Активатор роста дрожжей, грибов, микроорганизмов и сельскохозяйственных культур
Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается применение концентрата биологически активных веществ сои, полученного предварительной баротермической обработкой сырья с последующей водной экстракцией и упариванием, в качестве активатора роста микроорганизмов, сельскохозяйственных культур. Концентрат вносят в эффективном количестве в питательную или ферментационную среду, субстрат, почву или фолиарной обработкой. Изобретение позволяет повысить продуктивность и биомассу выращиваемых сельскохозяйственных культур, обеспечивает ускорение роста грибов, бактерий, дрожжей и других микроорганизмов, ускорение процессов компостирования и разложения целлюлозы. 4 ил., 7 табл., 4 пр.
Область применения
Изобретение относится к области биотехнологии, и может быть широко использовано в различных отраслях промышленности: перерабатывающей, пищевой, кормовой, фармацевтической и микробиологической, биотехнологической, сельского хозяйства (агрохимии), а именно к применению биологически активного препарата на основе растительного сырья для активации роста микроорганизмов и сельскохозяйственных культур и может найти применение в производстве грибов: шампиньоны, вешенки и других, в качестве компонентов ферментационных сред для культивирования различных микроорганизмов, в аэробном компостировании, в качестве органического удобрения при выращивании сельскохозяйственных культур.
Предшествующий уровень техники
Соевые бобы широко используются для производства белковых продуктов (мука, концентраты, изоляты). В то же время, для удовлетворения спроса на белковые ингредиенты с развитыми функционально-технологическими свойствами и улучшенными медико-биологическими характеристиками, необходимы новые технологические решения. В последние 10-15 лет были исследованы и подтверждены профилактические и лечебные свойства соевых пептидов, флавоноидов, олигосахаридов и других биологически активных соединений, содержащихся в семенах сои и продуктах их переработки. В связи с этим в настоящее время растет интерес к содержанию соответствующих биологически активных факторов в продуктах широкого потребления, к повышению их специфичности, и созданию промышленных технологий их извлечения, очистки и концентрирования.
Для приготовления питательных сред в микробиологической промышленности используют сырье минерального, животного и растительного происхождения, а также синтезированное химическим путем. Наиболее доступны для микроорганизмов углеводы, поэтому в лабораториях, а также во многих промышленных биотехнологических процессах (в производстве ферментов, антибиотиков, аминокислот и др.), используют глюкозу, сахарозу, лактозу и другие углеводы. Однако перечисленные углеводы являются ценным пищевым сырьем и достаточно дороги. В этой связи, в большинстве крупнотоннажных микробиологических производств индивидуальные углеводы заменяют более доступными по стоимости продуктами: отходами крахмало-паточного производства (меласса, гидрол), гидролизатами торфа и растительных отходов, побочными продуктами молочной промышленности и др. В качестве субстрата для роста микроорганизмов меласса может быть использована для получения микробного белка, молочной и лимонной кислот, культивирования бифидобактерий с целью получения пробиотических препаратов, биоэтанола и биобутанола.
Таким образом, соевая меласса является, с одной стороны, ценным продуктом за счет содержания большого количества углеводов (являющихся источником углерода при ее использовании в качестве компонента питательной среды), с другой - недорогим источником изофлавоноидов, которые могут быть выделены из мелассы.
Соевая меласса - коричневый вязкий сироп с горьковато-сладким запахом. Обычно соевая меласса содержит 50% сухих веществ. Она представляет собой совокупность различных соевых нутрицевтиков, а также олигосахаридов, состоит из углеводов (60%), белков и других азотистых веществ (10%), минеральных компонентов (10%), жиров и соединений липидной природы (20%). Основными составляющими соевой мелассы являются сахара, которые включают олигосахариды (стахиозу, раффинозу), дисахариды (сахарозу), небольшие количества моносахаридов (фруктоза, глюкоза). Соевую мелассу часто используют в качестве компонентов питательных сред для культивирования микроорганизмов, продуцирующих различные растворители (ацетон, этанол, бутанол), органические кислоты, в том числе молочную, полиэфиры, гликолипиды и т.д.
Традиционно соевые продукты с повышенным содержанием белка получают с применением процессов экстракции растворами этилового спирта или слабыми щелочами, изофокусирования в кислой зоне рН, промывания водой; более современные технологии включают использование мембран.
В качестве альтернативы данным методам, основными недостатками которых являются сложность аппаратурных схем, использование реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи), большие потери белка, была разработана технология 3Д-структурирования с применением термобаромеханического метода. Технология 3Д-структурирования заключается в переводе белков сои в единую трехмерную структуру - пористый гель, с последующей экстракцией водой низкомолекулярных веществ. В результате получают белковый продукт с содержанием сырого протеина 75%. Разработанный метод позволяет снизить потери белка, повысить эффективность экстракции, исключить использование химических реагентов [Хабибулина Н.В., Бикбов Т.М., Пономарев В.В. 3Д-структурирование - инновационный подход к интенсификации биотехнологических процессов. /Проектная культура и качество жизни. 2015. №1, С. 473-491].
При получении соевых белковых концентратов методом экстракции в качестве вторичного продукта образуется концентрат низкомолекулярных биологически активных веществ сои или т.н. водный экстракт 3Д-гранул, с высоким содержанием низкомолекулярных углеводов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, ростовых факторов.
Согласно способа, раскрытого в патенте РФ на изобретение №2636047, опубл. 17.11.2017, исходное сырье - соевую муку с объемной плотностью 500-600 г/л, смешивают с водой до достижения концентрации сырья 65-75%. Полученную увлажненную массу подвергают ступенчатому нагреву от 20 до 140-220°С в течение 60-90 сек при давлении от 50 до 120 атм. Затем резко сбрасывают давление до 1 атм и высушивают до остаточной влажности 10%, получая гранулированный пористый продукт с объемной плотностью от 50 до 350 г/л (в измельченном до размеров частиц муки виде полученный продукт имеет объемную плотность от 200 до 700 г/л). Далее проводят экстракцию муки водой при нейтральном рН при суммарном соотношении мука: вода 1:5-1:10 с получением водного экстракта. Экстракт упаривают до содержания сухих веществ 50%, получая концентрат биологически активных веществ сои (КБВС) (общие сахара - 60-70% от сухих веществ, сырой протеин - 10-15% от сухих веществ, изофлавоноиды - 0,7-1,0% от сухих веществ).
При использовании технологии 3Д-структурирования в качестве побочного продукта получают концентрат низкомолекулярных веществ сои (КНВС), содержащий 10-15% сырого протеина, 60-70% углеводов, 0,7-1,0% общего жира, а также минеральные и биологически активные вещества. Исходя из успешного опыта применения традиционной соевой мелассы в процессах культивирования микробных штаммов, концентрат биологически активных веществ сои также может иметь перспективы в качестве компонента ферментационных сред, как источник углеводов и ростовых факторов, стимулирующих синтез целевых продуктов.
Известен способ RU 2603088, опубл. 20.11.2016, стимуляции роста и развития растений, предусматривающий обработку семян биопрепаратом, в качестве которого используют культуру лактобактерий Enterococcus durans ВКПМ В-10093, смешанную со свекловичной мелассой. Изобретение позволяет увеличить продуктивность сельскохозяйственных культур и снизить их заболеваемость.
Из патента RU 2227806, опубл. 27.04.2004, известно применение соевой мелассы в качестве стимуляторов роста бифидобактерий. Отход производства соевого белкового изолята - кислую соевую мелассу - подвергают электрохимической активации в катодной зоне до достижения заданных параметров, отделяют жидкую фазу и подвергают ее сублимационной сушке. Полученный препарат смешивают с питательной основой "Эпидермат-О", хлористым натрием и дистиллированной водой с получением питательной основы для культивирования бифидобактерий. Изобретение позволяет утилизировать отход производства соевого белкового изолята - кислой соевой мелассы.
Из RU 2698213, опубл. 23.08.2019, известна среда для получения пробиотической добавки для корма перепелов, состоящая из смеси свекловичной и кукурузной меласс, взятых в равных частях, К2НРО4, микроорганизмов Lactobacillus salivarius. Изобретение позволяет повысить продуктивность перепелов за счет выращивания их с использованием разработанной пробиотической добавки.
Востребованным продуктом микробного синтеза являются ферменты, широко используемые в различных отраслях промышленности и сельском хозяйстве. На рынке промышленных ферментов одну из доминирующих групп представляют карбогидразы, доля которых в 2018 г составляла 24% от общего рынка ферментов. Промышленные карбогидразы включают, главным образом, амилазы, целлюлазы и гемицеллюлазы.
Способность целлюлаз и гемицеллюлаз гидролизовать некрахмальные полисахариды (НКП) обусловливает их широкое применение в процессах биоконверсии растительного сырья в пищевой, текстильной, целлюлозно-бумажной промышленности, в кормовой отрасли, при производстве биотоплива и моющих средств [Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma. /Ф.К. Алимова. - Казань: Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина, 2006. 209 с., Михайлова Р.В. Мацерирующие ферменты мицелиальных грибов в биотехнологии /Р.В. Михайлова. - Минск: Белорус. наука, 2007. 407 с.].
Наиболее интенсивно растет спрос на ферментные препараты (ФП) целлюлаз и гемицеллюлаз в кормопроизводстве, где гидролиз НКП в зерновом сырье приводит к снижению вязкости кормовых смесей и перевариваемой массы, повышает доступность питательных компонентов для действия пищеварительных ферментов, способствует нормализации микрофлоры кишечника, увеличивает энергетическую ценность и усвояемость кормов, позволяет заменять дорогостоящие компоненты рационов более дешевыми зерновыми культурами.
В качестве промышленных продуцентов карбогидраз предпочтительно используют мицелиальные грибы, которые отличаются высокой продуктивностью и достаточно простыми схемами культивирования и получения готовых форм препаратов. Известно, что сою и продукты на ее основе часто используют для культивирования мицелиальных грибов. Так штамм Т. reesei WX-112 - продуцент целлюлаз выращивали поверхностным способом на среде, содержащей в качестве основных компонентов пшеничные отруби, авицел и муку из соевого жмыха. Для индукции синтеза карбогидраз Т. reesei при глубинном культивировании в ферментационные среды добавляют соевую шелуху.
Во ВНИИПБТ совместно с НИЦ «Курчатовский институт» методом гамма-мутагенеза на кобальтовом источнике был получен штамм мицелиального гриба Trichoderma reesei Со-44 (ВКМ F-4789D) с увеличенной активностью ксиланазы и эндоглюканазы для получения ферментных препаратов кормового назначения [Костылева Е.В., Цурикова Н.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Веселкина Т.Н., Лобанов Н.С., Шашков И.А., Синицын А.П. Повышение активности карбогидраз эндодеполимеразного действия в штамме Trichoderma reesei с помощью мутагенеза. Микробиология. 2018. Т. 87. №5. С. 530-540].
Раскрытие изобретения
Технический результат применения препарата на основе концентрата биологически активных веществ сои в качестве активатора роста дрожжей, грибов и других микроорганизмов, путем введения его в субстрат, питательную среду, почву или методом фолиарной обработки, заключается, прежде всего, в экологичности используемого препарата, полученного без использования химических реагентов, а так же, в ускорении роста микроорганизмов, увеличении накопления продуктов метаболизма, увеличении урожая биомассы, ускорении биотехнологических процессов.
Заявленный технический результат заключается в применении концентрата биологически активных веществ сои, полученных предварительной баротермической обработкой сырья с последующей водной экстракцией и упариванием, в качестве активатора роста дрожжей, бактерий, грибов, штаммов микроорганизмов, сельскохозяйственных культур путем внесения в питательную или ферментационную среду, субстрат, почву или фолиарной обработкой в количестве 0,5-10 мас. %.
Предпочтительно, концентрат биологически активных веществ сои используют в виде концентрата 50 мас. % или в сухом виде с содержанием сухих веществ 90-95 мас. %.
В качестве компонента ферментационной среды при культивировании грибных продуцентов ферментов концентрат биологически активных веществ сои используют в количестве 0,5-10 мас. %.
В качестве компонента питательной среды при культивировании хлебопекарных и спиртовых дрожжей концентрат биологически активных веществ сои используют в количестве 1,0-3,0 мас. %.
В качестве компонента питательной среды при культивировании дрожжей, молочнокислых бактерий концентрат биологически активных веществ сои используют в количестве 1,5-5,0 мас. %.
В качестве компонента субстрата при выращивании грибов вешенка или шампиньоны концентрат биологически активных веществ сои используют, предпочтительно, в количестве 1,5-3,0 мас. % от субстрата.
В качестве компонента при аэробном компостировании и разложении концентрат биологически активных веществ сои используют в количестве 2,0-4,0 мас. %.
В качестве органического удобрения пролонгированного действия при выращивании сельскохозяйственных культур путем внесения в почву из расчета 50 мг/кг почвы в виде раствора с концентрацией 0,5-1,2 мас. % или фолиарной обработкой с содержанием концентрата биологически активных веществ сои 0,5 мас. %.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1.
Исследование влияния концентрата биологически активных веществ сои (КБВС), содержащегося в ферментационной среде, на продукцию целевых ферментов высокоактивным промышленным штаммом Т. reesei.
Использовались следующие материалы: концентрат биологически активных веществ сои с содержанием белка 14,5±0,3% а.с.в., общих сахаров - 53,1±1,5% а.с.в., массовой долей влаги - 4,8%. Для определения активности целевых ферментов использовали ксилан из древесины березы, Na-соль карбоксиметилцеллюлозы («Sigma», США).
Культивирование Т. reesei проводили в колбах на термостатируемых качалках (250 об./мин) при 30°С в течение 72-120 ч в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл ферментационной среды следующего состава, мас. %: лактоза - 2,0; дрожжевой экстракт - 1,0; солодовые ростки - 1,0; KН2РО4 - 0,2; (NH4)2SO4 - 0,6; CaCl2 - 0,06; водопроводная вода; рН среды 5,0±0,2. Концентрат биологически активных веществ сои (КБВС) вносили в среду в концентрации от 1 до 9 мас. % по вариантам опыта. Стерильные питательные среды засевали микробиологической петлей, используя в качестве инокулята культуру, выращенную на модифицированной среде SM следующего состава (мас. %): KН2РО4 - 0,2; глюкоза - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,4; пептон - 0,6; солодовое сусло - 2,0; агар-агар - 2,0. Биомассу культуры, выращенной глубинным способом, отделяли центрифугированием при 10750 g в течение 5 мин. Культуральную жидкость (КЖ) использовали для определения активности ксиланазы, эндоглюканазы и концентрации растворимого белка.
Периодическое культивирование Т. reesei в режиме fed-batch проводили в лабораторных ферментерах КФ 108/3 с рабочим объемом 1,5 л, оснащенных системами автоматического регулирования рН, pО2 и температуры. Инокулят для засева ферментеров получали посредством культивирования гриба в качалочных колбах (250 об./мин) при 30°С в течение 48 ч в среде следующего состава (мас. %): глюкоза - 2,5; кукурузный экстракт (40% СВ) - 2,0; КН2РО4 - 0,5, водопроводная вода. Засев ферментера осуществляли внесением жидкого инокулята в количестве 8 об. % от его рабочего объема.
Ферментацию проводили при следующих условиях: температура - 30±2°С, расход воздуха (аэрация) - 0,5 л/мин, парциальное давление кислорода (рО2) - 30±5% - регуляция осуществлялась изменением скорости перемешивающего устройства, рН среды поддерживали на уровне 5,5±0,1 с помощью подтитровки растворами 5% H2SO4 и 10% NH4OH. Использовали ферментационную среду следующего состава (мас. %): лактоза - 2,0; микрокристаллическая целлюлоза - 1,0; солодовые ростки - 1,0; дрожжевой экстракт - 1,0; KН2РО4 - 0,2; (NH4)2SO4 - 0,6; CaCl2 - 0,06; пеногаситель Пропинол - 0,1; водопроводная вода. Концентрат биологически активных веществ сои вносили в исходную ферментационную среду в концентрации 5 мас. %. Подпитку осуществляли после 48 ч культивирования в автоматическом режиме со скоростью 5 мл/ч 41% водным раствором лактозы, глюкозы и ксилозы в соотношении 6:3:1 Продолжительность культивирования составляла 120 ч. По окончании культивирования биомассу культуры отделяли центрифугированием при 10750 g в течение 5 мин. В КЖ определяли активности целевых ферментов, а также общее содержание растворимого белка.
Активность ксиланазы и эндоглюканазы определяли по скорости образования восстанавливающих сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе ксилана из древесины березы и Na-соли карбоксиметилцеллюлозы, соответственно. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 мин при рН 5,0; 50°С при концентрации субстрата в реакционной смеси 0,5 мас. %.
Исследование влияния внесения концентрата биологически активных веществ сои на биосинтез ксиланаз и эндоглюканаз при культивировании Т. reesei в колбах.
Т. reesei синтезирует большой спектр целлюлолитических и гемицеллюлолитических ферментов и характеризуется повышенной активностью карбогидраз эндодеполимеразного действия - ксиланаз и эндоглюканаз, которые являются ключевыми в составе кормовых ферментных препаратов, способствуя быстрому снижению вязкости зерновых смесей, повышению доступности питательных компонентов зернового сырья, увеличению энергетической ценности и усвояемости кормов.
Внесение препарата на основе концентрата биологически активных веществ сои в ферментационную среду при культивировании Т. reesei в колбах привело к значительному увеличению активности целевых ферментов и ускорению динамики их биосинтеза. Так эндоглюканазная активность штамма повысилась в среднем на 50 ед/мл при увеличении концентрации концентрата биологически активных веществ сои в среде на 2 мас. %, а максимум накопления фермента сдвинулся со 120 ч на 72 ч культивирования. При концентрации 3 мас. % и выше наблюдалось снижение активности эндоглюканазы к 120 ч роста. Это происходило, вероятно, из-за высоких значений рН КЖ (7,0-7,3), при которых эндоглюканаза нестабильна и теряет часть активности, в то время как для экспрессии ксиланаз II и III Т. reesei благоприятны значения рН в нейтральной зоне. Максимальная активность эндоглюканазы - 489±25 ед/мл (220% от максимальной активности эндоглюканазы в контроле) была получена на 72 ч культивирования с 9 мас. % концентрата биологически активных веществ сои.
Аналогичным образом внесение концентрата биологически активных веществ сои влияло на биосинтез ксиланазы. Наибольшее увеличение активности ксиланазы, почти, в 2 раза по отношению к максимальной ксиланазной активности на исходной среде, наблюдалось на 72-96 ч роста в варианте с 9 мас. %.
На Рис. 1 показано влияние концентрации концентрата биологически активных веществ сои на биосинтез эндоглюканазы (А) и ксиланазы (Б) Т. reesei при культивировании в колбах. При внесении 5 и 7 мас. % концентрата биологически активных веществ сои активность эндоглюканазы увеличилась в 1,8 раз, ксиланазы - на 40-50%.
Таким образом, при культивировании в колбах концентрат биологически активных веществ сои способствовал повышению ксиланазной и эндоглюканазной активности Т. reesei, кроме того наблюдалось ускорение динамики биосинтеза целевых ферментов, что позволяет сократить время культивирования в колбах до 72-96 ч вместо 120 ч.
Культивирование Т. reesei в лабораторных ферментерах с внесением концентрата биологически активных веществ сои.
Для проверки результатов глубинного культивирования Т. reesei с внесением препарата концентрата биологически активных веществ сои, проведенного в колбах, далее штамм был прокультивирован в лабораторных ферментерах с подпиткой. Соевый препарат добавляли в опытную среду в концентрации 5 мас. %, так как 7 и 9 мас. % препарата способствовали увеличению вязкости ферментационной среды.
На Рис. 2 показана динамика накопления эндоглюканазы (А) и ксиланазы (Б) при культивировании Т. reesei в лабораторных ферментерах в режиме fed-batch. Полученные данные показали, что при культивировании в режиме fed-batch внесение в исходную среду 5 мас. % концентрата биологически активных веществ способствовало увеличению активности эндоглюканазы и ксиланазы на 11 и 28% соответственно. В варианте с добавлением концентрата биологически активных веществ наблюдалось более интенсивное накопление эндоглюканазы на первые 2-3 суток роста. Биосинтез ксиланазы в варианте с внесением концентрата биологически активных веществ сои, наоборот, интенсифицировался после 96 ч роста, в то время как в контрольном варианте накопление ксиланазы после 120 ч роста замедлялось.
Следует отметить, что помимо продуктивности штаммов, эффективность ферментации определяет такой важнейший критерий, как общий съем целевых ферментов с ферментера. В расчет данного параметра входит активность целевых ферментов и количество полученного супернатанта КЖ. При культивировании с внесением концентрата биологически активных веществ сои вязкость слива снизилась более чем в три раза (таблица 1), что в свою очередь, способствовало увеличению выхода супернатанта на 55%, поэтому съем с ферментера по активности эндоглюканазы увеличился на 73%, а по активности ксиланазы - в два раза. Полученные результаты подтверждают значительный положительный эффект, который оказывает на экономические показатели ферментации Т.reesei введение в состав исходной среды 5 мас. % концентрата биологически активных веществ сои и целесообразность его использования в качестве компонента питательных сред.
Пример 2. Использование концентрата биологически активных веществ сои при выращивании грибов в условиях вегетационного опыта в защищенном грунте.
Были заложены опыты с вешенкой и шампиньонами с разными концентрациями концентрата биологически активных веществ сои в субстрате. Велось наблюдение за скоростью зарастания субстрата мицелием. В качестве субстрата для вешенки использовали кокосовое волокно, а для шампиньонов - смесь листового компоста и торфа. Испытывали следующие концентрации соевого препарата: 2,0; 3,0; 4,0 г на литр кокосового субстрата (1,7-3,3 мас. %). В опыте с шампиньонами концентрация соевого препарата (КБВС) составляла: 3,5; 7,0; 10,5 г на литр субстрата (1,2-3,5 мас. %).
На кокосовом волокне самое быстрое зарастание субстрата отмечалось на вариантах с концентрациями 2,0 грамма концентрата биологически активных веществ на литр кокосового субстрата (1,7 мас. %), более высокие концентрации тормозили рост мицелия. Лабораторные исследования кокосового волокна показали низкое содержание в нем основных питательных элементов, для дальнейших опытов было решено использовать более богатый по химическому составу субстрат: смесь опилок и раздробленных стержней кукурузы. На субстрате для шампиньонов лучшим по скорости роста мицелия был вариант с 7,0 г концентрата биологически активных веществ сои на литр (2,3 мас. %).
Опыт по выращиванию Вешенки (Pleurotus ostreatus).
Для выращивания вешенки (Pleurotus ostreatus) использовали субстрат следующего состава: сосновые опилки, отмытые от смолистых веществ, и рубленые кукурузные стержни. Соотношение компонентов в субстрате - 3:1 по объему. На кг сухого субстрата добавляли 15 г извести. Химический состав полученного субстрата (мас. %): общая зола - 2,3, целлюлоза - 36; гемицеллюлоза - 24; лигнин - 28,4; экстрактивные вещества - 9,3. Содержание в мас. %: общего азота - 1,5, общего фосфора - 0,45, общего калия - 2,0. После смешивания всех компонентов субстрата (опилки, кукурузные стержни, известь), производилось стерилизация полученного субстрата - автоклавирование при 1 атм в течение 20 минут. Часть стерильного субстрата смешивали с сухим концентратом биологически активных веществ сои из расчета 2 грамма на 1 л сухого субстрата. Затем субстрат смачивали стерильной водой из расчета 2,5 части воды на 1 часть субстрата, что соответствовало 70% влажности. Содержание концентрата биологически активных веществ сои в готовом субстрате составила 2 мас. %.
Влажный субстрат инокулировали зерновым мицелием вешенки (Pleurotus ostreatus,) из расчета 25 грамм зернового мицелия на 1 литр влажного субстрата. Субстрат помещали в полиэтиленовые мешки зип-лок объемом 1,2 литра. Пакеты с субстратами выдерживали в освещенном помещении при температуре +23°С. Интенсивное зарастание субстрата мицелием вишенки наблюдалось через 12 дней. Через 24 дня от начала опыта, когда мицелий полностью занял всю поверхность субстрата, пакеты были помещены в климатическую камеру с температурой воздуха +12°С для «холодного стресса» на 7 дней. После «холодного стресса» пакеты с мицелием вешенки помещали в климатическую камеру с восходящим током теплого влажного воздуха (температура +21°С). Стерильным лезвием в пакетах делались надрезы каждые 3,5 см. Через неделю началось образование примордий на варианте с концентратом биологически активных веществ сои. Первые плодовые тела были получены через 57 дней от инокулирования. К этому времени плодовые тела на контроле еще не образовались. Пакеты контрольного варианта (без концентрата биологически активных веществ сои) повторно подверглись «холодному стрессу» в течение 7 дней. Плодовые тела на варианте без соевого препарата были получены почти на месяц позже. Вешенки, выращенные на субстрате с концентратом биологически активных веществ сои, были срезаны, и взвешены через 62 дня от инокулирования, а с контрольного варианта через 86 дней. Средний сырой вес грибов варианта с концентратом биологически активных веществ сои (4 повторности) - 43,7 г/пакет, на контрольном варианте (4 повторности) - 6,4 г/пакет. Срезанные плодовые тела вешенки высушивались в термостате при температуре +40°С до постоянного веса, размалывались. В сухом веществе определяли содержание основных питательных элементов и белка. По химическому составу, то есть по содержанию в сухом веществе азота, фосфора и калия, а также по содержанию белка плодовые тела на контроле и варианте с концентратом биологически активных веществ достоверно не отличались. Если учесть, что вес плодовых тел на контроле был примерно в 7 раз ниже, чем на варианте с концентратом биологически активных веществ, то и выход белка при использовании концентрата, как компонента субстрата, был пропорционально выше.
Таким образом, добавление концентрата биологически активных веществ сои в субстрат позволило получить продукцию грибов вешенка почти на месяц раньше, чем на варианте без добавления концентрата, вес плодовых тел и выход белка был в 7 раз выше.
Опыт с шампиньонами (Agaricus bisporus). Субстрат для выращивания шампиньонов представлял собой 4-х летний листовой компост. Содержание в мас. %: органического вещества в компосте составляло 45, азота общего - 1,7, фосфора - 0,8, калия - 3,8. Перед закладкой опыта субстрат смешивали со свекловичной мелассой или концентратом биологически активных веществ сои и автоклавировали в колбах на 0,5 литра с ватно-марлевыми пробками для сохранения стерильности. Слой субстрата в колбах - 5 см. После автоклавирования субстрата по 20 мин при 1 атмосфере методам тиндализации (в течение 3-х суток), инокулировали его грибным мицелием. Опыт состоял из трех вариантов: 1 вариант - Контроль, субстрат без внесения дополнительных компонентов, 2 вариант - субстрат + 7 г сухого концентрата биологически активных веществ сои на 1 литр сухого субстрата или от массы готового субстрата 3%, 3 вариант - субстрат + 1 г свекловичной мелассы на 1 л сухого субстрата. После зарастания субстрата через 12 дней мицелием шампиньонов, проводили засыпку мицелия покровным субстратом (1 см торфа).
На вариантах с добавками через 60 дней отмечено образование плодовых тел шампиньонов. Размер шляпок грибов не превышал 1,5-2,0 мм. На контроле плодовые тела шампиньонов отсутствовали. Визуально количество плодовых тел было примерно в 10-12 раз больше на варианте с концентратом биологически активных веществ сои, чем на варианте со свекловичной мелассой.
Таким образом, концентрат биологически активных веществ сои в количестве 1,2-3,5 мас% является более эффективным стимулятором образования плодовых тел шампиньонов на выбранном субстрате, чем свекловичная меласса, а его содержание в количестве 2,0-3,0 мас%, близкий к оптимальному интервал концентраций его применения для выращивания указанных видов грибов..
Пример 3. Исследования аэробного разложения (компостирования) опилок бука с использованием концентрата биологически активных веществ сои, биопрепарата и удобрений.
Было проведено 6 вариантов опыта в 3-х повторностях (табл. 2), время компостирования - 48 суток. Опилки - переработанный ствол бука, очищенный от коры, размером ≈1,5×1,5 см.
Опыт проводились в сосудах на 500 мл, в них вносили высушенные до воздушно-сухого состояния опилки массой 50 г, далее увлажняли до 70%, вливая воду, объемом 35 мл, или питательный раствор такого же объема. Питательный раствор готовили по аналогии с питательной средой для культивирования аэробных целлюлитиков. Состав среды Гетчинсона и Клейтона для культивирования аэробных целлюлитиков (г/л), где целлюлоза не вносилась: NaNO3 - 2,5; K2HPO4 - 1,0; MgSO4 × 7H2O - 0,3; NaCl - 0,1; CaCl2×4 H2O - 0,1; FeCl3×6 H2O - 0,01.
В варианты опыта 3 и 4 вносили сухой концентрат биологически активных веществ сои массой 1 г. В варианты опыта 5 и 6 вносили культуру микроорганизмов, выделенных из желудочно-кишечного тракта слона, объемом - 3 мл, численность микроорганизмов - 105 кл/мл. Далее, проводили компостирование опилок с ежедневным перемешиванием.
После завершения компостирования опилки промывали на сите с диаметром отверстий 5 мм, высушивали на воздухе, и взвешивали. При этом было отмечено, что опилки вариантов 3 и 4 отмывались сложнее, чем на других вариантах, промывные воды были более темного цвета, древесина легко крошилась, что является критерием наибольшего разложения органического вещества. Взвешивание показало, что наибольшая убыль целлюлозы отмечена на варианте 4, где вносили одновременно концентрат биологически активных веществ и питательный раствор.
Как следует из таблицы 3, в присутствии питательного раствора (удобрения) концентрат биологически активных веществ сои при его содержании в количестве 2-4 мас. % обеспечивает наилучший результат: разложение целлюлозы ускоряется (по сравнению с контролем) в 1,34 раза, а по сравнению с биопрепаратом в смеси с удобрением - в 1,16 раза.
Пример 4. Исследование влияния концентрата биологически активных веществ сои в качестве органического удобрения при выращивании сельскохозяйственных культур.
Почва (тип почвы - подзол иллювиально-железистый супесчаный) отобрана в районе г. Малаховка, Московской обл., рН - 5,6, подвижный фосфор - 330 мг/кг воздушно-сухой почвы, обменного калия - 110,0 мг/кг воздушно-сухой почвы (калий и фосфор определяли методом Кирсанова).
Вегетационный опыт был заложен в фитотроне при температуре - 22°С, интенсивности освещения - 10000 люкс. Сосуды, объемом 1 литра, набивали почвой (тип почвы - подзол иллювиально-железистый супесчаный) и в них высевали сельскохозяйственные культуры: горох (Pisum sp.), сорт «Амброзия», ячмень (
sp.), сорт «Михайловский» и редис (Raphanus sativus), сорт «Дуро». Опыт состоял из пяти вариантов в 3-х повторностях, вариант 1 (К) - Контроль, в почву ничего не вносили, вариант 2 (N) - вносили в почву аммиачную селитру (NH4NO3) в концентрации 100 мг/кг действующего вещества (азота) или 300 кг/га, вариант 3 (М) - вносили в почву концентрат биологически активных веществ сои, масса препарата - 2,73 г/сосуд, содержание азота - 100 мг/кг, вариант 4 (О) - одновременное внесение минерального азота (NH4NO3) и азота концентрата биологически активных веществ сои в дозе 50 мг/кг почвы каждого, вариант 5 (Ф) - фолиарное (на лист) внесение концентарта биологически активных веществ сои, всего было проведено 3 обработки его водным раствором до полного смачивания растений с концентрацией 1 г/300 мл воды, т.е. с разведением 1:300. Почву, перед тем, как набить сосуды, перемешивали в лотке с точной навеской минерального или органического удобрения.
Иллювиально-железистый супесчаный подзол, перед закладкой опыта имел следующие характеристики: рН - 7,1, обменный (доступный растениям) калий - 109,3 мг/кг воздушно-сухой почвы (низкая обеспеченность), подвижный (доступный растениям) фосфор - 330 мг/кг воздушно-сухой почвы (очень высокая степень обеспеченности), цинк (Zn) - 6,5 мг/кг воздушно-сухой почвы, магний (Mg) - 63,0 мг/кг воздушно-сухой почвы, медь (Cu) - 0,75 мг/кг воздушно-сухой почвы, натрий (Na) - 12,0 мг/кг воздушно-сухой почвы.
Анализ сухого концентрата биологически активных веществ показал, что его влажность ≈5%, водорастворимый калий - 14285,7 мг/кг препарата (фотометрически с окрашиванием по Дениже), водорастворимый фосфор - 1297,5 мг/кг препарата (на плазменном фотометре). C/N соотношение - 11,27 (углерода - 41,24%, азота - 3,66%).
Содержание элементов определили методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе Agilent 7700х ICP-MS. Содержание элементов в сухом концентрате биологически активных веществ, мг/кг: Р (по Р2О5) - 18902; S - 2118; K (по K2O) - 54056; Са - 3264; Cr - 137,9; Со - 0,5; Mn - 31,8; Fe - 936; Ni - 89,2; Cu - 14; Zn - 55,3; Mo <0,1; As - 0,32; Na - 206; Са - 3114; Mg - 4500; С - 41,24%; N - 3,66%.
Результаты вегетационного опыта. Через 42 дня опыт был закончен, зеленая масса сельскохозяйственных культур взвешена. Результаты представлены в таблице 4 и на Рис. 3. На Рис. 3 показана зеленая масса ста растений по вариантам опыта. Прибавка зеленой массы на варианте (М) с внесением концентрата биологически активных веществ сои составила: редис - 98,4%, горох - 33,5%, ячмень - 18,6%; на варианте (О) с внесением концентрата биологически активных веществ сои и минерального удобрения: редис - 138,1%, горох - 39,3%, ячмень - 0,5%, на варианте (Ф) с фолиарной обработкой растений водным раствором концентрата биологически активных веществ: редис - 138,1%, горох - 10,1%, ячмень - 18,6%.
Однако, более объективные данные получаются при сравнении массы высушенных растений. После высушивания растений на воздухе и учета массы, показано, что прибавка зеленой сухой массы на варианте (М) с внесением концентрата биологически активных веществ сои составила: редис - 92,4%, горох - 49,6%, ячмень - 19,9%; на варианте (О) с внесением концентрата биологически активных веществ сои и минерального удобрения: редис - 153,6%, горох - 11,8%, ячмень - 32,1%, на варианте (Ф) с фолиарной обработкой растений водным раствором концентрата биологически активных веществ (Ф): редис - 46,0%, горох - 4,4%, ячмень - 55,6% (таблица 5, рис. 4). На Рис. 4 показана сухая масса 100 растений по вариантам опыта в граммах.
Определение в почве, после уборки опыта, рН и макроэлементов показало, что: валовый азот (определенный методом Кьельдаля после мокрого озоления с серной кислотой) на Контрольных вариантах опыта - 0,34%, на варианте (N) - 0,28%, на варианте (М) - 0,31%, на варианте (О) - 0,20%, на варианте (Ф) - 0,36%, при значительном выносе азота с вариантов N, М, О и Ф по сравнению с Контролем, остается примерно одинаковым. Отмечен значительный вынос растениями доступных форм фосфора и калия (таблица. 6).
Определение в растениях макро- и микроэлементов (цинка и меди) показало, что при внесении в почву концентрата биологически активных веществ сои соотношение N:P:K в растениях становится более оптимальным, по сравнению с другими вариантами опыта (таблицы 6 и 7). Азот, фосфор и калий в растениях определяли после мокрого озоления в серной кислоте: азот - методом Кьельдаля, фосфор - фотометрически с окрашиванием по Дениже, калий - на пламенном фотометре. Цинк и медь, после сухого озоления и растворения навески 1 м азотной кислотой на атомно-абсорбционном спектрометре.
Вегетационный опыт показал, что концентрат биологически активных веществ сои может вноситься в почву как органоминеральное удобрение пролонгированного действия, увеличивая биомассу выращиваемых сельскохозяйственных культур в количестве 0,5-1,2 мас. %.
При внесении концентрата биологически активных веществ сои совместно с минеральным удобрением увеличение показателя сухого веса растения редиса по сравнению с использованием только минерального удобрения составило 20%. Отсюда можно сделать предварительный вывод о высокой отзывчивости на концентрат биологически активных веществ корнеплодных культур. Для злаковых культур (ячмень) дополнительная отзывчивость составила 10%. При внесении концентрата биологически активных веществ сои в почву оптимизируется N:P:K соотношение в растениях. Наилучшие результаты по повышению уровня и оптимизации N:P:K достигнуты на редисе (корнеплоды).
Несмотря на высокое содержание в исходном концентрате биологически активных веществ сои микроэлементов с контролируемыми уровнями ПДК, концентрация цинка и меди во всех образцах растений не превысила установленных нормативов, что свидетельствует о безопасности концентрата биологически активных веществ в качестве удобрения.
Применение концентрата биологически активных веществ сои, полученного предварительной баротермической обработкой сырья с последующей водной экстракцией и упариванием, в качестве активатора роста дрожжей, грибов, микроорганизмов и сельскохозяйственных культур путем внесения в питательную или ферментационную среду, субстрат, почву или фолиарной обработкой в количестве 0,5-10 мас. %.
