растворе 0,1 моль/л Na2HP04 при рН 9,5 в течение одного часа. Полярные остатки удаляли путем инкубирования прототипов в течение 1 часа в растворе 1 моль/л хлорида натрия и дважды в течение часа в растворе 2 моль/л хлорида натрия. Химически сшитые прототипы промывали в дистиллированной воде в общей сложности 8 раз в течение 30-60 минут, после чего выполняли их обезвоживание путем в общей сложности 5-кратного погружения в этанол в течение 15 минут. Затем следовали трехкратная обработка диэтилэфиром в течение 5 минут и сушка при 10 мбар и 40°С в течение 30 минут либо высушивание путем лиофилизации (замораживание до температуры ниже -10°С и сушка посредством проведения обычной процедуры лиофилизации).

В альтернативном варианте сшивание выполняли путем дегидротермальной обработки при 0,1-10 мбар и 80-120°С в течение 1-4 дней. В этом случае не было необходимости в последующей сушке.

Пример 3. Изготовление резорбируемой сшитой формостабильной мембраны (М) путем компоновки и приклеивания двух слоев эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала на двух противоположных поверхностях гидроксиапатит-коллагеновых пластин (Д)

Приведенное ниже описание позволяют лучше понять ссылки на фиг. 2 и 3.

Для компоновки плоского или U-образного прототипа необходимо использование жестких или гибких рамок, позволяющих осуществить растягивание слоев коллагенового материала.

Формирование плоских или U-образных прототипов (Е)

На фиг. 2 представлено схематическое изображение оборудования, подходящего для обеспечения растягивания слоев коллагенового материала до их компоновки в плоскую или U-образную формостабильную мембрану согласно изобретению.

Это оборудование состоит из рамки (а), которая может быть изготовлена из любого подходящего материала, например стали или алюминия. Основным назначением этой рамки является закрепление на ней пружин (b), растягивающих два смоченных коллагеновых слоя (с). Гидроксиапатит-коллагеновая пластина (Е) располагалась между этими двумя коллагеновыми слоями (с).

Если требовалось изготовить U-образную резорбируемую сшитую формостабильную мембрану, то использовали негативную форму (е) для изгибания коллагеновой пластины (Е) и кронштейны с шарнирами (f), обеспечивающие получение U-образных прямолинейных прототипов.

Слои коллагенового материала (слои нестерильного коллагена Geistlich Bio-Gide) предварительно растягивали посредством растяжения каждой пружины с усилием 2-3 Н до удлинения, или растяжения, составлявшего от 40 до 100% от первоначальной длины, вплоть до перехода этого коллагенового материала в линейную область кривой напряжение-деформация. В пределах этой линейной области модуль упругости имеет максимальное значение и, следовательно, достигается максимальная жесткость.

Из-за вязкоупругой природы коллагеновых тканей смоченные и растянутые материалы выдерживали в растянутом состоянии в течение приблизительно 30 минут.Вследствие того, что предварительно растянутая мембрана возвращается в исходное состояние, пружины растягивали снова с усилием 1-3 Н с тем, чтобы коллагеновый материал оставался в линейной области кривой напряжение-деформация.

Из нестерильной мембраны Geistlich Bio-Gide® были вырезаны два круглых образца коллагена диаметром 10 см, один из которых был подвергнут прокалыванию посредством игольчатого барабана, содержащего 50 игл на квадратный сантиметр и имевшего диаметр вала, равный 0,88 мм. Эти два круглых образца были подвергнуты смачиванию и растягиванию в радиальном направлении посредством 12 пружин, каждую из которых растягивали с усилием 1-3 Н, что приводило к удлинению, составлявшему от 40 до 100% от первоначального размера этих коллагеновых образцов.

В завершение этого этапа смачивали гидроксиапатит-коллагеновые пластины (Е) с обеих сторон клеем (Г) из коллагеновых волокон, после чего размещали гидроксиапатит-коллагеновую пластину между двумя слоями эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала. Центральный стержень (е) и шарниры (f) требуются для изготовления U-образных прототипов (см. ниже).

Эластичные и предварительно растянутые мембраны помещали на нагревательную плиту и подвергали предварительному нагреву до 40°С.

Сшитую пластину Bio-Oss (Е), полученную в Примере 2, ненадолго погружали в предварительно нагретый клей (Г) из коллагеновых волокон и размещали между двумя эластичными и предварительно растянутыми коллагеновыми мембранами.

Полиамидную сетку и губку (толщиной 5 см, плотностью приблизительно 20-25 мг/см, содержащую сообщающиеся поры, изготовленную из полиуретана) размещали с обеих сторон и сжимали на 50-95%, доводя давление сжатия до 120 кПа.

На фиг. 3 представлена компоновка плоской формостабильной мембраны, где (1) - стальная пластина, (2) - сжатая полиуретановая губка, (3) -полиамидная сетка, (4) - слой эластичного и предварительно растянутого коллагена и (5) - сшитая гидроксиапатит-коллагеновая пластина.

Затем полученное изделие высушивали в вакуумной печи при 40°С, равномерно понижая давление воздуха до 10 мбар в течение в общей сложности 32 часов.

Формирование U-образных прототипов

Специалист в данной области легко адаптирует устройство, показанное на фиг. 2 и 3, и описанный выше способ к формированию прямо- или криволинейных U-образных прототипов путем изгибания конструкции соответственно требуемой негативной форме и замены одной из губок более тонкой полиуретановой губкой или безворсовым бумажным полотенцем.

Сшивание плоских или U-образных прототипов (Е)

Плоские или U-образные прототипы (Е) обрезали до требуемых размеров с помощью ножниц или маленькой циркулярной пилы. Сшивание прототипов осуществляли с помощью химических реагентов или путем дегидротермальной обработки (DHT).

Химическое сшивание выполняли в буфере 0,1 моль/л MES при рН 5,5, содержании этанола 40% по объему и концентрации EDC и NHS, составлявшей соответственно от 10 до 400 мМ и от 13 до 520 мМ. Концентрация прототипа в сшивающем растворе составляла 10%. Для обеспечения гомогенного сшивания пластины сначала обрабатывали под вакуумом (менее 40 мбар), так что реакция сшивания протекала при 4°С в течение 2 часов, причем все буферные растворы предварительно охлаждали до этой температуры.

Реакцию останавливали путем двукратного инкубирования прототипов в буферном растворе 0,1 моль/л Na2HP04 при рН 9,5 в течение одного часа.

Полярные остатки удаляли путем инкубирования прототипов в течение 1 часа в растворе 1 моль/л NaCl и дважды в течение часа в растворе 2 моль/л NaCl. Прототипы промывали в дистиллированной воде в общей сложности 8 раз в течение 30-60 минут. После этого выполняли их обезвоживание путем в общей сложности 5-кратного погружения в этанол в течение 15 минут и трехкратной обработки диэтилэфиром в течение 5 минут и сушку при 10 мбар и 40°С в течение ночи или до полного высушивания продукта либо путем лиофилизации (замораживания до температуры ниже -10°С и сушки посредством проведения обычной процедуры лиофилизации) продукта, не обработанного растворителем.

В альтернативном варианте сшивание выполняли путем дегидротермальной обработки (DHT) при 0,1-10 мбар и 80-120°С в течение 1-4 дней. В этом случае не было необходимости в последующей сушке.

Прототипы, полученные описанными выше способами, отмачивали в физиологическом растворе или в фосфатно-солевом буферном растворе в течение одного-двух часов. Для достижения пропитки в пределах 10 минут прототипы отмачивали повторно в дистиллированной воде в течение приблизительно 1-2 часов. В это время может быть также выполнено прокалывание посредством описанного выше игольчатого барабана. Обработку хлоридом натрия осуществляли путем трехкратного инкубирования прототипов в течение 40 минут в растворе 200 г/л NaCl. Осаждение хлорида натрия выполняли как описано ниже (Ж).

Сушка сшитых плоских или U-образных прототипов (Ж)

Сшитые прототипы подвергали обезвоживанию путем в общей сложности 5-кратного погружения в этанол на 15 минут. Затем выполняли сушку с помощью растворителя (трехкратная обработка диэтилэфиром в течение 5 минут и последующее высушивание при 10 мбар и 40°С) либо путем лиофилизации (замораживания до температуры ниже -10°С и высушивания посредством проведения обычной процедуры лиофилизации).

Толщина различных прототипов сшитой формостабильной мембраны в смоченном состоянии составляла от 1,0 до 2,0 мм, в большинстве случаев - от 1,2 до 1,8 мм.

Высушенные прототипы подвергали выборочной стерилизации рентгеновским излучением при 27-33 кГр.

Пример 4. Свойства резорбируемой сшитой формостабильной мембраны

Были определены следующие характеристики резорбируемой сшитой формостабильной мембраны, полученной в Примере 3: (1) смачиваемость в фосфатно-солевом буферном растворе, (2) механическая прочность, (3) ферментативная деградация с использованием коллагеназы, полученной из Clostridium histolyticum, (4) клеточная адгезия, (5) измеренное удлинение слоев эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала и (6) измеренная толщина гидроксиапатит-коллагеновых пластин и конечных прототипов.

(1) Смачиваемость в фосфатно-солевом буферном растворе Согласно наблюдениям, визуально оцениваемое время полного смачивания в фосфатно-солевом буферном растворе составляло для различных прототипов резорбируемой сшитой формостабильной мембраны от 5 до 10 минут и зависело, главным образом, от обработки хлоридом натрия, предшествующей обезвоживанию этанолом и сушке.

(2) Механическая прочность

Формостабильность мембраны, предлагаемой в изобретении, оценивали с помощью испытания на трехточечный одноосный изгиб, проводившегося аналогично методике, описанной в документах EN ISO 178 и ASTM D6272-10, где мембрану, предлагаемую в изобретении, погружали в фосфатно-солевой буферный раствор при рН 7,4 и температуре 37°С.

Данное испытание признано наиболее полезным, поскольку каждая формостабильная мембрана, предназначенная для механической стабилизации незамкнутого дефекта костной ткани, будет подвергаться воздействию изгибающих моментов. Поэтому можно использовать трех- или четырехточечный изгиб в качестве испытания с целью получения характеристик используемых материалов и, кроме того, для сравнения различных продуктов, например с разной толщиной. Наиболее подходящим параметром для охарактеризования материала является модуль упругости при изгибе. Тем не менее, для сравнения различных продуктов, имеющих разную толщину, более релевантным параметром является максимальное усилие после вдавливания на 8-10 мм, которое поэтому и использовалось для охарактеризования продукта.

Для проведения испытания на трехточечный одноосный изгиб нарезали образцы размером 50×13 мм, которые инкубировали в фосфатно-солевом буферном растворе до полного смачивания, определявшегося визуально.

Механическое испытание проводили со скоростью 5 мм в минуту на устройстве для трехточечного изгиба с расстоянием между опорами 26 мм и радиусом каждой опоры 5 мм. Модуль упругости при изгибе вычисляли в пределах изгибной деформации 1 и 5%. Результирующее максимальное усилие отсчитывали после опускания центрального пуансона на 8-10 мм.

Испытание выполняли на мембране, соответствующей изобретению, имеющей толщину 1,5 мм и сшитой посредством EDC/NHS, на мембране, соответствующей изобретению, имеющей толщину 1,6 мм и сшитой посредством DHT, и на PLA-мембране Resorb-X® производства компании KLS Martin, имеющей толщину 0,137 мм.

На фиг. 4, где представлен график изменения усилия как функции деформации для этих мембран, показано, что механическая стабильность мембраны, соответствующей изобретению и сшитой посредством EDC/NHS (около 0,65 Н для деформации 8 мм) или посредством DHT (около 0,40 Н для деформации 8 мм), существенно превосходит механическую стабильность PLA-мембраны Resorb-X® (около 0,10 Н для деформации 8 мм). Таким образом, мембрана, предлагаемая в изобретении, лучше стабилизирует незамкнутый дефект костной ткани.

(3) Испытание на ферментативную деградацию с использованием коллагеназы, полученной из Clostridium histolyticum

В теле человека коллагены разрушаются (деградируют) содержащимися в человеческих тканях матриксными металлопротеиназами (ММР), катепсинами и, предположительно, некоторыми сериновыми протеиназами. Наиболее изученными являются ММР, в которых коллагеназы (а именно ММР-1, ММР-8, ММР-13 и ММР-18) представляют собой наиболее важные ферменты для непосредственной деградации коллагена (Лауэр-Филдс и др. [Lauer- Fields et al.]. "Матриксные металлопротеиназы и расщепление коллагена". Biopolymers-Peptide Science Section, 2002, и Сонг и др. [Song et al.]. "Деградация коллагена, зависящая и не зависящая от матриксной металлопротеиназы". Frontiers in Bioscience, 2006).

Способность коллагеназы вызывать деградацию коллагеновых тканей и мембран зависит от гибкости субстрата и типа коллагена, активных сайтов и экзосайтов ММР.

Коллагеназы совмещаются с тройной спиралью коллагена, раскручивают ее и затем расщепляют (Сонг и др., 2006, см. выше).

Для преодоления различий в деградации между разными типами коллагена оценку деградации последнего, вызываемой коллагеназой, часто выполняют, используя коллагеназу, полученную из Clostridium histolyticum и придающую высокую скорость каталитической реакции (Кадлер и др. [Kadler et al.]. "Коротко 0 коллагене". J Cell Sci, 2007). В целом, природный коллагеновый продукт деградирует быстрее коллагенового продукта, сшитого химическим путем.

В ходе данного испытания коллагеновые продукты (образцы резорбируемой сшитой формостабильной мембраны с концентрацией коллагена 1 мг/мл) инкубировали при 37°С с 50 единиц/мл коллагеназы, полученной из Clostridium histolyticum (одна единица определялась как высвобождение пептидов из коллагена, полученного из ахиллова сухожилия коров, эквивалентное 1,0 микромоль лейцина при окрашивании в растворе нингидрина в течение 5 часов при рН 7,4 и 37°С в присутствии ионов кальция), в кальцийсодержащем Трис-буфере, а деградацию коллагенового матрикса измеряли визуально и с помощью набора DC Protein для определения концентрации белка производства компании Bio-Rad Laboratories (Геркулес, США, заказ №500-0116), используя коллаген I типа в качестве эталонного материала. Концентрацию коллагена определяли с помощью микропланшетного спектрометра Infinite М200, поставляемого компанией Tecan.

Все прототипы резорбируемой сшитой формостабильной мембраны, предлагаемой в изобретении, продемонстрировали по меньшей мере 10%-ю деградацию коллагена (оцененную посредством набора DC Protein с использованием коллагена I типа в качестве эталона) по истечении 4 часов, при этом скорость деградации коллагена (меньшая, чем у мембраны Geistlich Bio-Gide®) зависела от выбранных условий сшивания.

(4) Клеточная адгезия

Клеточную адгезию применительно к разным мембранам оценивали путем засевания 8 мм-ой перфорированной мембраны первичной культурой из 100000 фибробластов десны человека, предварительно маркированных флуоресцентным липофильным окрашивающим веществом, инкубирования в течение 24 часов в фосфатно-солевом буферном растворе при 37°С, удаления неприлипших клеток промыванием мембран в фосфатно-солевом буферном растворе, лизирования прилипших клеток и определения их количества посредством измерения флуоресценции при 485 нм. Флуоресценция была нормализована по стандартной кривой, полученной для засеянной клетками перфорированной мембраны, которую не промывали до лизиса.

Результаты, полученные для формостабильной резорбируемой мембраны, показаны на фиг. 6, где представлена столбиковая диаграмма, в которой по горизонтали отложена процентная доля клеток, способных приклеиваться к различным типам стоматологических мембран - коллагеновой мембраны Geistlich Bio-Gide®, резорбируемой сшитой формостабильной мембраны, предлагаемой в изобретении, и PTFE-мембраны Cystoplast® (Keystone Dental).

Фиг. 6 показывает, что адгезия резорбируемой сшитой формостабильной мембраны, предлагаемой в изобретении, составляет приблизительно 10,5%, и это значение гораздо ближе к соответствующему значению для мембраны Geistlich Bio-Gide® (приблизительно 13%), чем для PTFE-мембраны Cystoplast® (приблизительно 4%). Мембрана Geistlich Bio-Gide® широко известна своими высокими характеристиками в отношении заживления при низкой степени дегисценции (Цицман, Наеф и др. [Zitzmann, Naef et al.], 1997; Таль, Козловски и др. [Tal, Kozlovsky et al.], 2008) и отсутствии чрезмерного воспаления (Чон [Jung], 2012). Это измеренное значение адгезии фибробластов десны человека на резорбируемой сшитой формостабильной мембране, предлагаемой в изобретении, позволяет прогнозировать плавное заживление тканей без осложнений, таких как чрезмерное воспаление или дегисценция.

(5) Измерение удлинения слоев эластичного и предварительно растянутого коллагенового материала

Для определения величины растяжения слоев коллагена закрепляли такой сухой слой на натяжной рамке (фиг. 2, деталь "а") с помощью еще не растянутых пружин (фиг. 2, деталь "b"). Карандашом или ручкой отмечали в центре мембраны по меньшей мере 4 точки, расположенные в нескольких сантиметрах друг от друга. Расстояние между точками измеряли линейкой. Измеренные расстояния между точками принимали в качестве начальных значений длины. Погружали слой коллагена в воду и растягивали с требуемым усилием. Подвергали слой коллагена инкубированию в воде в течение 30 минут. Из-за вязкоупругой природы большинства слоев коллагена растяжение уменьшалось. Поэтому требовалось повторное растягивание этих слоев коллагена. После 30-40-минутного инкубирования измеряли линейкой расстояние между точками. Процентную долю деформации определяли путем вычитания начальных значений длины из значений длины после растягивания, деления полученного результата на начальное значение длины и умножения на 100.

Типичные результаты с нахождением в линейной области кривой напряжение-деформация находились для нестерильного коллагена Geistlich Bio-Gide в диапазоне деформации (удлинения, растяжения) между 40 и 100%.

Значения деформации, измеренные этим способом, не могут непосредственно сравниваться со значениями деформации, полученными при испытании на одноосное растяжение.

(6) Измерение толщины гидроксиапатит-коллагеновых пластин и конечных прототипов

Толщину конечных прототипов или гидроксиапатит-коллагеновых пластин (Е) можно измерить как описано выше или с помощью штангенциркуля.

(7) Анализ механических свойств различных слоев коллагена (фиг. 5) Для сравнения слоев коллагена, полученных из разных источников, и

оценки их механических свойств использовали стандартное испытание на одноосное растяжение смоченных образцов. Общая процедура в соответствии с этим аналитическим методом описана в документе ASTM D882-09 "Стандартный метод испытания на растяжение тонких листов полимерных материалов". Из-за высокой стоимости используемых коллагеновых мембран некоторые параметры испытания были изменены. Образцы нарезали на прямоугольные пластинки размером, например, 2×1 см, предварительно смачивали в изотоническом фосфатно-солевом буферном растворе и помещали в машину для испытания на растяжение, где расстояние между держателями образцов составляло 1 см. Образцы растягивали с постоянной скоростью, составлявшей 33% от начальной длины в минуту. Усилие, при котором фиксировалось 100% от начальной длины, обычно предварительно устанавливалось на 50 кПа. Удлинение образца вычисляли с использованием расстояния между двумя держателями образца.

Таким путем были получены кривые напряжение-деформация, представленные на фиг. 5.

Хотя настоящее изобретение иллюстрируется чертежами и подробно излагается в приведенном выше описании, эти чертежи и описание следует рассматривать в качестве иллюстраций или примеров, не подразумевающих никаких ограничений: изобретение не ограничивается представленными вариантами его осуществления.

Изучая эти чертежи, описание и измененную формулу изобретения, специалисты в данной области, применяющие на практике настоящее изобретение, могут разработать и реализовать другие варианты его осуществления, отличающиеся от представленных.

В формуле изобретения слово "содержащий" не исключает использования других элементов, а упоминание какого-либо элемента в единственном числе не исключает использования группы таких элементов.

1. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана для использования в полости рта, содержащая композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц, которые представляют собой природный костный минерал, включающий от 1,5 до 3,5 весовых частей неорганической керамики на 1 весовую часть коллагенового материала, расположенный между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, причем эластичный и предварительно растянутый коллагеновый материал представляет собой коллагеновый материал, растянутый так, что он находится в линейной/упругой области кривой напряжение-деформация, и содержащий 70-90 вес.% коллагена и 10-30 вес.% эластина.

2. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по п. 1, в которой композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц содержит от 2,0 до 3,0, весовых частей неорганической керамики на 1 весовую часть коллагенового материала.

3. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1, 2, в которой коллагеновый материал получен из тканей естественного происхождения, выбранных из группы, включающей мембраны брюшины или перикарда, плацентарные мембраны, подслизистый слой тонкого кишечника, кожу, твердую мозговую оболочку, связки, сухожилия, диафрагму, в частности грудную, сальник и фасции мышц или органов млекопитающих.

4. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1, 2, в которой коллагеновый материал получают из мембран брюшины или перикарда, подслизистого слоя тонкого кишечника или мышечных фасций свиней, коров и лошадей.

5. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-3, в которой эластичный и предварительно растянутый коллагеновый материал имеет модуль упругости, составляющий от 2 до 150 МПа.

6. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-3, в которой один из слоев эластичного предварительно растянутого коллагенового материала имеет отверстия от 5 до 500 мкм.

7. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-6, в которой неорганические керамические частицы имеют размер от 150 до 500 мкм.

8. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-7, в которой неорганические керамические частицы представляют собой гидроксиапатит.

9. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-8, в которой неорганические керамические частицы представляют собой костный минерал гидроксиапатит.

10. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-9, сшивание которой выполнено химическим путем.

11. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-9, сшивание которой выполнено путем дегидротермальной обработки (DHT).

12. Способ изготовления резорбируемой сшитой формостабильной мембраны по одному из пп. 1-11, включающий следующие стадии: (а) приготовление композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц и выполнение, при необходимости, сшивания этого композиционного слоя, (б) компоновку и приклеивание композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц между двумя слоями коллагенового материала, подвергнутыми растягиванию, приводящему к растяжению коллагенового материала в линейной области кривой напряжение-деформация, в результате чего композиционный слой коллагенового материала и неорганических керамических частиц располагается между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, и (в) сшивание этого композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, расположенного между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, с последующей обработкой для придания гидрофильности.

13. Способ по п. 12, в котором обработка для придания гидрофильности включает погружение сшитого композиционного слоя коллагенового материала и неорганических керамических частиц, размещенного между двумя слоями эластичного предварительно растянутого коллагенового материала, в раствор хлористого натрия.

14. Резорбируемая сшитая формостабильная мембрана по одному из пп. 1-11, предназначенная для использования в качестве импланта для поддержки костеобразования, регенерации, пластики и/или замены костной ткани при наличии ее незамкнутого дефекта в области зубов у людей или животных.