Способ получения повышающей регуляции экспрессии pd-l1, полипептиды, конъюгат, слитый полипептид, композиция и комбинация для обеспечения повышающей регуляции экспрессии pd-l1

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидным иммуносупрессорам, и может быть использовано в медицине. Предложены полипептиды на основе TREM-подобного транскрипта 1 (TLT-1), а также конъюгаты и слитые с ними белки. Изобретение обеспечивает повышающую регуляцию экспрессии PD-L1 и понижающую регуляцию экспрессии HLA-DR путем связывания предложенных полипептидов напрямую с иммунными клетками и индукции иммуносупрессивных фенотипов, что может быть полезным для лечения заболеваний, связанных с иммунной гиперреактивностью, таких как аутоиммунные заболевания, реакции гиперчувствительности, отторжение трансплантатов и реакции «трансплантат против хозяина». 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области модуляции иммунного ответа. В частности, настоящее изобретение относится к способам и полипептидам, предназначенным для модуляции иммунного ответа за счет связывания TLT-1 непосредственно с иммунными клетками и запуска проявления клетками иммуносупрессивных фенотипов.

Уровень техники

Тромбоциты являются критически важными медиаторами гемостаза. Последние научные достижение указывают на то, что тромбоциты могут влиять как на врожденный, так и на адаптивный иммунный ответ.Активированные тромбоциты могут высвобождать растворимые медиаторы, такие как растворимый CD40L, которые взаимодействуют с лейкоцитами для модуляции воспалительных процессов и могут вносить вклад в иммунную дисрегуляцию у пациентов с сепсисом. TREM-подобный транскрипт-1 (TLT-1) был обнаружен исключительно в альфа-гранулах покоящихся тромбоцитогенных мегакариоцитов и на поверхности активированных тромбоцитов. TLT-1 является членом семейства запускающих рецепторов, экспрессируемых на миелоидных клетках (trigger in g receptor expressed on myeloid cells, TREM) и состоит из одного домена V-типа иммуноглобулина (Ig), короткого цитоплазматического хвоста и заряженного остатка в трансмембранном домене. В недавнем исследовании с использованием антител к TLT-1 была выявлена роль белков в тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов {Giomarelli В, Washington V. A., Chisholm М.М., Quigley L., McMahon J.В., et al. (2007) Inhibition of thrombin-induced platelet aggregation using human single-chain Fv antibodies specific for TREM-like transcript-1. Thromb Haemost 97: 955-963). Патент США № US 7553936 В2 относится к способам и композициям для модуляции активности тромбоцитов, и способам и композициям для лечения заболеваний или нарушений, связанных с активностью тромбоцитов, у пациентов, включающим введение одноцепочечных антител к TREM-подобному транскрипту-1 (TLT-1) или функционального фрагмента или варианта указанных антител в количестве, эффективном для модуляции активности тромбоцитов.

Малые растворимые фрагменты внеклеточного домена TLT-1 (12 и 14 кДа) были выявлены в сыворотке здорового человека, но не в плазме. Исследования показали, что TLT-1 может выступать в качестве регулятора гемостаза за счет связывания с фибриногеном, которое способствует активации тромбоцитов, также было показано наличие значимой корреляции между высокими уровнями содержания растворимого TLT-1 (sTLT-1) и показателями диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Патент США №US 20040180409 А1 описывает нуклеиновую кислоту TLT-1 и молекулы белка, которые могут быть использованы в качестве модулирующих агентов при регуляции различных клеточных процессов, например, свертывания крови и иммунного ответа. Длительная экспрессия sTLT-1 в плазме была связана с пониженным выживанием у пациентов с септическим шоком (Washington А V, Gibot S, Acevedo I, Gattis J, Quigley L, et al. (2009) TREM-like transcript-l protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans. J Clin Invest 119: 1489-1501). Патент США №US20130029921 Al раскрывает, что пептиды, полученные на основе TLT-1 и TLT-1, демонстрируют противовоспалительные свойства, за счет специфичного ингибирования активности TREM-1. Недавно в работе Derive et al. было показано, что sTLT-1 может связываться с растворимым лигандом TREM-1, препятствуя активации лейкоцитов (Derive М, Bouazza Y, Sennoun N, Marchionni S, Quigley L, et al. (2012) Soluble TREM-like transcript-1 regulates leukocyte activation and controls microbial sepsis. J Immunol 188: 5585-5592). В совокупности, эти клинические исследования и исследования in vitro указывают на то, что sTLT-1 может оказывать двойственное действие, играя роль в активации тромбоцитов и опосредуя функцию лейкоцитов во время сепсиса.

Таким образом, по-прежнему имеется необходимость в разработке агента или терапии для модуляции иммунного ответа.

Раскрытие изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, предлагается способ модуляции иммунного ответа, содержащий связывание полипептида, TREM-подобного транскрипта 1 (TLT-1), с иммунной клеткой, в котором связывание полипептида TLT-1 с иммунной клеткой подавляет иммунный ответ.В одном из вариантов осуществления изобретения, связывание полипептида TLT-1 с иммунной клеткой обеспечивает лечение и/или предотвращение заболевания, связанного с иммунной гиперреактивностью; предпочтительно, заболевание представляет собой аутоиммунной заболевание, реакцию гиперчувствительности, отторжение трансплантата или возникновение реакции «трансплантат против хозяина». В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептиды TLT-1 представляют собой полипептиды, описанные ниже в настоящем документе.

В соответствии с настоящим изобретением, также предлагается полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере 5 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, или по меньшей мере приблизительно на 50% совпадающую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, 2 или 3, или биологически активный фрагмент или вариант указанного полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, приблизительно на 80% совпадающую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, 2 или 3; предпочтительно, полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 3. В одном из вариантов осуществления изобретения, указанный полипептид представляет собой рекомбинантный полипептид или синтетический полипептид.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид является пегилированным или конъюгированным с соединением, обладающим направленным воздействием на ткани, альбумином или пептидом, связывающимся с сывороточным альбумином. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид слит с соединением, обладающим направленным воздействием на ткани, альбумином или пептидом, связывающимся с сывороточным альбумином.

Помимо этого, в соответствии с настоящим изобретением, предлагается композиция, содержащая полипептид TLT-1 в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемый носитель. Также, предлагается способ лечения и/или предотвращения заболеваний, связанных с иммунной гиперреактивностью, включающий введение пациенту полипептида TLT-1 согласно настоящему изобретению, или композиции, содержащей полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением, также предлагается слитый белок TLT-1, содержащий полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению, слитый с одним или несколькими гетерогенными полипептидами или с другим полипептидом TLT-1 согласно настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением, также предлагается пегилированный полипептид TLT-1, содержащий по меньшей мере одну молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ), функционально связанных по меньшей мере с одним аминокислотным остатком на N-конце полипептида TLT-1 согласно настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением, также предлагается конъюгат полипептида TLT-1, содержащий полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению, конъюгированный с иммуносупрессивным агентом.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 показано взаимодействие между TLT-1 и лейкоцитами. Мононуклеарные клетки периферической крови инкубировали с rsTLT-1 в течение 1 часа и окрашивали биотинилированными козьим антителами к TLT-1 с конъюгатом аллофикоцианин-авидин для выявления поверхностного связывания TLT-1. (А) показывает репрезентативную гистограмму различных лейкоцитов в присутствии или при отсутствии обработки rsTLT-1, полученную способом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (fluorescence-activated cell sorting, FACS). Моноциты, полиморфоядерные клетки и лимфоциты отсортированы на основании их характеристик FSC/SSC (гистограмма, показанная сплошной линией: клетки, обработанные rsTLT-1; гистограмма, показанная пунктирной линией: необработанные клетки; гистограмма, показанная тонкой пунктирной линией: контрольный образец соответствующего изотипа). TLT-1 связывается с моноцитами и полиморфоядерными клетками, но не с лимфоцитами. (Б) демонстрирует связывание rsTLT-1 в различных концентрациях с моноцитами и полиморфоядерными клетками. Полиморфоядерные клетки и моноциты были способны к дозозависимому связыванию с rsTLT-1. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, по результатам 3 независимых экспериментов.

На Фиг. 2 показано влияние sTLT-1 на поверхностную экспрессию молекул HLA-DR и PD-L1 в моноцитах. (А) Моноциты подвергали инкубированию с rsTLT-1 (10 мкг/мл) в течение 3 дней. В указанный момент времени клетки были собраны и подвергнуты анализу для выявления молекул HLA-DR и PD-L1 с использованием проточной цитометрии. Обработка rsTLT-1 приводит к возникновению тренда с понижающей регуляцией экспрессии HLA-DR. Напротив, обработка rsTLT-1 приводит к повышающей регуляции уровня экспрессии PD-L1 на поверхности моноцитов. (Б) Моноциты культивировали с rsTLT-1 в различных концентрациях в течение 2 дней. После этого клетки были собраны и подвергнуты анализу для выявления молекул HLA-DR и PD-L1 с использованием проточной цитометрии. Экспрессия молекул на поверхности клетки выражена как средняя интенсивность флуоресценции (MFI) относительно каждого дня, когда клетки были обработаны контрольной средой (пунктирная линия). Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, по результатам 3 независимых экспериментов.

На Фиг. 3 показано влияние полипептидов TLT-1 на поверхностную экспрессию молекул PD-L1 в моноцитах. (А) показывает структурные характеристики внеклеточного домена TLT-1 и разработанных полипептидов TLT-1. (Б) показывает, что моноциты были подвергнуты культивированию с фрагментами полипептида TLT-1 различной длины (10 мкг/мл) и 10 мкг/мл rsTLT-1 в течение 1 дня. После этого клетки были собраны и подвергнуты анализу для выявления молекул PD-L1 с использованием проточной цитометрии. Экспрессия молекул на поверхности клетки выражена как средняя интенсивность флуоресценции (MFI) относительно каждого дня, когда клетки были обработаны контрольной средой (пунктирная линия).

На Фиг. 4 показано влияние полипептидов TLT-1 15-63 на поверхностную экспрессию молекул HLA-DR в моноцитах. Моноциты были подвергнуты культивированию с 10 мкг/мл полипептида TLT-1 15-63 и 10 мкг/мл rsTLT-1 в течение 2 дней. После этого клетки были собраны и подвергнуты анализу для выявления молекул HLA-DR с использованием проточной цитометрии. Экспрессия молекул на поверхности клетки выражена как средняя интенсивность флуоресценции (MFI) относительно каждого дня, когда клетки были обработаны контрольной средой (пунктирная линия).

Осуществление изобретения

Перед началом описания композиций, способов и методик выделения, согласно настоящему изобретению, необходимо подчеркнуть, что настоящее изобретение ими не ограничивается, поскольку такие композиции, способы и условия могут варьироваться. Также необходимо понимать, что терминология, использованная настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не является ограничительной, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Было обнаружено, что TLT-1 напрямую связывается с иммунными клетками и за счет связывания запускает проявление клетками иммуносупрессивных фенотипов; т.е. понижающую регуляцию экспрессии HLA-DR и повышающую регуляцию экспрессии PD-L1. Индукция экспрессии PD-L1 и редукция экспрессии HLA-DR под действием TLT-1 или полипептидов TLT-1, таким образом, может быть полезной для лечения заболеваний, связанных с иммунной гиперреактивностью, таких как аутоиммунные заболевания, реакции гиперчувствительности, отторжение трансплантатов и возникновение реакций «трансплантат против хозяина». Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют общепринятые значения, понятные обычному специалисту в области техники, к которой относится изобретение. Любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы при реализации или испытаниях настоящего изобретения в случае, если будет понятно, что модификации и вариации не выходят за пределы сущности и объема раскрытия настоящего изобретения.

Если не указано иное, в тех случаях, когда термин употреблен в единственном числе, это подразумевает «один или более».

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, аминокислотные остатки обозначаются следующими сокращенными обозначениями: аланин (Ala; А), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), аргинин (Arg; R), цистеин (Cys; С), глутаминовая кислота (Glu; Е), глутамин (Gin; Q), глицин (Gly; G), гистидин (His; Н), изолейцин (Не; I), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Met; М), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; Р), серии (Ser; S), треонин (Thr; Т), триптофан (Trp; W), тирозин (Туг; Y) и валин (Val; V).

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, обозначение «PD-L1» указывает на лиганд белка программируемой смерти 1 (PD-L1), кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 В7 (В7-Н1). PD-L1 представляет собой трансмембранный белок типа 1 с молекулярной массой 40 кДа, который играет существенную роль в подавлении иммунной системы во время определенных состояний, таких как беременность, аутоиммунные заболевания, рак, сепсис и другие инфекционные заболевания, такие как микобактериальный туберкулез, цитомегаловирусная инфекция и гепатит.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «моноцит», также называемый мононуклеарным лейкоцитом, принадлежит к типу лейкоцитов, участвующих в защитном механизме первой линии и признается способным к дифференциации в дендритную клетку или прекурсор макрофага. В норме моноциты движутся в кровеносной системе. В ответ на внешние стимулирующие сигналы моноциты секретируют множество иммунорегулирующих цитокинов, перемещаются к месту инфекции в тканях и дифференциируются в макрофаги.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «модуляция» включает «увеличение» или «стимулирование», а также «уменьшение» или «сокращение», как правило, в статистически значимых или физиологических значимых количествах, по сравнению с контролем.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «совпадение» указывает на взаимосвязь между двумя или более последовательностями полипептидов или белков, определяемую путем сравнения последовательностей. В современной терминологии соответствующей области техники термин «совпадение» также обозначает степень родственности между последовательностями полипептидов или белков, определяемую путем сопоставления между аминокислотными цепочками таких последовательностей. «Совпадение» можно легко вычислить с использованием известных биоинформационных способов. «Процент совпадения» двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностей определяют путем сравнения последовательностей с использованием компьютерной программы GAP (часть GCG Wisconsin Package, версия 10.3) с использованием параметров по умолчанию.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «биологически активный фрагмент» обозначает фрагмент аминокислотной последовательности полипептида, входящего в объем настоящего изобретения, при этом указанный фрагмент также обладает эффективностью полипептида, раскрываемого в настоящем изобретении.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «вариант» обозначает аминокислотную последовательность, которая относится к дикому типу, или которая была изменена путем замены, инсерции, кроссовера, делеции и/или другой генетической операции. Для целей раскрытия настоящего изобретения вариант не ограничивается конкретным способом, с использованием которого он получен. В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность, являющаяся вариантом, может иметь повышенную, пониженную или по существу сходную активность или свойства, по сравнению с исходной родительской последовательностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид может содержать по меньшей мере один аминокислотный остаток, который мутировал по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или несколько аминокислотных остатков полипептида могут быть сохранены константными, инвариантными или не замещенными, по сравнению с исходным родительским полипептидом, в вариантах полипептидов, обуславливая множественность. В некоторых вариантах осуществления изобретения, исходный родительский полипептид используют в качестве основы для создания вариантов с повышенной устойчивостью или другими улучшенными свойствами. Варианты также могут отличаться, по меньшей мере, по одной из следующих характеристик: вторичная структура, четвертичная структура и степень укладки.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, каждый из терминов «пептид», «полипептид» и «белок» обозначает молекулу, состоящую из двух или более аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидными связями. Эти термины охватывают, например, нативные и искусственные белки, фрагменты белков и полипептидные аналоги (такие как варианты и слитые белки) последовательности белка, а также белки, претерпевшие посттрансляционные или иные модификации, как ковалентные, так и нековалентные. Пептид, полипептид или белок может быть мономерным или полимерным.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «фрагмент полипептида» обозначает полипептид, имеющий аминотерминальную и/или карбокситерминальную делецию, по сравнению с соответствующим белком полной длины. Фрагменты также могут быть получены в результате протеолитической (или иной) обработки, которая, например, приводит к изменениям одной-пяти аминокислот на амино-или карбоксильном конце относительно прогнозируемой последовательности. Также, фрагмент может содержать на одном или на обоих концах по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, например, последовательность аминокислот из различных естественных белков или искусственную аминокислотную последовательность (например, искусственно созданную линкерную последовательность или белковую метку).

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает ингредиент в составе фармацевтической композиции, отличный от активного ингредиента, который является нетоксичным для пациента. К фармацевтически приемлемым носителям относятся (не ограничиваясь приведенным списком) буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «пациент» обозначает организм, относящийся к позвоночным животным, предпочтительно к млекопитающим, и наиболее предпочтительно - являющийся человеком. К млекопитающим относятся (не ограничиваясь приведенным списком) человек, сельскохозяйственные животные, спортивные животные и домашние питомцы.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термин «эффективное количество» обозначает количество, достаточное для достижения положительного эффекта или требуемых клинических результатов. Эффективное количество может быть введено за один или несколько приемов. Применительно к настоящему изобретению, эффективное количество представляет собой количество, достаточное, для диагностики, облегчения состояния, достижения улучшения, стабилизации, обращения вспять, замедления или задержки прогресса заболевания.

В контексте употребления в материалах настоящей заявки, термины «терапия», «лечение», «лечить» и т.п., как правило, обозначают достижение требуемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим, то есть может заключаться в полном или частичном предотвращении возникновения заболевания или его симптома, и/или может быть терапевтическим, то есть может заключаться в частичной или полной стабилизации или излечении заболевания и/или нежелательного эффекта, связанного с заболеванием. «Терапия», В контексте употребления в материалах настоящей заявки,, охватывает любую терапию заболевания у млекопитающих, в частности, у человека, и включает: (а) предотвращение возникновения заболевания или его симптомов у пациента, который может быть предрасположен к возникновению этого заболевания или симптома, однако ему еще не был поставлен соответствующий диагноз; (b) ингибирование симптома, т.е., прерывание его развития; или (с) снятие симптома заболевания, т.е., обеспечение регрессии заболевания или симптома.

Термин «предотвращение» В контексте употребления в материалах настоящей заявки, обозначает предупреждающую или профилактическую меру, которая не дает заболеванию или состоянию возникнуть у пациента. Предотвращение также может включать уменьшение вероятности возникновения заболевания или состояния у пациента и препятствование или приостановку наступления указанного заболевания или состояния.

В тех случаях, когда указан диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение, до десятой части нижней границы диапазона, если контекст четко не диктует иное, находящееся между верхней и нижней границей указанного диапазона, и любое другое указанное или промежуточное значение, находящееся в указанном диапазоне, входит в объем настоящего изобретения. Верхние и нижние границы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, и также входят в объем настоящего изобретения, с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает одну или обе границы, диапазоны, исключающие одну или обе указанные включенные границы, также входят в объем настоящего изобретения.

Модуляция иммунного ответа

Было обнаружено, что прямое связывание TLT-1 с иммунными клетками запускает проявление клетками иммуносупрессивных фенотипов за счет понижающей регуляции экспрессии HLA-DR и повышающей регуляции экспрессии PD-L1.

В соответствии с одним из объектов настоящего изобретения предлагается способ модулирования иммунного ответа, содержащий связывание полипептида, TREM-подобного транскрипта 1 (TLT-1), с иммунной клеткой, в котором связывание полипептида TLT-1 с иммунной клеткой подавляет иммунный ответ. В одном из вариантов осуществления изобретения, полипептиды TLT-1 представляют собой полипептиды, описанные ниже в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления изобретения, предлагается способ лечения и/или предотвращения заболеваний, связанных с иммунной гиперреактивностью, содержащий введение пациенту эффективного количества полипептида TLT-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, к заболеваниям относятся (не ограничиваясь приведенным списком) аутоиммунные заболевания, реакции гиперчувствительности, отторжение трансплантатов и возникновение реакций «трансплантат против хозяина».

При связывании полипептида TLT-1 с моноцитами может быть запущена индукция экспрессии PD-L1 и редукция экспрессии HLA-DR, что может обеспечить лечение заболеваний, связанных с иммунной гиперреактивностью. Любой полипептид TLT-1, способный к связыванию с иммунными клетками, может обеспечить достижения указанной выше модуляции экспрессии PD-L1 и HLA-DR, включая полипептид TLT-1 полной длины и фрагменты указанного полипептида.

Полипептиды TLT-1

Было обнаружено, что последовательность внеклеточного домена TLT-1 отвечает за связывание с иммунными клетками; предпочтительно, последовательность, содержащая по меньшей мере 30 аминокислот (TLT-1 34-63), последовательность, содержащая по меньшей мере 49 аминокислот (TLT-1 15-63) или последовательность, содержащая по меньшей мере, 147 аминокислот (TLT-1 16-162). При связывании полипептида TLT-1 с иммунными клетками может быть запущена индукция экспрессии PD-L1 и редукция экспрессии HLA-DR, это указывает на то, что индукция экспрессии PD-L1 и редукция экспрессии HLA-DR под действием TLT-1 или полипептидов TLT-1, таким образом, может быть полезной для лечения заболеваний, связанных с иммунной гиперреактивностью, таких как аутоиммунные заболевания, реакции гиперчувствительности, отторжение трансплантатов и возникновение реакций «трансплантат против хозяина».

В соответствии с другим объектом настоящего изобретения, предлагается полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере 5 аминокислот последовательности с идентификационным номером 1, или, по меньшей мере, приблизительно на 80% совпадающую с аминокислотной последовательностью с идентификационным номером 1, или биологически активный фрагмент или вариант указанного полипептида.

(идентификационный номер последовательности: 1)

В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность полипептида, по меньшей мере, на 80%, т.е., по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или, по меньшей мере, на 100% совпадает с аминокислотной последовательностью, описанной под идентификационным номером последовательности 1.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, полипептид содержит аминокислотную последовательность, включающую 5 аминокислот последовательности с идентификационным номером 2, или по меньшей мере приблизительно на 80% совпадающую с аминокислотной последовательностью, описанной под идентификационным номером 2, или биологически активный фрагмент или вариант указанного полипептида.

GQGIVGSLPEVLQAPVGSSILVQCHYRLQDVKAQKVWCRFLPEGCQPLV (идентификационный номер последовательности: 2)

В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность полипептида, по меньшей мере, на 80%, т.е., по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или, по меньшей мере, на 100% совпадает с аминокислотной последовательностью, описанной под идентификационным номером последовательности 2.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, полипептид содержит аминокислотную последовательность, включающую 5 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 3, или, по меньшей мере, приблизительно на 70% совпадающую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, или биологически активный фрагмент или вариант указанного полипептида.

QGIVGSLPEVLQAPVGSSILVQCHYRLQDVKAQKVWCRFLPEGCQPLVSSAVDPvRAPAG PvRTFLTDLGGGLLQVEMVTLQEEDAGEYGCMVDGARGPQILHRVSLNILPPEEEEETHK IGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIP (SEQ ID NO: 3)

В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность полипептида, по меньшей мере, на 70%, т.е., по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или, по меньшей мере, на 100% совпадает с аминокислотной последовательностью, описанной под идентификационным номером последовательности 3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, предлагается полипептид, содержащий одну или несколько инсерций, замен и/или делеций в любой из аминокислотных последовательностей TLT-1, описанных в настоящем документе. Предпочтительно, аминокислотная последовательность TLT-1 представляет собой последовательность, описанную под идентификационным номером 1, 2 или 3.

Полипептиды могут быть получены с использованием рекомбинантных способов и химического синтеза. Помимо этого, могут быть использованы функционально эквивалентные полипептиды, при этом эквивалентный полипептид может содержать делеции, добавления или замены аминокислотных остатков, которые представляют собой «молчащее изменение» и дают дифференциально экспрессируемый функционально эквивалентный продукт гена. Замены аминокислот могут быть сделаны на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы аминокислотных остатков. Термин «функционально эквивалентный», В контексте употребления в материалах настоящей заявки,, обозначает белок, способный к проявлению по существу совпадающей активности in vivo.

Полипептиды могут быть получены с использованием технологии рекомбинантной ДНК или синтетической технологии, с использованием методик, известных специалистам в соответствующей области. Для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующие последовательности и соответствующие сигналы контроля транскрипции/трансляции, могут быть использованы способы, известные специалистам в соответствующей области. Такие способы включают, например, методики с использованием рекомбинантной ДНК in vitro, синтетические методики и рекомбинацию/генетическую рекомбинацию in vivo. В качестве альтернативы, может быть проведен химический синтез РНК, способной кодировать требуемые полипептиды.

Как правило, кодирующая последовательность находится под контролем промотера, обладающего в необходимой клетке-хозяине функциональностью, обеспечивающей получение относительно больших количеств продукта гена. Известно широкое разнообразие промотеров, которые могут быть использованы в векторах экспрессии, раскрываемых в настоящем изобретении, в зависимости от конкретных целей применения. Как правило, промотер выбирают в зависимости от клетки, в которой указанный промотер должен проявлять активность. Также при необходимости могут быть включены другие последовательности контроля экспрессии, такие как сайты связывания с рибосомой, сайты терминации транскрипции и т.п.Конструкты, содержащие одну или несколько указанных контрольных последовательностей, называют «экспрессионными кассетами». Экспрессия может быть проведена в прокариотических и эукариотических клетках с использованием промотеров и других регулирующих агентов, соответствующих конкретной клетке-хозяину. Примерами клетки-хозяина являются (не ограничиваясь приведенным списком), Е. coli, другие бактериальные хозяева, дрожжевые грибы и различные эукариотические клетки, такие как линии клеток COS, СНО и HeLa и линии клеток миеломы.

После экспрессирования рекомбинантные пептиды могут быть очищены в соответствии со стандартными методиками, известными специалистам в соответствующей области, включая осаждение сульфатом аммония, очистку на аффинных колонках, ионообменную и/или эксклюзионную хроматографию, гель-электрофорез и т.п. (см., например, R. Scopes, ProteinPurification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)).

В качестве альтернативы рекомбинантным способам, полипептиды могут быть получены путем химического синтеза. Указанные способы, как правило, включают подходы на основе использования веществ в твердом состоянии, однако также могут быть использованы химические вещества или комбинации в виде растворов или сочетание подходов на основе использования веществ в твердом состоянии и растворов. Примеры методологий синтеза белков на основе использования веществ в твердом состоянии описаны в работе Merrifield (1964) J. Am. Chem. Soc. 85:2149; and Houghton (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., 82:5132. Могут быть синтезированы фрагменты полипептидов белка согласно настоящему изобретению, с их последующим объединением. Способы проведения таких реакций описаны в работе Grant (1992) Synthetic Peptides: AUserGuide, W.H. Freemanand Co., N.Y.; и в работе «Principles of Peptide Synthesis» (Bodansky and Trost, ed.), Springer-Verlag, Inc. N.Y., (1993).

В соответствии с другим объектом настоящего изобретения предлагается слитый белок TLT-1, содержащий полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению, слитый с одним или несколькими гетерогенными полипептидами или с другим полипептидом TLT-1 согласно настоящему изобретению. Полипептид TLT-1 может быть ковалентно связан с одним или несколькими гетерогенными полипептидами или другим полипептидом TLT-1 согласно настоящему изобретению, как напрямую, так и через аминокислотный линкер. Полипептиды, образующие слитый белок, как правило, связаны в порядке «С-конец к N-концу», хотя они также могут быть связаны в порядке «С-конец к С-концу», «N-конец к N-концу» или «N-конец к С-концу». Полипептиды слитого белка могут быть расположены в любом порядке и могут включать более одной копии одного или обоих входящих в состав слитого белка полипептидов. Примерами гетерогенных полипептидов являются (не ограничиваясь приведенным списком) альбумин, пептиды, связывающиеся с сывороточным альбумином, проникающие пептиды (cell penetrating peptide, СРР), соединения, обладающие направленным воздействием на ткани, и иммуносупрессивные пептиды. Предпочтительно, гетерогенный полипептид представляет собой альбумин или пептид, связывающийся с сывороточным альбумином.

В соответствии с настоящим изобретением, также предлагается пегилированный полипептид TLT-1, содержащий по меньшей мере одну молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ), функционально связанную по меньшей мере с одним аминокислотным остатком на N-конце полипептида TLT-1 согласно настоящему изобретению. Пегилирование молекул может быть проведено, например, в соответствии с способами, описанными в работе Youngster et al., Curr Pharm Des (2002), 8:2139. Для целей настоящего изобретения подходит любой вид полиэтиленгликоля, при условии, что ПЭГ-полипептид остается функционально активным, что может быть оценено в соответствии с способами, известными специалистам в соответствующей области. Предпочтительно, что полиэтиленгликоль, указанный в настоящем изобретении, представляет собой ПЭГ 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 15000, 20000, 30000, 40000 или 50000. В одном из примеров осуществления настоящего изобретения пегилированный полипептид TLT-1 включает мономерный полипептид TLT-1. В другом примере осуществления настоящего изобретения пегилированное соединение включает олигомерный полипептид TLT-1. Еще в одном примере осуществления настоящего изобретения пегилированный полипептид TLT-1 включает разветвленный ПЭГ, при этом один или несколько мономерных полипептидов TLT-1 функционально связаны с разветвленным ПЭГ.

Настоящее изобретение также раскрывает конъюгат полипептида TLT-1, содержащий полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению, конъюгированный с иммуносупрессивным агентом, соединением, обладающим направленным воздействием на ткани, альбумином или пептидом, связывающимся с сывороточным альбумином. Композиции на основе полипептида согласно настоящему изобретению

В соответствии с другим объектом настоящего изобретения, предлагаются композиции, включающие полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такие композиции могут вводиться в организм пациентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению, может быть включен в состав композиции, в которую входит один или более компонентов, включая (но не ограничиваясь приведенным списком) фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферные агенты для поддержания рН, консерванты и/или любые другие компоненты, пригодные для применения в соответствии с назначением композиции. Такие композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий и т.п. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает различные разбавители, вспомогательные вещества и/или носители, в которых, или с которыми, могут быть представлены полипептиды TLT-1, белки и/или белковые комплексы, раскрываемые в настоящем изобретении. К фармацевтически приемлемым носителям относятся (не ограничиваясь приведенным списком) носители, признанные безопасными при использовании для доставки в организм человека и/или других животных, и/или одобренные регуляторным агентством федерального или регионального правительства, и/или указанные в Фармакопее США, и/или в другой общепризнанной фармакопее, и/или получившие специальное или индивидуальное разрешение на использование у человека и/или других животных в одном или более общепризнанных регуляторных агентств. К таким фармацевтически приемлемым носителям относятся (не ограничиваясь приведенным списком) вода, водные растворы (такие как солевые растворы, буферы и т.п.), органические растворители (такие как определенные спирты и масла, включая масла минерального, животного, растительного и синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло) и т.п.

В одном из вариантов осуществления изобретения, полипептид TLT-1 согласно настоящему изобретению может быть представлен в виде компонента композиции, содержащего один или несколько дополнительных активных компонентов, таких как один или несколько дополнительных иммуносупрессоров. Указанным иммуносупрессором может быть (не ограничиваясь приведенным списком) глюкокортикоид, цитостатический агент, алкилирующий агент, антиметаболит, метотрексат, азатиоприн, мерпактопурин, дактиномицин, антрациклины, митомицин С, блеомицин, митрамицин, антитела к CD20, муромонаб-СВЗ, базиликсимаб, даклизумаб, циклоспорин, такролимус, сиролимус, интерферон, опиоид, ФНО-связывающий белок, микофенолят, финголимод и мириоцин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиции, являющиеся объектом настоящего изобретения, содержат «эффективное количество» полипептида TLT-1 согласно настоящему изобретению. «Эффективное количество» представляет собой количество, необходимое для достижения требуемого конечного результата. Количество полипептида TLT-1 согласно настоящему изобретению, которое является эффективным для достижения требуемого конечного результата, будет зависеть от различных факторов, включая (но не ограничиваясь приведенным списком), вид, к которому относится организм (человек или некоторые другие виды животных), возраст и/или пол пациента, планируемый путь введения, планированный режим дозирования, серьезность любых имеющихся заболеваний или состояний и.т.п. Эффективное количество - которое может быть представлено в виде диапазона значений эффективного количества - может быть определено с использованием стандартных методик без каких-либо избыточных экспериментов, например, с использованием анализов in vitro и/или анализов in vivo на соответствующих видах организмов, или на любой подходящей модели на животных. Подходящие анализы включают (не ограничиваясь приведенным списком) анализы, предусматривающие экстраполяцию на основе кривых зависимости доза-ответ и/или на основе других данных, полученных на модельных системах in vitro и/или in vivo. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эффективное количество может быть определено по усмотрению врача или ветеринара, с учетом конкретных условий.

В одном из вариантов осуществления изобретения, эффективное количество полипептида TLT-1 находится в диапазоне от приблизительно 0,0002 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг массы тела на одно введение. Способы введения

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в соответствии с настоящим изобретением, предлагаются способы, содержащие введение пациенту полипептида TLT-1. Указанные способы могут представлять собой способы лечения пациентов, страдающих заболеванием, связанных с иммунной гиперреактивностью, таким аутоиммунные заболевания, реакции гиперчувствительности, отторжение трансплантатов и возникновение реакций «трансплантат против хозяина».

Пациентами, которым могут быть введены (например, в ходе реализации способа терапии) полипептиды TLT-1, раскрываемые в настоящем изобретении, или композиции, содержащие указанные полипептиды TLT-1, могут являться любые виды животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения, пациенты являются представителями видов млекопитающих. К пациентам, являющимся представителями видов млекопитающих, относятся (не ограничиваясь приведенным списком) человек, другие приматы помимо человека, грызуны, кролики и хорьки.

Специалистам в соответствующей области известны различные системы доставки, для введения пациентам композиций, раскрываемых в настоящем изобретении, может быть использована любая подходящая система доставки. Указанные системы доставки включают (не ограничиваясь приведенным списком) системы интрадермальной, внутримышечной, интраперитонеальной, внутривенной, подкожной, интраназальной, эпидуральной и пероральной доставки. Композиции, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть введены любым подходящим путем, например, путем инфузии или болюсного введения, путем абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистая оболочка полости рта, прямой кишки и кишечника и т.д.), и могут быть введены совместно с другими биологически активными агентами. Применение может быть системным или местным.

В некоторых таких вариантах осуществления изобретения предпочтительно однократное введение. Однако, в других вариантах осуществления изобретения с целью достижения требуемого эффекта могут быть введения дополнительные дозы, таким же или другим путем. В некоторых вариантах осуществления изобретения, схема применения может содержать однократное введение. В других вариантах осуществления изобретения схема применения может содержать многократное введение.

Примеры

Материалы и способы, использованные в указанных далее примерах, описаны ниже. Выделение человеческих клеток и культивирование клеток Концентраты лейкоцитов, взятых у здоровых добровольцев, были получены из Тайваньского фонда службы крови (Taiwan Blood Service Foundation) (г. Тайбэй, Тайвань). Было получено информированное согласие на участие в исследовании в письменной форме, которое было одобрено Экспертным советом организации Мемориальной больницы МакКэй. Человеческие моноциты были выделены как описано выше. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были выделены с использованием центрифугирования в градиенте состава Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Затем моноциты были подвергнуты очистке путем проведения отбора CD 14 с применением микросфер CD 14 MACS (Miltenyi Biotec). Чистота моноцитов, подтвержденная с использованием анализа способом проточной цитометрии, составляла приблизительно 90%.

Получение рекомбинантного растворимого TLT-1 и полипептидов TLT-1 Для получения рекомбинантного растворимого TLT-1 (rsTLT-1) проводили экспрессию pET28a(+)-rsTLT-l, кодирующего внеклеточный домен человеческого TLT-1 (Glul6-Pro162) с полигистидиновой меткой на N-конце с использованием клеток Е. coli, с последующей очисткой с использованием колонок Ni-NTA (Novagen). Чистота рекомбинантного белка, которую определяли с использованием электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) и визуализировали с использованием красителя кумасси синего. Загрязнение очищенных белков эндотоксинами оценивали с использованием LAL-теста (QCL-1000). Все белки были стерильными, концентрация эндотоксинов была ниже предела обнаружения (<0,1 ЕЭ/мкг белка). Полипептиды TLT-1 были синтезированы химическим путем в компании Kelowna International Scientific Inc. (г. Тайбэй, Тайвань). Анализ методом проточной цитометрии

Для экспериментов по исследованию связывания TLT-1 мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) инкубировали в течение ночи в среде AIM-V (Life Technologies) при температуре 37°С в увлажненной атмосфере с содержанием 5% СО₂ для отделения тромбоцитов от поверхности клеток. Для оценки наличия специфичного связывания лейкоцитов с TLT-1 выделенные мононуклеарные клетки периферической крови инкубировали с TLT-1 в различных концентрациях и с конкурирующим пептидом в течение 1 часа при температуре 37°С. После этого клетки промывали и окрашивали козьими антителами к TLT-1, конъюгированными с биотином (R&D Systems). Моноциты, полиморфоядерные лейкоциты (PMN) и лимфоциты отбирали на основе их характеристик FSC/SSC. Для анализа поверхностного фенотипа моноцитов, примированных TLT-1 или полипептидами TLT-1, клетки инкубировали в течение 30 минут на льду в темноте со следующими моноклональными антителами, разведенными в фосфатном буферном растворе (ФБР), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА): HLA-DR-PE, PD-L1-FITC, CD14-Per GP (BD Biosciences). Детекцию флуоресценции осуществляли с использованием FACS Calibur, анализ данных проводили с использованием программного обеспечения FCS Express, версия 3 (De Novo Software).

Статистический анализ

Анализ данных был проведен с использованием программного обеспечения Prism 6.0 (Graph Pad), результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравнение между группами проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляции определяли с использование коэффициента корреляции Пирсона. Был принят уровень значимости при значении Р<0,05. Пример 1. Взаимодействие между TLT-1 и лейкоцитами

Для определения того, связывается ли TLT-1 с лейкоцитами, лейкоциты инкубировали с 10 мкг/мл rsTLT-1 в течение 1 часа и выявляли связывание TLT-1 на поверхности клетки с использованием проточной цитометрии. Как показано на Фиг. 1А, было выявлено связывание rsTLT-1 с полиморфоядерными клетками и моноцитами, но не с лимфоцитами. Помимо этого, было обнаружено, что связывание rsTLT-1 с полиморфоядерными клетками и моноцитами было дозозависимым (Фиг. 1В).

Полученные результаты указывают на то, что на поверхности полиморфоядерных клеток и моноцитов человека имеется рецептор TLT-1.

Пример 2. TLT-1 изменяет поверхностную экспрессию молекул HLA-DR и PD-L1 в моноцитах

Для исследования того, может ли присутствие sTLT-1 модулировать экспрессию HLA-DR и PD-L1 на моноцитах, вначале моноциты человека инкубировали с rsTLT-1 (10 мкг/мл) и затем оценивали экспрессию HLA-DR и PD-L1 в течение 3 последовательных дней. Как показано на Фиг. 3А (слева), наблюдалась значимая повышающая регуляция HLA-DR под действием rsTLT-1 в течение первых 24 часов, с последующей быстрой понижающей регуляцией экспрессии HLA-DR в дальнейшие моменты времени. Также наблюдалась повышение экспрессии PD-L1 в течение 24 часов, однако экспрессия PD-L1 сохранялась на протяжении всего 3-дневного эксперимента (Фиг. 2А, справа). Во-вторых, было проведено исследование зависимости доза-эффект для влияния sTLT-1 на экспрессию HLA-DR и PD-L1. Фиг. 2В (слева) показывает, что экспрессия HLA-DR на поверхности моноцитов уменьшилась через 48 часов инкубирования с rsTLT-1, и что наблюдаемая понижающая регуляция значимо коррелировала с повышением концентрации rsTLT-1. В отношении экспрессии PD-L1, напротив, наблюдалась значимая повышающая регуляция при увеличении концентрации rsTLT-1 (Фиг. 2В, справа). В совокупности, полученные данные указывают на то, что моноциты, стимулированные rsTLT-1, имеют иммуносупрессивные фенотипы.

Пример 3. Полипептиды TLT-1 15-63 изменяют поверхностную экспрессию молекул PD-L1 и HLA-DR в моноцитах TLT-1 имеет один внеклеточный вариабельный домен Ige (IgV), который содержит 9 бета-тяжей, формирующих 2 антипараллельных бета-листа, соединяемых консервативной дисульфидной связью между тяжами В и тяжами F. Помимо этого, в структуре TLT-1 имеется еще одна дисульфидная связь, стабилизирующая бета-шпильку С-С.Для выявления функционального домена sTLT-1 были синтезированы полипептиды различной длины, в соответствии с Ig-структурой полипептида V-типа (Фиг. ЗА). Полипептидные последовательности показаны в Таблице I. Было проведено инкубирование моноцитов человека с различными полипептидами (10 мкг/мл) и оценка экспрессии PD-L1 в течение 24 часов. Как показано на Фиг. ЗВ, экспрессия PD-L1 была значимо увеличена в течение 24 часов в моноцитах, обработанных TLT-1 15-63. Помимо этого, обработка пептидом TLT-1 34-63 также приводила к индукции экспрессии PD-L1. Экспрессия HLA-DR на моноцитах также была уменьшена через 48 часов инкубирования с пептидом TLT-1 15-63 (Фиг. 4). Таким образом, TLT-1 15-63 может служить в качестве терапевтического агента для лечения заболеваний, связанных с повышенным иммунитетом, за счет повышающей регуляции экспрессии PD-L1 и понижающей регуляции экспрессии HLA-DR.

Таблица I: Была разработаны полипептиды TLT-1, раскрываемые в настоящем изобретении, имитирующие различные части внеклеточного домена указанного полипептида.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>МакКэйМемориэлХоспитэлофТайвэнПрисбитериэнЧёчи

МакКэйМемориэлСошлУоркФаундейшн

<120>СПОСОБЫ И ПОЛИПЕПТИДЫ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИИ ММУННОГО ОТВЕТА

<130>L88340/CN24524

<160> 26

<170>Патент в версии 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>рекомбинантный полипептид

<400> 1

Ile Leu Val GlnCys His Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys Ala Gln Lys

1 5 10 15

Val TrpCysArgPheLeu Pro GluGlyCysGln Pro Leu Val

20 25 30

<210> 2

<211> 49

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>рекомбинантный полипептид

<400> 2

GlyGlnGly Ile Val GlySerLeu Pro Glu Val LeuGln Ala Pro Val

1 5 10 15

GlySerSer Ile Leu Val GlnCys His Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys

20 25 30

Ala Gln Lys Val TrpCysArgPheLeu Pro GluGlyCysGln Pro Leu

35 40 45

Val

<210> 3

<211> 147

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>рекомбинантный полипептид

<400> 3

GlnGly Ile Val GlySerLeu Pro Glu Val LeuGln Ala Pro Val Gly

1 5 10 15

SerSer Ile Leu Val GlnCys His Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys Ala

20 25 30

Gln Lys Val TrpCysArgPheLeu Pro GluGlyCysGln Pro Leu Val

35 40 45

SerSer Ala Val Asp ArgArg Ala Pro Ala GlyArgArgThrPheLeu

50 55 60

Thr Asp LeuGlyGlyGlyLeuLeuGln Val Glu Met Val ThrLeuGln

65 70 75 80

GluGlu Asp Ala GlyGlu Tyr GlyCys Met Val Asp Gly Ala ArgGly

85 90 95

Pro Gln Ile Leu His Arg Val SerLeuAsn Ile Leu Pro ProGluGlu

100 105 110

GluGluGluThr His Lys Ile GlySerLeu Ala GluAsn Ala Phe Ser

115 120 125

Asp Pro Ala GlySer Ala Asn Pro LeuGlu Pro SerGln Asp Glu Lys

130 135 140

Ser Ile Pro

145

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Наименование полипептида: TLT-1 20-39

<400> 4

GlySerLeu Pro Glu Val LeuGln Ala Pro Val GlySerSer Ile Leu

1 5 10 15

Val GlnCys His

20

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Наименование полипептида: TLT-1 15-46

<400> 5

GlyGlnGly Ile Val GlySerLeu Pro Glu Val LeuGln Ala Pro Val

1 5 10 15

GlySerSer Ile Leu Val GlnCys His Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys

20 25 30

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Наименование полипептида: TLT-1 15-53

<400> 6

GlyGlnGly Ile Val GlySerLeu Pro Glu Val LeuGln Ala Pro Val

1 5 10 15

GlySerSer Ile Leu Val GlnCys His Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys

20 25 30

Ala Gln Lys Val TrpCysArg

35

<210> 7

<211> 49

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Наименование полипептида: TLT-1 15-63

<400> 7

GlyGlnGly Ile Val GlySerLeu Pro Glu Val LeuGln Ala Pro Val

1 5 10 15

GlySerSer Ile Leu Val GlnCys His Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys

20 25 30

Ala Gln Lys Val TrpCysArgPheLeu Pro GluGlyCysGln Pro Leu

35 40 45

Val

<210> 8

<211> 24

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Наименование полипептида: TLT-1 40-63

<400> 8

Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys Ala Gln Lys Val TrpCysArgPheLeu

1 5 10 15

Pro GluGlyCysGln Pro Leu Val

20

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Наименование полипептида: TLT-1 34-63

<400> 9

Ile Leu Val GlnCys His Tyr ArgLeuGln Asp Val Lys Ala Gln Lys

1 5 10 15

Val TrpCysArgPheLeu Pro GluGlyCysGln Pro Leu Val

20 25 30

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-Интегринвета2

(CD18)

<400> 10

Arg Tyr AsnGlyGln Val CysGlyGly Pro GlyArgGly

1 5 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин вета2

(CD18)

<400> 11

Lys Val Thr Tyr Asp SerPheCysSerAsnGly Val Thr His ArgAsn

1 5 10 15

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин вета2

(CD18)

<400> 12

Lys Leu Ala GluAsnAsn Ile Gln Pro Ile Phe Ala Val ThrSerArg

1 5 10 15

Met

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин вета2

(CD18)

<400> 13

ArgSerAsnGluPhe Asp Tyr Pro Ser Val GlyGlnLeu Ala His Lys

1 5 10 15

Leu

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин вета2

(CD18)

<400> 14

Lys Val Thr Ala ThrGluCys Ile GlnGluGlnSerPhe Val Ile Arg

1 5 10 15

Ala

<210> 15

<211> 19

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин вета2(CD18)

<400> 15

ArgGly Asp Cys Asp Gly Val Gln Ile Asn Val Pro Ile ThrPheGln

1 5 10 15

Val Lys Val

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин вета2

(CD18)

<400> 16

Lys Val Thr Tyr Asp SerPheCysSerAsnGly Val Thr His ArgAsn

1 5 10 15

Gln Pro ArgGly

20

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин-альфаM

(CD11b)

<400> 17

ArgSerGlnArgSerTrpArgLeu

1 5

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин-альфаM

(CD11b)

<400> 18

Arg Tyr Val Ile Gly Val Gly Asp Ala PheArgSer

1 5 10

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией- Интегрин-альфаM

(CD11b)

<400> 19

ArgSerLeu Pro Ile SerLeu Val PheLeu Val Pro Val ArgLeu

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-CD33

<400> 20

Lys Ile Leu Ile Pro GlyThrLeuGlu Pro Gly His Ser Lys Asn

1 5 10 15

<210> 21

<211> 14

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-CD33

<400> 21

Lys Leu Asp GlnGlu Val GlnGluGluThrGlnGlyArgPhe

1 5 10

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-CD33

<400> 22

Lys Ser Pro GlnLeuSer Val His Val Thr Asp LeuThr His Arg Pro

1 5 10 15

Lys Ile

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-HSP90

<400> 23

Lys Tyr Ile Asp GlnGluGluLeuAsn Lys Thr

1 5 10

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-HSP90

<400> 24

Lys GluGln Val Ala AsnSer Ala Phe Val GluArg Val

1 5 10

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-HSP90

<400> 25

ArgGly Val Val Asp SerGlu Asp Leu Pro LeuAsn Ile SerArgGlu

1 5 10 15

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213>искусственный

<220>

<223>Пептиды, идентифицированные тандемной масс-спектрометрией-HSP90

<400> 26

ArgAsn Pro Asp Asp Ile ThrGlnGluGlu Tyr GlyGluPhe Tyr Lys

1 5 10 15

Ser

<---

1. Способ получения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, содержащий введение пациенту растворимого полипептида TREM-подобного транскрипта 1 (TLT-1), состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или фрагмента полипептида TLT-1, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2.

2. Способ по п. 1, в котором указанный фрагмент полипептида TLT-1 обеспечивает связывание с иммунной клеткой.

3. Способ по п. 2, в котором указанная иммунная клетка представляет собой моноцит или нейтрофил.

4. Способ по любому из пп. 1, 2 или 3, в котором фрагмент полипептида TLT-1 является пегилированным или конъюгированным с соединением, обладающим направленным воздействием на ткани, альбумином или пептидом, связывающимся с сывороточным альбумином.

5. Способ по пп. 1, 2 или 3, в котором растворимый полипептид TLT-1 или фрагмент полипептида TLT-1 обеспечивает понижающую регуляцию экспрессии HLA-DR.

6. Полипептид для обеспечения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

7. Полипептид для обеспечения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

8. Полипептид для обеспечения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

9. Конъюгат для обеспечения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, содержащий полипептид по любому из пп. 6-8, являющийся пегилированным или конъюгированным с соединением, обладающим направленным воздействием на ткани, альбумином или пептидом, связывающимся с сывороточным альбумином.

10. Слитый полипептид для обеспечения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, содержащий полипептид по любому из пп. 6-8, являющийся слитым с соединением, обладающим направленным воздействием на ткани, альбумином или пептидом, связывающимся с сывороточным альбумином.

11. Композиция для обеспечения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, содержащая полипептид по любому из пп. 6-8, конъюгат по п. 9 или слитый полипептид по п. 10, и фармацевтически приемлемый носитель.

12. Комбинация для обеспечения повышающей регуляции экспрессии PD-L1, содержащая полипептид по любому из пп. 6-8, конъюгат по п. 9 или слитый полипептид по п. 10 и по меньшей мере один дополнительный иммуносупрессор.

13. Комбинация по п. 12, в которой иммуносупрессор выбирают из группы, содержащей глюкокортикоид, цитостатический агент, алкилирующий агент, антиметаболит, метотрексат, азатиоприн, мерпактопурин, дактиномицин, антрациклины, митомицин С, блеомицин, митрамицин, антитела к CD20, муромонаб-CD3, базиликсимаб, даклизумаб, циклоспорин, такролимус, сиролимус, интерферон, опиоид, ФНО-связывающий белок, микофенолят, финголимод или мириоцин.