Способы применения zscan4 для омоложения человеческих клеток

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломер, посредством увеличения уровня экспрессии Zscan4, и может быть использовано в медицине. Приведение клеток пациента в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей Zscan4, позволяет эффективно осуществлять терапию заболеваний, вызываемых укорочением теломеры, хромосомной или кариотипической аберрацией. 8 н. и 48 з.п. ф-лы, 19 ил., 1 табл., 19 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки на патент США No. 61/800668, поданной 15 марта 2013, которая во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Представление списка последовательностей в текстовом файле ASCII

Содержание текстового файла в формате ASCII во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки, а указанный список последовательностей был создан в электронной форме (CRF) (название файла: 699442000840SEQLIST.TXT, дата подачи: 11 марта 2014, размер: 104 KB).

Область, к которой относится изобретения

Настоящее изобретение относится к способам увеличения длины теломеры в одной или более человеческих клетках и/или повышения стабильности генома одной или более человеческих клеток, например, посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках. Настоящее изобретение также относится к способам лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры; к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с геномными и/или хромосомными аберрациями; к способу омоложения одной или более человеческих клеток; к способу омоложения тканей или органов и омоложения индивидуума, нуждающегося в этом, например, посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4, или путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, способствующего повышению уровня экспрессии Zscan4.

Предшествующий уровень техники

Теломеры представляют собой повторяющиеся последовательности ДНК, связанные с белками, которые «кэпируют» конец каждой хромосомы и защищают его от непрерывной деградации в каждом клеточном цикле, и, тем самым, сохраняют и обеспечивают целостность хромосомы. Укорочение теломеры может также приводить к развитию рака из-за внесения нестабильности в геном (Raynaud et al., Crit. Rev Oncol Hematol 66:99-117, 2008), и ассоциируется со старением организма и разрушением клеток (Yang, Cytogenet Genome Res 122:211-218, 2008). Хорошо известно, что теломеры постепенно укорачиваются в процессе естественного старения организма. Сообщалось, что в каждом раунде репликации ДНК теряется до 200 пар оснований ДНК теломеры. Так, например, у новорожденных, ДНК в лимфоцитах периферической крови имеет теломеру длиной приблизительно 10 т.п.н. по обоим концам каждой хромосомы, и эта ДНК постепенно укорачивается, а в возрасте 70 лет она достигает приблизительно 6 т.п.н. Также известно, что факторы окружающей среды и факторы качества жизни человека могут ускорять укорочение теломеры. Очевидно, что такое укорочение теломеры ассоциируется с возрастным старением клеток. Также очевидно, что укорочение теломеры ограничивает число деления клеток, что, в конечном счете, приводит к сокращению продолжительности жизни. Кроме того, известно, что люди рождаются с теломерами различной длины. Так, например, некоторые люди при рождении, имеют теломеру длиной приблизительно 9 т.п.н., а другие имеют теломеру длиной приблизительно 12 т.п.н. В соответствии с этим, люди с более короткими теломерами могут быть более восприимчивыми к развитию некоторых возрастных патологических состояний в более раннем возрасте, чем люди с более длинными теломерами. Такими патологическими состояниями являются, например, иммунодефицит, хронические язвы, атеросклероз, возрастная слепота, вызываемая прогрессирующим старением пигментированных эпителиальных клеток сетчатки, и рак.

Кроме того, существуют различные заболевания и расстройства, которые также ассоциируются с укорочением теломеры (Armanios and Blackburn, Nat. Rev. Genet. 2012 Oct;13(10):693-704). Примерами генетических заболеваний, которые могут вызывать укорочение теломеры, являются врожденный дискератоз, синдром Хейераала-Хрейдерсона, синдром Ревеша, синдром Коутса+. Кроме того, недавно было показано, что значительная составляющая идиопатического фиброза легких (ИФЛ) вызывается укорочением теломеры. Аналогичным образом, укорочение теломеры может вносить некоторый вклад в развитие цирроза печени и фиброза поджелудочной железы. Принимая во внимание распространенность таких патологических состояний, очевидно, что заболевания, вызываемые укорочением теломеры, встречаются чаще, чем это предполагалось ранее.

Другим примером заболевания, ассоциированного с укорочением теломеры, является анемия Фанкони. Анемия Фанкони представляет собой редкое аутосомно-рецессивное заболевание. Анемия Фанкони представляет собой врожденный синдром недостаточности костного мозга, характеризующийся прогрессирующей панцитопенией и восприимчивостью к развитию рака (Bogliolo et al., Mutagenesis, 2002 Nov; 17(6):529-38). Сообщалось, что у пациентов с анемией Фанкони наблюдается ускоренное укорочение теломеры (Leteurte et al., Br. J. Haematol., 1999; Ball et al., Blood, 1998; Hanson et al., Cytogenet. Cell Genet. 2001; и Callen, et al., Hum Mol Genet. 2002 Feb. 15;l l(4):439-44).

Одним из возможных методов лечения различных заболеваний и расстройств, ассоциированных с укорочением теломеры, является применение теломеразы для удлинения укороченных теломер. Теломеразу идентифицируют как основной фермент, который, как известно, участвует в удлинении теломеры. Теломераза является активной в эмбриональных стволовых клетках, но, она обычно не экспрессируется в неэмбриональных клетках (то есть в клетках взрослого человека), таких как соматические клетки. Таким образом, для увеличения длины теломеры может быть использована реактивация теломеразы или форсированная экспрессия теломеразы в клетках взрослого человека. Однако, одна из возможных проблем, связанных с использованием теломеразы, заключается в том, что непрерывная экспрессия теломеразы часто ассоциируется с онкогенезом и раковым перерождением клеток. В соответствии с этим, экспрессия теломеразы не является идеальным методом увеличения длины теломеры у пациентов, страдающих заболеваниями или состояниями, ассоциированным с укорочением теломеры.

Другим возможным методом удлинения теломер является использование недавно открытого компонента Китайской травы (TA-65), который может способствовать удлинению теломеры (Harley et al., Rejuvenation Research 14:45-56, 2011). Однако, тот факт, что такая трава может способствовать эффективному удлинению теломер, не был точно подтвержден. Кроме того, применение этой травы для лечения пациентов, нуждающихся в удлинении теломеры требует длительного непрерывного введения лекарственных средств.

Кроме того, недавно было показано, что Zscan4 (белок «цинковый палец» и белок 4, содержащий домен Scan) необходим для поддержания стабильности генома и сохранения нормального кариотипа в мышиных эмбриональных стволовых клетках, и что этот белок экспрессируется в мышиных эмбриональных клетках и в мышиных эмбриональных стволовых клетках (Falco et al., Dev Biol 307:539-550, 2007; Zalzman et al., Nature 464:858-863, 2010; публикации заявок PCT Nos. WO 2008/118957, WO 2011/02880, WO 2012/103235, WO 2012/129342, WO 2012/158561 и WO 2012158564; и публикации заявок на патент США Nos. 2010/0105043, 2012/0129161 и 2012/0156305). Было также показано, что экспрессия Zscan4 в мышиных эмбриональных стволовых клетках ассоциируется с удлинением теломеры (Zalzman et al., Nature 464:858-863, 2010; публикации заявок РСТ Nos. WO 2011/02880, WO 2012/129342 и WO 2012158564; и публикация заявки на патент США No. 2012/0156305). Хотя было показано, что человеческий геном также содержит ген ZSCAN4, однако, ни в одной из публикаций Falco et al., Dev Biol 307:539-550, 2007; Zalzman et al., Nature 464:858-863, 2010; публикаций заявок PCT N№ WO 2008/118957, WO 2011/02880, WO 2012/103235, WO 2012/129342, WO 2012/158561 и WO 2012158564; или публикаций заявок на патент США N№ 2010/0105043, 2012/0129161 и 2012/0156305 не приводится какого-либо экспериментального подтверждения того факта, что экспрессия Zscan4 дает такие же эффекты в человеческих клетках, как и в мышиных эмбриональных клетках. В частности, пока неясно, обладает ли человеческий ZSCAN4 такой же функцией, как и мышиный Zscan4, поскольку мышиный геном содержит шесть генов Zscan4 и три псевдогена Zscan4, тогда как человеческий геном содержит только один ген ZSCAN4 (публикация заявки РСТ No. WO 2008/118957). Кроме того, неизвестно, имеет ли экспрессия ZSCAN4 в человеческих клетках, таких как соматические клетки, участвующие в развитии заболеваний и состояний, ассоциированных с укорочением теломеры, такой же эффект, как и в мышиных эмбриональных стволовых клетках.

Описание сущности изобретения

В соответствии с этим, необходимо разработать усовершенствованные способы увеличения длины теломеры и способы коррекции геномных и/или хромосомных аберраций в человеческих клетках для лечения заболеваний или состояний, ассоциированных с укорочением теломеры и геномными аберрациями.

Для решения вышеуказанных проблем, авторами настоящего изобретения были разработаны новые способы увеличения длины теломеры, повышения стабильности хромосомы и/или генома в человеческих клетках, коррекции хромосомных аберраций и/или кариотипических аберраций (например, трисомии по хромосоме 21) в человеческих клетках и/или омоложения человеческих клеток посредством приведения человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 (белка «цинковый палец» и белка 4, содержащего домен Scan) в клетках. Используемый здесь термин «Zscan4» означает полипептиды и полинуклеотиды Zscan4, такие как гены, кодирующие полипептиды Zscan4 животных любых видов, включая мышей и человека. Используемый здесь термин «ZSCAN4» означает, в частности, человеческие полипептиды и полинуклеотиды Zscan4, такие как гены, кодирующие полипептиды Zscan4.

Настоящее изобретение также относится к новым способам лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной, хромосомной и/или кариотипической аберрацией; повышения стабильности генома; и коррекции кариотипических аберраций в человеческих ооцитах, в человеческих оплодотворенных ооцитах и в человеческих предварительно имплантированных эмбрионах; а также способы омоложения тканей или органов и/или омоложения индивидуума, нуждающемуся в этом, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческими клетками являются клетки взрослого человека (то есть неэмбриональные клетки).

Настоящее изобретение также основано, по меньшей мере частично, на неожиданном обнаружении того факта, что экспрессия Zscan4 в человеческих клетках, таких как фибробласты, способствует быстрому и резкому увеличению длины теломер в клетках уже через два дня. В частности, как описано ниже в примере 8, экспрессия Zscan4 в человеческих фибробластах приводит приблизительно к 40% увеличению длины теломеры через три дня. Кроме того, экспрессия Zscan4 в человеческих фибробластах, выделенных у пациента с анемией Фанкони, приводит приблизительно к 160% увеличению длины теломеры через три дня. Неожиданно было обнаружено, что экспрессия Zscan4 в популяциях фибробластов, выделенных у пациента с синдромом Дауна, также способствует резкому снижению процента клеток у группы пациентов с трисомией по хромосоме 21. В частности, как описано ниже в примере 15, экспрессия Zscan4 в популяциях фибробластов, выделенных у пациента с синдромом Дауна, обеспечивает коррекцию патологии, вызываемой трисомией по хромосоме 21, приблизительно в 55% клеток.

Описанные здесь результаты оказались особенно неожиданными, если принять во внимание тот факт, что еще нигде ранее не сообщалось о том, что экспрессия Zscan4 может приводить к увеличению длины теломеры в человеческих клетках. Результаты, описанные в настоящей заявке, также являются неожиданными. Хотя ранее было показано, что экспрессия Zscan4 способствует увеличению длины теломеры в мышиных эмбриональных стволовых (ЭC) клетках, однако, различия не только между человеческим ZSCAN4 и мышиным Zscan4, но также между биологическими функциями человеческих и мышиных клеток и между биологическими функциями ЭC-клеток и не-ЭC-клеток, таких как клетки взрослого человека, не дают основания ожидать, что экспрессия Zscan4 в человеческих клетках также будет способствовать увеличению длины теломеры. Этот фактор является особенно важным, если учесть, что, как было уже ранее продемонстрировано, элементы регуляции транскрипции, присутствующие в человеческих и мышиных геномах, сильно отличаются друг от друга. Особенно поразительно, то, что даже факторы транскрипции, ответственные за консервативные функции у человека и у мышей, обнаруживают значительную степень предпочтительности в отношении событий видоспецифического связывания (Odom et al., Nature Genetics 6:39, 2007).

Вспомогательные агенты, которые повышают уровень экспрессии Zscan4, такие как молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие Zscan4, могут быть преимущественно использованы для повышения шанса успешного оплодотворения in vitro (IVF) и успешного протекания беременности у женщин в позднем периоде детородного возраста посредством восстановления хромосом и/или коррекции геномных и/или хромосомных аберраций, таких как анеуплоидия, в ооцитах, в оплодотворенных ооцитах или в предварительно имплантированных эмбрионах. Кроме того, вспомогательные агенты, которые повышают уровень экспрессии Zscan4, такие как молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие Zscan4, могут быть использованы для лечения пациента, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с укорочением теломеры, таким как анемия Фанкони, посредством увеличения длины теломер в клетках пациента, страдающего таким заболеванием или состоянием. Кроме того, агенты, способствующие повышению уровня экспрессии Zscan4, такие как молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие Zscan4, могут быть также использованы для омоложения клеток, тканей или органов у индивидуума или индивидуума посредством увеличения длины теломер в клетках, тканях и органах индивидуума, старение которых вызывается укорочением теломер.

В соответствии с этим, в некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения длины теломеры в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, где указанный способ включает приведение одной или более человеческих клеток индивидуума в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4, в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4, в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках; и iii. введение индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках, и где указанное введение осуществляют для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где такое повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где такое повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в одной или более человеческих клетках, и где указанное введение осуществляют для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с хромосомной аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в одной или более человеческих клетках; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где такое повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в одной или более человеческих клетках, и где указанное введение осуществляют для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с кариотипической аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток индивидуума в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в одной или более человеческих клетках; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, кариотипическая аберрация выбрана из хромосомной нуллисомии, хромосомной моносомии, хромосомной трисомии, хромосомной тетрасомии и хромосомной пентасомии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, кариотипическая аберрация выбрана из трисомии по хромосоме 21, трисомии по хромосоме 16, трисомии по хромосоме 18, трисомии по хромосоме 13, моносомии по хромосоме X, анеуплоидии XXX, анеуплоидии XXY, анеуплоидии XYY и дупликации 1p36. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, заболевание или состояние, ассоциированное с кариотипической аберрацией, выбрано из синдрома dup(17)(p11.2p11.2), болезни Пелициуса-Мерцбахера, синдрома dup(22)(q11.2q11.2), синдрома кошачьих глаз, синдрома кошачьего крика, синдрома Вольфа-Хиршхорна, синдрома Вильямса-Бейрена, болезни Шарко-Мари-Туфа, наследственной невропатии с предрасположенностью к параличу от сдавливания нерва, синдрома Смита-Маджениса, нейрофиброматоза, синдрома Аладжилля, синдрома ущемления небно-сердечно-челюстного нерва, синдрома Ди Георга, заболевания, ассоциированного с дефицитом стероид-сульфатазы, синдрома Кальмана, микрофтальмии, ассоциированной с дефектами клеточной линии кожи, гипоплазии коры надпочечника, заболевания, ассоциированного с дефицитом глицерин-киназы, болезни Пелициуса-Мерцбахера, заболевания, ассоциированного с фактором дифференцировки клеток яичек на хромосоме Y, азооспермии (фактора a), азооспермии (фактора b), азооспермии (фактора c) и заболевания, ассоциированного с делецией 1p36. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является одно или более заболеваний или состояний, выбранных из заболеваний, вызываемых укорочением теломеры; синдромов недостаточности костного мозга; возрастных заболеваний или расстройств, ассоциированных с укорочением теломеры; и заболеваний или расстройств, ассоциированных с преждевременным старением. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является заболевание, ассоциированное с укорочением теломеры, и выбранное из врожденного дискератоза, синдрома Хейераала-Хрейдерсона (Hoyeraal-Hreidarsson), синдрома Ревеша (Revesz), синдрома Коутса⁺, идиопатического фиброза легких, цирроза печени, фиброза поджелудочной железы, болезни Альцгеймера и остеоартрита. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является синдром недостаточности костного мозга, выбранный из анемии Фанкони, амегакариоцитарной тромбоцитопении, апластической анемии, анемии Даймонда-Блэкфана, врожденного дискератоза, ночной пароксизмальной гемоглобинурии (НПГ), синдрома Пирсона, синдрома Швахмана-Даймонда, тромбоцитопении и миелодиспластического синдрома. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является возрастное заболевание или расстройство, ассоциированное с укорочением теломеры; заболевание или расстройство, ассоциированное с преждевременным старением; или оба эти заболевания, выбранные из синдрома Вернера, синдрома Блума, синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированного со старением, кокаинового синдрома, пигментной ксеродермии, атаксии-телангиэктазии, синдрома Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофии, синдрома Юберга-Марсиди и синдрома Дауна. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием являются одно или более заболеваний или состояний, выбранных из иммунодефицита, аутоиммунного заболевания, аутоиммунного расстройства, хронических язв, атеросклероза, рака, нервного расстройства, дегенеративного расстройства, нейродегенеративного расстройства, заболевания, ассоциированного с заживлением ран, регенерацией мышц и репарацией сердечной мышцы, заболевания, ассоциированного с замещением хрящевой ткани, артрита, остеоартрита, регенерации зубной ткани, слепоты, возрастной слепоты, вызываемой пролиферирующим разрушением пигментированных эпителиальных клеток сетчатки, глухоты, недостаточности костного мозга, заболевания, ассоциированного с трансплантацией костного мозга, диабета, мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшенна, генетического заболевания, генетической мутации и заболевания, ассоциированного с повреждением ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является рак, выбранный из рака сердца (например, ангиосаркомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, миксомы, рабдомиомы, фибромы, липомы и тератомы); рака легких (например, бронхогенной карциномы (плоскоклеточной карциномы, недифференцированной мелкоклеточной карциномы, недифференцированной крупноклеточной карциномы, аденокарциномы); альвеолярной (бронхолярной) карциномы, аденомы бронхов, саркомы, лимфомы, хондроматозной гамартомы, мезотелиомы); рака желудочно-кишечного тракта (например, рака пищевода (плоскоклеточной карциномы, аденокарциномы, лейомиосаркомы, лимфомы); рака желудка (карциномы, лимфомы, лейомиосаркомы)); рака поджелудочной железы (аденокарциномы протоков, инсулиномы, глюкагономы, гастриномы, карциноидных опухолей, апудомы); рака тонкого кишечника (аденокарциномы, лимфомы, карциноидных опухолей, саркомы Капоши, лейомиомы, гемангиомы, липомы, нейрофибромы, фибромы); рака толстого кишечника (аденокарциномы, аденомы канальцев, ворсинчатой аденомы, гамартомы, лейомиомы); рака мочеполовых путей (например, рака почек (аденокарциномы, опухоли Вильмса, нефробластомы, лимфомы, лейкоза); рака мочевого пузыря и уретры (плоскоклеточной карциномы, карциномы переходных клеток, аденокарциномы); рака предстательной железы (аденокарциномы, саркомы); рака яичек (семиномы, тератомы, эмбриональной карциномы, тератокарциномы, хориокарциномы, саркомы, карциномы интерстициальных клеток, фибромиы, фиброаденомы, аденоматоидных опухолей, липомы); рака печени (например, гепатомы (гепатоцеллюлярной карциномы), холангиокарциномы, гепатобластомы, ангиосаркомы, гепатоцеллюлярной аденомы, гемангиомы)); рака кости (например, остеогенной саркомы, (остеосаркомы), фибросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, злокачественной лимфомы (саркомы клеток ретикулума), множественной миеломы, злокачественной гигантоклеточной опухоли, хордомы, остеохондромы (остеоэкзостоза хряща), доброкачественной хондромы, хондробластомы, хондромиксофибромы, остеоидной остеомы и гигантоклеточных опухолей); рака нервной системы (например, рака черепа (остеомы, гемангиомы, гранулемы, ксантомы, деформирующего остеита); рака мозговой оболочки (менингиомы, менингиосаркомы, глиоматоза), рака головного мозга (астроцитомы, медуллобластомы, глиомы, эпиндимомы, герминомы, пинеаломы, мультиформной глиобластомы, олигодендроглиомы, шванномы, ретинобластомы, наследственных опухолей); рака спинного мозга (нейрофибромы, менингиомы, глиомы, саркомы)); рака женских половых органов (например, рака матки (карциномы эндометрия), рака шейки матки (карциномы шейки матки, предопухолевой дисплазии шейки матки); рака яичника (карциномы яичника, серозной цистаденокарциномы, цистаденокарциномы слизистой, эндометриоидных опухолей, опухоли Бреннера, светлоклеточной карциномы, неклассифицированной карциномы, гранулезных опухолей стромы яичника, клеточных опухолей Сертоли-Лейдига, дисгерминомы, злокачественной тератомы), рака вульвы (плоскоклеточной карциномы, интраэпителиальной карциномы, аденокарциномы, фибросаркомы, меланомы); рака влагалища (светлоклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, ботриоидной саркомы, эмбриональной рабдомиосаркомы, рака фаллопиевых труб (карциномы фаллопиевых труб); рака системы кровообращения (например, рака крови (миелоидного лейкоза (острого и хронического), острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, миелопролиферативных заболеваний, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома); болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы (злокачественной лимфомы)); рака кожи (например, злокачественной меланомы, базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, саркомы Капоши, хориоаденомы, диспластических новообразований, липомы, ангиомы, дерматофибромы, келоидных рубцов, псориаза) и рака коры надпочечника (например, нейробластомы). В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является аутоиммунное заболевание, выбранное из тиреоидита, болезни Гудпасчера, ревматоидного артрита, ювенильного олигоартрита, артрита, индуцированного коллагеном, артрита, индуцированного адъювантом, синдрома Сьегрена, рассеянного склероза, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, аутоиммунной атрофии желудка, вульгарной пузырчатки, псориаза, витилиго, диабета типа 1, диабета «тощих», тяжелой миастении, болезни Грейвса, тиреоидита Хашимото, склерозирующего холангита, склерозирующего сиаладенита, системной красной волчанки, аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, болезни Аддисона, системного склероза, полимиозита, дерматомиозита, аутоиммунной гемолитической анемии и пернициозной анемии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является нейродегенеративное заболевание, выбранное из адренолейкодистрофии (AЛД), алкоголизма, болезни Александера, болезни Альпера, болезни Альцгеймера, амиотрофического бокового склероза, болезни Луи Герига, атаксии-телангиэктазии, болезни Баттена, болезни Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена, бычьей спонгиформной энцефалопатии (БСЭ), болезни Канавана, церебрального паралича, кокаинового синдрома, кортикобазальной дегенерации, болезни Крейцфельда-Якоба, наследственной злокачественной бессоницы, дегенерации передней височной доли, болезни Гентингтона, ВИЧ-ассоциированной деменции, болезни Кеннеди, болезни Краббе, деменции телец Леви, нейроборрелиоза, болезни Мачадо-Йозефа, атаксии спинного мозга и мозжечка типа 3, атрофии многих органов, рассеянного склероза, нарколепсии, болезни Ньюмана-Пика, болезни Паркинсона, болезни Пелициуса-Мерцбахера, болезни Пика, первичного бокового склероза, заболеваний, вызываемых прионами, прогрессирующего надъядерного паралича, болезни Рефсума, болезни Сандхоффа, болезни Шильдера, подострой дегенерации спинного мозга, вызывающей пернициозную анемию, болезни Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена, болезни Баттена, атаксии спинного мозга и мозжечка, атрофии мышц спинного мозга, болезни Стила-Ричардсона-Ольшевского, сухотки спинного мозга и токсической энцефалопатии.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения рака путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более раковых клетках индивидуума, где повышение уровня экспрессии Zscan4 подавляет рост одной или более раковых клеток, и где указанное введение осуществляют для лечения рака. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения восприимчивости к химиотерапии у ракового пациента путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, агента, снижающего уровень экспрессии эндогенного ZSCAN4 в одной или более раковых стволовых клетках индивидуума, где снижение уровня экспрессии эндогенного ZSCAN4 приводит к ослаблению или устранению резистентности к одному или более химиотерапевтическим средствам в одной или более раковых стволовых клетках и, тем самым, к повышению восприимчивости к одному или более химиотерапевтическим средствам у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом, снижающим уровень экспрессии эндогенного ZSCAN4, является киРНК или кшРНК, специфичная к ZSCAN4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рак выбран из рака сердца (например, ангиосаркомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, миксомы, рабдомиомы, фибромы, липомы и тератомы); рака легких (например, бронхогенной карциномы (плоскоклеточной карциномы, недифференцированной мелкоклеточной карциномы, недифференцированной крупноклеточной карциномы, аденокарциномы)); альвеолярной (бронхолярной) карциномы, аденомы бронхов, саркомы, лимфомы, хондроматозной гамартомы, мезотелиомы)); рака желудочно-кишечного тракта (например, рака пищевода (плоскоклеточной карциномы, аденокарциномы, лейомиосаркомы, лимфомы); рака желудка (карциномы, лимфомы, лейомиосаркомы); рака поджелудочной железы (аденокарциномы протоков, инсулиномы, глюкагономы, гастриномы, карциноидных опухолей, апудомы); рака тонкого кишечника (аденокарциномы, лимфомы, карциноидных опухолей, саркомы Капоши, лейомиомы, гемангиомы, липомы, нейрофибромы, фибромы); рака толстого кишечника (аденокарциномы, аденомы канальцев, ворсинчатой аденомы, гамартомы, лейомиомы); рака мочеполовых путей (например, рака почек (аденокарциномы, опухоли Вильмса, нефробластомы, лимфомы, лейкоза); рака мочевого пузыря и уретры (плоскоклеточной карциномы, карциномы переходных клеток, аденокарциномы); рака предстательной железы (аденокарциномы, саркомы); рака яичек (семиномы, тератомы, эмбриональной карциномы, тератокарциномы, хориокарциномы, саркомы, карциномы интерстициальных клеток, фибромиы, фиброаденомы, аденоматоидных опухолей, липомы); рака печени (например, гепатомы (гепатоцеллюлярной карциномы), холангиокарциномы, гепатобластомы, ангиосаркомы, гепатоцеллюлярной аденомы, гемангиомы)); рака кости (например, остеогенной саркомы, (остеосаркомы), фибросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, злокачественной лимфомы (саркомы клеток ретикулума), множественной миеломы, злокачественной гигантоклеточной опухоли, хордомы, остеохондромы (остеоэкзостоза хряща), доброкачественной хондромы, хондробластомы, хондромиксофибромы, остеоидной остеомы и гигантоклеточных опухолей); рака нервной системы (например, рака черепа (остеомы, гемангиомы, гранулемы, ксантомы, деформирующего остеита); рака мозговой оболочки (менингиомы, менингиосаркомы, глиоматоза); рака головного мозга (астроцитомы, медуллобластомы, глиомы, эпиндимомы, герминомы, пинеаломы, мультиформной глиобластомы, олигодендроглиомы, шванномы, ретинобластомы, наследственных опухолей); рака спинного мозга (нейрофибромы, менингиомы, глиомы, саркомы)); рака женских половых органов (например, рака матки (карциномы эндометрия), рака шейки матки (карциномы шейки матки, предопухолевой дисплазии шейки матки), рака яичника (карциномы яичника, серозной цистаденокарциномы, цистаденокарциномы слизистой, эндометриоидных опухолей, опухоли Бреннера, светлоклеточной карциномы, неклассифицированной карциномы, гранулезных опухолей стромы яичника, клеточных опухолей Сертоли-Лейдига, дисгерминомы, злокачественной тератомы), рака вульвы (плоскоклеточной карциномы, интраэпителиальной карциномы, аденокарциномы, фибросаркомы, меланомы), рака влагалища (светлоклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, ботриоидной саркомы, эмбриональной рабдомиосаркомы, рака фаллопиевых труб (карциномы фаллопиевых труб); рака системы кровообращения (например, рака крови (миелоидного лейкоза (острого и хронического), острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, миелопролиферативных заболеваний, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома), болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы (злокачественной лимфомы)); рака кожи (например, злокачественной меланомы, базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, саркомы Капоши, хориоаденомы, диспластических новообразований, липомы, ангиомы, дерматофибромы, келоидных рубцов, псориаза) и рака коры надпочечника (например, нейробластомы).

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности генома в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одной или более человеческих клетках по сравнению со стабильностью генома в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения способности к репарации ДНК в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению способности к репарации ДНК в одной или более человеческих клетках по сравнению со способностью к репарации ДНК в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения одной или более человеческих клеток путем приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению одной или более человеческих клеток по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения кожи, лечения атопического дерматита и/или лечения поражений кожи путем нанесения на кожу индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения облысения путем местного нанесения на волосистую часть головы индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу предупреждения поседения волос устранения поседения волос или того и другого путем нанесения на один или более волосяных фолликулов индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу восстановления роговицы путем введения в роговицу индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения «сухого глаза» путем введения в роговицу индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения идиопатического фиброза легких путем введения в легкие индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения атеросклероза, ишемической болезни сердца или обоих заболеваний путем введения в кровоток индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу сообщения резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, таким генотоксическим агентом является митомицин С или цисплатин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются клетки взрослого человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения, одной или более человеческими клетками являются стволовые клетки взрослого человека, стволовые клетки ткани, клетки-предшественники или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются одна или более стволовых клеток взрослого человека, одна или более стволовых клеток ткани или одна или более клеток-предшественников, выбранных из гемопоэтических стволовых клеток, стволовых клеток мезенхимы, стволовых клеток жировой ткани, стволовых клеток нервной системы и зародышевых стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются соматические клетки, зрелые клетки или дифференцированные клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются одна или более соматических клеток, зрелых клеток или дифференцированных клеток, выбранных из эпидермальных клеток, фибробластов, лимфоцитов, гепатоцитов, эпителиальных клеток, миоцитов, хондроцитов, остеоцитов, адипоцитов, кардиомиоцитов, панкреатических β-клеток, кератиноцитов, эритроцитов, клеток периферической крови, нейроцитов, астроцитов, зародышевых клеток, клеток спермы и ооцитов.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу индуцирования паттерна метилирования ДНК, подобного паттерну метилирования ДНК человеческих эмбриональных стволовых клеток в одной или более человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клетках посредством приведения одной или более человеческих иПС-клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих иПС-клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует паттерн метилирования ДНК, подобный паттерну метилирования ДНК человеческих эмбриональных стволовых клеток в одной или более человеческих иПС-клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими иПС-клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения одного или более человеческих ооцитов посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению одного или более человеческих ооцитов по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более человеческих ооцитов выделяют у индивидуума, ранее не подвергавшегося контактированию в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, после приведения с агента, повышающим уровень экспрессии Zscan4, один или более человеческих ооцитов подвергают оплодотворению in vitro.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу in vitro повышения стабильности генома в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах посредством приведения одного или более оплодотворенных человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими оплодотворенными человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу in vitro коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах посредством приведения одного или более оплодотворенных человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими оплодотворенными человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более оплодотворенных человеческих ооцитов были подвергнуты оплодотворению in vitro. В некоторых вариантах осуществления изобретения, перед оплодотворением, один или более человеческих ооцитов были выделены у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более оплодотворенных ооцитов представляют собой эмбрионы промежуточной стадии развития между образованием одной клетки и образованием бластоциста.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение человеческих клеток костного мозга у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией; ii. приведение человеческих клеток костного мозга в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках костного мозга, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в человеческих клетках костного мозга; и iii. трансплантацию человеческих клеток костного мозга, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение человеческих клеток костного мозга у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с хромосомной аберрацией; ii. приведение человеческих клеток костного мозга в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках костного мозга, где такое повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в человеческих клетках костного мозга; и iii. трансплантацию человеческих клеток костного мозга, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является одно или более заболеваний или состояний, выбранных из заболеваний, вызываемых укорочением теломеры; синдромов недостаточности костного мозга; возрастных заболеваний или расстройств, ассоциированных с укорочением теломеры; и заболеваний или расстройств, ассоциированных с преждевременным старением. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является заболевание, ассоциированное с укорочением теломеры и выбранное из врожденного дискератоза, синдрома Хейераала-Хрейдерсона, синдрома Ревеша, синдрома Коутса +, идиопатического фиброза легких, цирроза печени, фиброза поджелудочной железы, болезни Альцгеймера и остеоартрита. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является синдром недостаточности костного мозга, выбранный из анемии Фанкони, амегакариоцитарной тробмоцитопении, апластической анемии, анемии Даймонда-Блэкфана, врожденного дискератоза, ночной пароксизмальной гемоглобинурии (НПГ), синдрома Пирсона, синдрома Швахмана-Даймонда, тромбоцитопении и миелодиспластического синдрома. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является возрастное заболевание или расстройство, ассоциированное с укорочением теломеры; заболевание или расстройство, ассоциированное с преждевременным старением; или оба эти заболевания, выбранные из синдрома Вернера, синдрома Блума, синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированного со старением, кокаинового синдрома, пигментной ксеродермии, атаксии-телангиэктазии, синдрома Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофии, синдрома Юберга-Марсиди и синдрома Дауна.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения ткани или органов у индивидуума путем введения этому индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в ткани или в органе, где повышение уровня экспрессии Zscan4 способствует омоложению ткани или органа.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения индивидууму агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где повышение уровня экспрессии Zscan4 способствует омоложению указанного индивидуума.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни одной или более человеческих клеток посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках индивидуума, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток по сравнению с продолжительностью жизни одной или более соответствующих человеческих клеток, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни ткани или органа индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в ткани или органе, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни ткани или органа.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток и, тем самым, к увеличению продолжительности жизни самого индивидуума.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни индивидуума, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для увеличения его продолжительности жизни.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу определения одного или более Zscan4-индуцированных эффектов в одной или более человеческих клетках, где указанный способ включает: i. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках; ii. измерение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках; и iii. сравнение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках с уровнями экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не были подвергнуты контактированию с этим агентом, где повышение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках указывает на Zscan4-индуцирование одного или более эффектов в одной или более человеческих клетках.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, повышение уровня экспрессии Zscan4 является временным. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный агент способствует повышению уровня экспрессии Zscan4 в течение периода времени приблизительно от 1 часа до 23 часов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный агент способствует повышению уровня экспрессии Zscan4 в течение периода времени приблизительно от 1 дня до 10 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный агент непосредственно взаимодействует с эндогенным Zscan4, что приводит к повышению уровня экспрессии Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным агентом является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, выделенной молекулой нуклеиновой кислоты является синтетическая мРНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит вектор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным вектором является вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным вирусным вектором является парамиксовирусный вектор, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор или аденовирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным вирусным вектором является парамиксовирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным парамиксовирусным вектором является вектор на основе вируса Сендай. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным вектором является плазмидный вектор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный вектор кодирует Zscan4, функционально присоединенный к промотору. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным промотором является конститутивный промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным промотором является индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, Zscan4 представляет собой гибридный белок Zscan4-ERT2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, Zscan4 представляет собой гибридный белок Zscan4-ΔC. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC включает делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой мышиный Zscan4, человеческий ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 выбран из Zscan4a, Zscan4b, Zscan4c, Zscan4d, Zscan4e и Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID Nos: 1-10 и 21-30. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, Zscan4 представляет собой человеческий ZSCAN4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным агентом является белок Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 присоединен к пептиду, способному проникать в клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, пептид, способный проникать в клетку, содержит домен для трансдукции белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, пептид, способный проникать в клетку, содержит полиаргининовую пептидную метку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 инкапсулирован в наночастицу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой мышиный белок Zscan4, человеческий белок ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 выбран из белка Zscan4a, белка Zscan4b, белка Zscan4c, белка Zscan4d, белка Zscan4e и белка Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID №№: 11-20 и 31-40. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой человеческий белок ZSCAN4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой гибридный белок Zscan4-ERT2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой белок Zscan4-ΔC. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC содержит мышиный белок Zscan4, человеческий белок ZSCAN4 или его гомолог, где указанный белок Zscan4 включает делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC содержит белок Zscan4, выбранный из белка Zscan4a, белка Zscan4b, белка Zscan4c, белка Zscan4d, белка Zscan4e и белка Zscan4f, где указанный белок Zscan4 содержит делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC содержит человеческий белок ZSCAN4, где указанный белок Zscan4 содержит делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным агентом является ретиноид, агент, индуцирующий окислительный стресс, или оба этих агента.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения длины теломеры в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, посредством приведения одной или более человеческих клеток индивидуума в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, путем: i. выделения одной или более человеческих клеток у индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры; ii. приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках; и iii. введения индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках индивидуума, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках, необходимое для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, путем: i. выделения одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией; ii. приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках; и iii. введения индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках индивидуума, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в одной или более человеческих клетках, необходимую для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, путем: i. выделения одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с хромосомной аберрацией; ii. приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в одной или более человеческих клетках; и iii. введения индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках индивидуума, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в одной или более человеческих клетках, необходимую для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией, путем: i. выделения одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с кариотипической аберрацией; ii. приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в одной или более человеческих клетках; и iii. введения индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, кариотипическая аберрация выбрана из хромосомной нуллисомии, хромосомной моносомии, хромосомной трисомии, хромосомной тетрасомии и хромосомной пентасомии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, кариотипическая аберрация выбрана из трисомии по хромосоме 21, трисомии по хромосоме 16, трисомии по хромосоме 18, трисомии по хромосоме 13, моносомии по хромосоме X, анеуплоидии XXX, анеуплоидии XXY, анеуплоидии XYY и дупликации 1p36. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, заболевание или состояние, ассоциированное с кариотипической аберрацией, выбрано из синдрома dup(17)(p11.2p11.2), болезни Пелициуса-Мерцбахера, синдрома dup(22)(q11.2q11.2), синдрома кошачьих глаз, синдрома кошачьего крика, синдрома Вольфа-Хиршхорна, синдрома Вильямса-Бейрена, болезни Шарко-Мари-Туфа, наследственной невропатии с предрасположенностью к параличу от сдавливания нерва, синдрома Смита-Маджениса, нейрофиброматоза, синдрома Аладжилля, синдрома ущемления небно-сердечно-челюстного нерва, синдрома Ди Георга, заболевания, ассоциированного с дефицитом стероид-сульфатазы, синдрома Кальмана, микрофтальмии, ассоциированной дефектами линий клеток кожи, гипоплазии коры надпочечника, заболевания, ассоциированного с дефицитом глицерин-киназы, болезни Пелициуса-Мерцбахера, заболевания, ассоциированного с фактором дифференцировки клеток яичек на хромосоме Y, азооспермии (фактора a), азооспермии (фактора b), азооспермии (фактора c) и заболевания, ассоциированного с делецией 1p36. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является одно или более заболеваний или состояний, выбранных из заболеваний, вызываемых укорочением теломеры; синдромов недостаточности костного мозга; возрастных заболеваний или расстройств, ассоциированных с укорочением теломеры; и заболеваний или расстройств, ассоциированных с преждевременным старением. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является заболевание, ассоциированное с укорочением теломеры, и выбранное из врожденного дискератоза, синдрома Хейераала-Хрейдерсона, синдрома Ревеша, синдрома Коутса+, идиопатического фиброза легких, цирроза печени, фиброза поджелудочной железы, болезни Альцгеймера и остеоартрита. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является синдром недостаточности костного мозга, выбранный из анемии Фанкони, амегакариоцитарной тробмоцитопении, апластической анемии, анемии Даймонда-Блэкфана, врожденного дискератоза, ночной пароксизмальной гемоглобинурии (НПГ), синдрома Пирсона, синдрома Швахмана-Даймонда, тромбоцитопении и миелодиспластического синдрома. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является возрастное заболевание или расстройство, ассоциированное с укорочением теломеры; заболевание или расстройство, ассоциированное с преждевременным старением; или оба эти заболевания, выбранные из синдрома Вернера, синдрома Блума, синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированного со старением, кокаинового синдрома, пигментной ксеродермии, атаксии-телангиэктазии, синдрома Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофии, синдрома Юберга-Марсиди и синдрома Дауна. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием являются одно или более заболеваний или состояний, выбранных из иммунодефицита, аутоиммунного заболевания, аутоиммунного расстройства, хронических язв, атеросклероза, рака, нервного расстройства, дегенеративного расстройства, нейродегенеративного расстройства, заболевания, ассоциированного с заживлением ран, репарацией мышц и репарацией сердечной мышцы, заболевания, ассоциированного с замещением хрящевой ткани, артрита, остеоартрита, регенерации зубной ткани, слепоты, возрастной слепоты, вызываемой пролиферирующим разрушением пигментированных эпителиальных клеток сетчатки, глухоты, недостаточности костного мозга, заболевания, ассоциированного с трансплантацией костного мозга, диабета, мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшенна, генетического заболевания, генетической мутации и заболевания, ассоциированного с повреждением ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является рак, выбранный из рака сердца (например, ангиосаркомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, миксомы, рабдомиомы, фибромы, липомы и тератомы); рака легких (например, бронхогенной карциномы (плоскоклеточной карциномы, недифференцированной мелкоклеточной карциномы, недифференцированной крупноклеточной карциномы, аденокарциномы), альвеолярной (бронхолярной) карциномы, аденомы бронхов, саркомы, лимфомы, хондроматозной гамартомы, мезотелиомы); рака желудочно-кишечного тракта (например, рака пищевода (плоскоклеточной карциномы, аденокарциномы, лейомиосаркомы, лимфомы); рака желудка (карциномы, лимфомы, лейомиосаркомы); рака поджелудочной железы (аденокарциномы протоков, инсулиномы, глюкагономы, гастриномы, карциноидных опухолей, апудомы); рака тонкого кишечника (аденокарциномы, лимфомы, карциноидных опухолей, саркомы Капоши, лейомиомы, гемангиомы, липомы, нейрофибромы, фибромы); рака толстого кишечника (аденокарциномы, аденомы канальцев, ворсинчатой аденомы, гамартомы, лейомиомы); рака мочеполовых путей (например, рака почек (аденокарциномы, опухоли Вильмса, нефробластомы, лимфомы, лейкоза); рака мочевого пузыря и уретры (плоскоклеточной карциномы, карциномы переходных клеток, аденокарциномы); рака предстательной железы (аденокарциномы, саркомы); рака яичек (семиномы, тератомы, эмбриональной карциномы, тератокарциномы, хориокарциномы, саркомы, карциномы интерстициальных клеток, фибромиы, фиброаденомы, аденоматоидных опухолей, липомы); рака печени (например, гепатомы (гепатоцеллюлярной карциномы), холангиокарциномы, гепатобластомы, ангиосаркомы, гепатоцеллюлярной аденомы, гемангиомы)); рака кости (например, остеогенной саркомы, (остеосаркомы), фибросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, злокачественной лимфомы (саркомы клеток ретикулума), множественной миеломы, злокачественной гигантоклеточной опухоли, хордомы, остеохондромы (остеоэкзостоза хряща), доброкачественной хондромы, хондробластомы, хондромиксофибромы, остеоидной остеомы и гигантоклеточных опухолей); рака нервной системы (например, рака черепа (остеомы, гемангиомы, гранулемы, ксантомы, деформирующего остеита); рака мозговой оболочки (менингиомы, менингиосаркомы, глиоматоза), рака головного мозга (астроцитомы, медуллобластомы, глиомы, эпиндимомы, герминомы, пинеаломы, мультиформной глиобластомы, олигодендроглиомы, шванномы, ретинобластомы, наследственных опухолей); рака спинного мозга (нейрофибромы, менингиомы, глиомы, саркомы)); рака женских половых органов (например, рака матки (карциномы эндометрия), рака шейки матки (карциномы шейки матки, предопухолевой дисплазии шейки матки), рака яичника (карциномы яичника, серозной цистаденокарциномы, цистаденокарциномы слизистой, эндометриоидных опухолей, опухоли Бреннера, светлоклеточной карциномы, неклассифицированной карциномы, гранулезных опухолей стромы яичника, клеточных опухолей Сертоли-Лейдига, дисгерминомы, злокачественной тератомы), рака вульвы (плоскоклеточной карциномы, интраэпителиальной карциномы, аденокарциномы, фибросаркомы, меланомы), рака влагалища (светлоклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, ботриоидной саркомы, эмбриональной рабдомиосаркомы, рака фаллопиевых труб (карциномы фаллопиевых труб); рака системы кровообращения (например, рака крови (миелоидного лейкоза (острого и хронического), острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, миелопролиферативных заболеваний, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома), болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы (злокачественной лимфомы)); рака кожи (например, злокачественной меланомы, базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, саркомы Капоши, хориоаденомы, диспластических новообразований, липомы, ангиомы, дерматофибромы, келоидных рубцов, псориаза) и рака коры надпочечника (например, нейробластомы). В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является аутоиммунное заболевание, выбранное из тиреоидита, болезни Гудпасчера, ревматоидного артрита, ювенильного олигоартрита, артрита, индуцированного коллагеном, артрита, индуцированного адъювантом, синдрома Сьегрена, рассеянного склероза, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, аутоиммунной атрофии желудка, вульгарной пузырчатки, псориаза, витилиго, диабета типа 1, диабета «тощих», тяжелой миастении, болезни Грейвса, тиреоидита Хашимото, склерозирующего холангита, склерозирующего сиаладенита, системной красной волчанки, аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, болезни Аддисона, системного склероза, полимиозита, дерматомиозита, аутоиммунной гемолитической анемии и пернициозной анемии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является нейродегенеративное заболевание, выбранное из адренолейкодистрофии (AЛД), алкоголизма, болезни Александера, болезни Альпера, болезни Альцгеймера, амиотрофического бокового склероза, болезни Луи Герига, атаксии-телангиэктазии, болезни Баттена, болезни Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена, бычьей спонгиформной энцефалопатии (БСЭ), болезни Канавана, церебрального паралича, кокаинового синдрома, кортикобазальной дегенерации, болезни Крейцфельда-Якоба, наследственной злокачественной бессоницы, дегенерации передней височной доли, болезни Гентингтона, ВИЧ-ассоциированной деменции, болезни Кеннеди, болезни Краббе, деменции телец Леви, нейроборрелиоза, болезни Мачадо-Йозефа, атаксии спинного мозга и мозжечка типа 3, атрофии многих органов, рассеянного склероза, нарколепсии, болезни Ньюмана-Пика, болезни Паркинсона, болезни Пелициуса-Мерцбахера, болезни Пика, первичного бокового склероза, заболеваний, вызываемых прионами, прогрессирующего надъядерного паралича, болезни Рефсума, болезни Сандхоффа, болезни Шильдера, подострой дегенерации спинного мозга, вызывающей пернициозную анемию, болезни Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена, болезни Баттена, атаксии спинного мозга и мозжечка, атрофии мышц спинного мозга, болезни Стила-Ричардсона-Ольшевского, сухотки спинного мозга и токсической энцефалопатии.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения рака путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более раковых клетках индивидуума, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 подавляет рост одной или более раковых клеток, и где указанное введение осуществляют для лечения рака. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения восприимчивости к химиотерапии у ракового пациента путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, агента, снижающего уровень экспрессии эндогенного ZSCAN4 в одной или более раковых стволовых клетках индивидуума, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где снижение уровня экспрессии эндогенного ZSCAN4 приводит к ослаблению или устранению резистентности к одному или более химиотерапевтическим средствам в одной или более раковых стволовых клетках и, тем самым, к повышению восприимчивости к одному или более химиотерапевтическим средствам у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом, снижающим уровень экспрессии эндогенного ZSCAN4, является киРНК или кшРНК, специфичная к ZSCAN4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рак выбран из рака сердца (например, ангиосаркомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, миксомы, рабдомиомы, фибромы, липомы и тератомы), рака легких (например, бронхогенной карциномы (плоскоклеточной карциномы, недифференцированной мелкоклеточной карциномы, недифференцированной крупноклеточной карциномы, аденокарциномы)), альвеолярной (бронхолярной) карциномы, аденомы бронхов, саркомы, лимфомы, хондроматозной гамартомы, мезотелиомы); рака желудочно-кишечного тракта (например, рака пищевода (плоскоклеточной карциномы, аденокарциномы, лейомиосаркомы, лимфомы); рака желудка (карциномы, лимфомы, лейомиосаркомы); рака поджелудочной железы (аденокарциномы протоков, инсулиномы, глюкагономы, гастриномы, карциноидных опухолей, апудомы); рака тонкого кишечника (аденокарциномы, лимфомы, карциноидных опухолей, саркомы Капоши, лейомиомы, гемангиомы, липомы, нейрофибромы, фибромы); рака толстого кишечника (аденокарциномы, аденомы канальцев, ворсинчатой аденомы, гамартомы, лейомиомы); рака мочеполовых путей (например, рака почек (аденокарциномы, опухоли Вильмса, нефробластомы, лимфомы, лейкоза); рака мочевого пузыря и уретры (плоскоклеточной карциномы, карциномы переходных клеток, аденокарциномы); рака предстательной железы (аденокарциномы, саркомы); рака яичек (семиномы, тератомы, эмбриональной карциномы, тератокарциномы, хориокарциномы, саркомы, карциномы интерстициальных клеток, фибромиы, фиброаденомы, аденоматоидных опухолей, липомы); рака печени (например, гепатомы (гепатоцеллюлярной карциномы), холангиокарциномы, гепатобластомы, ангиосаркомы, гепатоцеллюлярной аденомы, гемангиомы)); рака кости (например, остеогенной саркомы, (остеосаркомы), фибросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, злокачественной лимфомы (саркомы клеток ретикулума), множественной миеломы, злокачественной гигантоклеточной опухоли, хордомы, остеохондромы (остеоэкзостоза хряща), доброкачественной хондромы, хондробластомы, хондромиксофибромы, осеоидной остеомы и гигантоклеточных опухолей); рака нервной системы (например, рака черепа (остеомы, гемангиомы, гранулемы, ксантомы, деформирующего остеита); рака мозговой оболочки (менингиомы, менингиосаркомы, глиоматоза), рака головного мозга (астроцитомы, медуллобластомы, глиомы, эпиндимомы, герминомы, пинеаломы, мультиформной глиобластомы, олигодендроглиомы, шванномы, ретинобластомы, наследственных опухолей); рака спинного мозга (нейрофибромы, менингиомы, глиомы, саркомы)); рака женских половых органов (например, рака матки (карциномы эндометрия), рака шейки матки (карциномы шейки матки, предопухолевой дисплазии шейки матки), рака яичника (карциномы яичника, серозной цистаденокарциномы, цистаденокарциномы слизистой, эндометриоидных опухолей, опухоли Бреннера, светлоклеточной карциномы, неклассифицированной карциномы, гранулезных опухолей стромы яичника, клеточных опухолей Сертоли-Лейдига, дисгерминомы, злокачественной тератомы), рака вульвы (плоскоклеточной карциномы, интраэпителиальной карциномы, аденокарциномы, фибросаркомы, меланомы), рака влагалища (светлоклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, ботриоидной саркомы, эмбриональной рабдомиосаркомы, рака фаллопиевых труб (карциномы фаллопиевых труб); рака системы кровообращения (например, рака крови (миелоидного лейкоза (острого и хронического), острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, миелопролиферативных заболеваний, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома), болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы (злокачественной лимфомы)); рака кожи (например, злокачественной меланомы, базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, саркомы Капоши, хориоаденомы, диспластических новообразований, липомы, ангиомы, дерматофибромы, келоидных рубцов, псориаза) и рака коры надпочечника (например, нейробластомы).

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности генома в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одной или более человеческих клетках по сравнению со стабильностью генома в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения способности к репарации ДНК в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению способности к репарации ДНК в одной или более человеческих клетках по сравнению со способностью к репарации ДНК в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения одной или более человеческих клеток посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению одной или более человеческих клеток по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения кожи, лечения атопического дерматита и/или лечения поражений кожи путем нанесения на кожу индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения облысения путем местного нанесения на волосистую часть головы индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу предупреждения поседения волос, устранения поседения волос или того и другого путем нанесения на один или более волосяных фолликулов индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу восстановления роговицы путем введения в роговицу индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения «сухого глаза» путем введения в роговицу индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения идиопатического фиброза легких путем введения в легкие индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения атеросклероза, ишемической болезни сердца или обоих заболеваний путем введения в кровоток индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу сообщения резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, таким генотоксическим агентом является митомицин С или цисплатин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются клетки взрослого человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются стволовые клетки взрослого человека, стволовые клетки ткани, клетки-предшественники или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются одна или более стволовых клеток взрослого человека, одна или более стволовых клеток ткани или одна или более клеток-предшественников, выбранных из гемопоэтических стволовых клеток, стволовых клеток мезенхимы, стволовых клеток жировой ткани, стволовых клеток нервной системы и зародышевых стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются соматические клетки, зрелые клетки или дифференцированные клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются одна или более соматических клеток, зрелых клеток или дифференцированных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, одной или более человеческими клетками являются одна или более соматических клеток, зрелых клеток или дифференцированных клеток, выбранных из эпидермальных клеток, фибробластов, лимфоцитов, гепатоцитов, эпителиальных клеток, миоцитов, хондроцитов, остеоцитов, адипоцитов, кардиомиоцитов, панкреатических β-клеток, кератиноцитов, эритроцитов, клеток периферической крови, нейроцитов, астроцитов, зародышевых клеток, клеток спермы и ооцитов.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу индуцирования паттерна метилирования ДНК, подобного паттерну метилирования ДНК человеческих эмбриональных стволовых клеток в одной или более человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клетках посредством приведения одной или более человеческих иПС-клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих иПС-клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует паттерн метилирования ДНК, подобный паттерну метилирования ДНК человеческих эмбриональных стволовых клеток в одной или более человеческих иПС-клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими иПС-клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения одного или более человеческих ооцитов посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению одного или более человеческих ооцитов по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 стимулирует коррекцию одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более человеческих ооцитов выделяют у индивидуума, ранее не подвергавшегося контактированию в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, после приведения агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, один или более человеческих ооцитов подвергают оплодотворению in vitro.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу in vitro повышения стабильности генома в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах посредством приведения одного или более оплодотворенных человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими оплодотворенными человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу in vitro коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах посредством приведения одного или более оплодотворенных человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 стимулирует коррекцию одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими оплодотворенными человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более оплодотворенных человеческих ооцитов были подвергнуты оплодотворению in vitro. В некоторых вариантах осуществления изобретения, перед оплодотворением, один или более человеческих ооцитов были выделены у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более оплодотворенных ооцитов представляют собой эмбрионы промежуточной стадии развития между образованием одной клетки и образованием бластоциста.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение человеческих клеток костного мозга у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией; ii. приведение человеческих клеток костного мозга в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках костного мозга, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в человеческих клетках костного мозга; и iii. трансплантацию человеческих клеток костного мозга, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение человеческих клеток костного мозга у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с хромосомной аберрацией; ii. приведение человеческих клеток костного мозга в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках костного мозга, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где такое повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в человеческих клетках костного мозга; и iii. трансплантацию человеческих клеток костного мозга, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием являются одно или более заболеваний или состояний, выбранных из заболеваний, ассоциированных с укорочением теломеры; синдромов недостаточности костного мозга; возрастных заболеваний или расстройств, ассоциированных с укорочением теломеры; и заболеваний или расстройств, ассоциированных с преждевременным старением. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является заболевание, ассоциированное с укорочением теломеры и выбранное из врожденного дискератоза, синдрома Хейераала-Хрейдерсона, синдрома Ревеша, синдрома Коутса+, идиопатического фиброза легких, цирроза печени, фиброза поджелудочной железы, болезни Альцгеймера и остеоартрита. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является синдром недостаточности костного мозга, выбранный из анемии Фанкони, амегакариоцитарной тробмоцитопении, апластической анемии, анемии Даймонда-Блэкфана, врожденного дискератоза, ночной пароксизмальной гемоглобинурии (НПГ), синдрома Пирсона, синдрома Швахмана-Даймонда, тромбоцитопении и миелодиспластического синдрома. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным заболеванием или состоянием является возрастное заболевание или расстройство, ассоциированное с укорочением теломеры; заболевание или расстройство, ассоциированное с преждевременным старением; или оба эти заболевания, выбранные из синдрома Вернера, синдрома Блума, синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированного со старением, кокаинового синдрома, пигментной ксеродермии, атаксии-телангиэктазии, синдрома Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофии, синдрома Юберга-Марсиди и синдрома Дауна.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения ткани или органов у индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в ткани или в органе, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 способствует омоложению ткани или органа.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу омоложения индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 способствует омоложению индивидуума.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни одной или более человеческих клеток посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках индивидуума, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток по сравнению с продолжительностью жизни одной или более соответствующих человеческих клеток, которые не контактировали с этим агентом.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни ткани или органа индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в ткани или органе, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни ткани или органа.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток и, тем самым, к увеличению продолжительности жизни самого индивидуума.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни индивидуума, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4, и где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для увеличения его продолжительности жизни.

В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к способу определения одного или более Zscan4-индуцированных эффектов в одной или более человеческих клетках, где указанный способ включает: i. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где указанным агентом является синтетическая молекула мРНК, кодирующая Zscan4, или вирусный вектор, а предпочтительно, вектор на основе вируса Сендай, кодирующий Zscan4; ii. измерение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках; и iii. сравнение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках с уровнями экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не были подвергнуты контактированию с этим агентом, где повышение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках указывает на Zscan4-индуцирование одного или более эффектов в одной или более человеческих клетках.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, повышение уровня экспрессии Zscan4 является временным. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный агент способствует повышению уровня экспрессии Zscan4 в течение периода времени приблизительно от 1 часа до 23 часов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный агент способствует повышению уровня экспрессии Zscan4 в течение периода времени приблизительно от 1 дня до 10 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный агент непосредственно взаимодействует с эндогенным Zscan4, что приводит к повышению уровня экспрессии Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанный вектор кодирует Zscan4, функционально присоединенный к промотору. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным промотором является конститутивный промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным промотором является индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, Zscan4 представляет собой белок Zscan4-ERT2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, Zscan4 представляет собой гибридный белок Zscan4-ΔC. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC включает делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой мышиный Zscan4, человеческий ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, Zscan4 выбран из Zscan4a, Zscan4b, Zscan4c, Zscan4d, Zscan4e и Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID N№: 1-10 и 21-30. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, Zscan4 представляет собой человеческий ZSCAN4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным агентом является белок Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 присоединен к пептиду, способному проникать в клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, пептид, способный проникать в клетку, содержит домен для трансдукции белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, пептид, способный проникать в клетку, содержит полиаргининовую пептидную метку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 инкапсулирован в наночастицу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой мышиный белок Zscan4, человеческий белок ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 выбран из белка Zscan4a, белка Zscan4b, белка Zscan4c, белка Zscan4d, белка Zscan4e и белка Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID №№: 11-20 и 31-40. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой человеческий белок ZSCAN4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой гибридный белок Zscan4-ERT2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4 представляет собой белок Zscan4-ΔC. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC содержит мышиный белок Zscan4, человеческий белок ZSCAN4 или его гомолог, где указанный белок Zscan4 включает делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC содержит белок Zscan4, выбранный из белка Zscan4a, белка Zscan4b, белка Zscan4c, белка Zscan4d, белка Zscan4e и белка Zscan4f, где указанный белок Zscan4 содержит делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, белок Zscan4-ΔC содержит человеческий белок ZSCAN4, где указанный белок Zscan4 содержит делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец». В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов, указанным агентом является ретиноид, агент, индуцирующий окислительный стресс, или оба этих агента.

Вышеупомянутые и другие цели и признаки настоящего изобретения будут более понятны из нижеследующего подробного описания изобретения, представленного со ссылкой на прилагаемый графический материал.

Краткое описание графического материала

На фиг. 1 проиллюстрирована коррекция хромосомных аберраций в мышиных эмбриональных стволовых (ЭC) клетках, трансфецированных hZSCAN4-мРНК. На фиг. 1A проиллюстрирована экспериментальная процедура. На фиг. 1B указан процент эуплоидных мышиных ЭC-клеток, трансфецированных hZSCAN4-мРНК.

На фиг. 2 проиллюстрирована коррекция хромосомных аберраций в мышиных ЭC-клетках, инфицированных векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими mZscan4 или hZSCAN4. На фиг. 2А указан процент эуплоидных мышиных ЭC-клеток, инфицированных SeVmZscan4 или SeVhZSCAN4. На фиг. 2B указан процент эуплоидных мышиных ЭC-клеток, инфицированных SeVmZERT2 или SeVhZERT2.

На фиг. 3 проиллюстрирована коррекция хромосомных аберраций в мышиных ЭC-клетках, инфицированных термочувствительными векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими mZscan4 или hZSCAN4. На фиг. 3A указан процент эуплоидных мышиных ЭC-клеток, инфицированных SeVmZscan4-TS15 или SeVhZSCAN4-TS15, а затем культивированных при 35°C в течение трех дней. На фиг. 3B указан процент эуплоидных мышиных ЭC-клеток, инфицированных SeVmZscan4-TS15 или SeVhZSCAN4-TS15, а затем культивированных при 35°C в течение шести дней. На фиг. 3C указан процент эуплоидных мышиных ЭC-клеток, инфицированных SeVmZscan4-TS15 или SeVhZSCAN4-TS15, а затем культивированных при 35°C в течение трех дней и при 37°C в течение трех дней.

На фиг. 4 проиллюстрировано влияние биологической природы Zscan4 на мышиные ЭC-клетки. На фиг. 4A проиллюстрированы эффекты hZSCAN4-мРНК-трансфекции мышиных ЭC-клеток. На фиг. 4B проиллюстрированы эффекты инфицирования мышиных ЭC-клеток векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими Zscan4. На фиг. 4C проиллюстрированы эффекты инфицирования мышиных ЭC-клеток термочувствительными векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими mZscan4 или hZSCAN4.

На фиг. 5 проиллюстрировано влияние биологической природы Zscan4 на человеческие иПС-клетки. На фиг. 5A проиллюстрированы эффекты Zscan4-мРНК-трансфекции человеческих иПС-клеток. На фиг. 5B проиллюстрированы эффекты инфицирования человеческих иПС-клеток векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими Zscan4. На фиг. 5C проиллюстрированы эффекты инфицирования человеческих иПС-клеток термочувствительными векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими mZscan4 или hZSCAN4.

На фиг. 6 представлены результаты анализа на рост человеческих фибробластов, взятых у пациента с ВДК (врожденным дискератозом) и трансфецированных hZSCAN4-мРНК или GFP-мРНК.

На фиг. 7A представлены результаты анализа на рост человеческих фибробластов, взятых у пациента с ВДК, инфицированного SeVhZScan4. На фиг. 7B представлены микрофотографии, иллюстрирующие морфологию человеческих фибробластов, взятых у пациента с ВДК, инфицированного SeVhZScan4.

На фиг. 8A проиллюстрирована экспериментальная процедура. На фиг. 8B представлены результаты анализа длины теломеры в человеческих фибробластах, взятых у пациента с ВДК и трансфецированных hZSCAN4-мРНК или GFP-мРНК.

На фиг. 9 представлены результаты анализа на рост человеческих фибробластов, взятых у пациента с синдромом Вернера (СВ) и трансфецированных hZSCAN4-мРНК или GFP-мРНК.

На фиг. 10 представлена репрезентативная схема лечения, проводимого с использованием Zscan4.

На фиг. 11 представлена гистограмма, на которой проиллюстрировано, что сверхэкспрессия человеческого ZSCAN4 приводит к увеличению длины теломеры в фибробластах здорового взрослого человека. «N» означает число повторностей.

На фиг. 12 представлена гистограмма, на которой проиллюстрировано, что сверхэкспрессия человеческого ZSCAN4 приводит к увеличению длины теломеры в человеческих фибробластах, выделенных у пациента с анемией Фанкони, входящего в дополнительную группу «А». «N» означает число повторностей.

На фиг. 13 представлены результаты анализа на рост кожных фибробластов взрослого человека (HDFa), трансфецированных hZSCAN4-мРНК, mZscan4-мРНК или GFP-мРНК. На фиг. 13A представлены результаты анализа на рост клеток HDFa, трансфецированных hZSCAN4-мРНК или GFP-мРНК и культивированных приблизительно в течение 50 дней. На фиг. 13B представлены результаты анализа на рост клеток HDFa, трансфецированных hZSCAN4-мРНК или GFP-мРНК и культивированных приблизительно в течение 30 дней. На фиг. 13C представлены результаты анализа на рост клеток HDFa, трансфецированных mZscan4-мРНК, hZSCAN4-мРНК или GFP-мРНК и культивированных приблизительно в течение 20 дней.

На фиг. 14 представлены результаты анализа на удлинение теломеры в человеческих мезенхимных стволовых (МС) клетках, инфицированных термочувствительными векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими мышиный Zscan4 или человеческий ZSCAN4.

На фиг. 15 проиллюстрировано влияние биологических агентов Zscan4 на дифференцированные клетки и стволовые клетки ткани.

На фиг. 16 указана плоидность хромосомы 21 фибробластов, взятых у пациента с синдромом Дауна (CД-клеток) и трансфецированных hZSCAN4-мРНК. На фиг. 16A представлены типичные результаты анализов FISH. Три точки указывают на трисомию по хромосоме 21, а две точки указывают на нормальную диплоидность хромосомы 21. На фиг. 16B указаны CД-клетки, трансфецированные hZSCAN4-мРНК только один раз. На фиг. 16C указаны CД-клетки, трансфецированные hZSCAN4-мРНК два раза. На этой фигуре, «n» означает число оцененных ядер.

На фиг. 17A проиллюстрирована экспериментальная процедура. На фиг. 17B указана плоидность хромосомы 21 фибробластов, взятых у пациента с синдромом Дауна (CД-клеток) и инфицированных SeVhZSCAN4-TS15 только один раз, а затем инфицированных SeVhZSCAN4 два раза. На фиг. 17С указана плоидность хромосомы 21 фибробластов, взятых у пациента с синдромом Дауна (CД-клеток) и инфицированных SeVhZSCAN4-TS15 только один раз, а затем инфицированных SeVhZSCAN4 четыре раза.

На фиг. 18 представлена репрезентативная схема лечения, проводимого для омоложения и/или коррекции хромосомных аберраций в человеческих ооцитах, в человеческих оплодотворенных ооцитах и в человеческих предварительно имплантированных эмбрионах с использованием мышиного Zscan4 или человеческого ZSCAN4.

На фиг. 19 проиллюстрировано ингибирование роста раковых клеток HCT116, инфицированных либо SeVmZscan4-TS15, либо SeVhZSCAN4-TS15.

Подробное описание изобретения

Обзор

Как обсуждалось выше, ранее было показано, что экспрессия мышиного Zscan4 в мышиных эмбриональных стволовых клетках ассоциируется с удлинением теломеры. Поскольку мышиный геном содержит шесть генов Zscan4 и три псевдогена Zscan4, а человеческой геном содержит только одни ген Zscan4, то специалисты в данной области не могут экстраполировать результаты анализа экспрессии Zscan4 в мышиных клетках на экспрессию Zscan4 в человеческих клетках. Однако, как описано ниже в примере 8, заявителем впервые было обнаружено, что экспрессия человеческого ZSCAN4 в полностью дифференцированных фибробластах взрослого человека приводит приблизительно к 40% увеличению длины теломеры в этих фибробластах. Кроме того, заявителем было обнаружено, что экспрессия Zscan4 в человеческих фибробластах, выделенных у пациента с анемией Фанкони, приводит приблизительно к 160% увеличению длины теломеры в этих фибробластах. Эти результаты неожиданно продемонстрировали, что Zscan4 представляет собой эффектор, который действует на раннем этапе удлинения теломеры, в отличие от активатора, действующего на более позднем этапе удлинения теломеры, что указывает на то, что для увеличения длины теломеры в человеческих фибробластах, выделенных у пациента с анемией Фанкони, достаточной является лишь экспрессия Zscan4. Таким образом, активация экспрессии или повышение уровня экспрессии Zscan4 в клетках могут служить эффективным средством для лечения анемии Фанкони или любого другого заболевания или состояния, ассоциированного с укорочением теломеры. Кроме того, как описано ниже в примере 15, заявителем также впервые было обнаружено, что стимуляция экспрессии Zscan4 далеко не ограничивается лишь стимуляцией стабильности генома. Экспрессия Zscan4 в популяции человеческих фибробластов, имеющих трисомию по хромосоме 21, индуцирует коррекцию аберрации, такой как трисомия по хромосоме 21, приблизительно у 55% клеток. В соответствии с этим, активация экспрессии или повышение уровня экспрессии Zscan4 могут быть осуществлены в целях устранения анеуплоидии клеток, а также для повышения эффективности оплодотворения in vitro (IVF) и успешного протекания беременности у женщин в позднем периоде детородного возраста посредством восстановления хромосом и/или коррекции хромосомных аберраций, таких как анеуплоидия, в ооцитах и в оплодотворенных ооцитах.

В соответствии с этим, в общих чертах, настоящее изобретение относится к способам повышения уровня экспрессии Zscan4 (например, экспрессии белка Zscan4) в человеческих клетках в целях увеличения длины теломеры и/или повышения стабильности генома. В своих различных аспектах, настоящее изобретение относится к увеличению длины теломеры в одной или более человеческих клетках; к лечению индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры; к лечению заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией; к лечению заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией; к повышению стабильности генома в одной или более человеческих клетках; к омоложению одной или более человеческих клеток; к омоложению ткани или органа у индивидуума; и к омоложению индивидуума, нуждающегося в этом.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способу увеличения длины теломеры в одной или более человеческих клетках, включающему приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, где указанный способ включает приведение одной или более человеческих клеток индивидуума в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках; и iii. введение индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках, и где указанное введение осуществляют для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в одной или более человеческих клетках, и где указанное введение осуществляют для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с хромосомной аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в одной или более человеческих клетках; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией, путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в одной или более человеческих клетках, и где указанное введение осуществляют для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с кариотипической аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток индивидуума в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в одной или более человеческих клетках; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с кариотипической аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения рака путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более раковых клетках индивидуума, где повышение уровня экспрессии Zscan4 подавляет рост одной или более раковых клеток, и где указанное введение осуществляют для лечения рака.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу повышения восприимчивости к химиотерапии у ракового пациента путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, агента, снижающего уровень экспрессии эндогенного ZSCAN4 в одной или более раковых стволовых клетках индивидуума, где снижение уровня экспрессии эндогенного ZSCAN4 приводит к ослаблению или устранению резистентности к одному или более химиотерапевтическим средствам в одной или более раковых стволовых клетках и, тем самым, к повышению восприимчивости к одному или более химиотерапевтическим средствам у индивидуума.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности генома в одной или более человеческих клетках, где указанный способ включает приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одной или более человеческих клетках по сравнению со стабильностью генома в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу повышения способности к репарации ДНК в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению способности к репарации ДНК в одной или более человеческих клетках по сравнению со способностью к репарации ДНК в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу омоложения одной или более человеческих клеток, где указанный способ включает приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению одной или более человеческих клеток по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу сообщения резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования паттерна метилирования ДНК, подобного паттерну метилирования ДНК человеческих эмбриональных стволовых клеток в одной или более человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клетках посредством приведения одной или более человеческих иПС-клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих иПС-клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует паттерн метилирования ДНК, подобный паттерну метилирования ДНК человеческих эмбриональных стволовых клеток в одной или более человеческих иПС-клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими иПС-клетками, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу омоложения одного или более человеческих ооцитов посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению одного или более человеческих ооцитов по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности генома in vitro в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах посредством приведения одного или более оплодотворенных человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими оплодотворенными человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу in vitro коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах посредством приведения одного или более оплодотворенных человеческих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах по сравнению с одним или более соответствующими оплодотворенными человеческими ооцитами, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение человеческих клеток костного мозга у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток костного мозга в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4, в человеческих клетках костного мозга, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в человеческих клетках костного мозга; и iii. трансплантацию человеческих клеток костного мозга, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией, где указанный способ включает: i. выделение человеческих клеток костного мозга у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с хромосомной аберрацией; ii. приведение одной или более человеческих клеток костного мозга в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4, человеческих клетках костного мозга, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует коррекцию теломерной аберрации в человеческих клетках костного мозга; и iii. трансплантацию человеческих клеток костного мозга, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с хромосомной аберрацией.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу омоложения ткани или органа у индивидуума, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в ткани или в органе, где повышение уровня экспрессии Zscan4 способствует омоложению ткани или органа.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу омоложения индивидуума, нуждающегося в этом, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где повышение уровня экспрессии Zscan4 способствует омоложению индивидуума.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни одной или более человеческих клеток посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках индивидуума, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток по сравнению с продолжительностью жизни одной или более соответствующих человеческих клеток, которые не контактировали с этим агентом.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни ткани или органа индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в ткани или органе, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни ткани или органа.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток и, тем самым, к увеличению продолжительности жизни самого индивидуума.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности жизни индивидуума, где указанный способ включает: i. выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума; ii. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток; и iii. введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для увеличения его продолжительности жизни.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу определения одного или более Zscan4-индуцированных эффектов в одной или более человеческих клетках, где указанный способ включает: i. приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках; ii. измерение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках; и iii. сравнение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках с уровнями экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не были подвергнуты контактированию с этим агентом, где повышение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках указывает на Zscan4-индуцирование одного или более эффектов в одной или более человеческих клетках.

Zscan4

Ген (Zscan4), содержащий домен «цинковый палец» и домен SCAN, представляет группу генов, которые ранее были идентифицированы как гены, характеризующиеся экспрессией, специфичной для эмбрионов на 2-клеточной стадии и для ЭC-клеток (публикация PCT No. WO 2008/118957). Ген Zscan4 был идентифицирован по профилю экспрессии мышиных эмбрионов на всех стадиях перед имплантацией в соответствии с программой крупномасштабного секвенирования кДНК (Ko et al., Development 127: 1737-1749, 2000; Sharov et al., PLoS Biol 1:E74, 2003) и анализа микромассива ДНК (Hamatani et al., Dev Cell 6: 117-131, 2004). Что касается мышей, то термин «Zscan4» означает набор генов, включающий три псевдогена (Zscan4-psl, Zscan4-ps2 и Zscan4-ps3) и шесть экспрессируемых генов (Zscan4a, Zscan4b, Zscan4c, Zscan4d, Zscan4e и Zscan4f). Было предсказано, что из указанных шести паралогов, парологи Zscan4c, Zscan4d и Zscan4f имеют открытые рамки считывания, которые кодируют домен SCAN, опосредующий белок-белковые взаимодействия, а также кодируют четыре домена «цинковый палец», что дает основание предположить, что они могут играть роль факторов транскрипции. В отличие от мышиного генома, человеческий геном содержит только одну копию Zscan4. Термин «Zscan4» может означать полипептиды Zscan4, а может означать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды Zscan4.

Недавно было показано, что Zscan4 (белок 4, содержащий домен «цинковый палец» и домен Scan), экспрессия которого у мышей является специфичной для эмбрионов на 2-клеточной стадии и для ЭC-клеток (Falco et al., Dev. Biol. 307:539-550, 2007), необходим для поддержания стабильности генома и сохранения нормального кариотипа в ЭC-клетках (Zalzman et al., Nature 464:858-863, 2010). Хотя лишь небольшая часть (приблизительно от 1% до 5%) недифференцированных ЭC-клеток экспрессирует Zscan4 в соответствующий период времени (Falco et al., Dev. Biol. 307:539-550, 2007), однако, почти все ЭC-клетки в культуре продуцируют Zscan4⁺ в переходном состоянии в течение 9 пассажей (Zalzman et al., Nature 464:858-863, 2010). После подавления экспрессии Zscan4, опосредуемого короткой шпилечной РНК (кшРНК), ЭC-клетки, приблизительно после 8 пассажей, подвергаются значительной кариотипической аберрации. Ранее проведенные исследования также показали, что мышиные ЭC-клетки, содержащие Zscan4⁺ в переходном состоянии, ассоциируются с удлинением теломеры (Zalzman et al., Nature 464:858-863, 2010). Хотя ЭC-клетки обладают превосходной способностью сохранять целостность генома в культуре, однако, также хорошо известно, что даже ЭC-клетки в долгоживущей культуре постепенно теряют свою способность к дальнейшему развитию. Теломера может представлять собой конец эукариотической хромосомы, то есть специализированную структуру, участвующую в репликации и в повышении стабильности хромосомы. Теломеры содержат множество повторов короткой последовательности ДНК в специфической ориентации. Функции теломеры заключаются в защите концов хромосомы от их сцепления друг с другом и в обеспечении репликации крайних концов хромосом (посредством теломеразы). Число повторов теломерной ДНК на конце хромосомы с возрастом уменьшается.

Ранее было показано, что искусственно индуцированная экспрессия мышиного Zscan4 в мышиных ЭC-клетках в течение трех дней приводит к увеличению средней длины теломер от стандартной, то есть приблизительно 40 т.п.н., до 66 т.п.н. (Zalzman et al., 2010). Это указывает на то, что даже один Zscan4 может эффективно и быстро увеличивать длину теломеры. Однако, не известно, может ли Zscan4 увеличивать длину теломер в неэмбриональных человеческих клетках, таких как стволовые клетки взрослого человека и соматические клетки.

Человеческие клетки

В некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к увеличению длины теломеры в одной или более человеческих клетках, включая, но не ограничиваясь ими, клетки взрослого человека, с использованием агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 (например, экспрессии белка Zscan4) в одной или более человеческих клетках. В некоторых вариантах осуществления изобретения, одной или более человеческими клетками являются человеческие клетки, взятые у индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, или у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией, или у индивидуума, у которого было диагностировано такое заболевание или состояние.

В описанных здесь способах могут быть использованы различные человеческие клетки. Используемый здесь термин «человеческая(ие) клетка(и)» означает любую(ые) клетку(и), присутствующую(ие) в организме человека во время и после эмбрионального развития, такую(ие) как человеческие эмбриональные клетки, стволовые клетки, плюрипотентные клетки, дифференцированные клетки, зрелые клетки, соматические клетки и клетки взрослого человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческими клетками согласно изобретению являются клетки взрослого человека. Используемый здесь термин «клетка(и) взрослого человека» означает любую(ые) клетку(и), присутствующую(ие) в организме человека после эмбрионального развития (то есть неэмбриональную(ые) клетку(и)). Человеческими клетками согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, клетки спермы, ооциты, оплодотворенные ооциты (то есть зиготы), эмбриональные клетки, зрелые клетки, дифференцированные клетки, соматические клетки, клетки-предшественники, эмбриональные стволовые (ЭC) клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки, стволовые клетки взрослого человека, соматические стволовые клетки и стволовые клетки ткани. Стволовые клетки взрослого человека, также известные как соматические стволовые клетки или стволовые клетки ткани, могут представлять собой недифференцированные клетки, присутствующие в организме после эмбрионального развития и размножающиеся путем деления с восполнением погибших клеток и регенерацией поврежденных тканей. Клетки-предшественники могут представлять собой олигопотентные или унипотентные клетки, которые дифференцируются в клетки или клеточные линии специфического типа. Клетки-предшественники представляют собой клетки, аналогичные стволовым клеткам, но являющиеся более дифференцированными с ограниченным самообновлением. Репрезентативными стволовыми клетками взрослого человека, стволовыми клетками ткани и/или клетками-предшественниками могут быть, но не ограничиваются ими, гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки мезенхимы, стволовые клетки жировой ткани, стволовые клетки нервной системы, стволовые клетки тонкого кишечника, стволовые клетки кожи и зародышевые клетки (такие как клетки спермы и ооциты).

Человеческими клетками могут быть также, но не ограничиваются ими, соматические клетки, зрелые клетки и дифференцированные клетки. Соматические клетки могут представлять собой любые клетки организма, включая, но не ограничиваясь ими, зародышевые клетки, стволовые клетки ткани, клетки-предшественники, индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки и дифференцированные клетки. Репрезентативными соматическими клетками, зрелыми клетками и/или дифференцированными клетками могут быть, но не ограничиваются ими, эпидермальные клетки, фибробласты, лимфоциты, гепатоциты, эпителиальнык клетки, миоциты, хондроциты, остеоциты, адипоциты, кардиомиоциты, панкреатические β-клетки, кератиноциты, эритроциты, клетки периферической крови, клетки костного мозга, нейроциты, астроциты и зародышевые клетки. Зародышевые клетки могут представлять собой клетки, которые превращаются в гаметы (то есть яйцеклетку и сперму) организма, репродуцирующиеся половым путем. В некоторых вариантах осуществления изобретения, зародышевыми клетками являются, но не ограничиваются ими, ооциты и клетки спермы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, соматическими клетками, зрелыми клетками и/или дифференцированными клетками согласно изобретению также являются, но не ограничиваются ими, предварительно имплантированные эмбрионы.

Агенты, повышающие уровень экспрессии Zscan4

В некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к применению агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 (например, экспрессии белка Zscan4) в человеческих клетках, для увеличения длины теломеры в человеческих клетках. Термин «агент» может означать любые молекулы нуклеиновой кислоты, белок, соединение, небольшую молекулу, органическое соединение, неорганическое соединение или другие представляющие интерес молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом является любой агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 либо посредством прямого взаимодействия с эндогенным геном Zscan4 (включающим любые вышерасположенные или нижерасположенные регуляторные последовательности), либо посредством взаимодействия с генами и/или белками, которое приводит к индуцированию экспрессии Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом может быть молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Zscan4, включая, но не ограничиваясь ими, синтетическую мРНК и экспрессионный вектор, включая, но не ограничиваясь ими, вирусный вектор, такой как векторы на основе вируса Сендай. В других вариантах осуществления изобретения, агентом может быть полипептид, содержащий белок Zscan4 или его функциональную часть, такую как Zscan4-ΔC. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанным агентом может быть ретиноид или агент, индуцирующий окислительный стресс.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, агент согласно изобретению, повышающий уровень экспрессии Zscan4 (например, экспрессии белка Zscan4) в человеческих клетках, способствует временному повышению уровня экспрессии Zscan4. Так, например, агент согласно изобретению, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, может повышать уровень экспрессии Zscan4 в течение периода времени приблизительно от 1 часа до 23 часов (например, приблизительно в течение 1 часа, приблизительно в течение 2 часов, приблизительно в течение 3 часов, приблизительно в течение 4 часов, приблизительно в течение 5 часов, приблизительно в течение 6 часов, приблизительно в течение 7 часов, приблизительно в течение 8 часов, приблизительно в течение 9 часов, приблизительно в течение 10 часов, 11 часов, приблизительно в течение 12 часов, приблизительно в течение 13 часов, приблизительно в течение 14 часов, приблизительно в течение 15 часов, приблизительно в течение 16 часов, приблизительно в течение 17 часов, приблизительно в течение 18 часов, приблизительно в течение 19 часов, приблизительно в течение 20 часов, приблизительно в течение 21 часа, приблизительно в течение 22 часов или приблизительно в течение 23 часов) или приблизительно в течение периода времени от 1 дня до 10 дней (например, приблизительно в течение 1 дня, приблизительно в течение 1,25 дней, приблизительно в течение 1,5 дней, приблизительно в течение 1,75 дней, приблизительно в течение 2 дней, приблизительно в течение 2,25 дней, приблизительно в течение 2,5 дней, приблизительно в течение 2,75 дней, приблизительно в течение 3 дней, приблизительно в течение 3,25 дней, приблизительно в течение 3,5 дней, приблизительно в течение 3,75 дней, приблизительно в течение 4 дней, приблизительно в течение 4,25 дней, приблизительно в течение 4,5 дней, приблизительно в течение 4,75 дней, приблизительно в течение 5 дней, приблизительно в течение 6,25 дней, приблизительно в течение 6,5 дней, приблизительно в течение 6,75 дней, приблизительно в течение 7 дней, приблизительно в течение 7,25 дней, приблизительно в течение 7,5 дней, приблизительно в течение 7,75 дней, приблизительно в течение 8 дней, приблизительно в течение 8,25 дней, приблизительно в течение 8,5 дней, приблизительно в течение 8,75 дней, приблизительно в течение 9 дней, приблизительно в течение 9,25 дней, приблизительно в течение 9,5 дней, приблизительно в течение 9,75 дней или приблизительно в течение 10 дней).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные благоприятные эффекты повышения уровня экспрессии Zscan4 (например, экспрессии белка Zscan4) в человеческих клетках могут быть усилены путем повторного временного повышения уровня экспрессии Zscan4. В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, агент согласно изобретению, повышающий уровень экспрессии Zscan4 (например, экспрессии белка Zscan4) в человеческих клетках, может быть использован для повторного временного повышения уровня экспрессии Zscan4 в человеческих клетках через каждые 4 часа, через каждые 8 часов, через каждые 12 часов, через каждые 16 часов, через каждые 24 часа, через каждые 32 часа, через каждые 40 часов, через каждые 48 часов, через каждые три дня, через каждые четыре дня, через каждые пять дней, через каждые шесть дней, через каждую неделю, через каждые две недели, через каждые три недели, через каждые четыре недели, через каждый месяц, через каждые два месяца, через каждые три месяца, через каждые четыре месяца, через каждые шесть месяцев, через каждые семь месяцев, через каждые восемь месяцев, через каждые девять месяцев, через каждые 10 месяцев, через каждые 11 месяцев, через каждый год, через каждые два года, через каждые три года, через каждые четыре года, через каждые пять лет, через каждые шесть лет, через каждые семь лет, через каждые восемь лет, через каждые девять лет, через каждые 10 лет, через каждые 11 лет, через каждые 12 лет, через каждые 13 лет, через каждые 14 лет, через каждые 15 лет, через каждые 16 лет, через каждые 17 лет, через каждые 18 лет, через каждые 19 лет, через каждые 20 лет, через каждые 21 год, через каждые 22 года, через каждые 23 года, через каждые 24 года, через каждые 25 лет, через каждые 26 лет, через каждые 27 лет, через каждые 28 лет, через каждые 29 лет, через каждые 30 лет, через каждые 35 лет, через каждые 40 лет, через каждые 45 лет или через каждые 50 лет.

Как описано в настоящей заявке, человеческие клетки обычно не экспрессируют белок ZSCAN в любом достаточном количестве. Таким образом, агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, способствуют повышению уровня экспрессии белка Zscan4 в обработанных клетках. В некоторых вариантах осуществления изобретения, обработка человеческих клеток агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4, может приводить к повышению уровня экспрессии белка Zscan4 по меньшей мере в 1,5-1000000 раз.

В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, агент согласно изобретению, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, способствует повышению уровня экспрессии белка Zscan4 по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 1,6 раза, по меньшей мере в 1,7 раза, по меньшей мере в 1,8 раза, по меньшей мере в 1,9 раза, по меньшей мере в 2,0 раза, по меньшей мере в 2,1 раза, по меньшей мере в 2,15 раза, по меньшей мере в 2,2 раза, по меньшей мере в 2,25 раза, по меньшей мере в 2,3 раза, по меньшей мере в 2,35 раза, по меньшей мере в 2,4 раза, по меньшей мере в 2,45 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 2,55 раза, по меньшей мере в 3,0 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4,0 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, по меньшей мере в 5,0 раза, по меньшей мере в 5,5 раза, по меньшей мере в 6,0 раза, по меньшей мере в 6,5 раза, по меньшей мере в 7,0 раза, по меньшей мере в 7,5 раза, по меньшей мере в 8,0 раза, по меньшей мере в 8,5 раза, по меньшей мере в 9,0 раза, по меньшей мере в 9,5 раза, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, по меньшей мере в 400 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 600 раз, по меньшей мере в 700 раз, по меньшей мере в 800 раз, по меньшей мере в 900 раз, по меньшей мере в 1000 раз, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, по меньшей мере в 4000 раз, по меньшей мере в 5000 раз, по меньшей мере в 6000 раз, по меньшей мере в 7000 раз, по меньшей мере в 8000 раз, по меньшей мере в 9000 раз, по меньшей мере в 10000 раз, по меньшей мере в 25000 раз, по меньшей мере в 50000 раз, по меньшей мере в 75000 раз, по меньшей мере в 100000 раз, по меньшей мере в 125000 раз, по меньшей мере в 150000 раз, по меньшей мере в 175000 раз, по меньшей мере в 200000 раз, по меньшей мере в 225000 раз, по меньшей мере в 250000 раз, по меньшей мере в 275000 раз, по меньшей мере в 300000 раз, по меньшей мере в 325000 раз, по меньшей мере в 350000 раз, по меньшей мере в 375000 раз, по меньшей мере в 400000 раз, по меньшей мере в 425000 раз, по меньшей мере в 450000 раз, по меньшей мере в 475000 раз, по меньшей мере в 500000 раз, по меньшей мере в 525000 раз, по меньшей мере в 550000 раз, по меньшей мере в 575000 раз, по меньшей мере в 600000 раз, по меньшей мере в 625000 раз, по меньшей мере в 650000 раз, по меньшей мере в 675000 раз, по меньшей мере в 700000 раз, по меньшей мере в 725000 раз, по меньшей мере в 750000 раз, по меньшей мере в 775000 раз, по меньшей мере в 800000 раз, по меньшей мере в 825000 раз, по меньшей мере в 850000 раз, по меньшей мере в 875000 раз, по меньшей мере в 900000 раз, по меньшей мере в 925000 раз, по меньшей мере в 950000 раз, по меньшей мере в 975000 раз, или по меньшей мере в 1000000 раз, например, по сравнению с уровнем экспрессии белка Zscan4 в человеческих клетках, которые не контактировали с этим агентом.

Для определения уровня экспрессии белка Zscan4 в клетке или для оценки количества белка (то есть стехиометрической оценки белка) на клетку может быть применен любой метод, известный специалистам и описанный в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения, не все клетки в клеточной популяции или клетки индивидуума, которому был введен данный агент, будут подвергаться воздействию этого агента. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых агентом является вирусный вектор, экспрессирующий Zscan4, этот вирусный вектор может не инфицировать каждую клетку в популяции обработанных клеток или у индивидуума. Таким образом, используемый здесь термин «кратное увеличение» уровня экспрессии белка Zscan4 означает среднее увеличение уровня экспрессии белка Zscan4 в клетках обработанной популяции или в клетках индивидуума, подвергаемых воздействию этого агента. Так, например, в тех вариантах осуществления изобретения, в которых агентом является вирусный вектор, такое кратное увеличение уровня экспрессии белка Zscan4 может означать среднее увеличение уровня экспрессии белка Zscan4 в инфицированных клетках обработанной популяции или у индивидуума.

Полинуклеотиды Zscan4

В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4, является молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок Zscan4. Термин «полинуклеотид» может означать последовательность нуклеиновой кислоты (такую как линейная последовательность) любой длины. Поэтому, полинуклеотид включает олигонуклеотиды, а также генные последовательности, присутствующие в хромосомах. Олигонуклеотид представляет собой множество нуклеотидов, связанных друг с другом природными фосфодиэфирными связями. Олигонуклеотидом является полинуклеотид, длина которого составляет от 6 до 300 нуклеотидов. Термин «олигонуклеотидный аналог» означает молекулы, которые имеют функцию, аналогичную функции олигонуклеотидов, но, при этом, содержат неприродные части. Так, например, олигонуклеотидные аналоги могут содержать неприродные части, такие как модифицированные сахарные группы или межсахарные связи, такие как фосфортиоатный олигодезоксинуклеотид. Функциональные аналоги природных полинуклеотидов могут связываться с РНК или ДНК, и такими аналогами являются молекулы нуклеиновой кислоты, связанной с пептидом (PNA).

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид Zscan4, называются полинуклеотидами или молекулами нуклеиновой кислоты Zscan4. Эти полинуклеотиды включают последовательности ДНК, кДНК и РНК, такие как последовательности мРНК, кодирующие Zscan4. Следует отметить, что все полинуклеотиды, кодирующие полипептид Zscan4, также входят в объем настоящего изобретения, при условии, что они кодируют полипептид, обладающий известной активностью Zscan4, такой как способность модулировать стабильность генома или длину теломеры. Термин «стабильность генома» может означать способность клетки осуществлять «правильную» репликацию ДНК и поддерживать целостность ДНК под действием механизма репликации. Считается, что длинные теломеры играют роль буфера, защищающего клетку от старения, и, по существу, сохраняющего стабильность генома и общее нормальное состояние клетки. Стабильность хромосомы (например, незначительное количество мутаций и отсутствие хромосомной реаранжировки или изменения числа хромосом) также ассоциируется со стабильностью генома. Потеря стабильности генома ассоциируется с развитием рака, нервными расстройствами и преждевременным старением. Признаками нестабильности генома являются увеличенное число мутаций, значительное число хромосомных реаранжировок, изменение числа хромосом и укорочение теломер.

Последовательности нуклеиновой кислоты Zscan4 были ранее описаны в литературе (см., например, заявку WO 2008/118957, описание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки; Falco et al., Dev. Biol. 307(2):539-550, 2007; и Carter et al., Gene Expr. Patterns. 8(3): 181-198, 2008). Нуклеиновыми кислотами Zscan4 могут быть, но не ограничиваются ими, любая нуклеиновая кислота одной из групп мышиных генов Zscan4, экспрессия которых является специфичной для эмбрионов на 2-клеточной стадии и для ЭC-клеток (включая Zscan4a, Zscan4b, Zscan4c, Zscan4d, Zscan4e и Zscan4f), человеческий ортолог ZSCAN4 или ортолог Zscan4 любых других видов.

Как описано в настоящей заявке, нуклеотидная последовательность мышиного гена Zscan4a представлена в SEQ ID NO: 1, нуклеотидная последовательность мышиного гена Zscan4b представлена в SEQ ID NO: 2, нуклеотидная последовательность мышиного гена Zscan4c представлена в SEQ ID NO: 3, нуклеотидная последовательность мышиного гена Zscan4d представлена в SEQ ID NO: 4, нуклеотидная последовательность мышиного гена Zscan4e представлена в SEQ ID NO: 5, а нуклеотидная последовательность мышиного гена Zscan4f представлена в SEQ ID NO: 6. Кроме того, нуклеотидная последовательность человеческого гена ZSCAN4 представлена в SEQ ID NO: 7.

Последовательности нуклеиновой кислоты Zscan4 животных других видов являются общедоступными, и такими последовательностями являются собачий Zscan4 (GenBank Accession Nos. XM.sub.-541370.2 и XM.sub.-848557.1; SEQ ID NO: 8); коровий Zscan4 (GenBank Accession No. XM.sub.-001789250.1; SEQ ID NO: 9); лошадиный Zscan4 (GenBank Accession No. XM.sub.-001493944.1; SEQ ID NO: 10); Zscan4 гориллы (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. A1YEQ9; SEQ ID NO: 21); Zscan4 бонобо (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. A1YFX5; SEQ ID NO: 22); Zscan4 орангутанга острова Борнео (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. A2T7G6; SEQ ID NO: 23); Zscan4 орангутанга острова Суматра (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. H2P0E3; SEQ ID NO: 24); Zscan4 панды (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. G1LE29; SEQ ID NO: 25); Zscan4 свиньи (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. F1SCQ2; SEQ ID NO: 26); Zscan4 северного белощекого гиббона (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. G1RJD4; SEQ ID NO: 27); Zscan4 макак-резуса (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. F7GH55; SEQ ID NO: 28); Zscan4 морских свинок (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. H0V5E8; SEQ ID NO: 29); и Zscan4 тринадцатиполосного суслика (нуклеотидная последовательность UniProt Accession No. I3N7T3; SEQ ID NO: 30). Каждый из вышеперечисленных регистрационных номеров GenBank Accession вводится в настоящее описание посредством ссылки и был зарегистрирован в базе данных GenBank 11 августа, 2009. Каждый из вышеперечисленных регистрационных номеров UniProt Accession вводится в настоящее описание посредством ссылки и был зарегистрирован в базе данных UniProt 15 марта, 2013.

В конкретном примере, Zscan4 представляет собой мышиный Zscan4c или человеческий ZSCAN4. Нуклеиновыми кислотами Zscan4 могут быть также, но не ограничиваются ими, нуклеиновые кислоты Zscan4 или их гомологи, кодирующие полипептид Zscan4, которые обладают способностью повышать стабильность генома и/или увеличивать длину теломеры.

Фрагменты и варианты полинуклеотидов Zscan4 могут быть легко получены специалистами с применением молекулярных методов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фрагмент полинуклеотида Zscan4 включает по меньшей мере 250, по меньшей мере 500, по меньшей мере 750, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 1500 или по меньшей мере 2000 смежных нуклеиновых кислот полинуклеотида Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фрагмент Zscan4 представляет собой фрагмент, который, при его экспрессии в представляющей интерес клетке, сообщает этой клетке Zscan4-функцию, такую как, но не ограничивающуюся ими, повышенная стабильность генома и/или увеличенная длина теломеры.

Небольшие модификации полинуклеотидных последовательностей Zscan4 могут индуцировать экспрессию пептидов, которые обладают активностью, по существу, эквивалентной активности пептидов, кодируемых описанными здесь немодифицированными полинуклеотидными аналогами. Такие модификации могут быть искусственными, например, созданными посредством сайт-направленного мутагенеза, либо они могут быть спонтанными. Все полинуклеотиды, продуцируемые путем введения этих модификаций, входят в объем настоящего изобретения.

Полинуклеотиды Zscan4 могут включать рекомбинантную ДНК, которая была введена в вектор; в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус; или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая присутствует в виде отдельной молекулы (например, кДНК) независимо от других последовательностей. Нуклеотидами могут быть рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или модифицированные формы любого из этих нуклеотидов. Этот термин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. Рекомбинантной нуклеиновой кислотой или рекомбинантным полипептидом являются нуклеиновая кислота или полипептид, которые имеют неприродную последовательность или последовательность, полученную путем создания искусственной комбинации из двух отличающихся друг от друга отдельных сегментов последовательности. Такую искусственную комбинацию часто получают путем химического синтеза или путем искусственной модификации выделенных сегментов нуклеиновых кислот, например, методами генной инженерии.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, вырожденный вариант любого из описанных здесь полинуклеотидов Zscan4 может быть использован в способах согласно изобретению. Термин «вырожденный вариант» может означать полинуклеотид, кодирующий полипептид, такой как полипептид Zscan4, включающий последовательность, которая является вырожденной вследствие вырожденности генетического кода. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых характеризуются тем, что они кодируются более, чем одним кодоном. Поэтому, в настоящее изобретение могут быть включены все вырожденные нуклеотидные последовательности, при условии, что аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью, будет оставаться неизменной.

Zscan4-кодирующая последовательность может быть функционально присоединена к гетерологичному промотору для прямой транскрипции Zscan4-кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты. Термин «промотор» может означать регуляторные последовательности нуклеиновой кислоты, ответственные за прямую транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промотор включает необходимые последовательности нуклеиновой кислоты, расположенные поблизости от сайта инициации транскрипции. Промотор также включает, но необязательно, дистальные энхансерные или репрессорные элементы. Конститутивный промотор представляет собой промотор, который всегда является активным и не подвергается регуляции внешними сигналами или молекулами. В противоположность этому, активность индуцибельного промотора регулируется внешним сигналом или внешней молекулой (например, фактором транскрипции). Первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально присоединена ко второй последовательности нуклеиновой кислоты, если первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Так, например, промотор считается функционально присоединенным к кодирующей последовательности, если он влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Вообще говоря, функционально присоединенные последовательности нуклеиновой кислоты являются смежными, и там, где это необходимо, они связаны с двумя белок-кодирующими областями в одной и той же рамке считывания. Термин «гетерологичный полипептид или полинуклеотид» означает полипептид или полинуклеотид, происходящий от различных источников или видов. Промотор включает необходимые последовательности нуклеиновой кислоты, расположенные поблизости от сайта инициации транскрипции, а в случае промотора полимеразы типа II, такой последовательностью является элемент TATA. Промотор также включает, но необязательно, дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены от сайта инициации транскрипции на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований. Одним из примеров может служить конститутивный промотор, такой как CAG-промотор (Niwa et al., Gene 108(2): 193-9, 1991), или промотор фосфоглицерат-киназы (PGK). В некоторых вариантах осуществления изобретения, промотором является индуцибельный промотор, такой как промотор, индуцируемый тетрациклином (Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005). Другими репрезентативными промоторами, которые могут быть использованы для инициации экспрессии Zscan4, являются, но не ограничиваются ими, система lac, система trp, система tac, система trc, основной оператор и промоторные области фага лямбда, регуляторная область оболочечного белка fd, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы, происходящие от вируса полиомы, аденовируса, ретровируса, бакуловируса и обезьяньего вируса, промотор 3-фосфоглицерат-киназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей и промотор факторов скрещивания дрожжей альфа. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется нативный промотор Zscan4. Полинуклеотиды Zscan4 согласно изобретению могут находиться под контролем конститутивного промотора, индуцибельного промотора или любого подходящего промотора, описанного в настоящей заявке, или другого подходящего промотора, известного специалистам.

Термин «идентичность или сходство последовательностей» означает идентичность/сходство между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты или между двумя или более аминокислотными последовательностями. Идентичность последовательностей может быть измерена как процент идентичности, то есть чем выше процент, тем более идентичными являются последовательности. Сходство последовательностей может быть измерено как процент сходства (с учетом консервативных аминокислотных замен), то есть чем выше процент, тем более сходными являются последовательности. Гомологи или ортологи последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей имеют относительно высокую степень идентичности/сходства последовательностей при их выравнивании стандартными методами. Такая гомология является более высокой, если ортологичные белки или кДНК происходят от близкородственных видов (таких как человеческие и мышиные последовательности), по сравнению с ортологичными белками или кДНК, происходящими от дальнородственных видов (таких как человеческие последовательности и последовательности C. elegans).

Термины «идентичный» или «процент идентичности», употребляемые по отношению к двум или более последовательностям (например, последовательностям нуклеиновой кислоты или аминокислотным последовательностям), означают, что две или более последовательностей или подпоследовательностей являются одинаковыми. Две последовательности являются, по существу, идентичными, если они имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (то есть если они являются идентичными на 29%, и необязательно на 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% по всей конкретной области, или, если это не оговорено особо, то по всей последовательности) при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в «окне» сравнения или в обозначенной области, измеряемой с использованием одного из описанных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем выравнивания последовательностей вручную и их визуальной оценки.

Для сравнения последовательностей, одну последовательность обычно принимают за эталонную, и с этой последовательностью сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей, тестируемые последовательности и эталонную последовательность вводят в компьютер, устанавливают координаты подпоследовательностей, если это необходимо, и устанавливают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. При этом, могут быть использованы параметры программы по умолчанию, либо могут быть использованы альтернативные параметры. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей вычисляют процент идентичности тестируемых последовательностей и эталонной последовательности исходя из параметров программы. При сравнении двух последовательностей на идентичность, необязательно, чтобы сравниваемые последовательности были непрерывными, но для вычисления общего процента идентичности, на любой пробел должен быть наложен «штраф». Для алгоритма blastp, параметрами по умолчанию являются «штраф» на пробел-пропуск=11, а «штраф» на пробел-удлинение=1. Для алгоритма blastn, параметрами по умолчанию являются «штраф» на пробел-пропуск=5, а «штраф» на пробел-удлинение=2.

«Окно сравнения» может включать в качестве эталона сегмент из любого числа смежных положений, включая, но не ограничиваясь ими, от 20 до 600, обычно приблизительно от 50 до 200, а чаще всего приблизительно от 100 до 150, где последовательность может сравниваться с эталонной последовательностью, имеющей то же самое число смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Методы выравнивания сравниваемых последовательностей хорошо известны специалистам. Оптимальное выравнивание сравниваемых последовательностей может быть осуществлено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Уотермана (1981); с помощью алгоритма выравнивание гомологичных последовательностей Нидлмана и Вюнша (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453); путем поиска сходства по методу Пирсона и Липмана (Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448); путем компьютерной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA в пакете компьютерных программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или путем выравнивания последовательностей вручную и их визуальной оценки [см., например, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)].

Двумя примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в руководствах Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402 и Altschul et al. (1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410, соответственно. Компьютерная программа для проведения анализов BLAST является общедоступной и имеется на сайте Национального центра биотехнологической информации. Этот алгоритм включает сначала идентификацию пар последовательностей с высокой оценкой (HSP) путем определения коротких «слов» длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторым пороговым оценкам Т с положительным значением при выравнивании со «словом» той же самой длины в последовательности базы данных. T означает пороговую величину оценки соседнего слова (Altschul et al., см. выше). Эти первоначальные наилучшие оценки соседнего слова играют роль «затравки» для инициации поиска более длинных «слов», содержащих эти HSP-«слова». Такое слово с высокой оценкой удлиняют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличена кумулятивная оценка выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей, кумулятивные оценки вычисляют с использованием, параметров M («премия» за пару соответствующих остатков всегда >0) и N («штраф» за несоответствующие остатки всегда <0). Для аминокислотных последовательностей, вычисление кумулятивной оценки осуществляют с использованием оценочной матрицы. Удлинение «слов» с высокой оценкой в каждом направлении прекращают, если: кумулятивная оценка выравнивания снижается на величину X от ее максимально достигнутого значения; кумулятивная оценка доходит до 0 или ниже, что обусловлено накоплением одного или более выравниваний остатков с отрицательную оценкой; или достигается конец любой из последовательностей. С использованием параметров алгоритма BLAST, W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Для аминокислотных последовательностей, в программе BLASTP используются следующие параметры по умолчанию: длина «слова»=3, математическое ожидание (E)=10, а оценочная матрица BLOSUM62 [см. Henikoff & Henikoff, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22): 10915-10919] имеет следующие параметры: выравнивание (B)=50, математическое ожидание (E)=10, M=5, N=-4, и сравнение обеих цепей. Для нуклеотидных последовательностей, в программе BLASTN используются следующие параметры по умолчанию: длина «слова» (W)=11, математическое ожидание (E)=10, M=5, N=-4, и сравнение обеих цепей.

С помощью алгоритма BLAST можно также осуществлять статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877). Одним из показателей сходства, определенного с помощью алгоритма BLAST, является наименьшая сумма вероятностей (P(N)), которая является показателем случайного соответствия между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Так, например, считается, что нуклеиновая кислота имеет сходство с эталонной последовательностью, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет приблизительно менее, чем 0,2, более предпочтительно, приблизительно менее, чем 0,01, а наиболее предпочтительно, приблизительно менее, чем 0,001.

Одним из показателей того, что две молекулы нуклеиновой кислоты являются близкородственными, является способность этих двух молекул гибридоваться друг с другом в жестких условиях. Последовательности нуклеиновой кислоты, которые не имеют высокой степени идентичности, тем не менее могут кодировать идентичные или сходные (консервативные) аминокислотные последовательности, что обусловлено вырожденностью генетического кода. Изменения в последовательности нуклеиновой кислоты могут быть внесены с учетом такой вырожденности с получением множества молекул нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодирует, в основном, один и тот же белок. Альтернативным (и необязательно, общим) показателем значительной идентичности двух последовательностей нуклеиновой кислоты является способность полипептида, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, вступать в перекрестную иммунную реакцию с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой.

Кроме того, одним из показателей значительной идентичности двух полипептидов является способность первого полипептида вступать в перекрестную иммунную реакцию с антителами против второго полипептида. Таким образом, обычно считается, что полипептид, по существу, идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами.

В своих различных аспектах, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам, таким как выделенные нуклеиновые кислоты или синтетические молекулы мРНК. Выделенная нуклеиновая кислота была, в основном, отделена или очищена от других последовательностей нуклеиновой кислоты и от клеток организма, в котором эта нуклеиновая кислота присутствует в природе, то есть от другой хромосомной и внехромосомной ДНК и РНК. Таким образом, термин «выделенный» относится к нуклеиновым кислотам, очищенным стандартными методами очистки нуклеиновых кислот. Этот термин также относится к нуклеиновым кислотам, полученным путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также к химически синтезированным нуклеиновым кислотам. Аналогичным образом, выделенные белки были, в основном, отделены или очищены от других белков клеток организма, в которых такой белок присутствует в природе, и эти выделенные белки представляют собой белки, полученные путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные белки. Аналогичным образом, выделенные клетки были, в основном, отделены от клеток других типов.

В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотиды согласно изобретению включают последовательности, которые являются вырожденными, что обусловлено вырожденностью генетического кода. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых характеризуются тем, что они кодируются более, чем одним кодоном. Поэтому, в настоящее изобретение могут быть включены все вырожденные нуклеотидные последовательности, при условии, что аминокислотная последовательность полипептида Zscan4, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью, будет оставаться функционально неизменной. Полинуклеотид Zscan4 кодирует полипептид Zscan4, описанный в настоящей заявке. Репрезентативными полинуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды Zscan4, могут быть, например, нуклеотидная последовательность, происходящая от любой из SEQ ID №№: 1-10 и 21-30. Кроме того, не-человеческие гомологи человеческого ZSCAN4 могут быть использованы для повышения уровня экспрессии Zscan4 у человека с применением любых способов согласно изобретению, поскольку экспрессия таких не-человеческих гомологов Zscan4 является временной и не приводит к вырабатыванию нежелательного иммунного ответа у человека.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидом Zscan4, кодирующим полипептид Zscan4, является человеческий полинуклеотид ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидом Zscan4, кодирующим полипептид Zscan4, является мышиный полинуклеотид Zscan4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидом Zscan4, кодирующим полипептид Zscan4, является полинуклеотид Zscan4a, полинуклеотид Zscan4b, полинуклеотид Zscan4c, полинуклеотид Zscan4d, полинуклеотид Zscan4e или полинуклеотид Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидом Zscan4, кодирующим полипептид Zscan4, является собачий полинуклеотид Zscan4, коровий полинуклеотид Zscan4, лошадиный полинуклеотид Zscan4 или их гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид Zscan4, кодирующий полипептид Zscan4, включает нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, происходящей от любой из SEQ ID NO: 1-10 и 21-30.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидом Zscan4, кодирующим полипептид Zscan4, является человеческий полинуклеотид ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид Zscan4, кодирующий полипептид Zscan4, включает нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7.

Методы введения полинуклеотидов Zscan4 в человеческие клетки

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотиды Zscan4 вводят в человеческие клетки. Введение молекулы нуклеиновой кислоты или белка в клетку осуществляют любыми способами доставки молекулы нуклеиновой кислоты или белка в клетку. Так, например, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть перенесены в клетку путем трансфекции, трансдукции или электропорации. Доставка белков в клетку может быть осуществлена, например, путем присоединения белка к пептиду, проникающему в клетку, такому как пептид, имеющий домен для трансдукции белка (например, Tat ВИЧ-1) или полиаргининовую пептидную метку (Fuchs and Raines, Protein Science 14: 1538-1544, 2005). Домены для трансдукции белка могут представлять собой небольшие катионные пептиды, облегчающие проникновение более крупных молекул (белков, молекул нуклеиновой кислоты и т.п.) в клетку по механизму, не зависящему от классического эндоцитоза. Полиаргининовая пептидная метка может представлять собой короткий пептид (в основном, из 7-11 остатков), состоящий из аргининовых остатков, облегчающих доставку более крупных молекул (таких как белки и молекулы нуклеиновой кислоты) в клетки (см., например, Fuchs and Raines, Protein Science 14: 1538-1544, 2005).

Введение полинуклеотидов Zscan4 в человеческие клетки может включать применение вирусного вектора (такого как интегрирующиеся или неинтегрирующиеся вирусные векторы) или плазмидного вектора, доставку молекул мРНК, кодирующих полинуклеотиды Zscan4, или прямую доставку белков Zscan4. Каждый из этих методов описан в литературе, а поэтому известен специалистам в данной области. Краткое описание каждого метода, который может быть применен для доставки Zscan4 в человеческую клетку, приводится в настоящей заявке. Вектор может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая, при ее введении в клетку-хозяина, будет стимулировать продуцирование трансформированной клетки-хозяина. Вектор может включать последовательности нуклеиновой кислоты, позволяющие этому вектору реплицироваться в клетке-хозяине, такие как ориджин репликации (последовательности ДНК, участвующие в инициации синтеза ДНК). Так, например, экспрессионный вектор содержит регуляторные последовательности, необходимые для транскрипции и трансляции встроенного гена или встроенных генов. Вектор может также включать один или более селективных маркерных генов и других генетических элементов, известных специалистам. Векторами могут быть, например, вирусные векторы и плазмидные векторы.

Промоторные последовательности Zscan4 и экспрессионные векторы

Экспрессионный вектор, включающий промоторную последовательность Zscan4, функционально присоединенную к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид (к такой последовательности, как репортерный ген), может быть использован для идентификации клеток, экспрессирующих Zscan4. Методы детектирования экспрессии репортерного гена варьируются в зависимости от типа репортерного гена и хорошо известны специалистам. Так, например, при использовании флуоресцентного репортера, детектирование экспрессии может быть достигнуто с помощью FACS или флуоресцентной микроскопии. Идентификация человеческих клеток, экспрессирующих Zscan4, может быть достигнута альтернативными методами, включая, но не ограничиваясь ими, методы с использованием антител, специфичных к Zscan4, или методы гибридизации in situ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты (такая как репортерная молекула) экспрессируется под контролем промотора Zscan4 (например, в векторе). Промотор Zscan4 может представлять собой промоторную последовательность, регулирующую экспрессию эндогенного полинуклеотида Zscan4, описанного в настоящей заявке. Идентификация промоторов Zscan4 хорошо известна специалистам и описана в настоящей заявке. Другие последовательности регуляции экспрессии, включая соответствующие энхансеры, терминаторы транскрипции, старт-кодон (то есть ATG), находящийся перед белок-кодирующим геном, сигналы сплайсинга для интронов и стоп-кодоны могут быть включены в экспрессионный вектор вместе с промотором Zscan4. Вообще говоря, этот промотор включает по меньшей мере минимальную последовательность, достаточную для прямой транскрипции гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует репортерную молекулу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты (такую как репортерная молекула) вводят в геномную ДНК индивидуума, Например, путем гомологичной рекомбинации. Так, например, кодирующая последовательность GFP может быть встроена в кодирующую область Zscan4, либо кодирующая область Zscan4 может быть заменена этой последовательностью так, чтобы GFP экспрессировался на таком же уровне, как и эндогенный Zscan4. Методы «выключения» экспрессии гена («нокаута» гена), осуществляемые посредством гомологичной рекомбинации, хорошо известны специалистам.

Гетерологичный белок, кодируемый гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, обычно представляет собой репортерную молекулу, такую как маркер, фермент, флуоресцентный белок, полипептид, сообщающий клетке резистентность к антибиотику, или антиген, который может быть идентифицирован стандартными методами молекулярной биологии. Репортерные молекулы могут быть использованы для идентификации представляющей интерес клетки или популяции клеток, таких как человеческие клетки, которые были подвергнуты приведению в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гетерологичным белком является флуоресцентный маркер (такой как белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра или его вариант, например, Emerald (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)); антигенный маркер (такой как человеческий гормон роста, человеческий инсулин, человеческие антигены HLA); маркер клеточной поверхности (такой как CD4 или любой рецептор клеточной поверхности); или ферментный маркер (такой как lacZ, щелочная фосфатаза). Экспрессия репортерного гена указывает на то, что клетка экспрессирует Zscan4. Методы детектирования экспрессии репортерного гена варьируются в зависимости от типа репортерного гена и хорошо известны специалистам. Так, например, при использовании флуоресцентного репортера, детектирование экспрессии может быть достигнуто с помощью FACS или флуоресцентной микроскопии.

Экспрессионные векторы обычно содержат ориджин репликации, а также специфические гены, позволяющие осуществлять фенотипический отбор трансформированных клеток, такие как ген резистентности к антибиотику. Векторы, подходящие для использования в настоящем изобретении, хорошо известны специалистам, и такими векторами являются вирусные векторы и плазмидные векторы (такие как векторы, описанные в настоящей заявке). В некоторых вариантах осуществления изобретения, энхансер расположен выше промотора Zscan4, но энхансерные элементы могут находиться в любом положении вектора, и при этом они также обладают энхансерным действием. Однако, по мере увеличения расстояния энхансера от промотора, уровень повышения активности обычно снижается. Кроме того, две или более копий энхансерной последовательности могут быть функционально присоединены друг к другу, что будет приводить к еще большему повышению промоторной активности.

Экспрессионные векторы, включающие промотор Zscan4, могут быть использованы для трансфекции клеток-хозяев, таких как, например, человеческие клетки. Биологически функциональные вирусные и плазмидные ДНК-векторы, способные экспрессироваться и реплицироваться в хозяине, известны специалистам, и могут быть использованы для трансфекции любой представляющей интерес клетки. Термин «клетка-хозяин» может означать клетки, в которых вектор может амплифицироваться и экспрессировать ДНК. Этот термин также включает любое потомство клеток-хозяев индивидуума. Совершенно очевидно, что потомство не может быть полностью идентично родительской клетке, поскольку в процессе репликации могут возникать мутации. Однако, такое потомство также входит в определение используемого здесь термина «клетка-хозяин».

Термин «трансфецированная клетка» может означать клетку-хозяина, в которую (или в ее предшественника) была введена молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула ДНК), такая как молекула ДНК, включающая промоторный элемент Zscan4. Термин «способ трансфекции» или «трансфекция» может означать способ введения нуклеиновой кислоты в клетку или в ткань. Трансфекция может быть осуществлена любыми методами, такими как, но не ограничивающимися ими, трансфекция, опосредуемая липосомами, электропорация и инжекция. Трансфекция клетки-хозяина рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты может быть осуществлена стандартными методами, хорошо известными специалистам. Термин «трансфекция» может включать трансфекцию, опосредуемую липосомами, электропорацию, инжекцию или любой другой подходящий метод введения молекулы нуклеиновой кислоты в клетку.

Вирусные векторы

В некоторых вариантах осуществления изобретения, векторами, используемыми в способах согласно изобретению, являются вирусные векторы. Различные вирусные векторы известны специалистам и описаны в настоящей заявке.

В способах согласно изобретению могут быть использованы парамиксовирусы. Парамиксовирусный вектор может включать, но не ограничивается ими, вектор (или носитель), который происходит от парамиксовируса, и который используется для переноса гена, такого как полинуклеотид Zscan4, в клетки-хозяева, такие как человеческие клетки. Парамиксовирусным вектором может быть рибонуклеопротеин (RNP) или вирусная частица, обладающая инфективностью. Термин «инфективность» может означать способность парамиксовирусного вектора переносить, посредством клеточной адгезии и мембранного слияния, ген, содержащийся в этом векторе, в клетки, в которые проникает этот вектор. Парамиксовирусный вектор может обладать способностью к репликации, либо он может представлять собой дефектный вектор, не обладающий способностью к репликации. Термин «способность к репликации» может означать способность парамиксовирусных векторов реплицироваться в клетках-хозяевах, инфицированных вирусными векторами и продуцировать инфекционные вирусные частицы в этих клетках. (См., например US 2004/0005296).

Парамиксовирус представляет собой вирус, принадлежащий к семейству Paramyxoviridae, или его производное. Парамиксовирусами могут быть, но не ограничиваются ими, вирусы, принадлежащие к семейству Paramyxoviridae, такие как вирус Сендай, вирус ньюкаслской болезни, вирус паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус, вирус чумы рогатого скота, вирус чумы собак, обезьяний вирус парагриппа (SV5) и человеческий вирус парагриппа типа I, II и III. Используемый здесь вирусный вектор может быть получен на основе вируса рода Paramyxovirus или его производного. Используемый здесь вирусный вектор может быть получен на основе различных парамиксовирусов, включая, но не ограничиваясь ими, человеческий вирус парагриппа типа I (HPI-V-1), человеческий вирус парагриппа типа III (HPIV-3), бычий вирус парагриппа типа III (BPIV-3), вирус Сендай (также называемый «мышиным вирусом парагриппа типа I») или обезьяний вирус парагриппа типа x (SPIV-10). Эти вирусы могут представлять собой природные штаммы, штаммы дикого типа, мутантные штаммы, пассированные лабораторные штаммы или искусственно созданные штаммы. Неполные вирусы, такие как, например, частица DI (Willenbrink W. & Neubert W. J., J. Virol., 1994, 68, 8413-8417) и синтезированные олигонуклеотиды могут быть также использованы в качестве материала для получения используемого здесь парамиксовирусного вектора. (См., например US 2004/0005296).

Генами, кодирующими белки парамиксовируса, являются гены NP, P, M, F, HN и L. Гены NP, P, M, F, HN и L представляют собой гены, кодирующие нуклеокапсидный белок, фосфопротеин, белок матрикса, гибридный белок, гемаглютинин-нейраминидазу и крупный белок, соответственно. Ген NP может также обозначаться как ген N. Вышеупомянутые белки парамиксовируса хорошо известны специалистам. Так, например, регистрационными номерами для каждого гена вируса Сендай, классифицированного, например, как респировирус семейства Paramyxoviridae в базе данных нуклеотидных последовательностей, являются M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046 и X17218 для гена NP; M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007 и X17008 для гена P; D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584 и X53056 для гена M; D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152 и X02131 для гена F; D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808 и X56131 для гена HN; и D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587 и X58886 для гена L. (См., например US 2004/0005296). Следует отметить, что используемые здесь векторы на основе парамиксовируса, такие как векторы на основе вируса Сендай, могут включать модификации, такие как делеции эндогенных вирусных белков.

Вирусные векторы на основе парамиксовируса являются подходящими для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. Поскольку парамиксовирусные векторы не являются патогенными для человека, то очевидно, что они могут оказаться предпочтительными для использования в клинических испытаниях на безопасность при их применении в генотерапии. Главным препятствием в высокоэффективном переносе гена, в большинстве случаев, является то, что ДНК должна быть транспортирована в ядро, либо ядерная мембрана должна быть удалена для осуществления экспрессии экзогенного гена в плазмидной ДНК или т.п. Однако, в случае вируса Сендай, экспрессия экзогенного гена запускается клеточным тубулином и его РНК-полимеразой (белком L) в цитоплазме при репликации вирусов. Это дает основание предположить, что вирус Сендай не взаимодействует с хромосомами клеток-хозяев, что позволяет избежать риска малигнизации и иммортализации клеток. Кроме того, известно, что вирус Сендай является патогенным у грызунов и вызывает у них пневмонию, но он не является патогенным для человека, что было подтверждено в испытаниях, которые показали, что интраназальное введение вируса Сендай дикого типа приматам, не являющимся человеком, не приводило к негативным последствиям (Hurwitz J. L. et al., Vaccine, 1997, 15, 533-540). Полученные результаты дают основание предположить, что вектор на основе вируса Сендай может быть использован в медицине, и кроме того, было подтверждено, что векторы на основе вируса Сендай могут оказаться перспективными средствами, в частности, для их применения в целях приведения человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках (см., например US 2004/0005296). В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, вирусным вектором является вектор на основе вируса Сендай. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вектором Сендай является термочувствительный вектор Сендай. Так, например, термочувствительный вектор Сендай TS15 является функциональным при 35°C, но он может быть инактивирован путем культивирования при 37°C (см., например, Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2011; 108(34): 14234-14239). Примерами других термочувствительных векторов Сендай являются, но не ограничиваются ими, векторы Сендай TS7 и TS13, которые являются функциональными при 32°C, 35°C и 37°C, но могут быть инактивированы путем их культивирования при 38°C или 39°C (см., например, Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2011; 108(34):14234-14239). Для экспрессии Zscan4 согласно изобретению может быть также использован любой другой вариант вектора Сендай, известный специалистам.

Кроме того, в настоящей заявке могут быть также использованы ретровирусные векторы (например, векторы на основе вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV)) (см., например Takahashi et al., Cell 126:663-666, 2006; Takahashi et al., Cell 31:861-872, 2007; Okita et al., Nature 313-317, 2007; Park et al., Nature 451: 141-146; публикацию заявки на патент США No. 2009/0047263). Исследования с использованием векторов на основе лентивирусов (Brambrink et al., Cell Stem. Cell 2: 151-159, 2008; Wernig et al., Nat. Biotechnol. 26:916-924, 2008; Stadtfeld et al., Science 322:945-949, 2008) продемонстрировали преимущество этих векторов, как векторов, способных инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и, тем самым, повышать скорость трансдукции в клетки. Кроме того, лентивирусы могут быть псевдотипированы для расширения тропизма вирусов. Так, например, псевдотипирование гликопротеином вируса везикулярного стоматита (VSVg) позволяет инфицировать клетки широкого ряда (Lai et al., J. Assist Reprod. Genet. 28(4):291-301, 2011). Лентивирусы также способны к конститутивной и индуцибельной экспрессии белков. Примеры экспрессионных систем лентивирусов, индуцируемых лекарственными средствами, описаны Hockmeyer et al. (Cell Stem. Cell 3:346-353, 2008) и Wernig et al. (Nat. Biotechnol. 26:916-924, 2008).

Лентивирусами являются, но не ограничиваются ими, вирус иммунодефицита человека (такой как ВИЧ-1 и ВИЧ-2), вирус кошачьего иммунодефицита, вирус лошадиной инфекционной анемии и вирус обезьяньего иммунодефицита. Другими ретровирусами являются, но не ограничиваются ими, человеческий T-лимфотропный вирус, обезьяний T-лимфотропный вирус, вирус мышиного лейкоза, вирус коровьего лейкоза и вирус кошачьего лейкоза. Методы получения ретровирусных и лентивирусных векторов и их применения подробно описаны в литературе (см., например, патенты США №№. 7211247; 6979568; 7198784; 6783977 и 4980289).

Для доставки молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих белки, в клетки, могут быть также использованы неинтегрирующиеся вирусные векторы, такие как аденовирусные векторы. Так, например, аденовирусные векторы, которые сохраняются в клетках в эписомной форме, были с успехом использованы для доставки белков в мышиные фибробласты и в клетки печени (Stadtfeld et al., Science 322:945-949, 2008).

В некоторых вариантах осуществления изобретения используются векторы, содержащие промоторные и энхансерные области SV40 или длинный концевой повтор (LTR) вируса саркомы Рауса и сигнал полиаденилирования и сплайсинга SV40 (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072-6; Gorman et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6777-81). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вектором является вирусный вектор, такой как аденовирусный вектор или аденоассоциированный вирус (AAV), такой как вирус, описанный в патенте США No. 4797368 (Carter et al.) и в публикации McLaughlin et al. (J. Virol. 62: 1963-73, 1988), вирус AAV типа 4 (Chiorini et al. J. Virol. 71:6823-33, 1997) и вирус AAV типа 5 (Chiorini et al. J. Virol. 73: 1309-19, 1999), или ретровирусный вектор (такой как вектор на основе вируса мышиного лейкоза Молони и вируса некроза селезенки, и векторы, происходящие от ретровирусов, таких как вирус саркомы Рауса, вирус саркомы Харви, вирус птичьего лейкоза, вирус иммунодефицита человека, вирус миелопролиферативной саркомы и вирус опухоли молочной железы). Могут быть также использованы и другие системы вирусной трансфекции, включая вирус коровьей оспы (Moss et al., 1987, Annu. Rev. Immunol. 5:305-24), вирус коровьей папилломы (Rasmussen et al., 1987, Methods Enzymol. 139:642-54) или члены группы герпесвирусов, такие как вирус Эпштейна-Барра (Margolskee et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2837-47). Кроме того, векторы могут содержать селективные маркеры резистентности к антибиотикам (таким как неомицин, гигромицин или микофеноловая кислота), которые позволяют проводить отбор трансфецированных клеток, обладающих способностью к стабильной длительной экспрессии векторов (а следовательно, нуклеиновой кислоты Zscan4).

Векторы могут сохраняться в клетках в виде эписомных свободно реплицирующихся молекул благодаря регуляторным элементам вирусов, таких как вирус папилломы (Sarver et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:486) или вирус Эпштейна-Барра (Sugden et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:410). Альтернативно, могут быть также продуцированы клеточные линии, в геномную ДНК которых был интегрирован вектор. Клеточные линии этих обоих типов продуцируют генный продукт в непрерывном режиме. Специалист в данной области может также получить клеточные линии, имеющие ряд амплифицированных копий вектора (а следовательно, также и кДНК), для создания клеточных линий, которые могут продуцировать высокие уровни генного продукта.

Плазмидные векторы

В некоторых случаях, во избежание интеграции в геном клетки-хозяина желательно использовать не-вирусные векторы. Таким образом, Zscan4-кодирующие полинуклеотиды могут быть доставлены в человеческие клетки с использованием одного или более плазмидных векторов. Плазмидные векторы сохраняются в эписомной форме и, по существу, экспрессируют ген в течение непродолжительного периода времени (Lai et al., J. Assist. Reprod. Genet. 28(4):291-301, 2011). Так, например, в публикации Okita et al. (Science 322:949-953, 2008) описано использование плазмиды pCX, содержащей промотор CAG, для экспрессии белков в соматических клетках.

Эписомные плазмидные векторы рассматриваются как другой вариант для введения Zscan4-кодирующих полинуклеотидов в человеческие клетки. Эписомные плазмидные векторы могут автономно реплицироваться как внехромосомные элементы, а поэтому они экспрессируют ген в клетках-мишенях в течение более длительного периода времени. Эписомный плазмидный вектор, происходящий от вируса Эпштейна-Барра (oriP/EBNA1), был использован для экспрессии белков в человеческих соматических клетках (Yu et al., Science 324:797-801, 2009).

Выбор соответствующего вектора может быть осуществлен самим специалистом. Экспрессионные векторы обычно содержат ориджин репликации, промотор и, необязательно, специфические гены, позволяющие осуществлять фенотипический отбор трансформированных клеток (например, кластер резистентности к антибиотику). Обычно, экспрессионный вектор включает промотор. Промотор может быть индуцибельным или конститутивным. Промотор может быть также тканеспецифическим. Репрезентативными промоторами являются промотор CAG, промотор тимидинкиназы (TK), промотор металлотионеина I, промотор полиэдрона, промотор нейрон-специфической энолазы, промотор тирозин-гидроксилазы, промотор бета-актина, предранний промотор CMV или другие промоторы. В вектор может быть также включен, но необязательно, энхансерный элемент, который может находиться в любом положении вектора, но, при этом, он должен обладать энхансерным действием, усиливающим экспрессию гена.

Плазмидные векторы могут быть введены в человеческие клетки любым подходящим методом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вектор доставляют в клетку путем трансфекции с использованием липида, состоящего из катионного полимера. В конкретных примерах, трансфецирующим реагентом является липофектамин (LIPOFECTAMINE™) или подобный реагент. В других примерах, доставку осуществляют с применением технологии трансфецирования в ядро (Amaxa, Cologne, Germany). Эта технология основана на методе электропорации, осуществляемом на устройстве для доставки NUCLEOFECTOR™ в целях непосредственного введения ДНК в ядро клетки-хозяина (Lakshmipathy et al., Stem Cells 22:531-543, 2004). В другом примере, трансфецирующий реагент включает сложные поли-β-аминоэфиры.

Перенос ДНК в клетки человека или другого млекопитающего осуществляют стандартным методом. Так, например, выделенная последовательность нуклеиновой кислоты Zscan4 (например, в виде «оголенной» ДНК или части экспрессионного вектора) может быть введена в клетки реципиента путем преципитации фосфатом кальция (Graham and vander Eb, 1973, Virology 52:466) или фосфатом стронция (Brash et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2013), методом электропорации (Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841), методом липофекции (Feigner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413), методом с использованием DEAE-декстрана (McCuthan et al., 1968, J. Natl. Cancer Inst. 41:351), методом микроинжекции (Mueller et al., 1978, Cell 15:579), методом слияния протопластов (Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163-7) или методом выстреливания частиц (Klein et al., 1987, Nature 327:70).

Стратегии вырезания

Может оказаться желательным вырезание экзогенных полинуклеотидов из сайтов геномной интеграции. Ранее было описано два метода вырезания, а именно, рекомбинация CreloxP и транспозиция piggyBac. В публикации Soldner et al. (Cell 136:964-977, 2009) описано использование системы Cre-lox. Эта стратегия включает позиционирование сайта loxP 3'-LTR лентивирусного вектора, который содержит Dox-индуцибельный минимальный промотор CMV, для запуска экспрессии перепрограммирующих факторов. В процессе провирусной репликации, loxP был дуплицирован в 5'-LTR, что приводило к геномной интеграции перепрограммирующих факторов, фланкированных двумя сайтами loxP. Временная экспрессия Cre-рекомбиназы приводила к вырезанию lox-фланкированных перепрограммирующих факторов.

Транспозон piggyBac может сам вырезаться в клеточном геноме без каких-либо остатков экзогенной ДНК (Elick et al., Genetica 98:33-41, 1996; Fraser et al., Insect Mol Biol 5: 141-151, 1996). С применением этого метода, более, чем два белка были успешно продуцированы в человеческих клетках путем доставки полицистронной конструкции, несущей гены, сцепленные с пептидным линкером 2A, расположенным между 5'- и 3'-концевыми повторами транспозона piggyBac. Точное вырезание интегрированных перепрограммирующих генов наблюдалось после экспрессии транспозазы (Kaji et al., Nature 458:771-775, 2009; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:9290-9295, 2008; Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369, 2009).

мРНК

Другой стратегией введения Zscan4 в человеческие клетки является доставка синтетических мРНК, кодирующих Zscan4. Было показано, что специфический белок может быть эффективно продуцирован путем трансфекции синтетической мРНК, кодирующей белок, в клетки (Warren et al., Cell Stem Cell 7(5):618-630, 2010). В исследовании, проводимом Warren et al., мРНК была модифицирована для предотвращения вырабатывания природных антивирусных ответов. Трансфекцию мРНК осуществляли несколько раз, от одного раза в день до одного раза в течение нескольких недель, в качестве компенсации за временный эффект этого метода, поскольку мРНК быстро разлагаются в клетках. Этот отличительный признак может оказаться преимущественным для Zscan4, поскольку проведение экспрессии для достижения желаемых эффектов (то есть удлинения теломер и повышения стабильности генома) требует небольшого количества времени (например, порядка от нескольких часов до нескольких дней). В некоторых вариантах осуществления изобретения, синтетические мРНК, кодирующие Zscan4, были инкапсулированы в вирусную оболочку. При этом предпочтительно, чтобы вирусная оболочка содержала оболочечные белки, распознающие рецепторы клеточной поверхности, что способствовало бы повышению эффективности доставки синтетических мРНК Zscan4 в клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, синтетические мРНК, кодирующие Zscan4, были инкапсулированы в наночастицы или в липосомы, покрытые вирусными оболочечными белками. При этом, могут быть использованы любые подходящие вирусные оболочки, известные специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вирусной оболочкой является оболочка вируса Сендай. Методы инкапсуляции полинуклеотидов, таких как синтетические мРНК, в вирусные оболочки или в вирусные оболочечные белки, хорошо известны специалистам.

Клетки, включающие полинуклеотиды Zscan4

Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты Zscan4 или Zscan4-содержащий вектор, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клеткой является человеческая клетка. Человеческая клетка может происходить от клеток любого вида. Человеческой клеткой может быть человеческая клетка любого типа, описанная в настоящей заявке.

Полипептиды Zscan4

В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4, является полипептид Zscan4. Термин «полипептид» может означать полимер, в котором мономерами являются аминокислотные остатки, связанные друг с другом амидными связями. Если аминокислотами являются альфа-аминокислоты, то может быть использован либо оптический L-изомер, либо оптический D-изомер, причем, предпочтительными являются L-изомеры. Термины «полипептид» или «белок» охватывают любую аминокислотную последовательность и модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. Термин «полипептид», в частности, охватывает природные белки, а также белки, полученные рекомбинантным методом или методом синтеза.

Различные полипептиды Zscan4 известны специалистам и могут быть использованы в методах, описанных в настоящей заявке. Для специалиста в данной области очевидно, что описанные здесь различные полипептиды Zscan4, которые сохраняют активность Zscan4, такую как способность к повышению длины теломеры и/или стабильность генома в клетке, могут быть использованы в описанных здесь методах.

Репрезентативные полипептиды Zscan4 описаны в настоящей заявке. Так, например, аминокислотная последовательность мышиного полипептида Zscan4a представлена в SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность мышиного полипептида Zscan4b представлена в SEQ ID NO: 12, аминокислотная последовательность мышиного полипептида Zscan4c представлена в SEQ ID NO: 13, аминокислотная последовательность мышиного полипептида Zscan4d представлена в SEQ ID NO: 14, аминокислотная последовательность мышиного полипептида Zscan4e представлена в SEQ ID NO: 15, а аминокислотная последовательность мышиного полипептида Zscan4f представлена в SEQ ID NO: 16. Кроме того, аминокислотная последовательность человеческого полипептида ZSCAN4 представлена в SEQ ID NO: 17.

Аминокислотные последовательности Zscan4 животных различных других видов являются общедоступными, и такими последовательностями являются собачий Zscan4 (GenBank Accession Nos. XP.sub.-541370.2 и XP.sub.-853650.1; SEQ ID NO: 18); коровий Zscan4 (GenBank Accession No. XP.sub.-001789302.1; SEQ ID NO: 19); лошадиный Zscan4 (GenBank Accession No. XP.sub.-001493994.1; SEQ ID NO: 20); Zscan4 гориллы (UniProt Accession No. A1YEQ9; SEQ ID NO: 31); Zscan4 бонобо (UniProt Accession No. A1YFX5; SEQ ID NO: 32); Zscan4 орангутанга острова Борнео (UniProt Accession No. A2T7G6; SEQ ID NO: 33); Zscan4 орангутанга острова Суматра (UniProt Accession No. H2P0E3; SEQ ID NO: 34); Zscan4 панды (UniProt Accession No. G1LE29; SEQ ID NO: 35); Zscan4 свиньи (UniProt Accession No. F1SCQ2; SEQ ID NO: 36); Zscan4 северного белощекого гиббона (UniProt Accession No. G1RJD4; SEQ ID NO: 37); Zscan4 макак-резуса (UniProt Accession No. F7GH55; SEQ ID NO: 38); Zscan4 морских свинок (UniProt Accession No. H0V5E8; SEQ ID NO: 39); и Zscan4 тринадцатиполосового суслика (UniProt Accession No. I3N7T3; SEQ ID NO: 40). Каждый из вышеперечисленных регистрационных номеров GenBank Accession вводится в настоящее описание посредством ссылки и был зарегистрирован в базе данных GenBank 11 августа, 2009. Каждый из вышеперечисленных регистрационных номеров UniProt Accession вводится в настоящее описание посредством ссылки и был зарегистрирован в базе данных UniProt 15 марта, 2013.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептидом Zscan4 является человеческий полипептид ZSCAN4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептидом Zscan4 является мышиный полипептид Zscan4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептидом Zscan4 является полипептид Zscan4a, полипептид Zscan4b, полипептид Zscan4c, полипептид Zscan4d, полипептид Zscan4e или полипептид Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептидом Zscan4 является собачий полипептид Zscan4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептидом Zscan4 является коровий полипептид Zscan4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептидом Zscan4 является лошадиный полипептид Zscan4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид Zscan4 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности, происходящей от любой из SEQ ID NO: 11-20 и 31-40.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептидом Zscan4 является человеческий полипептид ZSCAN4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид Zscan4 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.

Фрагменты и варианты полипептида Zscan4 могут быть легко получены специалистом с применением молекулярных методов. Темрин «фрагмент полипептида» может означать часть полипептида, имеющего по меньшей мере один подходящий эпитоп. Термин «функциональные фрагменты полипептида» означает все фрагменты полипептида, сохраняющие активность полипептида, такого как Zscan4. Биологически функциональные фрагменты, например, могут иметь размер, отличающийся от размера полипептидного фрагмента в пределах по меньшей мере от одного эпитопа, способного связываться с молекулой антитела, до крупного полипептида, способного участвовать в специфическом индуцировании или программировании фенотипических изменений в клетке, включая влияние на пролиферацию или дифференцировку клеток. Эпитоп представляет собой область полипептида, способную связываться с иммуноглобулином, продуцируемым в ответ на приведение в контакт с антигеном. Таким образом, в объем настоящего изобретения могут быть включены менее крупные пептиды, обладающие биологической активностью Zscan4, или консервативные варианты Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фрагмент полипептида Zscan4 включает по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450 или по меньшей мере 500 смежных аминокислот полипептида Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фрагментом Zscan4 является фрагмент, который, при его переносе в представляющую интерес клетку, сообщает Zscan4 определенную функцию, такую как, но не ограничивающуюся ими, способность повышать стабильность генома и/или увеличивать длину теломеры.

Небольшие модификации первичных аминокислотных последовательностей полипептида Zscan4 могут индуцировать образование пептидов, которые имеют активность, по существу, эквивалентную активности немодифицированных полипептидных аналогов, описанных в настоящей заявке. Такие модификации могут быть искусственными, например, созданными посредством сайт-направленного мутагенеза, либо они могут быть спонтанными. Все полипептиды, продуцируемые путем введения этих модификаций, входят в объем настоящего изобретения.

Специалист в данной области может легко получить гибридные белки, включающие представляющий интерес полипептид Zscan4 и второй полипептид. Линкер может находиться, но необязательно, между представляющим интерес полипептидом Zscan4 и вторым полипептидом. Гибридными белками являются, но не ограничиваются ими, полипептид, содержащий полипептид Zscan4 и маркерный белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения, маркерный белок может быть использован для идентификации или очистки полипептида Zscan4. Репрезентативными гибридными белками являются, но не ограничиваются ими, белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра, шесть гистидиновых остатков или myc и полипептид Zscan4.

Для специалиста в данной области очевидно, что такими вариантами, фрагментами и гибридами Zscan4, используемыми в описанных здесь методах, являются варианты, фрагменты и гибриды, сохраняющие активность Zscan4 (например, способность повышать стабильность генома и увеличивать длину теломеры или обе эти активности в человеческих клетках).

В своих различных аспектах, настоящее изобретение относится, в основном, к очищенным полипептидам. Термин «в основном, очищенный полипептид» может означать полипептид, который, по существу, не содержит других белков, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он ассоциируется в природе. В одном из вариантов осуществления изобретения, такой полипептид по меньшей мере на 50%, например, по меньшей мере на 80% не содержит других белков, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он ассоциируется в природе. В другом варианте осуществления изобретения, такой полипептид по меньшей мере на 90% не содержит других белков, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он ассоциируется в природе. В еще одном варианте осуществления изобретения, такой полипептид по меньшей мере на 95% не содержит других белков, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он ассоциируется в природе.

Полипептиды согласно изобретению, такие как полипептиды Zscan4, могут также включать консервативные замены аминокислот, составляющих этот полипептид. Термин «консервативные замены» означает замены одной аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет такой же размер, такую же гидрофобность и т.п. Примеры консервативных замен приводятся ниже.

Исходный остаток	Консервативные замены
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

Изменения в последовательности кДНК, приводящие к аминокислотным заменам, независимо от того, являются ли они консервативными или нет, должны быть минимизированы для сохранения функциональной и иммунологической идентичности кодируемого белка. Таким образом, в некоторых неограничивающих примерах, полипептид Zscan4 включает максимум две, максимум пять, максимум десять, максимум двадцать или максимум пятьдесят консервативных замен. Иммунологическая идентичность белка может быть оценена путем определения способности белка распознаваться антителом, то есть вариант, который распознается таким антителом, является иммунологически консервативным. Таким образом, любой вариант последовательности кДНК будет вводить в кодируемый полипептид предпочтительно, не более, чем двадцать, а еще более предпочтительно, менее, чем десять аминокислотных замен.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептиды Zscan4 согласно изобретению были инкапсулированы в вирусную оболочку. При этом предпочтительно, чтобы вирусная оболочка содержала оболочечные белки, распознающие рецепторы клеточной поверхности, что способствовало бы повышению эффективности доставки полипептида Zscan4 в клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептиды Zscan4 были инкапсулированы в наночастицы или в липосомы, покрытые вирусными оболочечными белками. При этом, могут быть использованы любые подходящие вирусные оболочки, известные специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вирусной оболочкой является оболочка вируса Сендай. Методы инкапсуляции полипептидов в вирусные оболочки или в вирусные оболочечные белки хорошо известны специалистам.

Клетки, включающие полипептиды Zscan4

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным клеткам, содержащим описанный здесь полипептид Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такой клеткой является человеческая клетка. Человеческая клетка может происходить от клеток любого вида. Человеческой клеткой может быть человеческая клетка любого типа, описанная в настоящей заявке.

Композиции, векторы и клетки, включающие модифицированный Zscan4

Настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим модифицированный белок Zscan4, где указанный белок был модифицирован в целях получения белка с регулируемой активностью (то есть с индуцибельной или ингибируемой активностью). Так, например, белок Zscan4 может представлять собой гибридный белок, содержащий индуцибельный рецептор или домен, связывающийся с лигандом. При этом может быть использован любой индуцибельный рецептор и/или домен, связывающийся с лигандом, известные специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, индуцибельным рецептором или доменом, связывающимся с лигандом, могут быть, но не ограничиваются ими, рецептор эстрогена (ER); мутантный рецептор эстрогена, чувствительный к тамоксифену или к его метаболиту, а именно, 4-гидрокси-тамоксифену (40HT), такому как ERT или ERT2; рецептор глюкокортикоида (GR), чувствительный к мифепристону (MIFEPREX); лиганд-связывающий домен, регулируемый лекарственным средством; и индуцируемый стероидом рецептор, такой как рецептор, индуцируемый экдизоном.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодируют гибридный белок, где указанный гибридный белок включает белок Zscan4, присоединенный к белку ERT2. ERT2 представляет собой мутированный вариант лиганд-связывающего домена человеческого рецептора эстрогена. ERT2 не связывается со своим природным лигандом (17β-эстрадиолом) при физиологических концентрациях, но является в высокой степени чувствительным к наномолярным концентрациям тамоксифена или его метаболита, а именно, 4-гидрокси-тамоксифена (40HT) (Feil et al., Biochem Biophys Res Commun 237(3):752-757, 1997). Термин «гибридный белок» может означать белок, содержащий по меньшей мере часть двух различных (гетерологичных) белков. В некоторых примерах, такие белки продуцируются посредством экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, сконструированной из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих по меньшей мере часть двух различных (гетерологичных) белков. Для создания гибридного белка, последовательности нуклеиновой кислоты должны находиться в одной и той же рамке считывания и не должны содержать внутренних стоп-кодонов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой человеческую нуклеиновую кислоту ZSCAN4, мышиную нуклеиновую кислоту Zscan4c, мышиную нуклеиновую кислоту Zscan4d или мышиную нуклеиновую кислоту Zscan4f или их функциональный фрагмент или вариант. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный белок Zscan4, такой как гибридный белок Zscan4-ERT2, может включать любой полинуклеотид Zscan4 или его гомолог, фрагмент или вариант, описанный в настоящей заявке. Функциональными фрагментами и вариантами Zscan4 являются, например, любой фрагмент или вариант Zscan4, сохраняющий одну или более биологических активностей Zscan4, таких как способность повышать плюрипотентность стволовых клеток или стабильность генома или увеличивать длину теломеры.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, может включать, например, нуклеотидную последовательность любой одной из последовательностей SEQ ID №№: 1-10 и 21-30. В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой мышиный полинуклеотид Zscan4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой человеческий полинуклеотид ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой полинуклеотид Zscan4a, полинуклеотид Zscan4b, полинуклеотид Zscan4c, полинуклеотид Zscan4d, полинуклеотид Zscan4e или полинуклеотид Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, включает нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, происходящей от любой из SEQ ID NO: 1-10 и 21-30.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой человеческий полинуклеотид ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4 согласно изобретению, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, включает нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок Zscan4, такой как гибридный белок Zscan4-ERT2, включает линкерную последовательность, находящуюся между Zscan4 и последовательностью индуцибельного рецептора и/или лиганд-связывающего домена, такую как ERT2-кодирующая последовательность. Линкеры хорошо известны специалистам, и выбор соответствующего линкера может быть осуществлен самим специалистом. Термин «линкер» может означать один или более нуклеотидов или одну или более аминокислот, которые служат в качестве спейсера, находящегося между двумя молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновой кислоты или между двумя пептидами (например, в гибридном белке). В некоторых вариантах осуществления изобретения, линкер состоит из 1-100 аминокислот, например, 1-50 или 5-10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения, линкер состоит по меньшей мере из 2 аминокислот (a.к.), по меньшей мере из 3, по меньшей мере из 5, по меньшей мере из 10, по меньшей мере мз 20, по меньшей мере из 50 или по меньшей мере из 100 аминокислот, например, из 2-50 или 2-10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения, линкер включает аминокислотную последовательность Ala-Ser.

Настоящее изобретение относится к векторам, которые включают модифицированный Zscan4, такой как Zscan4-ERT2, кодирующий описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты. В настоящем изобретении рассматривается любой подходящий экспрессионный вектор, такой как экспрессионный (плазмидный) вектор (например, pPyCAG-BstXI-IP) или вирусный вектор (например, парамиксовирусный вектор, такой как вектор на основе вируса Сендай, аденовируса, аденоассоциированного вируса, лентивируса или ретровируса). Многие экспрессионные векторы и вирусные векторы являются известными и могут быть выбраны самим специалистом.

Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам, содержащим модифицированный Zscan4, такой как Zscan4-ERT2, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такой клеткой является человеческая клетка. Человеческая клетка может происходить от клеток любого вида. Человеческой клеткой может быть человеческая клетка любого типа, описанная в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, кодирующие модифицированный белок Zscan4, такой как гибридный белок Zscan4-ERT2. Такие композиции могут также включать носитель или разбавитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Настоящее изобретение также относится к модифицированным белкам Zscan4, таким как гибридные белки Zscan4-ERT2, кодируемые описанными здесь молекулами нуклеиновой кислоты и векторами.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным модифицированным белкам Zscan4, таким как гибридные белки Zscan4-ERT2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный модифицированный белок Zscan4, такой как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой человеческий ZSCAN4, мышиный Zscan4c, мышиный Zscan4d или мышиный Zscan4f или их функциональный фрагмент или вариант. Часть Zscan4 модифицированного белка Zscan4, такого как рекомбинантный гибридный белок Zscan4-ERT2, может включать любой полипептид Zscan4 или его гомолог, ортолог, фрагмент или вариант, описанный в настоящей заявке. Функциональными фрагментами и вариантами Zscan4 являются, например, любой фрагмент или вариант Zscan4, сохраняющий одну или более биологических активностей Zscan4, таких как способность повышать стабильность генома или увеличивать длину теломеры.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть модифицированного белка Zscan4, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой мышиный полипептид Zscan4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть модифицированного белка Zscan4, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой человеческий ZSCAN4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть модифицированного белка Zscan4, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой полипептид Zscan4a, полипептид Zscan4b, полипептид Zscan4c, полипептид Zscan4d, полипептид Zscan4e или полипептид Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть модифицированного белка Zscan4, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности, происходящей от любой из SEQ ID NO: 11-20 и 31-40.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть модифицированного белка Zscan4, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, представляет собой человеческий полипептид ZSCAN4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть модифицированного белка Zscan4, такого как гибридный белок Zscan4-ERT2, включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.

Фрагменты и варианты белка Zscan4 могут быть легко получены специалистом с применением молекулярных методов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фрагмент белка Zscan4 включает по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450 или по меньшей мере 500 смежных аминокислот полипептида Zscan4. В другом варианте осуществления изобретения, фрагментом Zscan4 является фрагмент, который сообщает Zscan4 определенную функцию, такую как, но не ограничивающуюся ими, способность повышать стабильность генома и/или увеличивать длину теломеры.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим модифицированный белок Zscan4, такой как гибридный белок Zscan4-ERT2. Такие композиции могут также включать носитель или разбавитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, например, физиологический раствор.

Композиции, векторы и клетки, включающие Zscan4- Δ C

Настоящее изобретение также относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белок Zscan4 с С-концевым усечением (обозначаемый здесь Zscan4-ΔC). Усеченный по С-концу Zscan4 включает делецию по меньшей мере одного домена «цинковый палец». Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, белок Zscan4-ΔC имеет делецию одного, двух, трех или четырех доменов «цинковый палец».

В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Zscan4-ΔC, представляет собой усеченный по С-концу человеческий ZSCAN4, мышиный Zscan4c, мышиный Zscan4d или мышиный Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, белок Zscan4-ΔC представляет собой человеческий ZSCAN4 или мышиный Zscan4c с делецией всех четырех доменов «цинковый палец». Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Zscan4-ΔC, может иметь С-концевое усечение любого описанного здесь полинуклеотида Zscan4.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Zscan4-ΔC, может включать, например, нуклеотидную последовательность любой одной из последовательностей SEQ ID №№: 1-10 и 21-30. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Zscan4-ΔC, представляет собой мышиный полинуклеотид Zscan4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Zscan4-ΔC, представляет собой человеческий полинуклеотид ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Zscan4-ΔC, представляет собой полинуклеотид Zscan4a, полинуклеотид Zscan4b, полинуклеотид Zscan4c, полинуклеотид Zscan4d, полинуклеотид Zscan4e или полинуклеотид Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Zscan4-ΔC, включает нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, происходящей от любой из SEQ ID NO: 1-10 и 21-30.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Zscan4-ΔC, представляет собой человеческий полинуклеотид ZSCAN4 или его гомолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Zscan4-ΔC, включает нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7.

Рассматриваемые здесь последовательности нуклеиновой кислоты Zscan4-ΔC представляют собой последовательности, которые являются вырожденными, что обусловлено вырожденностью генетического кода. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых характеризуются тем, что они кодируются более, чем одним кодоном. Поэтому, в настоящее изобретение могут быть включены все вырожденные нуклеотидные последовательности, при условии, что аминокислотная последовательность полипептида Zscan4-ΔC, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью, будет оставаться функционально неизменной.

Настоящее изобретение также относится к векторам, которые включают Zscan4-ΔC-кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящей заявке. В настоящем изобретении рассматривается любой подходящий экспрессионный вектор, такой как экспрессионный (плазмидный) вектор (например, pPyCAG-BstXI-IP) или вирусный вектор (например, парамиксовирусный вектор, такой как вектор на основе вируса Сендай, аденовируса, аденоассоциированного вируса, лентивируса или ретровируса). Многие экспрессионные векторы и вирусные векторы являются известными и могут быть выбраны самим специалистом.

Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты или вектор Zscan4-ΔC, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такой клеткой является человеческая клетка. Человеческая клетка может происходить от клеток любого вида. Человеческой клеткой может быть человеческая клетка любого типа, описанная в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, кодирующие белок Zscan4-ΔC. Такие композиции могут также включать носитель или разбавитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Настоящее изобретение также относится к белкам Zscan4-ΔC, кодируемый описанными здесь молекулами нуклеиновой кислоты и векторами.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным белкам Zscan4-ΔC. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный белок Zscan4-ΔC представляет собой усеченный по С-концу человеческий ZSCAN4, мышиный Zscan4c, мышиный Zscan4d или мышиный Zscan4f. Часть Zscan4 рекомбинантного белка Zscan4-ΔC может включать любой полипептид Zscan4 или его гомолог, ортолог, фрагмент или вариант, описанные в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 рекомбинантного белка Zscan4-ΔC представляет собой мышиный полипептид Zscan4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 рекомбинантного белка Zscan4-ΔC представляет собой человеческий полипептид ZSCAN4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 рекомбинантного белка Zscan4-ΔC представляет собой полипептид Zscan4a, полипептид Zscan4b, полипептид Zscan4c, полипептид Zscan4d, полипептид Zscan4e или полипептид Zscan4f. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 рекомбинантного белка Zscan4-ΔC включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности, происходящей от любой из SEQ ID NO: 11-20 и 31-40.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 рекомбинантного белка Zscan4-ΔC представляет собой человеческий полипептид ZSCAN4 или его гомолог или ортолог. В некоторых вариантах осуществления изобретения, часть Zscan4 рекомбинантного белка Zscan4-ΔC включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.

Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам, содержащим описанный здесь белок Zscan4-ΔC. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такими клетками являются человеческие клетки. Человеческая клетка может происходить от клеток любого вида. Человеческой клеткой может быть человеческая клетка любого типа, описанная в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим белок Zscan4-ΔC. Такие композиции могут также включать носитель или разбавитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, например, физиологический раствор.

Методы введения полипептида Zscan4 в человеческие клетки

Введение полипептидов Zscan4 в клетки, такие как человеческие клетки, может быть осуществлено путем непосредственной доставки в эти клетки соответствующих белков. Доставка белка может быть осуществлена, например, путем электропорации, микроинжекции, а также с использованием катионных липидов или наночастиц с применением стандартных методов. Альтернативно, белки могут быть модифицированы посредством их слияния с пептидом, проникающим в клетку (СРР), для облегчения проникновения такого белка в клетку. Применение СРР и наночастиц более подробно обсуждается ниже.

Пептиды, проникающие в клетку (CPP)

CPP представляют собой семейство полипептидов, которые облегчают перенос белков, нуклеиновых кислот или других соединений через мембраны по независимому от рецепторов механизму (Wadia and Dowdy, Curr. Protein Pept. Sci. 4(2):91-104, 2003). Обычно, CPP представляют собой короткие поликатионные последовательности, которые могут облегчать проникновение соединений, с которыми они связываются, в эндосомы клеток. Примерами CРP являются полиаргининовые метки и домены для трансдукции белка. При этом могут быть использованы любые домены для трансдукции белка, известные специалистам. Примерами подходящих доменов для трансдукции белка являются, но не ограничиваются ими, Tat ВИЧ, Vpr ВИЧ, Vp22 ВИЧ, гомеодомены (HD), происходящие от HD-содержащих белков, и синтетические домены для трансдукции белка.

Способность некоторых пептидов осуществлять доставку белков или нуклеиновых кислот в клетки была уже описана на примере ВИЧ-кодируемого белка Tat, который, как было показано, проникает через мембраны и инициирует транскрипцию. Впоследствии было обнаружено, что часть белка Tat, необходимая для трансдукции белка, представляет собой полипептид, состоящий лишь из 11 аминокислот, и такой полипептид называется здесь пептидом Tat. Было продемонстрировано, что пептид Tat, при его присоединении к другим белкам, обладает способностью доставлять эти белки, размер которых варьируется в пределах от 15 до 120 кДа, в клетки тканевой культуры (Frankel and Pabo, Cell 55(6): 1189-93, 1988; Green and Loewenstein, J. Gen. Microbiol. 134(3 J:849-55, 1988; Vives et al., J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7, 1997; Yoon et al., J. Microbiol. 42(4):32S-35, 2004; Cai et al., Eur. J. Pharm. Sci. 27(4):311-9, 2006).

Другими известными CРP являются PENETRATIN™, то есть пептид, состоящий из 16 аминокислот и происходящий от тройной спирали гена гомеобокса усиков дрозофилы (патент США No. 5888762; Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 10444-10450, 1994; Schwarze et al., Trends Pharmacol. Sci. 27:45-48, 2000); транспортан, то есть химерный пептид, состоящий из 27 аминокислот, из которых 12 аминокислот происходят от N-конца нейропептида галанина, а 14 аминокислот происходят от белка мастопарана, и которые соединены друг с другом посредством лизина (патент США No. 6821948; Pooga, FASEB J. 12:61-11, 1998; Hawiger, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:89-94, 1999); пептиды, происходящие от белка VP22 вируса простого герпеса (HSV) типа 1 (Elliott et al., Cell 88:223-233, 1997); белок UL-56 вируса HSV-2 (публикация Pre-Grant (публикация через 18 месяцев с даты приоритета) заявки на патент США No. 2006/0099677); и белок Vpr вируса ВИЧ-1 (публикация Pre-Grant заявки на патент США No. 2005/0287648). Кроме того, также известно, что функцией CCP обладает ряд искусственных пептидов, таких как полиаргинин, полилизин и т.п. (см., например, публикации Pre-Grant заявок на патент США №№ 2006/0106197; 2006/0024331; 2005/0287648 и 2003/0125242; Zhibao et al., Mol. Ther. 2:339-347, 2000; и Laus et al. Nature Biotechnol. 18: 1269-1272, 2000).

В публикации Zhou et al. (Cell Stem Cell 4:381-384, 2009) описано успешное применение полиаргининовых пептидных меток. Кроме того, в публикации Kim et al. (Cell Stem Cell 4:472-476, 2009) описано успешное применение домена для трансдукции белка ВИЧ-TAT в целях доставки белков в фибробласты человеческого плода.

Наночастицы

Наночастицы представляют собой носители для доставки лекарственного средства, имеющие субмикронные размеры (приблизительно менее, чем 1000 нм), где указанные носители могут включать инкапсулированные лекарственные средства, такие как синтетические небольшие молекулы, белки, пептиды, клетки и биотерапевтические средства на основе нуклеиновой кислоты, используемые для быстрого или регулируемого высвобождения. Различные молекулы (например, молекулы белков, пептидов и нуклеиновых кислот) могут быть эффективно инкапсулированы в наночастицы способами, хорошо известными специалистам. Термин «молекула, инкапсулированная в наночастицу» может означать молекулу (такую как нуклеиновая кислота или белок Zscan4), которая либо содержится в наночастице, либо присоединена к поверхности этой наночастицы, либо содержится в этой наночастице и присоединена к ней.

В некоторых примерах, агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, был инкапсулирован в наночастицу для облегчения его доставки в клетки. Подходящие наночастицы, используемые в описанных здесь способах, известны специалистам и кратко описаны ниже.

Наночастицы, используемые в описанных здесь способах, могут представлять собой биосовместимые наночастицы любого типа, такие как биологически разлагаемые наночастицы, а именно, полимерные наночастицы, включая, но не ограничиваясь ими, наночастицы на основе полиамида, поликарбоната, полиалкена, поливиниловых эфиров и эфира целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы изготовлены из биосовместимых и биологически разлагаемых веществ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицами являются, но не ограничиваются ими, наночастицы, включающие полимолочную кислоту или полигликолевую кислоту или то и другое. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицами являются наночастицы на основе сополимера D,L-молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA).

В описанных здесь способах могут применяться и другие биологически разлагаемые полимерные вещества, такие как полимолочная кислота (PLA) и полигликолид (PGA). Другими подходящими наночастицами являются биологически разлагаемые наночастицы на основе полиалкилцианоакрилата (Vauthier et al., Adv. Drug Del. Rev. 55: 519-48, 2003).

Различные типы биологически разлагаемых и биосовместимых наночастиц, методы получения таких наночастиц, включая наночастицы на основе PLGA, и методы инкапсуляции различных синтетических соединений, белков и нуклеиновых кислот подробно описаны в литературе (см., например, публикацию заявки на патент США No. 2007/0148074; публикацию заявки на патент США No. 20070092575; публикацию заявки на патент США No. 2006/0246139; патент США No. 5753234; патент США No. 7081489; и публикацию заявки PCT No. WO/2006/052285).

Ретиноиды

В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4, является ретиноид. Термин «ретиноид» может означать класс химических соединений, которые по своей химической природе являются родственными витамину А. Ретиноиды используются в медицине, что обусловлено, главным образом, тем, что они регулируют рост эпителиальных клеток. Ретиноиды обладают множеством важных и разнообразных функций в организме, включая их роль, предположительно, в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток, росте клеточной ткани, в иммунной функции и активации генов-супрессоров опухоли. Примерами ретиноидов являются, но не ограничиваются ими, полностью транс (п.т.)-ретиноевая кислота (п.т.-РК), 9-цис-ретиноевая кислота (9-цис-РК), 13-цис-РК и витамин A (ретинол).

Различные ретиноиды известны специалистам и могут быть использованы в описанных здесь способах. Ретиноидами могут быть, но не ограничиваются ими, полностью транс-ретиноевая кислота, 9-цис-ретиноевая кислота, 13-цис-ретиноевая кислота или витамин A.

Агенты, индуцирующие окислительный стресс

В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4, является агент, индуцирующий окислительный стресс. Термин «окислительный стресс» может означать дисбаланс между продуцированием молекул активного кислорода и способностью биологической системы быстро детоксифицировать реакционноспособные промежуточные соединения или осуществлять репарацию образующихся повреждений. Нарушение нормального окислительно-восстановительного процесса в тканях может вызывать токсические эффекты, что обусловлено продуцированием пероксидов и свободных радикалов, разрушающих все компоненты клеток, включая белки, липиды и ДНК. В некоторых вариантах описанных способов, агентом, индуцирующим окислительный стресс, является пероксид водорода (H₂O₂).

Различные агенты, индуцирующие окислительный стресс, известны специалистам и могут быть использованы в описанных здесь способах.

Увеличение длины теломеры и повышение стабильности генома

В некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к способам увеличения длины теломеры и/или повышения стабильности генома в одной или более человеческих клетках, например, посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии (например, экспрессии белка) Zscan4 в одной или более человеческих клетках. Как описано в настоящей заявке, временное повышение уровня экспрессии и/или повышение уровня экспрессии в течение лишь короткого периода времени (например, приблизительно от 1 часа до 23 часов или приблизительно от 1 дня до 10 дней) является достаточным для увеличения длины теломеры и/или повышения стабильности генома в человеческих клетках. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения, повторное временное повышение уровня экспрессии Zscan4 в человеческих клетках усиливает эффекты повышения уровня экспрессии Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, временное повышение уровня экспрессии Zscan4 повторно достигается через каждые 4 часа, через каждые 8 часов, через каждые 12 часов, через каждые 16 часов, через каждые 24 часа, через каждые 32 часа, через каждые 40 часов, через каждые 48 часов, через каждые три дня, через каждые четыре дня, через каждые пять дней, через каждые шесть дней, через каждую неделю, через каждые две недели, через каждые три недели, через каждые четыре недели, через каждый месяц, через каждые два месяца, через каждые три месяца, через каждые четыре месяца, через каждые шесть месяцев, через каждые семь месяцев, через каждые восемь месяцев, через каждые девять месяцев, через каждые 10 месяцев, через каждые 11 месяцев, через каждый год, через каждые два года, через каждые три года, через каждые четыре года, через каждые пять лет, через каждые шесть лет, через каждые семь лет, через каждые восемь лет, через каждые девять лет, через каждые 10 лет, через каждые 11 лет, через каждые 12 лет, через каждые 13 лет, через каждые 14 лет, через каждые 15 лет, через каждые 16 лет, через каждые 17 лет, через каждые 18 лет, через каждые 19 лет, через каждые 20 лет, через каждые 21 год, через каждые 22 года, через каждые 23 года, через каждые 24 года, через каждые 25 лет, через каждые 26 лет, через каждые 27 лет, через каждые 28 лет, через каждые 29 лет, через каждые 30 лет, через каждые 35 лет, через каждые 40 лет, через каждые 45 лет или через каждые 50 лет.

Термин «приведение в контакт» может означать прямую физическую ассоциацию, включая ассоциацию в твердой и жидкой форме. Термин «приведение в контакт» может употребляться как синоним термина «обработка». В некоторых случаях, термин «приведение в контакт» включает трансфекцию, например, перенос молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Методы оценки стабильности генома и определения длины теломеры являются рутинными и не ограничиваются описанными здесь конкретными методами. Конкретные примеры приводятся здесь в качестве иллюстрации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, длина теломеры в человеческих клетках, приводимых в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии белка Zscan4 в человеческих клетках, увеличивается по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 1,6 раза, по меньшей мере в 1,7 раза, по меньшей мере в 1,8 раза, по меньшей мере в 1,9 раза, по меньшей мере в 2,0 раза, по меньшей мере в 2,1 раза, по меньшей мере в 2,15 раза, по меньшей мере в 2,2 раза, по меньшей мере в 2,25 раза, по меньшей мере в 2,3 раза, по меньшей мере в 2,35 раза, по меньшей мере в 2,4 раза, по меньшей мере в 2,45 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 2,55 раза, по меньшей мере в 3,0 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4,0 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, по меньшей мере в 5,0 раза, по меньшей мере в 5,5 раза, по меньшей мере в 6,0 раза, по меньшей мере в 6,5 раза, по меньшей мере в 7,0 раза, по меньшей мере в 7,5 раза, по меньшей мере в 8,0 раза, по меньшей мере в 8,5 раза, по меньшей мере в 9,0 раза, по меньшей мере в 9,5 раза, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, по меньшей мере в 400 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 600 раз, по меньшей мере в 700 раз, по меньшей мере в 800 раз, по меньшей мере в 900 раз, по меньшей мере в 1000 раз, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, по меньшей мере в 4000 раз, по меньшей мере в 5000 раз, по меньшей мере в 6000 раз, по меньшей мере в 7000 раз, по меньшей мере в 8000 раз, по меньшей мере в 9000 раз, по меньшей мере в 10000 раз, по меньшей мере в 25000 раз, по меньшей мере в 50000 раз, по меньшей мере в 75000 раз, по меньшей мере в 100000 раз, по меньшей мере в 125000 раз, по меньшей мере в 150000 раз, по меньшей мере в 175000 раз, по меньшей мере в 200000 раз, по меньшей мере в 225000 раз, по меньшей мере в 250000 раз, по меньшей мере в 275000 раз, по меньшей мере в 300000 раз, по меньшей мере в 325000 раз, по меньшей мере в 350000 раз, по меньшей мере в 375000 раз, по меньшей мере в 400000 раз, по меньшей мере в 425000 раз, по меньшей мере в 450000 раз, по меньшей мере в 475000 раз, по меньшей мере в 500000 раз, по меньшей мере в 525000 раз, по меньшей мере в 550000 раз, по меньшей мере в 575000 раз, по меньшей мере в 600000 раз, по меньшей мере в 625000 раз, по меньшей мере в 650000 раз, по меньшей мере в 675000 раз, по меньшей мере в 700000 раз, по меньшей мере в 725000 раз, по меньшей мере в 750000 раз, по меньшей мере в 775000 раз, по меньшей мере в 800000 раз, по меньшей мере в 825000 раз, по меньшей мере в 850000 раз, по меньшей мере в 875000 раз, по меньшей мере в 900000 раз, по меньшей мере в 925000 раз, по меньшей мере в 950000 раз, по меньшей мере в 975000 раз или по меньшей мере в 1000000 раз, например, по сравнению с экспрессией белка Zscan4 в соответствующих человеческих клетках, которые не были приведены в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4. Для определения уровня экспрессии белка Zscan4 в клетке или для оценки количества белка (то есть стехиометрической оценки белка) на клетку может быть применен любой метод, известный специалистам и описанный в настоящей заявке.

В других вариантах осуществления изобретения, способы увеличения длины теломеры и/или повышения стабильности генома в одной или более человеческих клетках включают приведение одной или более человеческих клеток в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты или вектором, кодирующими модифицированный белок Zscan4 согласно изобретению, такой как гибридный белок Zscan4-ERT2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанный способ включает приведение человеческих клеток или популяции человеческих клеток в контакт с модифицированным белком Zscan4 согласно изобретению, таким как гибридный белок Zscan4-ERT2.

В других вариантах осуществления изобретения, способы увеличения длины теломеры и/или повышения стабильности генома в одной или более человеческих клетках включают приведение человеческих клеток или популяции человеческих клеток в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты или вектором, кодирующими белок Zscan4-ΔC, описанный в настоящей заявке. В других вариантах осуществления изобретения, указанный способ включает приведение человеческих клеток или популяции человеческих клеток в контакт с описанным здесь белком Zscan4-ΔC.

Методы доставки молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих белки Zscan4-ERT2 или Zscan4-ΔC, и белков Zscan4-ERT2 или Zscan4-ΔC в человеческие клетки, известны специалистам и описаны в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, длина теломеры в человеческих клетках увеличена по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 110%, по меньшей мере на 115%, по меньшей мере на 120%, по меньшей мере на 125%, по меньшей мере на 130%, по меньшей мере на 135%, по меньшей мере на 140%, по меньшей мере на 145%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 155% или по меньшей мере на 160%, например, по сравнению с длиной теломеры в человеческих клетках, которые не контактировали с модифицированным белком Zscan4, таким как белок Zscan4-ERT2 или Zscan4-ΔC, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный белок Zscan4, такой как белок Zscan4-ERT2 или Zscan4-ΔC (или по сравнению с величиной или интервалом величин, ожидаемых для человеческих клеток, которые не подвергались периодической Zscan4-активации). В некоторых вариантах осуществления изобретения, длина теломеры в человеческих клетках увеличена по меньшей мере в 1,2 раза, по меньшей мере в 1,3 раза, по меньшей мере в 1,4 раза, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 1,6 раза, по меньшей мере в 1,7 раза, по меньшей мере в 1,8 раза, по меньшей мере в 1,9 раза, по меньшей мере в 2,0 раза, по меньшей мере в 2,1 раза, по меньшей мере в 2,15 раза, по меньшей мере в 2,2 раза, по меньшей мере в 2,25 раза, по меньшей мере в 2,3 раза, по меньшей мере в 2,35 раза, по меньшей мере в 2,4 раза, по меньшей мере в 2,45 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 2,55 раза, по меньшей мере в 3,0 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4,0 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, по меньшей мере в 5,0 раз, по меньшей мере в 5,5 раза, по меньшей мере в 6,0 раз, по меньшей мере в 6,5 раза, по меньшей мере в 7,0 раз, по меньшей мере в 7,5 раза, по меньшей мере в 8,0 раз, по меньшей мере в 8,5 раза, по меньшей мере в 9,0 раз, по меньшей мере в 9,5 раза или по меньшей мере в 10 раз, например, по сравнению с длиной теломеры в человеческих клетках, которые не контактировали с модифицированным белком Zscan4, таким как белок Zscan4-ERT2 или Zscan4-ΔC, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный белок Zscan4, такой как белок Zscan4-ERT2 или Zscan4-ΔC (или по сравнению с величиной или интервалом величин, ожидаемых для человеческих клеток, которые не подвергались периодической Zscan4-активации).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, длину теломеры измеряют в одной или более человеческих клетках, которые были приведены в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках. В некторых примерах, длина теломеры в человеческих клетках считается увеличенной, если длина теломер в этих клетках, например, больше, чем длина теломеры в человеческих клетках, которые не были приведены в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4. Так, например, длина теломеры может быть детектирована в человеческих клетках путем флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), количественной FISH (Q-FISH) или с помощью кол.ПЦР теломеры.

Стабильность генома

В некоторых вариантах осуществления изобретения, стабильность генома в одной или более человеческих клетках, контактирующих с агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, повышается по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98%, например, по сравнению со стабильностью генома в соответствующих человеческих клетках, которые были приведены в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4.

Методы оценки стабильности генома являются рутинными и не ограничиваются описанными здесь конкретными методами. Конкретные примеры приводятся здесь в качестве иллюстрации.

В некоторых примерах, стабильность генома в человеческих клетках, таких как человеческие клетки, приводимые в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 (например, в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии молекул Zscan4, таких как нуклеиновая кислота Zscan4, белок Zscan4, Zscan4-ERT или Zscan4-ΔC), измеряют с помощью анализа на кариотип. Стабильность генома считается повышенной, если присутствие кариотипических аберраций (таких как слияние хромосом и фрагментация хромосом) незначительно, или если такие аберрации вообще отсутствуют, по сравнению, например, с клетками, которые не были приведены в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4. Так, например, анализ на кариотип может быть осуществлен в человеческих клетках путем индуцирования задержки метафазы для получения хромосомы в длительном периоде метафазы.

В некоторых примерах, стабильность генома в человеческих клетках, таких как человеческие клетки, приводимые в контакт с белком или нуклеиновой кислотой Zscan4, Zscan4-ERT или Zscan4-ΔC, определяют путем оценки обмена сестринских хроматид (SCE). Стабильность генома считается повышенной, если происходит снижение SCE по сравнению с контролем, таким как стволовые клетки, которые не подвергались периодической Zscan4-активации. Так, например, SCE может быть определен в стволовых клетках путем его детектирования в длительном периоде метафазе.

Применение Zscan4 в терапии

В настоящей заявке сообщалось, что экспрессия Zscan4 способствует увеличению длины теломеры, повышению стабильности генома, коррекции геномных и/или хромосомных аберраций, защите клеток от повреждения ДНК и/или повышению уровня репарации ДНК. Термин «репарация ДНК» может означать совокупность процессов, во время которых в клетке идентифицируются и корректируются повреждения кодирующих молекул ДНК в геноме клетки. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам повышения уровня экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, которое способствует повышению стабильности генома, защите клеток от повреждения ДНК, повышению уровня репарации ДНК и увеличению длины теломеры в человеческих клетках.

Настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, нуждающегося в клеточной терапии, такого как индивидуум, имеющий человеческие клетки, требующие удлинения теломеры или коррекции теломерных и/или хромосомных аберраций. Эти способы могут включать применение человеческих клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках. Повышение уровня экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

Настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать приведение одной или более человеческих клеток индивидуума в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в одной или более человеческих клетках. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать выделение одной или более человеческих клеток, приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, и введение индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию. Повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинения теломеры в одной или более человеческих клетках.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной и/или с хромосомной аберрацией. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры и/или коррекцию теломерных и/или хромосомных аберраций в одной или более человеческих клетках, и где указанное введение осуществляют для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной и/или хромосомной аберрацией. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной и/или хромосомной аберрацией; приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках; и введение индивидууму одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, для лечения заболевания, ассоциированного с теломерной и/или хромосомной аберрацией. Повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры и/или коррекцию теломерных и/или хромосомных аберраций в одной или более человеческих клетках. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать выделение человеческих клеток костного мозга у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной и/или хромосомной аберрацией; приведение одной или более человеческих клеток костного мозга в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках костного мозга; и трансплантацию индивидууму человеческих клеток костного мозга, подвергнутых такому контактированию, для лечения заболевания, ассоциированного с теломерной и/или хромосомной аберрацией. Повышение уровня экспрессии Zscan4 индуцирует удлинение теломеры и/или коррекцию теломерных и/или хромосомных аберраций в человеческих клетках костного мозга.

Настоящее изобретение также относится к способам повышения стабильности генома в одной или более человеческих клетках. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению стабильности генома в одной или более человеческих клетках по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

Настоящее изобретение также относится к способам повышения способности одной или более человеческих клеток к репарации ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к повышению способности одной или более человеческих клеток к репарации ДНК по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

Настоящее изобретение также относится к способам омоложения одной или более человеческих клеток и/или увеличения продолжительности жизни одной или более человеческих клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению и/или к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток по сравнению с одной или более соответствующими человеческими клетками, которые не контактировали с этим агентом.

Настоящее изобретение относится к способам омоложения ткани или органа у индивидуума и/или увеличения продолжительности жизни ткани или органа у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в ткани или органе, где повышение уровня экспрессии Zscan4 в ткани или органе приводит к омоложению и/или увеличению продолжительности жизни ткани или органа.

Настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания или состояния, ассоциированного с дефицитом одной или более стволовых клеток-резидентов ткани (то есть стволовых клеток ткани, постоянно присутствующих в органе и/или в ткани организма человека), где таким заболеванием или состоянием является мышечная дистрофия Дюшенна. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать введение в стволовые клетки-резиденты ткани индивидуума, нуждающегося в этом, агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в стволовых клеток-резидентах ткани, где повышение уровня экспрессии Zscan4 предупреждает разрушение этих клеток.

Настоящее изобретение относится к способам омоложения индивидуума, нуждающегося в этом, и/или увеличения продолжительности жизни индивидуума, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать введение индивидууму агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению и/или к увеличению продолжительности жизни индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы могут включать выделение одной или более человеческих клеток у индивидуума; приведение одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках, где повышение уровня экспрессии Zscan4 приводит к омоложению и/или к увеличению продолжительности жизни одной или более человеческих клеток; и введение одной или более человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, индивидууму для омоложения и/или увеличения продолжительности жизни указанного индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, может включать, но не ограничивается ими, инъекцию агента в каждый орган и в каждую ткань организма; инъекцию указанного агента в кровоток индивидуума; инъекцию указанного агента в цереброспинальную жидкость индивидуума; инъекцию указанного агента в лимфатическую систему индивидуума; инъекцию указанного агента в ткань легких индивидуума; инъекцию указанного агента в органы и ткани пищеварительной системы, включая пищевод, желудок и тонкий кишечник индивидуума; инъекцию указанного агента в воротную вену индивидуума; и местное нанесение указанного агента на кожу и кожные дериваты, такие как волосяные фолликулы и потовые железы для омоложения стволовых клеток ткани, клеток-предшественников и/или клеток терминальной стадии дифференцировки, присутствующих в обработанном органе и/или в обработанной ткани. Очевидно, что общими эффектами омоложения стволовых клеток ткани, клеток-предшественников и/или клеток терминальной стадии дифференцировки у индивидуума, подвергнутого такому лечению, являются омоложение самого индивидуума и/или замедление процесса старения данного индивидуума. Также очевидно, что омоложение стволовых клеток ткани, клеток-предшественников и/или клеток терминальной стадии дифференцировки у индивидуума, подвергнутого такому лечению, приводит к увеличению продолжительности жизни данного индивидуума.

Так, например, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего раком, путем введения указанному индивидууму полипептида или полинуклеотида Zscan4. Термин «индивидуум» может означать живые многоклеточные позвоночные, относящиеся к классу, включающему человека и млекопитающих, не являющихся человеком. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанный способ также включает отбор пациентов, нуждающихся в таком лечении, то есть индивидуумов, у которых был диагностирован рак. Термин «рак» может означать злокачественную опухоль, характеризующуюся аномальным или неконтролируемым ростом клеток. Другими признаками, которые часто ассоциируются с раком, являются метастазы; негативное воздействие на нормальные функции близлежащих клеток; высвобождение цитокинов или других продуктов секреции на аномальных уровнях и подавление или усиление воспалительного или иммунного ответа; инвазия окружающих иди дистальных тканей или органов, таких как лимфоузлы и т.п. Термин «метастазирующее заболевание» может означать заболевание, при котором раковые клетки покидают участок первичной опухоли и мигрируют в другие части организма, например, через кровоток или лимфатическую систему.

В некоторых вариантах описанных здесь способов, индивидууму вводят полинуклеотид Zscan4. В некоторых примерах, индивидууму вводят вектор, включающий полинуклеотид Zscan4. Методы получения и использования Zscan4-экспрессирующих векторов описаны в других разделах настоящей заявки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид Zscan4 (или вектор, включающий полинуклеотид Zscan4) вводят непосредственно в опухолевые клетки или в опухолевую ткань, например, путем инъекции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидууму вводят полипептид Zscan4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид Zscan4 и/или полипептид Zscan4 согласно изобретению инкапсулируют в наночастицу для облегчения доставки полинуклеотида Zscan4, полипептида Zscan4 и/или агента, индуцирующего экспрессию Zscan4 в опухолевых клеток. Подходящие наночастицы, используемые в способах согласно изобретению, известны специалистам и описаны ниже.

Наночастицы представляют собой носители для доставки лекарственного средства, имеющие субмикронные размеры (приблизительно менее, чем 1000 нм), где указанные носители могут включать инкапсулированные лекарственные средства, такие как синтетические небольшие молекулы, белки, пептиды и биотерапевтические средства на основе нуклеиновой кислоты, используемые для быстрого или регулируемого высвобождения. Различные молекулы (например, молекулы белков, пептидов и нуклеиновых кислот) могут быть эффективно инкапсулированы в наночастицы способами, хорошо известными специалистам.

Наночастицы, используемые в описанных здесь композициях и способах, могут представлять собой биосовместимые наночастицы любого типа, такие как биологически разлагаемые наночастицы, а именно, полимерные наночастицы, включая, но не ограничиваясь ими, наночастицы на основе полиамида, поликарбоната, полиалкена, поливиниловых эфиров и эфира целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы изготовлены из биосовместимых и биологически разлагаемых веществ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицами являются, но не ограничиваются ими, наночастицы, включающие полимолочную кислоту или полигликолевую кислоту или то и другое. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицами являются наночастицы на основе сополимера D,L-молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA).

PLGA представляет собой биологический материал, разрешенный Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) к его применению в качестве рассасывающихся швов и биоразлагаемых имплантатов. PLGA-наночастицы были также использованы в системах для доставки ряда лекарственных средств различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, подкожное, внутривенное, офтальмическое, пероральное и внутримышечное введение. Термин «введение» может означать доставку или введение индивидууму агента любым эффективным способом. Репрезентативный способ введения включает, но не ограничивается ими, инъекцию (такую как подкожная, внутримышечная, интрадермальная, внутрибрюшинная, внутривенная или интраартериальная инъекция). PLGA разлагается на составляющие его мономеры, такие как молочная и гликолевая кислота, которые представляют собой природные побочные продукты метаболизма, а поэтому, такой сополимер является в высокой степени биосовместимым. Кроме того, PLGA имеется в продаже как вещество, используемое в медицине для синтеза наночастиц.

Другими биологически разлагаемыми полимерными веществами, которые могут быть применены в описанных здесь композициях и способах, являются полимолочная кислота (PLA) и полигликолид (PGA). Другими подходящими наночастицами являются биологически разлагаемые полиалкилцианоакрилатные наночастицы (Vauthier et al., Adv. Drug Del. Rev. 55: 519-48, 2003). Пероральная адсорбция может быть также усилена с использованием наночастиц на основе сополимера лактида и гликолида, покрытых хитозаном, который представляет собой мукоадгезивный катионный полимер. Метод получения таких наночастиц описан, например, Takeuchi et al. (Adv. Drug Del. Rev. 47: 39-54, 2001).

Известно, что среди биологически разлагаемых полимеров, используемых в настоящее время в медицине, PLA, PGA и PLGA являются, по существу, самыми безопасными, поскольку они подвергаются in vivo гидролизу с образованием безвредной молочной кислоты и гликолевой кислоты. Эти полимеры были использованы для изготовления материала для швов, которые не требуют их постхирургического удаления, и для изготовления инкапсулированного ацетата лейпролида, которые был одобрен FDA для его использования в медицине (Langer and Mose, Science 249: 1527, 1990); Gilding and Reed, Polymer 20: 1459, 1979; Morris, et al., Vaccine 12:5, 1994). Скорость разложения этих полимеров варьируется в зависимости от отношения гликолид/лактид и их молекулярной массы. Поэтому, высвобождение инкапсулированной молекулы (такой как белок или пептид) может поддерживаться в течение нескольких месяцев посредством коррекции молекулярной массы и отношения гликолид/лактид данного полимера, а также коррекции размера частиц и плотности покрытия препарата в виде капсулы (Holland, et al., J. Control. Rel. 4: 155, 1986).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы, используемые в описанных здесь композициях и способах, имеют диаметр приблизительно от 50 нм до 1000 нм. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы имеют размер приблизительно менее, чем 600 нм. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы имеют диаметр приблизительно от 100 нм до 600 нм. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы имеют диаметр приблизительно от 200 нм до 500 нм. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы имеют диаметр приблизительно от 300 нм до 450 нм. Специалисту в данной области хорошо известно, что размер наночастицы может варьироваться в зависимости от способа получения, клинического применения и типа используемого визуализирующего вещества.

Различные типы биологически разлагаемых и биосовместимых наночастиц, методы получения таких наночастиц, включая PLGA-наночастицы, и методы инкапсуляции различных синтетических соединений, белков и нуклеиновых кислот подробно описаны в литературе (см., например, публикацию заявки на патент США No. 2007/0148074; публикацию заявки на патент США No. 20070092575; публикацию заявки на патент США No. 2006/0246139; патент США No. 5753234; патент США No. 7081489; и публикацию заявки РСТ No. WO/2006/052285).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, одну или более человеческих клеток подвергают приведению в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках. Используемый здесь термин «человеческая клетка, которая повышает уровень экспрессии Zscan4» называется «человеческой Zscan4⁺-клеткой». Используемый здесь термин «Zscan4⁺-клетки» включает, но не ограничиваются ими, клетки, которые временно экспрессируют Zscan4. Таким образом, Zscan4⁺-клетки необязательно постоянно контактируют с Zscan4 или непрерывно экспрессируют Zscan4. Как описано в некоторых вариантах осуществления изобретения, действие Zscan4 является быстрым и обычно требует лишь временного и непродолжительного контакта (например, в течение нескольких часов или дней). В случае теломер, после их удлинения под временным действием Zscan4, уже не требуется длительного присутствия Zscan4, поскольку теломеры укорачиваются лишь постепенно. В соответствии с этим, термин «человеческие Zscan4⁺-клетки» может включать клетки, которые контактируют с агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4, и клетки, которые ранее контактировали с агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4, но больше уже не контактируют с этим агентом. Человеческие Zscan4⁺-клетки могут быть введены индивидууму, нуждающемуся в этом, для лечения расстройства или заболевания.

Индивидуумами, которые могут быть подвергнуты лечению описанными здесь способами, могут быть млекопитающие, такие как животные или человек. Индивидуумами могут быть плод, новорожденные, дети, подростки и/или взрослые. В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуума, который может быть подвергнут лечению, отбирают так, чтобы этот индивидуум поддавался лечению человеческими клетками, а в частности, лечение, которое включает введение человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках.

Примерами расстройств или заболеваний, которые могут поддаваться лечению путем введения человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, являются расстройства или заболевания, ассоциированные с укорочением теломеры. Другими примерами расстройств или заболеваний, которые могут поддаваться лечению путем введения человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, являются рак, аутоиммунные заболевания и заболевания, для лечения которых эффективной является регенерация клеток, такие как повреждения нервной системы или нейродегенеративные расстройства, а также слепота, глухота, потеря зубов, артрит, инфаркт миокарда, заболевания, ассоциированные с трансплантацией костного мозга, облысение, болезнь Крона, диабет, мышечная дистрофия и мышечная дистрофия Дюшенна. В конкретных примерах, для лечения указанных расстройств выбирают индивидуума, страдающего одним или более из этих расстройств.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуум согласно изобретению, нуждающийся в лечении путем введения Zscan4, страдает заболеванием или состоянием, ассоциированным с теломерной аберрацией. Термин «теломерная аберрация» может означать любое изменение в теломере, такое как укорочение теломеры, дизрупция теломерных ДНК-повторов или мутация теломерной ДНК, нарушающая одну или более функций теломеры. Репрезентативными заболеваниями или состояниями, которые ассоциируются с теломерой аберрацией, и которые могут поддаваться лечению с использованием человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть, но не ограничиваются ими, заболевания, ассоциированные с укорочением теломеры, синдромы недостаточности костного мозга, возрастные заболевания, ассоциированные с укорочением теломеры, и расстройства, ассоциированные с преждевременным старением.

Заболеваниями или состояниями, которые ассоциируются с укорочением теломеры, и которые могут поддаваться лечению с использованием человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть, но не ограничиваются ими, врожденный дискератоз, синдром Хейераала-Хрейдерсона, синдром Ревеша, синдром Коутса+, идиопатический фиброз легких, цирроз печени, фиброз поджелудочной железы и дегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и остеоартрит.

Заболеваниями или состояниями, которые представляют собой синдром недостаточности костного мозга, и которые могут поддаваться лечению с использованием человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть, но не ограничиваются ими, анемия Фанкони, амегакариоцитарная тробмоцитопения, апластическая анемия, анемия Даймонда-Блэкфана, врожденный дискератоз, ночная пароксизмальная гемоглобинурия (НПГ), синдром Пирсона, синдром Швахмана-Даймонда, тромбоцитопения и миелодиспластический синдром.

Заболеваниями или состояниями, которые представляют собой возрастное заболевание, ассоциирующееся с укорочением теломеры или преждевременным старением, и которые могут поддаваться лечению с использованием человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть, но не ограничиваются ими, синдром Вернера, синдром Блума, синдром Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированный со старением, кокаиновый синдром, пигментная ксеродермия, атаксия-телангиэктазия, синдром Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофия, синдром Юберга-Марсиди и синдром Дауна.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуум согласно изобретению страдает заболеванием или состоянием, ассоциированным с хромосомной аберрацией. Термин «хромосомная аберрация» может означать любую аномалию, аберрацию или мутацию в хромосоме, приводящие к уделению части хромосомной ДНК, к введению дополнительной части хромосомной ДНК или к изменению части хромосомной ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, хромосомная аберрация может быть обусловлена наличием числа хромосом, которое является нетипичным для данного вида, или структурными изменениями в одной или более хромосомах. В некоторых вариантах осуществления изобретения, хромосомная аберрация может включать кариотипическую аберрацию, такую как анеуплоидия. Используемый здесь термин «анеуплоидия» может означать аномальное число целых хромосом или частей хромосом, включая, но не ограничиваются ими, хромосомную нуллисомию, хромосомную моносомию, хромосомную трисомию, хромосомную тетрасомию и хромосомную пентасомию. Примерами человеческой анеуплоидии являются, но не ограничиваются ими, трисомия по хромосоме 21, трисомия по хромосоме 16, трисомия по хромосоме 18 (синдром Эдвардса), трисомия по хромосоме 13 (синдром Патау), моносомия по хромосоме X (синдром Тернера), анеуплоидия XXX, анеуплоидия XXY и анеуплоидия XYY. Примерами человеческой сегментарной анеуплоидии являются, но не ограничиваются ими, дупликация 1p36, синдром dup(17)(p11.2p11.2), болезнь Пелициуса-Мерцбахера, синдром dup(22)(q11.2q11.2) и синдром кошачьих глаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анеуплоидия может включать одну или более делеций половых и аутосомных хромосом, где указанные делеции могут вызывать такое состояние, как синдром кошачьего крика, синдром Вольфа-Хиршхорна, синдром Вильямса-Бейрена, болезнь Шарко-Мари-Туфа, наследственная невропатия с предрасположенностью к параличу от сдавливания нерва, синдром Смита-Маджениса, нейрофиброматоз, синдром Аладжилля, синдром ущемления небно-сердечно-челюстного нерва, синдром Ди Георга, заболевание, ассоциированное с дефицитом стероид-сульфатазы, синдром Кальмана, микрофтальмия, ассоциированная с дефектами линий клеток кожи, гипоплазия коры надпочечника, заболевание, ассоциированное с дефицитом глицерин-киназы, болезнь Пелициуса-Мерцбахера, заболевание, ассоциированное с фактором дифференцировки клеток яичек на хромосоме Y, азооспермия (фактор а), азооспермия (фактор b), азооспермия (фактор c) или заболевание, ассоциированное с делецией 1p36. В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки и/или агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть использованы для лечения анеуплоидии или заболевания, расстройства или состояния, ассоциированного с анеуплоидией.

Заболеваниями, расстройствами и состояниями различных типов, которые могут поддаваться лечению человеческими Zscan4⁺-клетками и/или агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, являются, но не ограничиваются ими, иммунодефицит, аутоиммунное заболевание, аутоиммунное расстройство, хронические язвы, атеросклероз, рак, нервное расстройство, дегенеративное расстройство, нейродегенеративное расстройство, заболевание, ассоциированное с заживлением ран, репарацией мышц и репарацией сердечной мышцы, заболевание, ассоциированное с замещением хрящевой ткани, артрит, остеоартрит, регенерация зубной ткани, слепота, возрастная слепота, вызываемая пролиферирующим разрушением пигментированных эпителиальных клеток сетчатки, глухота, недостаточность костного мозга, заболевание, ассоциированное с трансплантацией костного мозга, диабет, мышечная дистрофия, мышечная дистрофия Дюшенна, генетическое заболевание, генетическая мутация и заболевание, ассоциированное с повреждением ДНК.

Раковыми заболеваниями являются злокачественные опухоли, характеризующиеся аномальным или неконтролируемым ростом клеток. Рак часто ассоциируется с нестабильностью генома, хромосомными аберрациями, мутациями ДНК и аберрантной регуляцией теломеры. Принимая во внимание описанную здесь активность Zscan4, такую как повышение стабильности генома и коррекция хромосомных аберраций, лечение раковых пациентов может быть осуществлено путем введения биологических агентов Zscan4 согласно изобретению (например, агентов согласно изобретению, повышающих уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках). Как описано в примере 17 настоящей заявки, заявителем было обнаружено, что биологические агенты Zscan4 могут снижать уровень пролиферации раковых клеток. В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, агент согласно изобретению, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, может быть введен для предупреждения повышения инвазивности раковых клеток, обусловленного нестабильностью генома, хромосомными аберрациями, мутациями ДНК и/или аберрантной регуляцией теломеры. Кроме того, человеческие Zscan4⁺-клетки, такие как иммунные клетки, могут быть введены раковым пациентам для повышения способности их организма к подавлению роста раковых клеток. В других вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки могут быть введены пациентам, у которых уже была удалена опухоль, где для восстановления удаленных тканей и/или органов были использованы специфические клетки, дифференцированные из Zscan4⁺-клеток. В других вариантах осуществления изобретения, агент согласно изобретению, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, может быть введен для подавления роста (например, пролиферации) раковых клеток.

Известно, что раковые ткани человека (например, опухоли) содержат раковые стволовые клетки, которые не подвергаются активной пролиферации и являются резистентными к противораковой химиотерапии (например, к лечению химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатин). Очевидно, что раковые стволовые клетки могут быть резистентными к лечению химиотерапевтическими средствами, что может приводить к рецидиву рака после его лечения. Также очевидно, что в некоторых раковых стволовых клетках происходит экспрессия эндогенного ZSCAN4, в результате чего клетки приобретают резистентность к химиотерапевтическим средствам. Таким образом, очевидно, что агенты, снижающие уровень экспрессии эндогенного ZSCAN4, такие как киРНК или кшРНК, специфичные к ZSCAN4, могут быть введены раковым пациентам, которые проходят или будут проходить курс химиотерапии для снижения или устранения резистентности стволовых раковых клеток к одному или более химиотерапевтическим средствами и, тем самым, для повышения восприимчивости пациента к одному или более химиотерапевтическим средствам.

Репрезентативными раковыми заболеваниями, которые могут поддаваться лечению описанными здесь человеческими Zscan4⁺-клетками и/или агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, являются, но не ограничиваются ими, рак сердца (например, ангиосаркома, фибросаркома, рабдомиосаркома, липосаркома, миксома, рабдомиома, фиброма, липома и тератома), рак легких (например, бронхогенная карцинома (плоскоклеточная карцинома, недифференцированная мелкоклеточная карцинома, недифференцированная крупноклеточная карцинома, аденокарцинома)), альвеолярная (бронхолярная) карцинома, аденома бронхов, саркома, лимфома, хондроматозная гамартома, мезотелиома); рак желудочно-кишечного тракта (например, рак пищевода (плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома, лейомиосаркома, лимфома); рак желудка (карцинома, лимфома, лейомиосаркома); рак поджелудочная железы (аденокарцинома протоков, инсулинома, глюкагонома, гастринома, карциноидные опухоли, апудома); рак тонкого кишечника (аденокарцинома, лимфома, карциноидные опухоли, саркома Капоши, лейомиома, гемангиома, липома, нейрофиброма, фиброма); рак толстого кишечника (аденокарцинома, аденома канальцев, ворсинчатая аденома, гамартома, лейомиома); рак мочеполовых путей (например, рак почек (аденокарцинома, опухоль Вильмса, нефробластома, лимфома, лейкоз); рак мочевого пузыря и уретры (плоскоклеточная карцинома, карцинома переходных клеток, аденокарцинома); рак предстательной железы (аденокарцинома, саркома); рак яичек (семинома, тератома, эмбриональная карцинома, тератокарцинома, хориокарцинома, саркома, карцинома интерстициальных клеток, фиброма, фиброаденома, аденоматоидные опухоли, липома), рак печени (например, гепатома (гепатоцеллюлярная карцинома), холангиокарцинома, гепатобластома, ангиосаркома, гепатоцеллюлярная аденома, гемангиома)); рак кости (например, остеогенная саркома (остеосаркома), фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная лимфома (саркома клеток ретикулума), множественная миелома, злокачественная гигантоклеточная опухоль, хордома, остеохондрома (остеоэкзостоз хряща), доброкачественная хондрома, хондробластома, хондромиксофиброма, остеоидная остеома и гигантоклеточные опухоли); рак нервной системы (например, рак черепа (остеома, гемангиома, гранулемы, ксантома, деформирующий остеит); рак мозговой оболочки (менингиома, менингиосаркома, глиоматоза), рак головного мозга (астроцитома, медуллобластома, глиома, эпиндимома, герминома, пинеалома, мультиформная глиобластома, олигодендроглиома, шваннома, ретинобластома, наследственные опухоли), рак спинного мозга (нейрофиброма, менингиома, глиома, саркома)); рак женских половых органов (например, рак матки (карцинома эндометрия), рак шейки матки (карцинома шейки матки, предопухолевая дисплазия шейки матки), рак яичника (карцинома яичника, серозная цистаденокарцинома, цистаденокарцинома слизистой, эндометриоидные опухоли, опухоль Бреннера, светлоклеточная карцинома, неклассифицированная карцинома, гранулезные опухоли стромы яичника, клеточные опухоли Сертоли-Лейдига, дисгерминома, злокачественная тератома), рак вульвы (плоскоклеточная карцинома, интраэпителиальная карцинома, аденокарцинома, фибросаркома, меланома), рак влагалища (светлоклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, ботриоидная саркома, эмбриональная рабдомиосаркома, рак фаллопиевых труб (карцинома фаллопиевых труб); рак систем кровообращения (например, рак крови (миелоидный лейкоз (острый и хронический), острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, миелопролиферативные заболевания, множественная миелома, миелодиспластический синдром), болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома (злокачественная лимфома)); рак кожи (например, злокачественная меланома, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, саркома Капоши, хориоаденома, диспластические новообразования, липома, ангиома, дерматофиброма, келоидные рубцы, псориаз) и рак коры надпочечника (например, нейробластома).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, для лечения выбирают пациента, страдающего аутоиммунным заболеванием. Термин «аутоиммунное заболевание» может означать заболевание, вызываемое аберрантным иммунным ответом, таким как продуцирование антител или цитотоксических Т-клеток, специфичных к аутоантигену или к собственным клеткам или тканям индивидуума. Аутоиммунные заболевания могут быть обусловлены сверхактивным иммунным ответом организма против веществ и тканей, обычно присутствующих в организме. В некоторых примерах, аутоиммунное заболевание ограничивается заболеванием некоторых органов (например, тиреоидит) или может поражать конкретную ткань на различных участках (например, болезнь Гудпасчера, которая может поражать базальную мембрану в легких и в почках). В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки, такие как гемопоэтические стволовые клетки и/или иммунные клетки, и/или агент согласно изобретению, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть использованы для лечения аутоиммунного заболевания у индивидуума посредством коррекции иммунной системы пациента, страдающего аутоиммунным заболеванием. Репрезентативными аутоиммунными заболеваниями, которые могут поддаваться лечению описанными здесь человеческими Zscan4⁺-клетками и/или агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, являются, но не ограничиваются ими, ревматоидный артрит, ювенильный олигоартрит, артрит, индуцированный коллагеном, артрит, индуцированный адъювантом, синдрома Сьегрена, рассеянный склероз, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит), аутоиммунная атрофия желудка, вульгарная пузырчатка, псориаз, витилиго, диабет типа 1, диабет «тощих», тяжелая миастения, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, склерозирующий холангит, склерозирующий сиаладенит, системная красная волчанка, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, синдром Гудпасчера, болезнь Аддисона, системный склероз, полимиозит, дерматомиозит, аутоиммунная гемолитическая анемия и пернициозная анемия.

В некоторых вариантах осуществления изобретения был отобран индивидуум, страдающий нервным расстройством или нейродегенеративным расстройством. Термин «нервное расстройство» может означать травму нервной системы (такую как травма головного мозга или спинного мозга или специфических нейронов), которая негативно влияет на двигательную активность и/или память пациента с повреждением нервной системы. Так, например, такие пациенты могут страдать дизартрией (расстройством речи), гемипарезом или гемиплегией. Повреждения нервной системы могут быть вызваны травмой нервной системы (такой как травма головного мозга или спинного мозга или специфических нейронов), которая негативно влияет на двигательную активность и/или память пациента с повреждением нервной системы. Такие травмы могут быть вызваны инфекционным агентом (например, бактерией или вирусом); токсином; повреждениями в результате падения или другого несчастного случая; генетическим расстройством или другими неизвестными причинами. В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки, такие как гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки нервной системы, стволовые клетки мезенхимы и/или иммунные клетки и/или агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть использованы для лечения нервного расстройства у индивидуума путем омоложения стволовых клеток ткани нервной системы пациента, страдающего нервным расстройством, где такое омоложение стволовых клеток ткани нервной системы способствует продуцированию нейронов и глиальных клеток и, тем самым, устранению дефектов нервной системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такой пациент может страдать нервным расстройством, таким как поражение головного или спинного мозга, вызываемое несчастными случаями, такими как дорожно-транспортное происшествие или несчастный случай при нырянии, либо инсульт.

Нейродегенеративное заболевание представляет собой состояние, при котором происходит потеря клеток головного и спинного мозга. Нейродегенеративные заболевания вызываются повреждениями нейронов и их миелиновым слоем, что со временем приводит к дисфункции клеток и к инвалидности. Такие состояния могут приводить к нарушению двигательной способности (такому как атаксия) и к потере памяти (такой как деменция). В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки, такие как гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки нервной системы, стволовые клетки мезенхимы и/или иммунные клетки и/или агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, могут быть использованы для лечения нейродегенеративного заболевания у индивидуума путем омоложения стволовых клеток ткани нервной системы пациента, страдающего нейродегенеративным заболеванием, где омоложение стволовых клеток ткани нервной системы способствует продуцированию нейронов и глиальных клеток и, тем самым, устранению дефектов нервной системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки и/или указанный агент способствуют омоложению нервной системы индивидуума и устранению дегенеративных состояний или заболеваний. Репрезентативными примерами нейродегенеративных заболеваний, которые могут поддаваться лечению описанными здесь человеческими Zscan4⁺-клетками и/или агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, являются, но не ограничиваются ими, адренолейкодистрофия (AЛД), алкоголизм, болезнь Александера, болезнь Альпера, болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (болезнь Луи Герига), атаксия-телангиэктазия, болезнь Баттена (также известная как болезнь Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена), бычья спонгиформная энцефалопатия (БСЭ), болезнь Канавана, церебральный паралич, кокаиновый синдром, кортикобазальная дегенерация, болезнь Крейцфельда-Якоба, наследственная злокачественная бессоница, дегенерация передней височной доли, болезнь Гентингтона, ВИЧ-ассоциированная деменция, болезнь Кеннеди, болезнь Краббе, деменция телец Леви, нейроборрелиоз, болезнь Мачадо-Йозефа (атаксия спинного мозга и мозжечка типа 3), атрофия многих органов, рассеянный склероз, нарколепсия, болезнь Ньюмана-Пика, болезнь Паркинсона, болезнь Пелициуса-Мерцбахера, болезнь Пика, первичный боковой склероз, заболевания, вызываемые прионами, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Рефсума, болезнь Сандхоффа, болезнь Шильдера, подострая дегенерация спинного мозга, вызывающая пернициозную анемию, болезнь Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена (также известная как болезнь Баттена), атаксия спинного мозга и мозжечка, атрофия мышц спинного мозга, болезнь Стила-Ричардсона-Ольшевского, сухотка спинного мозга и токсическая энцефалопатия.

Человеческие Zscan4⁺-клетки могут быть получены или продуцированы описанными здесь методами. Методы введения человеческих Zscan4⁺-клеток млекопитающим известны специалистам. Так, например, человеческие Zscan4⁺-клетки вводят индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, путем инъекции, такой как подкожная, внутримышечная, интрадермальная, внутрибрюшинная, внутривенная или интраартериальная инъекция. В некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки вводят непосредственно в участок организма, требующий лечения, такой как орган или ткань, пораженные раком, или в головной или спинной мозг, пораженный раком. В некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки вводят отдельно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем (таким как носитель, инкапсулированный в подходящем полимере) или вместе с другими терапевтическими средствами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидууму вводят по меньшей мере 20000 человеческих Zscan4⁺-клеток, например, по меньшей мере 50000, по меньшей мере 100000, по меньшей мере 500000, по меньшей мере 1000000 или по меньшей мере 2000000 человеческих Zscan4⁺-клеток.

В некоторых своих аспектах, способы согласно изобретению включают применение терапевтического количества агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4. Термин «терапевтическое количество агента» может означать количество терапевтического агента, необходимое для достижения поставленной цели. Так, например, терапевтическим количеством человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, используемых для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с теломерной аберрацией, является количество, достаточное для лечения указанного заболевания или состояния или ослабления одного или более симптомов указанного заболевания или состояния. В некоторых примерах, терапевтическое количество не позволяет достичь 100%-ного излечения указанного заболевания или состояния или устранения симптомов такого заболевания или состояния. Однако, с использованием такого терапевтического количества может быть достигнуто ослабление любого известного признака или симптома заболевания или состояния, например, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или более. Терапевтическое количество данного терапевтического средства зависит от таких факторов, как природа указанного агента, способ его введения, масса и/или возраст индивидуума, которому вводят терапевтическое средство, а также цель такого введения. В каждом конкретном случае, терапевтическое количество может быть определено самим специалистом эмпирически без излишнего экспериментирования с применением известных методов.

В некоторых своих аспектах, способы согласно изобретению включают применение фармацевтического средства. Термин «фармацевтическое средство» может означать химическое соединение, небольшую молекулу или другую композицию, например, человеческие Zscan4⁺-клетки, которые, при их соответствующем введении индивидууму или в клетки индивидуума, будут индуцировать нужный терапевтический или профилактический эффект. Термин «инкубирование» включает взаимодействие лекарственного средства с клеткой в течение достаточного количества времени. Термин «приведение в контакт» включает инкубирование лекарственного средства в твердой или жидкой форме с клеткой.

Фармацевтически приемлемыми носителями, используемыми в настоящем изобретении, являются стандартные носители. В руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th Edition (1975) описаны композиции и препараты, подходящие для фармацевтической доставки описанных здесь белков Zscan4, молекул нуклеиновой кислоты Zscan4, ретиноидов, агентов, индуцирующих окислительный стресс, и клеток. Вообще говоря, природа носителя зависит от конкретного способа введения. Так, например, препараты для парентерального введения обычно содержат жидкости для инъекций, включающие в качестве носителя фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или т.п. Для твердых композиций (например, в форме порошка, гранул, таблеток или капсул), стандартными нетоксическими твердыми носителями могут быть, например, маннит, лактоза, крахмал или стеарат магния фармацевтической чистоты. Фармацевтические композиции для введения, помимо биологически нейтральных носителей, могут содержать небольшие количества нетоксических вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты и pH-забуферивающие агенты и т.п., например, ацетат натрия или монолаурат сорбитана.

В одном из примеров, человеческие Zscan4⁺-клетки или агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, инкапсулируют в полупроницаемую полимерную мембрану, и эту полимерную мембрану трансплантируют в ткань индивидуума-хозяина. С применением таких методов может быть осуществлена местная, длительная и непрерывная доставка терапевтического вещества с регулируемым высвобождением. См., например, патент США No. 5573528, где описан метод инкапсулирования соединений и клеток. В одном из вариантов осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки и/или агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, инкапсулируют в полимерную мембрану. Затем эту полимерную мембрану с инкапсулированными клетками трансплантируют в ткань индивидуума-хозяина. В одном из вариантов осуществления изобретения, указанной тканью является ткань центральной нервной системы, такой как головной или спинной мозг.

Полупроницаемая полимерная мембрана может быть синтетической или природной. Примерами полимера, который может быть использован, являются полиэфирсульфон (PES), сополимер полиакрилонитрила и винилхлорида (P[AN/VC], полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислоты, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, коллаген и т.п. Доставка инкапсулированных в полимерную мембрану человеческих Zscan4⁺-клеток и/или агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, позволяет избежать отторжения этих клеток хозяином и вырабатывания иммунного ответа на эти клетки, а также решить проблемы, связанные с реакцией отторжения и воспаления. Кроме того, клетки, содержащиеся в полимерной мембране, защищены полимерной стенкой (то есть стенками отдельных волокон, фибрилл, пленок, спреев, капелек, частиц и т.п.) от иммунного «надзора», но, при этом, эти клетки сохраняют жизнеспособность и способность к транспорту молекул, питательных веществ и продуктов метаболизма через полимерные стенки. Трансплантация инкапсулированных в полимере клеток была разработана Aebischer et al., 1991, Transplant, 111:269-275, и успешно применена для лечения приматов, не являющихся человеком, и человека (Aebischer et al., 1994, Transplant, 58: 1275-1277). См. также патент США No. 6110902.

В одном из вариантов осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки были сначала инкапсулированы путем их заливки в матрицу, состоящую из коллагена, агарозы или ПВС (поливинилового спирта). Затем, эти инкапсулированные клетки были введены в полые волокна, изготовленные из полипропилена, состоящего из сополимера полиакрилонитрила:поливинилхлорида (60:40). Перед имплантацией, эти волокна были разрезаны на кусочки, концы которых были запаяны. В одном из вариантов осуществления изобретения, инкапсулированные имплантаты содержат приблизительно от 20000 до 2000000 человеческих Zscan4⁺-клеток.

В некоторых примерах, человеческие Zscan4⁺-клетки являются экзогенными. Термин «экзогенные клетки» может означать клетки, полученные из источников, не принадлежащих индивидууму, которому они были имплантированы для лечения. Экзогенные клетки могут происходить от других организмов того же вида (таких как человеческие клетки, используемые для введения человеку). Экзогенные клетки могут также происходить от гетерологичных источников, то есть от вида, не принадлежащего к виду индивидуума, подвергаемого терапевтическому лечению (например, такими экзогенными клетками могут быть мышиные клетки, используемые для введения человеку). Человеческие Zscan4⁺-клетки могут быть также взяты из изогенного источника, то есть у индивидуума, которому вводят эти клетки. После взятия клеток у индивидуума, они могут быть генетически модифицированы (например, в них может быть введена нуклеиновая кислота, кодирующая Zscan4), либо они могут быть отобраны на наличие человеческих Zscan4⁺-клеток/обогащены этими клетками, а затем снова имплантированы индивидууму. Поскольку эти клетки являются изогенными, то, предполагается, что они не будут индуцировать вырабатывание иммунного ответа.

В одном из аспектов изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки являются иммортализованными. Неограничивающими примерами являются клетки, которые могут быть иммортализованы в определенных условиях (таких, при которых эти клетки будут хорошо расти в тканевой культуре при пониженных температурах, но их деление будет прерываться после имплантации пациенту и при хранении при 37°C) или конститутивно иммортализованы (например, путем трансфекции конструкциями, экспрессирующими большой Т-антиген, или путем иммортализации вирусом Эпштейна-Барра) методами, хорошо известными специалистам. Другим способом доставки человеческих Zscan4⁺-клеток индивидууму-хозяину является прямая трансплантация клеток в нужный участок ткани. После трансплантации, эти клетки остаются живыми, мигрируют в ткань хозяина и полностью интегрируются в эту ткань. В одном из вариантов осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки трансплантируют непосредственно в нервную систему индивидуума-хозяина, такую как развивающаяся нервная система или нервная система, поврежденная в результате травмы, или в нервную систему индивидуума, страдающего нервным расстройством. Человеческие Zscan4⁺-клетки, при их трансплантации в развивающуюся нервную систему, будут участвовать в процессах нормального развития и реагировать на признаки развития организма хозяина. Трансплантированные нервные клетки-предшественники будут мигрировать по установленным путям миграции и будут широко распространяться в диссеминированные области нервной системы, а также будут подвергаться дифференцировке по временному и региональному механизму с образованием потомства от нейронных и глиальных линий дифференцировки в соответствии с программой развития организма хозяина. Трансплантированные человеческие Zscan4⁺-клетки способны к недизруптивной интеграции с нервными клетками-предшественниками хозяина, а также с дифференцированными клетками. Трансплантированные клетки могут заменять популяции специфических дефицитных нейронных или глиальных клеток, восстанавливать их нарушенные функции и экспрессировать чужеродные гены в областях локализации широкого ряда.

Человеческие Zscan4⁺-клетки могут быть также трансплантированы в уже развитую нервную систему. Трансплантированные нервные клетки-предшественники могут образовывать стабильный траснплантат, могут мигрировать в нервную систему хозяина, а также смешиваться и взаимодействовать с клетками-предшественниками и дифференцированными клетками нервной системы хозяина. Эти клетки могут заменять популяции специфических дефицитных нейронных или глиальных клеток, восстанавливать их нарушенные функции и активировать процессы регенерации и заживления в нервной системе хозяина. В одном из вариантов осуществления изобретения, стабильным трансплантатом является трансплантат, прижившийся в центральной нервной системе или в периферической нервной системе.

Аналогичные методы могут быть применены для непосредственной трансплантации человеческих Zscan4⁺-клеток в любую область организма человека, нуждающуюся в клеточной терапии с использованием человеческих клеток. Такие клетки могут быть недифференцированными, либо они могут быть дифференцированы в клетки нужного типа in vitro (а затем введены индивидууму, нуждающемуся в этом). Так, например, если желательной является регенерация органа, то органы или ткани (например, зубы, волосы, ушные или глазные клетки, клетки кожи или мышц), удаленные в результате лечения рака или по другим причинам, могут быть заменены другими органами или тканями. В одном из вариантов осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки непосредственно трансплантируют в сердце, например, для регенерации сердечных тканей или клеток, поврежденных в результате инфаркта миокарда. В одном из вариантов осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки непосредственно трансплантируют в поджелудочную железу, например, для регенерации клеток у индивидуума с диабетом. В одном из вариантов осуществления изобретения, человеческие Zscan4⁺-клетки непосредственно трансплантируют в кость или вводят системно, например, для регенерации клеток костного мозга индивидуума, страдающего раком.

Терапевтические дозы и схемы введения, наиболее приемлемые для лечения пациента, могут варьироваться в зависимости от типа заболевания или состояния, подвергаемого лечению, а также от массы пациента и других факторов. Эффективная доза и протокол лечения могут быть установлены стандартными способами, то есть сначала вводят низкую дозу, обычно используемую для лабораторных животных, а затем эту дозу увеличивают с мониторингом эффектов и систематическим варьированием схемы введения доз. При определении оптимальной дозы для каждого конкретного индивидуума, врач-клиницист может принять во внимание различные факторы. Такими факторами являются масса пациента, возраст пациента, общее состояние здоровья пациента, конкретное заболевание, подвергаемое лечению, тяжесть такого заболевания, использование пациентом других лекарственных средств и т.п. Экспериментальные дозы могут быть выбраны по результатам исследования на животных и могут быть взяты из медицинской литературы.

В соответствии с этим, человеческие Zscan4⁺-клетки и/или агент, повышающий уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках, вводят индивидуумам для ослабления или устранения симптомов, ассоциированных с конкретным расстройством, а в частности, с теломерными аберрациями. Терапевтическими конечными точками для лечения рака могут быть снижение размера или объема опухоли, снижение степени опухолевого ангиогенеза или уменьшение метастазов опухоли. Если опухоль была удалена, то другой терапевтической конечной точкой может быть регенерация удаленных тканей или органов. Эффективность лечения рака может быть определена методами, описанными в литературе, например, путем визуализации опухоли или детектирования опухолевых маркеров или других индикаторов наличия рака. Терапевтическими конечными точками для лечения аутоиммунных заболеваний могут быть снижение аутоиммунного ответа. Эффективность лечения аутоиммунных заболеваний может быть определена методами, описанными в литературе, например, путем оценки уровня аутоиммунных антител, где снижение уровня таких антител у индивидуума, прошедшего лечение, указывает на успешно проведенную терапию. Терапевтическими конечными точками для лечения нейродегенеративных расстройств могут быть снижение дефицита нейродегенеративных функций, например, улучшение двигательной способности, улучшение памяти или устранение поведенческого расстройства. Эффективность лечения нейродегенеративных расстройств может быть определена методами, описанными в литературе, например, путем оценки нарушения познавательных способностей, где улучшение познавательных способностей у индивидуума, прошедшего лечение, указывает на успешно проведенную терапию. Терапевтическими конечными точками для лечения нервных расстройств могут быть снижение нарушений, ассоциированных с такими расстройствами, например, улучшение двигательной способности, улучшение памяти или устранение поведенческого расстройства. Эффективность лечения нервных расстройств может быть определена методами, описанными в литературе, например, путем оценки подвижности и гибкости, где улучшение таких функций у индивидуума, прошедшего лечение, указывает на успешно проведенную терапию. Такое лечение необязательно дает 100%-ную эффективность. Эффективным считается снижение тяжести заболевания (или его симптомов) по меньшей мере приблизительно на 10%, приблизительно на 15%, приблизительно на 25%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50% или более по сравнению, например, с заболеванием, не подвергаемым лечению человеческими Zscan4⁺-клетками и/или агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в человеческих клетках.

В некоторых примерах, человеческие Zscan4⁺-клетки вводят мышам или другому небольшому млекопитающему в дозе, составляющей приблизительно от 1×10⁴ клеток до 1×10⁷ клеток, или человеку или другому крупному млекопитающему в дозе, составляющей приблизительно от 1×10⁴ клеток до 1×10¹⁰ клеток. В одном конкретном неограничивающем варианте осуществления изобретения, терапевтически эффективное количество составляет приблизительно 1×10⁶ клеток. Для достижения желаемого эффекта у индивидуума, подвергаемого лечению, другие терапевтические средства (например, химические соединения, небольшие молекулы или пептиды) могут быть введены в терапевтически эффективной дозе в комбинации с человеческими Zscan4⁺-клетками (например, они могут быть введены непосредственно до или сразу после введения этих клеток, или одновременно с их введением). Эффективное количество человеческих Zscan4⁺-клеток может быть введено в виде разовой дозы или дробных доз, например, ежедневно во время всего курса лечения. Однако, для специалиста в данной области очевидно, что эффективное количество человеческих Zscan4⁺-клеток зависит от типа используемого агента, от конкретного индивидуума, подвергаемого лечению, от тяжести и типа заболевания и от способа введения агента.

Агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть использованы для омоложения кожи, лечения атопического дерматита или устранения кожных поражений у индивидуума, нуждающегося в этом, например, путем нанесения агента согласно изобретению, повышающего уровень экспрессии Zscan4, на кожу указанного индивидуума.

Агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть использованы для лечения облысения путем стимуляции роста волос у индивидуума, нуждающегося в этом, например, путем нанесения агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, на волосистую часть головы указанного индивидуума. Агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут также быть использованы для предупреждения или устранения поседения у индивидуума, нуждающегося в этом, путем нанесения агента согласно изобретению, повышающего уровень экспрессии Zscan4, на волосистую часть головы в целях увеличения длины теломеры и/или повышения стабильности генома меланоцитарных стволовых клеток в волосяных фолликулах, дисфункция которых вызывает поседение.

Как описано в настоящей заявке, стволовые клетки лимба регенерируют роговицу, а поэтому, очевидно, что увеличение длины теломеры и/или повышение стабильности генома в стволовых клеток лимба в результате повышения уровня экспрессии Zscan4 будет способствовать омоложению роговицы у индивидуума, нуждающегося в этом. Повышение экспрессии Zscan4 в роговице может быть также использовано для лечения «сухого глаза» у индивидуума, нуждающегося в этом. В соответствии с этим, агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть также использованы для омоложения роговицы и/или для лечения «сухого глаза» у индивидуума, нуждающегося в этом, например, путем введения агента согласно изобретению, повышающего уровень экспрессии Zscan4, в роговицу указанного индивидуума.

Как описано в настоящей заявке, известно, что идиопатический фиброз легких вызывается укорочением теломеры. В соответствии с этим, агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть также использованы для лечения идиопатического фиброза легких у индивидуума, нуждающегося в этом, например, путем приготовления агента согласно изобретению, повышающего уровень экспрессии Zscan4 (например, полинуклеотида Zscan4 согласно изобретению) так, чтобы этот агент мог быть введен путем ингаляции индивидууму для лечения идиопатического фиброза легких.

Агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть также использованы для лечения атеросклероза и/или ишемической болезни сердца у индивидуума, нуждающегося в этом, например, путем введения агента, повышающего уровень экспрессии Zscan4, в кровоток индивидуума так, чтобы этот агент контактировал с васкулярными эндотелиальными клетками и способствовал увеличению длины теломеры и/или повышению стабильности генома в этих клетках, где указанное введение осуществляют для лечения атеросклероза и/или ишемической болезни сердца у указанного индивидуума.

Агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть также использованы для сообщения резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках и/или у индивидуума, нуждающегося в этом, например, посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4 (например, полинуклеотида Zscan4 согласно изобретению) или введения указанного агента индивидууму, нуждающемуся в этом, так, чтобы повышение уровня экспрессии Zscan4 приводило к повышению резистентности к одному или более генотоксическим агентам в одной или более человеческих клетках или в организме индивидуума. При этом предпочтительно, чтобы экспрессия Zscan4 сообщала резистентность к любому известному генотоксическому агенту или лекарственному средству, включая, но не ограничиваясь ими, митомицин С и цисплатин.

Известно, что в геноме иПС-клеток присутствуют области, в которых паттерны метилирования ДНК отличаются от паттернов метилирования ДНК человеческих эмбриональных стволовых (ЭC) клеток, что, очевидно, создает проблемы при использовании иПС-клеток (см., например, Ohi, Y et al., Nat. Cell Biol. 2011 May;13(5):541-9). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут улучшать функцию иПС-клеток благодаря индуцированию паттерна метилирования ДНК в человеческих иПС-клетках, более сходного с паттерном метилирования ДНК в человеческих ЭC-клетках. Также очевидно, что индуцирование паттерна метилирования ДНК в человеческих иПС-клеток, более сходного с паттерном метилирования ДНК в человеческих ЭC-клетках, может делать такие клетки более безопасными при их применении в терапии. В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть использованы для индуцирования паттерна метилирования ДНК в одной или более человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клетках, аналогичного паттерну метилирования ДНК в человеческих эмбриональных стволовых клетках, например, посредством приведения одной или более человеческих иПС-клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 (например, полинуклеотида Zscan4 согласно изобретению), так, чтобы повышение уровня экспрессии Zscan4 способствовало индуцированию паттерна метилирования ДНК в одной или более человеческих иПС-клетках, аналогичного паттерну метилирования ДНК в человеческих эмбриональных стволовых клетках.

Агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть использованы для омоложения старых ооцитов и коррекции кариотипических аберраций в ооцитах и в оплодотворенных in vitro ооцитах, таких как зиготы или предварительно имплантированные эмбрионы, которые представляют собой эмбрионы в промежуточной стадии развития между образованием одной клетки и образованием бластоциста, где указанное омоложение осуществляют для повышения шанса успешного оплодотворения in vitro (IVF) и успешного протекания беременности у женщин в позднем периоде детородного возраста; а также они могут быть использованы для коррекции кариотипических аберраций, таких как анеуплоидия, и для снижения риска развития расстройств, таких как синдром Дауна. Такое лечение может быть, в частности, осуществлено для оплодотворения in vitro (IVF) и в клиниках, специализирующихся по искусственному оплодотворению (IVF-клиниках). В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть использованы для омоложения одного или более человеческих ооцитов, повышения стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах и/или коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах, например, посредством приведения одного или более человеческих ооцитов в контакт с агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4 (например, полинуклеотида Zscan4 согласно изобретению), так, чтобы повышение уровня экспрессии Zscan4 способствовало омоложению одного или более человеческих ооцитов, повышению стабильности генома в одном или более человеческих ооцитах и/или коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более человеческих ооцитах. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более человеческих ооцитов выделяют у индивидуума перед приведением этих ооцитов в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4. В других вариантах осуществления изобретения, после обработки одного или более человеческих ооцитов агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4, эти клетки подвергают оплодотворению in vitro.

В других вариантах осуществления изобретения, агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть использованы для повышения стабильности генома и/или коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах, например, посредством приведения одного или более оплодотворенных человеческих ооцитов в контакт с агентом согласно изобретению, повышающим уровень экспрессии Zscan4 (например, полинуклеотида Zscan4 согласно изобретению), так, чтобы повышение уровня экспрессии Zscan4 способствовало повышению стабильности генома и/или коррекции одной или более кариотипических аберраций в одном или более оплодотворенных человеческих ооцитах. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более оплодотворенных человеческих ооцитов были оплодотворены in vitro до их приведения в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4. В других вариантах осуществления изобретения, один или более человеческих ооцитов выделяют у индивидуума до оплодотворения. В других вариантах осуществления изобретения, один или более оплодотворенных человеческих ооцитов представляют собой предварительно имплантированные эмбрионы промежуточной стадии развития между образованием одной клетки и образованием бластоциста.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, агенты согласно изобретению, повышающие уровень экспрессии Zscan4, могут быть использованы для коррекции одной или более кариотипических аберраций, которыми являются, но не ограничиваются ими, анеуплоидия, такая как трисомия по хромосоме 21 (синдром Дауна), трисомия по хромосоме 16, трисомия по хромосоме 18 (синдром Эдвардса), трисомия по хромосоме 13 (синдром Патау), моносомия по хромосоме X (синдром Тернера), анеуплоидия XXX, анеуплоидия XXY и анеуплоидия XYY; сегментарная анеуплоидия, такая как дупликация 1p36, синдром dup(17)(p11.2p11.2), болезнь Пелициуса-Мерцбахера, синдром dup(22)(q11.2q11.2) и синдром кошачьих глаз; и состояния, такие как синдром кошачьего крика, синдром Вольфа-Хиршхорна, синдром Вильямса-Бейрена, болезнь Шарко-Мари-Туфа, наследственная невропатия с предрасположенностью к параличу от сдавливания нерва, синдром Смита-Маджениса, нейрофиброматоз, синдром Аладжилля, синдром ущемления небно-сердечно-челюстного нерва, синдром Ди Георга, заболевание, ассоциированное с дефицитом стероид-сульфатазы, синдром Кальмана, микрофтальмия, ассоциированная с дефектами линий клеток кожи, гипоплазия коры надпочечника, заболевание, ассоциированное с дефицитом глицерин-киназы, болезнь Пелициуса-Мерцбахера, заболевание, ассоциированное с фактором дифференцировки клеток яичек на хромосоме Y, азооспермия (фактор a), азооспермия (фактор b), азооспермия (фактор c) и заболевание, ассоциированное с делецией 1p36.

Как описано в настоящей заявке, человеческие гены SERPINB4, DNMT3L и DUX4 представляют собой маркерные гены, экспрессия которых не регулируется, если ген Zscan4 экспрессируется в человеческих клетках. Таким образом, очевидно, что SERPINB4, DNMT3L и DUX4 могут быть использованы в качестве маркеров эффектов Zscan4 в человеческих клетках. В соответствии с этим, в некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам определения одного или более Zscan4-индуцированных эффектов в одной или более человеческих клетках, например, посредством приведения одной или более человеческих клеток в контакт с агентом, повышающим уровень экспрессии Zscan4 в одной или более человеческих клетках; измерения уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках; и сравнения уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках с уровнями экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более соответствующих человеческих клетках, которые не были подвергнуты контактированию с этим агентом, где повышение уровней экспрессии SERPINB4, DNMT3L и/или DUX4 в одной или более человеческих клетках указывает на Zscan4-индуцирование одного или более эффектов в одной или более человеческих клетках.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумами согласно изобретению могут быть животные, не являющиеся человеком. Термин «животные, не являющиеся человеком» может включать всех животных, кроме человека. Термин «животные, не являющиеся человеком» включает, но не ограничивается ими, приматов, не являющихся человеком; сельскохозяйственных животных, таких как свиньи, крупный рогатый скот и домашняя птица; животных, участвующих в спортивных состязаниях, или животных-компаньонов, таких как собаки, кошки, лошади, хомячки; грызунов, таких как мыши; или животных, содержащихся в зоопарках, таких как львы, тигры или медведи. В одном из вариантов осуществления изобретения, животное, не являющееся человеком, представляет собой мышь.

Если это не оговорено особо, то все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значения, в основном, понятные среднему специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Артикли «a», «an» и «the», употребляемые с существительными в единственном числе, могут относиться и к существительным во множественном числе, если из контекста описания не следует обратное. Аналогичным образом, союз «или» может быть заменен союзом «и», если из контекста описания не следует обратное. Следовательно, словосочетание «содержащий А или В» означает включающий А или В, либо включающий А и В. Следует также отметить, что все размеры молекул оснований или аминокислот, а также все значения молекулярных весов или молекулярных масс, указанные для нуклеиновых кислот и полипептидов, являются приблизительными и приводятся в настоящем описании лишь в иллюстративных целях. Хотя для практического осуществления настоящего изобретения или для проведения описанных здесь анализов могут быть применены методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь методам и материалам, однако, предпочтительными являются методы, и материалы, описанные ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие цитируемые здесь документы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В случае возникновения противоречий, связанных с любыми определениями, представленными в настоящей заявке, следует отдать предпочтение определению терминов, приведенному в настоящем описании. Кроме того, представленные здесь материалы, методы и примеры приводятся лишь в целях иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничение изобретения.

Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации некоторых конкретных отличительных признаков и/или вариантов осуществления изобретения. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничение изобретения конкретными отличительными признаками или вариантами, описанными в настоящей заявке.

Примеры

Пример 1: Экспрессия Zscan4 корректирует хромосомные аберрации в мышиных эмбриональных стволовых клетках

В этом примере показано, что экспрессия Zscan4 синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4, может индуцировать коррекцию хромосомных аберраций в мышиных эмбриональных стволовых клетках (ЭC). В этом примере также продемонстрировано, что синтетические мРНК, кодирующие Zscan4, или вектор на основе вируса Сендай, экспрессирующий Zscan4, могут быть использованы в качестве биологических агентов, применяемых в терапии.

Материалы и методы

Клеточная культура

Клеточная ЭC-линия мыши MCIZE была описана в литературе (Amano et al., Nat. Commun, 2013; 4: 1966). Клетки мышей MCIZE были использованы как типичные мышиные ЭC-клетки с кариотипической аберрацией (то есть только приблизительно 20% клеток этих мышей имеют эуплоидию), что было обусловлено длительным культивированием (число пассажей=33) и интеграцией экзогенного гена. Клетки культивировали при 37°C в 5% CО₂ в полной среде для ЭC-клеток как описано в литературе (Amano et al., Nat. Commun, 2013; 4: 1966), где указанная среда включает: DMEM (Gibco), 15% FBS (Atlanta Biologicals), 1000 ед./мл фактора ингибирования лейкоза (LIF) (ESGRO, Chemicon), 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA), 2 мМ GlutaMAX, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола и пенициллин/стрептомицин (50 ед./50 мкг/мл). Затем среду ежедневно заменяли, и клетки подвергали рутинному пересеву через каждые 2-3 дня.

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5;7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Me-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Векторы на основе вируса Сендай

Векторы на основе вируса Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZscan4» или «SeVhZSCAN4», соответственно. В качестве контроля использовали тот же самый вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. В этих векторах Сендай отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+mZERT2/ΔF), или человеческий ZSCAN4, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+hZERT2/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Такие векторы обозначены здесь «SeVmZERT2» или «SeVhZERT2», соответственно. В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Кроме того, термочувствительные векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/TS15ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZscan4-TS15» или «SeVhZSCAN4-TS15», соответственно. Эти векторы Сендай являются функциональными при 35°C и неактивными при 37°C (Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(34): 14234-14239). В качестве контроля использовали тот же самый вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. Этот вектор обозначен здесь «SeVAG-TS15». В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Кариотипический анализ

Кариотипический анализ осуществляли посредством G-бэндинга, как описано Amano et al., Nat Commun, 2013;4: 1966.

Результаты

Синтетические мРНК, кодирующие мышиный или человеческий ZSCAN4, корректируют хромосомные аберрации в мышиных эмбриональных стволовых клетках

На фиг. 1A проиллюстрирована экспериментальная процедура. ЭC-клетки мышей MCIZE (при пассаже 33) высевали в 6-луночный планшет при концентрации 5×l0⁴ клеток/лунку и трансфецировали 1 мкг синтетических GFP-мРНК (контроль) или 1 мкг синтетических человеческих ZSCAN4-мРНК с использованием 5 мкл липофектамина (RNAiMAX: Life Technologies, California, USA). В качестве контроля, помимо клеток, трансфецированных GFP-мРНК, использовали также нетрансфецированные клетки. Клетки пересевали через каждые 2-3 дня, а затем трансфецировали синтетическими мРНК. Кариотипирование клеток осуществляли при пассаже 33 (через 3 дня после однократной трансфекции), при пассаже 34 (через 3 дня после трехкратной трансфекции), при пассаже 36 (через 3 дня после 4-кратной трансфекции) и при пассаже 40 (через 3 дня после 7-кратной трансфекции).

Как показано на фиг. 1B, трансфекция мышиных ЭC-клеток синтетическими мРНК человеческого ZSCAN4 приводила к коррекции хромосомных аберраций и к повышению числа клеток с нормальным кариотипом (эуплоидией). Хотя однократной трансфекции было достаточно для выявления значительного уровня коррекции, однако, повторные трансфекции (например, семикратные) приводили к еще большему увеличению числа клеток с эуплоидией, то есть приблизительно от 20% до 40%. Эти результаты показали, что введение человеческих ZSCAN4-мРНК в клетки может обеспечивать коррекцию ряда хромосомных аберраций.

Векторы на основе вируса Сендай, экспрессирующие человеческий ZSCAN4, корректируют хромосомные аберрации в мышиных эмбриональных стволовых клетках

На фиг. 2A в общих чертах проиллюстрирован кариотипический анализ, проводимый после обработки мышиных ЭC-клеток вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим мышиный Zscan4c или человеческий ZSCAN4. ЭC-клетки мышей MCIZE (при пассаже 33 или 34) высевали в 6-луночный планшет при концентрации 5×l0⁴ клеток/лунку и обрабатывали либо SeVAG (контроль), либо SeVmZscan4, либо SeVhZSCAN4 при множественности заражения (MOI), указанной на фиг. 2A. В качестве дополнительного контроля использовали клетки MCIZE, которые вообще не подвергали обработке. Через 3 дня проводили кариотипический анализ клеток. Как показано на фиг. 2A, кариотип мышиных ЭC-клеток значительно улучшался после приведения этих клеток в контакт с SeVmZscan4 или SeVhZSCAN4. Интересно отметить, что результаты, полученные для человеческого ZSCAN4, были лучше, чем результаты, полученные для мышиного Zscan4c.

На фиг. 2В в общих чертах проиллюстрирован кариотипический анализ, проводимый после обработки ЭC-клеток мышей MCIZE вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим мышиный гибридный белок Zscan4c-ERT2 или человеческий гибридный белок ZSCAN4-ERT2. Известно, что белок, присоединенный к домену ERT2, может быть активирован в присутствии тамоксифена (Tmx) в среде для культивирования клеток. ЭC-клетки мышей MCIZE (при пассаже 33 или 34) высевали в 6-луночный планшет при концентрации 5×l0⁴ клеток/лунку и обрабатывали либо SeVmZERT2, либо SeVhZERT2 при множественности заражения (MOI), указанной на фиг. 2В. В качестве контроля использовали клетки MCIZE, которые вообще не подвергали обработке. Как показано на фиг. 2В, обработка SeVmZERT2 или SeVhZERT2 может корректировать хромосомные аберрации даже в отсутствии Tmx. Однако, добавление Tmx еще больше повышало способность SeVmZERT2 и SeVhZERT2 корректировать хромосомные аберрации. Результаты, полученные для человеческого ZSCAN4, были лучше, чем результаты, полученные для мышиного Zscan4c, то есть гибридный белок, а именно, человеческий ZSCAN4-ERT2, в присутствии Tmx, давал еще большее увеличение числа клеток с эуплоидией, то есть с 15% до 53%.

На фиг. 3 в общих чертах проиллюстрирован кариотипический анализ, проводимый после обработки ЭC-клеток мышей MCIZE термочувствительным вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим мышиный Zscan4c или человеческий ZSCAN4. ЭC-клетки мышей MCIZE (при пассаже 33 или 34) высевали в 6-луночный планшет при концентрации 5×l0⁴ клеток/лунку и обрабатывали либо SeVAG-TS15 (контроль), либо SeVmZscan4-TS15, либо SeVhZSCAN4-TS15 при множественности заражения (MOI), указанной на фиг. 3. В качестве дополнительного контроля использовали клетки MCIZE, которые вообще не подвергали обработке. После приведения клеток в контакт с этими векторами, клетки культивировали при 35°C в течение трех дней (фиг. 3A), при 35°C в течение шести дней (фиг. 3B) и при 35°C в течение трех дней, а затем при 37°C в течение трех дней (фиг. 3C). Коррекция хромосомных аберраций после приведения клеток в контакт с SeVmZscan4-TS15 или SeVhZSCAN4-TS15 наблюдалась во всех трех условиях. Неожиданно было обнаружено, что человеческий ZSCAN4 давал лучший результат в отношении коррекции хромосомных аберраций, чем мышиный Zscan4с. Таким образом, неожиданно было обнаружено, что даже в мышиных клетках, человеческий ZSCAN4 давал лучшие результаты, чем мышиный Zscan4с. Действительно, наилучший результат был получен путем обработки клеток человеческим ZSCAN4 (то есть SeVhZSCAN4-TS15) и культивирования клеток при 35°C в течение трех дней, а затем при 37°C в течение трех дней, причем, такая обработка приводила к повышению числа клеток с эуплоидией с 19% до 53%. В этих экспериментах, культивирование клеток, обработанных термочувствительными векторами на основе вируса Сендай при допустимой температуре 35°C в течение трех дней, а затем культивирование клеток при инактивирующей температуре 37°C в течение трех дней приводило к временной экспрессии Zscan4. В противоположность этому, культивирование клеток, обработанных термочувствительными векторами на основе вируса Сендай при допустимой температуре 35°C в течение всех шести дней, приводило к перманентной экспрессии Zscan4. Результаты, полученные при этих условиях, показали, временная экспрессия Zscan4 обеспечивает лучшую коррекцию хромосомных аберраций, чем перманентная экспрессия Zscan4.

Пример 2: Влияние биологических агентов Zscan4 на мышиные эмбриональные стволовые клетки

Ранее было показано, что искусственно индуцированная экспрессия экзогенного мышиного Zscan4c в плазмидном векторе, интегрированном в мышиный геном, инициирует экспрессию уникального набора генов, включая гены Tmem92, Stra8 и эндогенные гены Zscan4 (Amano et al., Nat. Commun, 2013;4: 1966).

В этом примере продемонстрировано, что биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, либо вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) обладают такой же функцией в мышиных эмбриональных стволовых клетках (ЭC-клетках).

Материалы и методы

Клеточная культура

Эмбриональная линия стволовых клеток (ЭC) мышей MC1 была ранее использована как типичные мышиные плюрипотентные стволовые клетки для подтверждения функции экзогенно вводимого гена Zscan4с, который был интегрирован в мышиный геном (Amano et al., Nat. Commun, 2013; 4: 1966). Клетки MC1 культивировали при 37°C в 5% CО₂ в полной среде для ЭC-клеток как описано в литературе (Amano et al., Nat. Commun, 2013; 4: 1966), где указанная среда включает: DMEM (Gibco), 15% FBS (Atlanta Biologicals), 1000 ед./мл фактора ингибирования лейкоза (LIF) (ESGRO, Chemicon), 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA), 2 мМ GlutaMAX, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола и пенициллин/стрептомицин (50 ед./50 мкг/мл). Затем среду ежедневно заменяли, и клетки подвергали рутинному пересеву через каждые 2-3 дня.

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5;7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Me-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Векторы на основе вируса Сендай

Векторы на основе вируса Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Такие векторы обозначены здесь «SeVmZscan4» или «SeVhZSCAN4», соответственно. В качестве контроля использовали тот же самый вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. В этих векторах Сендай отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+mZERT2/ΔF), или человеческий ZSCAN4, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+hZERT2/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Такие векторы обозначены здесь «SeVmZERT2» или «SeVhZERT2», соответственно. В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Кроме того, термочувствительные векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/TS15ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZscan4-TS15» или «SeVhZSCAN4-TS15», соответственно. Эти векторы Сендай являются функциональными при 35°C и неактивными при 37°C (Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(34): 14234-14239). В качестве контроля использовали тот же самый термочувствительный вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. Такой вектор обозначен здесь «SeVAG-TS15». В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Результаты

На фиг. 4A представлены результаты кол.ОТ-ПЦР-анализа и мониторинга уровней экспрессии Tmem92, Stra8, Actb (бета-актина, контроль) и эндогенных генов Zscan4 после трансфекции мышиных ЭC-клеток MCl синтетическими мРНК. По сравнению с контрольными клетками, трансфецированными GFP-мРНК, уровень экспрессии эндогенного мышиного гена Zscan4 был выше при использовании человеческой ZSCAN4-мРНК.

На фиг. 4В представлены результаты кол.ОТ-ПЦР-анализа и мониторинга уровней экспрессии Tmem92, Stra8, Actb (бета-актина, контроль) и эндогенных генов Zscan4 после приведения мышиных ЭC-клеток MC1 в контакт с векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими мышиный Zscan4с или человеческий ZSCAN4. По сравнению с контрольными клетками, контактированными с пустым вектором Сендай (SeVAG), уровень экспрессии Tmem92, Stra8 и эндогенных генов Zscan4 был выше при использовании SeVmZscan4 и SeVhZSCAN4. SeVmZERT2 и SeVhZERT2 функционировали также в присутствии Tmx. Аналогичнным образом, термочувствительные векторы Сендай, экспрессирующие мышиный Zscan4с или человеческий ZSCAN4, функционировали также в клетках MC1 (фиг. 4C).

Эти результаты показали, что биологические агенты Zscan4 в форме векторов Сендай, экспрессирующих Zscan4 или синтетические Zscan4-мРНК, могут функционировать в мышиных ЭC-клетках так же, как и мышиный трансген Zscan4с, интегрированный в мышиный геном. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что биологические агенты Zscan4 являются предпочтительными в качестве реагентов для мышиных клеток и терапевтических средств для человеческих клеток, что обусловлено простотой их применения и возможностью предотвращения интеграции нежелательной ДНК в геном. Кроме того, вместо трудоемкой процедуры генетического конструирования клеток, занимающей много времени, могут быть использованы биологические агенты Zscan4, которые необходимо просто добавить в среду для культивирования клеток.

Пример 3: Влияние биологических агентов Zscan4 на индуцированные человеческие плюрипотентные стволовые клетки

Гены SERPINB4, DNMT3L и DUX4 были идентифицированы как маркерные гены, которые активируются при сверхэкспрессии мышиного гена Zscan4c или человеческого гена ZSCAN4 под действием экспрессионной системы трансгена.

В этом примере продемонстрировано, что биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, либо вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) могут функционировать в человеческих иПС-клетках так же, как и в системе сверхэкспрессии трансгена Zscan4, используемой в мышиных плюрипотентных стволовых клетках. В этом примере также продемонстрировано, что синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, и вектор на основе вируса Сендай, экспрессирующий человеческий ZSCAN4, могут быть использованы в качестве терапевтических биологических агентов для обработки человеческих плюрипотентных стволовых клеток.

Материалы и методы

Клеточная культура

Индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки, происходящие от фибробластов крайней плоти человека (System Biosciences, CA, USA), культивировали на митотически активированных мышиных эмбриональных фибробластах (MEF) и на среде, в которую была добавлена инактивированная 20% сыворотка, являющаяся заменителем обычной сыворотки, и 10 нг/мл bFGF (Life Technologies, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителей. Эту среду заменяли каждый день, и клетки пересевали через каждые 7 дней с использованием аккутазы.

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5;7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих мышиный Zscan4с, человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Me-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Векторы на основе вируса Сендай

Векторы на основе вируса Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZscan4» или «SeVhZSCAN4», соответственно. В качестве контроля использовали тот же самый вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. В этих векторах Сендай отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+mZERT2/ΔF), или человеческий ZSCAN4, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+hZERT2/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZERT2» или «SeVhZERT2», соответственно. В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Кроме того, термочувствительные векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/TS15ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZscan4-TS15» или «SeVhZSCAN4-TS15», соответственно. Эти векторы Сендай являются функциональными при 35°C и неактивными при 37°C (Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011;108(34): 14234-14239). В качестве контроля использовали тот же самый термочувствительный вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. Такой вектор обозначен здесь «SeVAG-TS15». В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Результаты

На фиг. 5A показано, что синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, могут индуцировать экспрессию SERPINB4. На фиг. 5В показано, что SeVmZscan4, SeVhZSCAN4, SeVmZERT2 (в присутствии Tmx⁺) и SeVhZERT2 (в присутствии Tmx⁺) могут индуцировать экспрессию SERPINB4 и, в некоторой степени, DNMT3L и DUX4. Аналогичнным образом, термочувствительные векторы Сендай, экспрессирующие мышиный Zscan4c или человеческий ZSCAN4, могут индуцировать экспрессию DNMT3L (фиг. 5C).

Эти результаты показали, что биологические агенты Zscan4 в форме векторов Сендай, экспрессирующих Zscan4 или синтетические Zscan4-мРНК, могут функционировать в человеческих плюрипотентных стволовых клетках, например, в человеческих иПС-клетках, поскольку Zscan4 индуцирует маркеры (например, SERPINB4, DNMT3L и DUX4) для определения воздействия Zscan4 на человеческие иПС-клетки. Эти маркеры могут быть также использованы для оценки качества и эффективности биологических агентов Zscan4 (Quality Control [QC]).

Пример 4: Экспрессия Zscan4 улучшает качество человеческих плюрипотентных стволовых клеток

В этом примере показано, что биологические агенты Zscan4 могут улучшать качество человеческих плюрипотентных стволовых клеток, включая, но не ограничиваясь ими, человеческие эмбриональные стволовые (ЭC) клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки, поскольку эти биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, либо вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) корректируют одну или более хромосомных аберраций и одну или более эпигенетических ошибок. В частности, было показано, что биологический агент Zscan4 может корректировать ошибочные паттерны метилирования ДНК в человеческих иПС-клетках посредством временного деметилирования нескольких областей ДНК, которые трудно поддаются деметилированию другими способами. Так, например, в геноме существуют области, в которых паттерны метилирования ДНК в человеческих иПС-клетках и в человеческих ЭC-клетках отличаются друг от друга. А поэтому очень важно скорректировать такие ошибочные паттерны метилирования ДНК в человеческих иПС-клетках. Очевидно, проблемы, связанные с ошибочным метилированием ДНК, могут быть решены путем простой обработки человеческих иПС-клеток биологическими агентами Zscan4, способными корректировать паттерны метилирования ДНК, и такой способ может представлять собой ключевую технологию повышения безопасности применения человеческих иПС-клеток в терапии. Способность биологических агентов Zscan4 корректировать паттерны метилирования ДНК в человеческих иПС-клетках также позволяет улучшить функцию уже существующих человеческих иПС-клеток.

Пример 5: Экспрессия Zscan4 способствует увеличению продолжительности жизни фибробластов у человека с врожденным дискератозом и увеличению длины теломеры в фибробластах у человека с врожденным дискератозом

В этом примере показано, что экспрессия человеческого ZSCAN4 синтетической мРНК, кодирующей ZSCAN4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4, индуцирует увеличение продолжительности жизни фибробластов у человека с врожденным дискератозом и увеличение длины теломеры в фибробластах у человека с врожденным дискератозом. В этом примере также показано, что синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, и вектор на основе вируса Сендай, экспрессирующий человеческий ZSCAN4, могут быть использованы в качестве терапевтических биологических агентов.

Материалы и методы

Клеточная культура

Фибробласты, выделенные у пациента с врожденным дискератозом (ВДК: X-сцепленным), закупали в депозитарии Coriell Cell Repository (Catalog ID AG04646). В соответствии с данными по каталогу Coriell Catalog, донором клеток был 11-летний пациент индоевропейской расы, страдающий поражениями кожи, анемией, дистрофией ногтей и нарушениями функции пищевода. Семейный анамнез этого пациента был отрицательным. Была проведена прижизненная биопсия непораженной кожи. Культура была инициирована 2/21/81 с использованием эксплантатов измельченной ткани. Морфология клеток была аналогична морфологии фибробластов. Уровень удвоения популяции (PDL) составлял 5,41 при заморозке и при 5 пассажах.

После получения ВДК-клеток из Coriell Cell Repository, эти клетки культивировали путем проведения еще нескольких пассажей. Клетки культивировали в условиях, рекомендованных депозитарием Coriell Cell Repository, а именно, в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей соли Эрла и заменимые аминокислоты, в которую была добавлена 15% фетальная бычья сыворотка (не инактивированная).

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5;7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Me-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Вектор на основе вируса Сендай

Вектор на основе вируса Сендай, который экспрессирует человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Такой вектор обозначен здесь «SeVhZSCAN4». В этом векторе Сендай отсутствует белок F, а поэтому он являются нетрансмиссивным (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003). В этих экспериментах, MOI (множественность заражения) составляла 10.

Саузерн-блот-анализ теломеры

Длину теломеры в клетках измеряли с помощью Саузерн-блот-анализа, проводимого с использованием набора для анализа длины теломеры TeloTAGGG Telomere Length Assay kit (Roche Applied Sciences, Indiana, USA) в соответствии с инструкциями производителей.

Результаты

Синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, способствовали увеличению продолжительности жизни фибробластов у человека, страдающего врожденным дискератозом

ВДК-клетки высевали в 6-луночный планшет при концентрации 5 x l0⁴ клеток/лунку, а затем трансфецировали 1 мкг синтетических мРНК с использованием 5 мкл липофектамина (RNAiMAX: Life Technologies, California, USA). На следующий день среду заменяли. Через каждую неделю клетки пересевали в отношении 1:2 и трансфецировали синтетическими мРНК в присутствии 50 нг/мл B18R (ингибитор IFN типа I: eBiosciences, Inc., California, USA). Образцы получали с тремя повторностями. Число клеток подсчитывали на автоматическом счетчике клеток Moxi Z (ORFLO Technologies, Idaho, USA). Число клеток преобразовывали в величину PDL (уровень удвоения популяции), начиная с PDL=0 (нормализованные после пассажа 9, что приблизительно эквивалентно PDL=9 в соответствии с данными депозитария Coriell Cell Repository).

На фиг.6 представлены результаты анализов на рост клеток в течение 60 дней. В контрольных экспериментах, повторные трансфекции GFP-мРНК не приводили к изменению паттернов роста ВДК-клеток: приблизительно через 20 дней культивирования (приблизительно PDL=2), пролиферация клеток прекращалась и наблюдалось старение клеток. В противоположность этому, повторные трансфекции человеческими ZSCAN4-мРНК приводили к увеличению продолжительности жизни клеток ВДК, и эти клетки продолжали расти вплоть до ~40 дней (~PDL=4). Важно отметить, что hZSCAN4-обработка не приводила к трансформации клеток в опухолеподобные клетки с неограниченной способностью к пролиферации. Полученные результаты показали, что hZSCAN4-обработка может способствовать увеличению продолжительности жизни клеток у пациентов с ВДК, где указанные клетки не трансформировались в опухоли.

Векторы на основе вируса Сендай, экспрессирующие человеческий ZSCAN4, способствовали увеличению продолжительности жизни фибробластов у человека, страдающего врожденным дискератозом

ВДК-клетки высевали в 6-луночный планшет при концентрации 5 x l0⁴ клеток/лунку, и через 6 часов подвергали контактированию с вектором SeVhZSCAN4 при MOI = 10 в течение 24 часов. В качестве контроля использовали второй образец ВДК-клеток, который культивировали тем же самым способом, но без обработки вектором SeVhZSCAN4. Клетки пересевали через каждые одну или две недели. Число клеток подсчитывали на автоматическом счетчике клеток Moxi Z (ORFLO Technologies, Idaho, USA). Число клеток преобразовывали в величину PDL (уровень удвоения популяции), начиная с PDL=0 (нормализованные после пассажа 9, что приблизительно эквивалентно PDL=9 в соответствии с данными депозитария Coriell Cell Repository).

На фиг.7А представлены результаты анализов на рост клеток. В контрольных экспериментах, ВДК-клетки обнаруживали типичный паттерн роста: приблизительно через 20 дней культивирования (приблизительно PDL=2) пролиферация клеток прекращалась и наблюдалось старение клеток. В противоположность этому, ВДК-клетки, подвергнутые контактированию с вектором SeVhZSCAN4, имели более высокую продолжительность жизни. Важно отметить, что SeVhZSCAN4-обработка не приводила к трансформации клеток в опухолеподобные клетки с неограниченной способностью к пролиферации.

На фиг. 7B показана морфология клеток на день 28. SeVhZSCAN4-обработанные клетки имели лучшую морфологию, чем необработанные контрольные клетки.

Эти результаты показали, что обработка вектором SeVhZSCAN4 может способствовать увеличению продолжительности жизни клеток у пациентов с ВДК, где указанные клетки не трансформировались в опухоли.

Синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, способствовали удлинению теломеры в фибробластах человека, страдающего врожденным дискератозом

На фиг. 8А представлена процедура экспериментов. ВДК-клетки высевали в культуральные 10 см-чашки при концентрации 1×l0⁵ клеток/культуральную 10 см-чашку. Клетки, содержащиеся в каждой 10 см-чашке, трансфецировали 5 мкг синтетических мРНК с использованием 25 мкл липофектамина (RNAiMAX: Life Technologies, California, USA). На следующий день среду заменяли. Клетки в первой чашке собирали на день 7 и экстрагировали геномную ДНК. Клетки в другой чашке пересевали в отношении 1:2 и трансфецировали 5 мкг синтетических мРНК с использованием 25 мкл липофектамина. Затем, клетки собирали на день 15 и экстрагировали геномную ДНК. После этого, геномную ДНК анализировали на длину теломеры.

На фиг. 8В представлены результаты анализов на длину теломеры. Как было описано ранее (Wong J.M., Collins K. Genes Dev. (2006), 20(20), 2848-2858), длина теломеры в ВДК-фибробластах была короче, чем в нормальных клетках, и при их культивировании, быстро уменьшались. В контрольных экспериментах, трансфекция GFP-мРНК не приводила к изменению паттернов укорочения длины теломеры в ВДК-клетках. В противоположность этому, трансфекция человеческими ZSCAN4-мРНК приводила к увеличению длины теломеры в ВДК-клетках и к предотвращению дальнейшего укорочения длины теломеры. Эти результаты показали, что укорочение длины теломеры в ВДК-клетках, обусловленное, главным образом, фенотипами заболевания ВДК, может быть прекращено путем обработки клеток hZSCAN4-мРНК.

Пример 6: Экспрессия Zscan4 приводит к увеличению продолжительности жизни клеток у человека с синдромом Вернера

Характерным признаком пациентов с синдромом Вернера (СВ) является преждевременное старение. В культуре клеток пациентов с СВ наблюдалась повышенное число хромосомных разрывов, транслокаций и делеций. Таким образом, пациенты с СВ нуждаются в лечении, которое может повышать стабильность генома и/или хромосомы.

В этом примере продемонстрировано, что синтетические мРНК, кодирующие Zscan4, могут способствовать увеличению продолжительности жизни фибробластов, выделенных у пациента с синдромом Вернера (СВ). В этом примере также продемонстрировано, что синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, могут быть использованы в качестве биологически терапевтических агентов.

Материалы и методы

Клеточная культура

Фибробласты, выделенные у пациента с синдромом Вернера (СВ), закупали в депозитарии Coriell Cell Repository (Catalog ID AG03141). В соответствии с данными по каталогу Coriell Catalog, донором клеток была 30-летняя женщина индоевропейской расы, у которой наблюдались признаки преждевременного старения, пигментации и атрофии кожи, а также катаракты и гиперлипидемии типа V. Была проведена прижизненная биопсия на дни 9/20/78. Культура была инициирована с использованием эксплантатов измельченных тканей кожи. Морфология этих клеток была аналогична морфологии фибробластов. Кариотип клеток представлял собой 46,XX, причем 80% оцененных клеток имели случайные хромосомные аберрации. Гомозиготная транзиция C→T в положении нуклеотида 2476 в гене WRN (2476C>T) приводила к образованию стоп-кодона в положении 748 {Gln748TER (Q748X)}. Кумулятивный уровень удвоения популяции (PDL) составлял 17,97 при заморозке и в течение 11 пассажей. После получения СВ-клеток из депозитария Coriell Cell Repository, эти клетки культивировали путем проведения еще нескольких пассажей. Клетки культивировали в соответствии с рекомендациями депозитария Coriell Cell Repository, а именно, в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей соли Эрла : модифицированной по способу Дульбекко среде МЕМ, в которую была добавлена 15% фетальная бычья сыворотка (не инактивированная).

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5;7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Me-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Результаты

СВ-клетки высевали в 6-луночный планшет при концентрации 5×l0⁴ клеток/лунку, а затем трансфецировали 1 мкг синтетических мРНК с использованием 5 мкл липофектамина (RNAiMAX: Life Technologies, California, USA) на день 0. На следующий день среду заменяли. На день 3 осуществляли вторую трансфекцию теми же самыми мРНК. В зависимости от роста клеток, эти клетки пересевали в отношении 1:2 через каждые 1 или 2 недели. Образцы получали с тремя повторностями. Число клеток преобразовывали в PDL, начиная с PDL=0 (что приблизительно эквивалентно кумулятивному PDL=19, где указанное значение почти соответствует старению клеток по данным депозитария Coriell Cell Repository).

На фиг. 9 представлены результаты анализов на рост клеток. СВ-клетки, трансфекцированные синтетическими GFP-мРНК, использовали в качестве контроля. Как показано на фиг.9, СВ-клетки, трансфекцированные синтетическими GFP-мРНК, подвергались старению и их пролиферация прекращалась. В противоположность этому, трансфекция СВ-клеток синтетическими hZSCAN4-мРНК приводила к продуцированию СВ-клеток с еще двумя PDL, и эти клетки имели большую продолжительность жизни (фиг. 9). Важно отметить, что, как показали полученные результаты, синтетические hZSCAN4-мРНК не индуцировали неограниченного роста клеток, поскольку эти клетки, в конечном счете, не пролиферировались. Аналогично результатам, полученным для синтетических hZSCAN4-мРНК, также было обнаружено, что большая продолжительность жизни СВ-клеток наблюдалась в том случае, когда эти клетки были подвергнуты контактированию с SeVhZSCAN4 или с векторами на основе вируса Сендай SeVhZSCAN4-TS15, которые экспрессировали человеческий ZSCAN4. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что использование ZSCAN4 в качестве терапевтического биологического агента не приводит к трансформации клеток и/или к перерождению обработанных клеток в раковые клетки. Эти результаты показали, что hZSCAN4-обработка может способствовать увеличению продолжительности жизни клеток у пациентов с СВ, где указанные клетки не трансформировались в опухоли.

Пример 7: Экспрессия Zscan4, осуществляемая для предотвращения укорочения теломеры у пациентов

На фиг. 10 проиллюстрирован один из способов лечения с использованием Zscan4. Этот способ почти аналогичен способам, проводимым путем трансплантации костного мозга, которую осуществляют рутинными методами в клиниках для лечения пациентов с недостаточностью костного мозга и с лейкозом. Костный мозг, включающий гемопоэтические клетки и мезенхимные стволовые клетки мезенхимы, брали у пациентов путем аспирации, а затем сразу обрабатывали Zscan4 (например, вектором Сендай, несущим человеческий ZSCAN4). Такая Zscan4-обработка может быть быстрой и может быть проведена в течение короткого периода времени. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что экспрессия Zscan4, очевидно, прекращается в случае повторного введения клеток костного мозга пациенту. Альтернативно, могут быть использованы термочувствительные векторы Сендай, поскольку экспрессия Zscan4 может «отключаться» при изменении температуры. Альтернативно, могут быть использованы векторы Сендай, несущие гибридный белок hZSCAN4-ERT2, который может быть активирован путем добавления тамоксифена и инактивирован путем удаления тамоксифена. Альтернативно, могут быть использованы синтетические мРНК, такие как hZSCAN4-мРНК, поскольку продуцирование белка ZSCAN4 является временным, что обусловлено ограниченным временем полужизни синтетических мРНК. Таким образом, клетки костного мозга, подвергнутые омоложению с использованием Zscan4, будут снова образовывать популяцию клеток костного мозга и компартмент гемопоэтических клеток у пациента. Принимая во внимание длительный эффект такого кратковременного контакта с Zscan4, и не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что эта процедура должна быть проведена только один раз или периодически через длительные интервалы времени (например, через много лет). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что клетки костного мозга, подвергнутые омоложению с использованием Zscan4, очевидно, будут вне всякой «конкуренции» и, таким образом, будут полностью заменять пораженные клетки костного мозга. В соответствии с этим, очевидно, что в данном случае отпадет необходимость в облучении костного мозга, обычно проводимом для удаления пораженных клеток костного мозга при стандартной операции по трансплантации костного мозга.

Пример 8: Экспрессия Zscan4 способствует удлинению теломер в человеческих фибробластах

В этом примере показано, что сверхэкспрессия Zscan4 индуцирует удлинение теломеры в человеческих фибробластах.

Материалы и методы

Клеточная культура

Первичные кожные фибробласты взрослого человека (HDFa), выделенные из кожи взрослого человека (в возрасте ~30 лет), закупали у Life Technologies (Cat. no. C-013-5C). Фибробласты (GM01309), выделенные у пациента с анемией Фанкони, входящего в дополнительную группу A (FANCA), закупали в депозитарии Coriell Cell Repository. Эти клетки выдерживали в стандартных условиях культивирования, то есть в среде DMEM (в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла), в которую была добавлена 10% фетальная бычья сыворотка.

Количественная оценка теломеры с помощью кол.ПЦР

Количественную оценку теломеры с помощью кол.ПЦР проводили в соответствии с процедурами, описанными в литературе (Cawthon, R.M. Nucleic Acids Res. 2002 May 15;30(10):e47; и Callicott, RJ et al. Comparative Medicine, 2006). Геномную ДНК экстрагировали из >5×10⁵ фибробластов с использованием набора для забора крови и ткани DNeasy (Qiagen). Качество образцов гДНК оценивали с использованием Nanodrop. Образцы геномной ДНК, которых отношение оптической плотности на длинах волн A260/280 составляло более, чем 1,8, а отношение оптической плотности на длинах волн A260/230 составляло приблизительно 2, использовали в целях проведения кол.ПЦР для определения длины теломеры.

Ниже представлены праймеры, используемые для ПЦР теломеры:

tellb: 5'-CGGTTT(GTTTGG)₅GTT-3' (SEQ ID NO:41); и

tel2b: 5'-GGCTTG(CCTTAC)₅CCT-3' (SEQ ID NO:42).

Каждый праймер использовали в конечной концентрации 300 нМ.

Ниже представлены праймеры, используемые для ПЦР одной копии генов:

36B4u: 5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3' (SEQ ID NO:43); и

36B4d: 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3' (SEQ ID NO:44).

Праймер 36B4u использовали в конечной концентрации 300 нМ, а праймер 36B4d использовали в конечной концентрации 500 нМ.

20 мкл конечной реакционной смеси для кол.ПЦР помещали в одну лунку 96-луночного планшета и добавляли 20 нг гДНК, праймеры и 1 × белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра Power SYBR (Applied Biosystems). ПЦР теломеры с использованием Tellb/2b проводили в термоячейке по следующей программе: 95°C в течение 10 минут, 40 циклов при 95°C в течение 15 сек, и при 56°C в течение 1 минуты. ПЦР теломеры с использованием 36B4 проводили в термоячейке по следующей программе: 95°C в течение 10 минут, 40 циклов при 95°C в течение 15 сек, и при 58°C в течение 1 минуты. Обработку образцов проводили в устройстве для кол.ПЦР StepOne Plus (Applied Biosystems). Пороговый уровень для образца устанавливали на величины Ct приблизительно 20-22. Для вычисления отношения теломера/однокопийный ген (отношение T/S), проводимого в целях определения длины теломеры в каждом образце, применяли метод «дельта,дельта-Ct» (ΔΔCt).

Векторы на основе вируса Сендай

Векторы на основе вируса Сендай, которые экспрессируют человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). В этом векторе Сендай отсутствует белок F, а поэтому он являются нетрансмиссивным (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Результаты

Сверхэкспрессия человеческого ZSCAN4 способствует быстрому увеличению длины теломеры в фибробластах здорового взрослого человека

Кожные фибробласты взрослого человека (HDFa) культивировали в стандартных условиях. На следующий день после пересева клеток, один образец клеток брали для проведения экстракции геномной ДНК (необработанный контроль). Второй образец клеток трансдуцировали вектором на основе вируса Сендай SvhZSCAN4.

Трансдуцированные клетки собирали через 2 дня (через 2 дня после SeVhZSCAN4-обработки) или 3 дня (через 3 дня после SeVhZSCAN4-обработки) после трансдукции. Затем измеряли длину теломеры собранных клеток с помощью кол.ОТ-ПЦР и вычисляли относительную длину теломеры (отношение T/S) по отношению к контролю, то есть к контрольным необработанным клеткам.

Как показано на фиг. 11, средняя длина теломер увеличивалась через 2 и 3 дня. В частности, через 2 дня после ZSCAN4-трансдукции, клетки HDFa имели отношение T/S приблизительно 1,4, а контрольные клетки имели отношение T/S=1,0 (фиг. 11). Аналогичным образом, через 3 дня после ZSCAN4-трансдукции, клетки HDFa имели отношение T/S приблизительно 1,4 (фиг. 11). Эти результаты показали, что через два дня после ZSCAN4-трансдукции, клетки HDFa обнаруживали приблизительно 40% увеличение относительной длины теломеры по сравнению с контрольными клетками, которые не были трансдуцированы ZSCAN4.

Сверхэкспрессия человеческого ZSCAN4 способствует быстрому увеличению длины теломеры в фибробластах, выделенных у пациента с анемией Фанкони, то есть у пациента, входящего в дополнительную группу А

Фибробласты GM01309, выделенные у пациента с анемией Фанкони (FANCA), культивировали в стандартных условиях. На следующий день после пересева клеток, один образец клеток брали для проведения экстракции геномной ДНК (необработанный контроль). Второй образец клеток трансдуцировали вектором на основе вируса Сендай SvhZSCAN4.

Трансдуцированные клетки собирали через 2 дня (через 2 дня после SeVhZSCAN4-обработки) или 3 дня (через 3 дня после SeVhZSCAN4-обработки) после трансдукции. Затем измеряли длину теломеры собранных клеток с помощью кол.ОТ-ПЦР и вычисляли относительную длину теломеры (отношение T/S) по отношению к контролю, то есть к контрольным необработанным клеткам.

Как показано на фиг. 12, средняя длина теломер немного увеличивалась через 2 дня и резко увеличивалась через 3 дня. В частности, через 2 дня после ZSCAN4-трансдукции, клетки GM01309 имели отношение T/S приблизительно 1,1, а контрольные клетки имели отношение T/S=1,0 (фиг. 12). Этот результат показал, что через два дня после ZSCAN4-трансдукции, клетки GM01309 обнаруживали приблизительно 10% увеличение относительной длины теломеры по сравнению с контрольными клетками, которые не были трансдуцированы ZSCAN4.

Через три дня после ZSCAN4-трансдукции, клетки GM01309 имели отношение T/S приблизительно 2,6 (фиг. 12). Этот результат показал, что через три дня после ZSCAN4-трансдукции, клетки GM01309 обнаруживали приблизительно 160% увеличение относительной длины теломеры по сравнению с контрольными клетками, которые не были трансдуцированы ZSCAN4.

Пример 9: Экспрессия Zscan4 способствует увеличению продолжительности жизни человеческих фибробластов

В этом примере показано, что синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, могут способствовать увеличению продолжительности жизни кожных фибробластов, выделенных у здорового взрослого человека. В этом примере также продемонстрировано, что синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, могут быть использованы в качестве терапевтических биологических агентов.

Материалы и методы

Клеточная культура

Первичные кожные фибробласты человека (HDFa), выделенные из кожи взрослого человека, закупали у Life Technologies. По данным производителя, клетки HDFa способны давать по меньшей мере 12 удвоений популяции (PDL) этих клеток. Клетки HDFa культивировали в соответствии с инструкциями производителей. После получения клеток HDFa, эти клетки культивировали посредством множества пересевов так, чтобы не наблюдалось их экспоненциального роста и не наступало их старение.

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5; 7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Me-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Результаты

Клетки HDFa на стадии, близкой к стадии их старения, высевали в 6-луночный планшет при концентрации 1×l0⁵ клеток/лунку, а затем трансфецировали 1 мкг синтетических мРНК с использованием 5 мкл липофектамина (RNAiMAX: Life Technologies, California, USA) на день 0. На следующий день среду заменяли. На день 3 осуществляли вторую трансфекцию теми же самыми мРНК. В зависимости от роста клеток, эти клетки пересевали в отношении 1:2 через каждые 1 или 2 недели. Образцы получали с тремя повторностями. Число клеток преобразовывали в PDL, начиная с PDL=0.

На фиг.13 представлены результаты анализов на рост клеток. клетки HDFa, трансфецированные синтетическими GFP-мРНК, использовали в качестве контроля. Через 2 недели, клетки HDFa, трансфекцированные синтетическими GFP-мРНК, подвергались старению и их пролиферация замедлялась (фиг. 13). В противоположность этому, клетки HDFa, трансфецированные синтетическими hZSCAN4-мРНК, размножались до еще большего, а именно, на 2-3 большего, уровня удвоения популяции (PDL), и, таким образом, клетки HDFa имели большую продолжительность жизни до фазы старения (фиг. 13А и 13В). Синтетические мышиные Zscan4-мРНК не способствовали увеличению продолжительности жизни. Этот результат показал, что в отношении увеличения продолжительности жизни клеток HDFa, человеческий ZSCAN4 являются более эффективными, чем мышиный Zscan4c (фиг. 13C). Однако, синтетические hZSCAN4-мРНК не индуцировали неограниченного роста клеток, поскольку эти клетки пролиферировались медленно или вообще не пролиферировались. Аналогично результатам, полученным для синтетических hZSCAN4-мРНК, также было обнаружено, что большая продолжительность жизни клеток HDFa наблюдалась в том случае, если эти клетки были подвергнуты контактированию с SeVhZSCAN4 или с векторами на основе вируса Сендай SeVhZSCAN4-TS15, которые экспрессировали человеческий ZSCAN4. Таким образом, использование ZSCAN4 в качестве терапевтического биологического агента не приводит к трансформации клеток и/или к перерождению обработанных клеток в раковые клетки. Эти результаты показали, что hZSCAN4-обработка может способствовать увеличению продолжительности жизни клеток HDFa, где указанные клетки не трансформировались в опухоли.

Пример 10: Удлинение теломеры в человеческих стволовых клетках мезенхимы (СМ) под действием биологических агентов Zscan4

В этом примере показано, что термочувствительный вектор на основе вируса Сендай, который экспрессирует человеческий ZSCAN4, может способствовать удлинению теломеры в человеческих стволовых клетках мезенхимы (СМ). В этом примере также продемонстрировано, что векторы на основе вируса Сендай, экспрессирующие человеческий ZSCAN4, могут быть использованы в качестве биологических агентов для повышения эффективности терапии путем введения стволовых клеток взрослого человека, включая, но не ограничиваясь ею, трансплантацию костного мозга.

Материалы и методы

Клеточная культура

Стволовые клетки мезенхимы, происходящие от жировой ткани человека (MSC), закупали у Life Technologies (CA, USA). По данным производителя, клетки ADSC обнаруживали почти такой же фенотип и почти такие же функциональные свойства, как и стволовые клетки мезенхимы, происходящие от костного мозга. Эти клетки могут быть размножены посредством 4-5 пассажей до потери ими способности расти или дифференцироваться в клетки всех возможных фенотипов. Клетки культивировали в условиях, рекомендованных производителем.

Векторы на основе вируса Сендай

Термочувствительные векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/TS15ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZscan4-TS15» или «SeVhZSCAN4-TS15», соответственно. Эти векторы Сендай являются функциональными при 35°C и неактивными при 37°C (Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011;108(34):14234-14239). В качестве контроля использовали тот же самый термочувствительный вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. Такой вектор обозначен здесь «SeVAG-TS15». В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Саузерн-блот-анализ теломеры

Длину теломеры в клетках измеряли с помощью Саузерн-блот-анализа, проводимого с использованием набора для анализа длины теломеры TeloTAGGG (Roche Applied Sciences, Indiana, USA) в соответствии с инструкциями производителей.

Результаты

Стволовые клетки мезенхимы, происходящие от жировой ткани человека (MSC), при пассаже 2 высевали в 10 см-чашки при плотности 1,5×10⁵ клеток, и подвергали контактированию с термочувствительными векторами Сендай при множественности заражения (MOI)=10 (на день 0). Клетки инкубировали в среде, содержащей 10 мкМ H₂О₂, и выдерживали при 35°C в течение 3 дней, а затем культивировали при 37°C. Клетки пересевали в отношении 1:2 на день 7. После второго пассажа на день 10, клетки снова подвергали контактированию с термочувствительными векторами Сендай при множественности заражения (MOI) 10 и инкубировали при 35°C в течение 3 дней, а затем культивировали при 37°C. После этого, клетки пересевали на день 14 (пассаж 3), на день 20, на день 27, на день 42 и на день 62 (пассаж 7). Клетки инкубировали в среде, содержащей 10 мкМ H₂О₂, в результате чего длина теломеры укорачивалась быстрее, чем в типичных условиях культивирования клеток.

На фиг. 14 представлены результаты анализов длины теломеры. Среднюю длину теломеры (как указано в надписи к рисунку) оценивали с помощью Саузерн-блот-анализа в соответствии с инструкциями производителей. Как показано на фиг. 14, человеческий ZSCAN4 (SeVhZSCAN4-TS15) способствовал увеличению длины теломеры в человеческих MSC, тогда как мышиный Zscan4 (SeVmZscan4-TS) не влиял на длину теломеры. Эти результаты показали, что укорочение длины теломеры в человеческих MSC может быть сохранено путем обработки клеток человеческими биологическими агентами ZSCAN4. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что описанный здесь человеческий ZSCAN4, очевидно, может действовать и в культуре других человеческих стволовых клеток ткани. Кроме того, очевидно, что человеческие биологические агенты ZSCAN4 могут также способствовать удлинению теломеры (например, способствовать омоложению клеток) в человеческих стволовых клетках ткани, которые всегда присутствуют в ткани человека (то есть in vivo).

Пример 11: Экспрессия Zscan4, осуществляемая для лечения пациентов с дефицитом стволовых клеток-резидентов ткани

Существует много заболеваний, вызываемых нарушением одной или более функций стволовых клеток-резидентов ткани (то есть стволовых клеток-резидентов ткани в органе и/или в ткани организма человека). Так, например, известно, что мышечная дистрофия Дюшенна ассоциируется с преждевременным старением мышечных стволовых клеток (клеток-сателлитов). Исходя из описанных здесь результатов, указывающих на то, что биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) могут способствовать омоложению стволовых клеток ткани, можно сделать вывод, что экспрессия Zscan4 в стволовых клетках-резидентах ткани будет корректировать дефицит клеток, ассоциированных с развитием данного заболевания. В случае мышечной дистрофии Дюшенна, очевидно, что экспрессия Zscan4 может быть осуществлена для лечения пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна путем введения биологического агента Zscan4 в мышечные клетки, а в частности, в мышечные стволовые клетки пациента с мышечной дистрофией Дюшенна для предупреждения повреждения мышечных клеток на ранней стадии развития организма.

Пример 12: Экспрессия Zscan4, осуществляемая для лечения пациентов с диабетом

Было продемонстрировано, что человеческий ZSCAN4, по своей природе, экспрессируется, хотя и редко, в некоторых стволовых клетках ткани поджелудочной железы человека. Исходя из описанных здесь результатов, указывающих на то, что биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) могут способствовать омоложению стволовых клеток ткани и клеток на терминальной стадии дифференцировки, можно сделать вывод, что экспрессия ZSCAN4 может быть осуществлена в целях лечения пациентов с диабетом путем введения биологического агента Zscan4 в клетки поджелудочной железы, а в частности, в стволовые клетки-резиденты поджелудочной железы пациента с диабетом для предупреждения повреждения клеток поджелудочной железы и, тем самым, для стимуляции продуцирования бета-клеток.

Пример 13: Экспрессия Zscan4, осуществляемая для лечения пациентов с атопическим дерматитом и другими поражениями кожи

Исходя из описанных здесь результатов, указывающих на то, что биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) могут способствовать омоложению стволовых клеток ткани и клеток терминальной стадии дифференцировки, можно сделать вывод, что экспрессия Zscan4 может быть осуществлена для лечения пациентов с атопическим дерматитом и другими поражениями кожи путем обработки кожи биологическим агентом Zscan4 (например, путем местного нанесения на кожу), а в частности, путем обработки стволовых клеток-резидентов ткани кожи пациента с атопическим дерматитом и другими поражениями кожи для предупреждения дальнейшего повреждения стволовых клеток ткани кожи и клеток кожи и, тем самым, для стимуляции продуцирования новых стволовых клеток ткани кожи и клеток кожи.

Пример 14: Экспрессия Zscan4, осуществляемая для омоложения индивидуума или для замедления процесса старения индивидуума путем омоложения клеток организма, включая клетки терминальной стадии дифференцировки, клетки-предшественники или стволовые клетки-резиденты ткани

Очевидно, что почти все органы и ткани организма человека поддерживаются благодаря сохранению стволовых клеток-резидентов ткани органов и тканей организма. Так, например, тонкий кишечник сохраняется благодаря непрерывному продуцированию зрелых и дифференцированных клеток, происходящих от стволовых клеток-резидентов тонкого кишечника, присутствующих в крипте тонкого кишечника. Аналогичным образом, кожа сохраняется благодаря непрерывному продуцированию кожного эпителия, происходящего от стволовых клеток кожи, а волосы сохраняются благодаря стволовым клеткам волосяных фолликул. По сравнению с полностью дифференцированными клетками, которые относительно быстро стареют и разрушаются, стволовые клетки ткани имеют тенденцию поддерживать свою функцию и молодость, например, благодаря сохранению длины теломеры (фиг. 15). Однако, даже стволовые клетки ткани постепенно теряют свою молодость (фиг. 15). Поэтому, вообще говоря, старение и постепенная потеря молодости и жизненных функций индивидуумом может рассматриваться как результат старения и разрушения стволовых клеток-резидентов ткани.

Исходя из описанных здесь результатов, указывающих на то, что биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) могут способствовать омоложению эмбриональных стволовых (ЭC) клеток и мезенхимных стволовых клеток (МСК), можно сделать вывод, что экспрессия Zscan4 в стволовых клетках ткани, присутствующих в каждом органе и/или в каждой ткани организма человека, может приводить к омоложению и, тем самым, к восстановлению органа и/или ткани до их нормального вида (то есть вида до старения) и нормальной функции. Этот результат был основан на обнаружении того факта, что человеческий ZSCAN4, по своей природе, экспрессируется, хотя и редко, в некоторых стволовых клетках ткани поджелудочной железы человека. Кроме того, исходя из описанных здесь результатов, указывающих на то, что биологические агенты Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемый синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) могут способствовать омоложению клеток терминальной стадии дифференцировки, таких как кожные фибробласты, можно сделать вывод, что экспрессия Zscan4 в клетках терминальной стадии дифференцировки и/или в клетках-предшественниках, присутствующих в каждом органе и/или в каждой ткани организма человека, может приводить к омоложению и, тем самым, к восстановлению органа и/или ткани до их нормального вида (то есть вида до старения) и нормальной функции.

В этом примере описана процедура экспрессии биологических агентов Zscan4 (например, Zscan4, экспрессируемых синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4) в стволовых клетках ткани, в клетках терминальной стадии дифференцировки и/или в клетках-предшественниках, присутствующих в органах и тканях организма человека, где такая экспрессия может приводить к омоложению и, тем самым, к восстановлению органов и тканей до их нормального вида (то есть вида до старения) и нормальной функции. В частности, описанный здесь биологический агент Zscan4 вводят индивидууму, нуждающемуся в этом, путем прямой инъекции биологического агента Zscan4 в каждый орган и в каждую ткань организма, или инъекции биологического агента Zscan4 в кровоток указанного индивидуума для доставки биологического агента Zscan4 во все органы и ткани организма. Альтернативно или дополнительно, биологический агент Zscan4 может быть введен путем инъекции в цереброспинальную жидкость для доставки указанного биологического агента Zscan4 во все органы и ткани нервной системы организма. Альтернативно или дополнительно, биологический агент Zscan4 может быть введен путем инъекции в лимфатическую систему для доставки указанного биологического агента Zscan4 во все лимфатические органы и ткани организма. Альтернативно или дополнительно, биологический агент Zscan4 может быть введен путем ингаляции в ткань легких для доставки указанного биологического агента Zscan4 в ткань легких. Альтернативно или дополнительно, биологический агент Zscan4 может быть введен перорально для доставки указанного биологического агента Zscan4 во все органы и ткани пищеварительной системы организма, включая пищевод, желудок и тонкий кишечник. Альтернативно или дополнительно, биологический агент Zscan4 может быть введен путем инъекции в воротную вену для доставки указанного биологического агента Zscan4 в печень организма. Альтернативно или дополнительно, биологический агент Zscan4 может быть введен путем местного нанесения на кожу или волосистую часть головы для доставки указанного биологического агента Zscan4 в кожу и в кожные дериваты организма, такие как волосяные фолликулы и потовые железы. Эти процедуры осуществляют в целях обработки стволовых клеток ткани, клеток-предшественников и клеток терминальной стадии дифференцировки в каждом органе и/или в каждой ткани индивидуума биологическим агентом Zscan4 для омоложения стволовых клеток ткани, клеток-предшественников и/или клеток терминальной стадии дифференцировки, присутствующих в органе и/или ткани, подвергнутых такой обработке. Очевидно, что общими эффектами омоложения стволовых клеток ткани, клеток-предшественников и/или клеток терминальной стадии дифференцировки у индивидуума, проходящего лечение, являются омоложение индивидуума и/или замедление процесса его старения. Также очевидно, что омоложение стволовых клеток ткани, клеток-предшественников и/или клеток терминальной стадии дифференцировки у индивидуума, проходящего лечение, будет приводить к увеличению продолжительности жизни индивидуума.

Пример 15: Экспрессия Zscan4 индуцирует коррекцию трисомии по хромосоме 21 в человеческих фибробластах, выделенных у пацминта с синдромом Дауна

В этом примере показано, что экспрессия человеческого ZSCAN4 синтетической мРНК, кодирующей ZSCAN4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим ZSCAN4, может корректировать кариотип трисомии по хромосоме 21 в фибробластах, выделенных у пациента с синдромом Дауна. В этом примере также продемонстрировано, что синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, и вектор на основе вируса Сендай, экспрессирующий ZSCAN4, могут быть использованы в качестве биологических терапевтических агентов.

Материалы и методы

Клеточная культура

Фибробласты, выделенные у пациента с синдромом Дауна (СД, трисомия по хромосоме 21), закупали в депозитарии Coriell Cell Repository (Catalog ID AG06872). В соответствии с данными по каталогу Coriell Catalog, донором клеток была девочка индоевропейской расы в возрасте 1 года. У этой девочки-донора наблюдались типичные признаки синдрома Дауна (трисомия по хромосоме 21). Была проведена посмертная биопсия кожи на дни 5/19/83. Культура была инициирована с использованием эксплантатов измельченных тканей кожи. Кариотип клеток представлял собой 47,XX,+21. Морфология этих клеток была аналогична морфологии фибробластов. Кумулятивный уровень удвоения популяции (PDL) составлял 10,5 при заморозке и в течение 5 пассажей. После получения СД-клеток из депозитария Coriell Cell Repository, эти клетки культивировали путем проведения еще нескольких пассажей. Затем клетки культивировали в соответствии с рекомендациями депозитария Coriell Cell Repository, а именно, в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей соли Эрла и заменимые аминокислоты, в которую была добавлена 10% фетальная бычья сыворотка (не инактивированная).

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5;7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Ме-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Векторы на основе вируса Сендай

Вектор Сендай, который экспрессирует человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Этот вектор обозначен здесь «SeVhZSCAN4». В этом векторе Сендай отсутствует белок F, а поэтому он являются нетрансмиссивным (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003). В этих экспериментах, MOI (множественность заражения) составляла 10.

Кроме того, термочувствительный вектор Сендай, который экспрессирует человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Этот вектор обозначен здесь «SeVhZSCAN4-TS15». Этот вектор Сендай является функциональным при 35°C и неактивным при 37°C (Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011;108(34):14234-14239). В этом векторе Сендай также отсутствует белок F, а поэтому он является нетрансмиссивным (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003). В этом эксперименте, MOI (множественность заражения) составляла 25.

Кариотипический анализ

Помимо проведения обычного кариотипического анализа посредством G-бэндинга делали подсчет копий хромосомы 21 в каждой культивированной клетке посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием зонда, который специфически гибридизуется с центромерной областью хромосомы 21 (CHR21-10-GR: Empire Genomics, New York, USA). В ядре на стадии интерфазы, детектирование 3 флуоресцентных точек указывает на трисомию по хромосоме 21 (синдром Дауна), а детектирование 2 флуоресцентных точек указывает на нормальное число копий хромосомы 21 (отсутствие заболевания).

Результаты

Синтетические мРНК, кодирующие человеческий ZSCAN4, корректируют хромосомные аберрации в фибробластах, выделенных у пациента с синдромом Дауна (с трисомией по хромосоме 21)

Фибробласты, выделенные у пациента с синдромом Дауна (СД) при пассаже 7, высевали в культуральные 10 см-чашки при концентрации 5×l0⁵ клеток/лунку, а затем трансфецировали 5 мкг синтетических мРНК (hZSCAN4 или GFP) с использованием 25 мкл липофектамина (RNAiMAX: Life Technologies, California, USA). В качестве контроля, помимо клеток, трансфецированных GFP-мРНК, использовали также нетрансфецированные клетки. В одном из экспериментов (1 × трансфекция), все клетки пересевали на день 5, а затем проводили кариотипический анализ на день 10 (пассаж 9). В другом эксперименте (2 × трансфекция), после пассажа клеток на день 5 осуществляли другую трансфекцию с использованием либо GFP-мРНК, либо hZSCAN4-мРНК, и проводили кариотипический анализ на день 10 (пассаж 9).

На фиг. 16A представлены репрезентативные изображения клеточных ядер после проведения анализа FISH с использованием зондов для хромосомы 21. Каждая точка указывает на число хромосом 21, присутствующих в ядре. Две точки указывают на нормальную дисомию по хромосоме 21, а три точки указывают на трисомию по хромосоме 21. На фиг. 16B указано общее число хромосом 21 в экспериментах по 1 × трансфекции: через 10 дней после трансфекции человеческими ZSCAN4-мРНК, 14% клеток имели нормальное число хромосом 21. На фиг. 16С указано общее число хромосом 21 в экспериментах по 2 × трансфекции: после 2-кратной трансфекции человеческими ZSCAN4-мРНК, 17% клеток имели нормальное число хромосом 21. В противоположность этому, нетрансфецированные клетки и клетки, трансфецированные GFP-мРНК, обнаруживали лишь небольшую фракцию (<3%) клеток, которые, по-видимому, имели нормальное число хромосом 21. Число клеток этой фракции дано с допустимым пределом ошибки. Полученные результаты показали, что введение человеческих ZSCAN4-мРНК в клетки может корректировать аномальное число хромосом.

Векторы на основе вектора Сендай, экспрессирующие человеческий ZSCAN4, корректируют хромосомные аберрации в фибробластах, выделенных у пациента с синдромом Дауна (с трисомией по хромосоме 21)

На фиг. 17A проиллюстрированы экспериментальные процедуры. Фибробласты, выделенные у пациента с синдромом Дауна (СД), высевали в 6-луночные планшеты при концентрации 5×l0⁵ клеток/лунку и при пассаже 8 (день 0). На следующий день, клетки обрабатывали SeVhZSCAN4-TS15 при множественности заражения (MOI) 25 и оставляли на 3 дня при 35°C. Затем, планшет переносили в среду при 37°C и оставляли этой температуре до конца эксперимента. Клетки пересевали на день 9, на день 12 и на день 15. После пассажа на день 15, клетки обрабатывали SeVhZSCAN4 при MOI=10. Затем клетки пересевали на день 18 и на день 21. После пассажа на день 21, клетки обрабатывали SeVhZSCAN4 при MOI=10. Кариотипический анализ проводили на день 24 с помощью FISH (фиг. 17B). После пассажа на день 30, клетки обрабатывали SeVhZSCAN4 при MOI=10. После пассажа на день 39, клетки обрабатывали SeVhZSCAN4 при MOI=10. Кариотипический анализ осуществляли на день 42 с помощью FISH (фиг. 17C). В качестве контроля использовали клетки, культивированные параллельно без приведения в контакт с вектором на основе вируса Сендай (необработанные клетки), или клетки, культивированные параллельно и приводимые в контакт с контрольным вектором Сендай, экспрессирующим вариант GFP. FISH-изображения независимо оценивались двумя экспериментаторами: 2 флуоресцентные точки (дисомия по хромосоме 21: норма); 3 флуоресцентные точки (трисомия по хромосоме 21, синдром Дауна).

На фиг. 17B указано общее число хромосом 21 в контрольных клетках и в клетках, обработанных SeVhZSCAN4-TS15 один раз и обработанных SeVhZSCAN4 два раза (3 обработки). Эти результаты показали, что обработка фибробластов, имеющих признак синдрома Дауна, вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим человеческий ZSCAN4, индуцирует коррекцию трисомии по хромосоме 21 почти в 30% клеток.

На фиг. 17C указано общее число хромосом 21 в необработанных контрольных клетках, в контрольных клетках, обработанных контрольным вектором Сендай, и в клетках, обработанных SeVhZSCAN4-TS15 один раз, и в клетках, обработанных SeVhZSCAN4 четыре раза (5 обработок). Эти результаты показали, что повторная обработка фибробластов, имеющих признак синдрома Дауна, вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим человеческий ZSCAN4, индуцирует коррекцию трисомии по хромосоме 21 почти в 55% клеток.

Полученные результаты показали, что введение человеческого ZSCAN4 в клетки может корректировать аномальное число хромосом.

Пример 16: Экспрессия Zscan4, осуществляемая для омоложения ооцитов и для коррекции хромосомных аберраций в ооцитах и в предварительно имплантированных эмбрионах

У женщин в позднем периоде детородного возраста, способность ооцитов к успешному оплодотворению резко снижается, что повышает риск выкидыша и вероятность возникновения врожденных пороков развития плода. В недавно проведенных исследованиях было обнаружено, что выкидыш у женщин позднего детородного возраста и пороки развития плода преимущественно вызываются нарушениями сегрегации хромосом в ооцитах. В настоящее время не имеется каких-либо сообщений об успешном предотвращении старения ооцитов посредством предупреждения или коррекции нарушений сегрегации хромосом.

В предварительно имплантированных мышиных эмбрионах с нормальным развитием, эндогенный Zscan4 экспрессируется временно и на высоком уровне в 2-клеточных эмбрионах (Falco et al., Dev Biol. 2007; 307: 539-50). Авторами было также показано, что экспрессия Zscan4 играет очень важную роль в нормальном развитии (Falco et al., Dev Biol. 2007; 307: 539-50). Аналогичным образом, человеческий ZSCAN4 временно экспрессируется в человеческих эмбрионах на 6-8-клеточной стадии развития (Vassena et al., Development. 2011; 138: 3699-709). Поскольку активация генома зиготы у мышей происходит на 2-клеточной стадии развития, а у человека - на 6-8-клеточной стадии развития, то считается, что экспрессия Zscan4 необходима для развития предварительно имплантированного эмбриона человека.

В этом примере показано, что биологические агенты Zscan4 могут способствовать омоложению ооцитов и коррекции хромосомных аберраций в предварительно имплантированных мышиных эмбрионах. Исходя из функционального сходства между мышиным геном Zscan4 и человеческим геном ZSCAN4, описанными в настоящей патентной заявке, а также исходя из функциональной предпочтительности мышиного гена ZSCAN4, можно предположить, что результаты, полученные для мышиного эмбриона, могут быть непосредственно экстраполированы на человеческие эмбрионы. Эти процедуры могут быть применены в Клиниках по экстракорпоральному оплодотворению (In Vitro Fertilization (IVF) clinic). Такие процедуры могут снизить риск развития синдрома Дауна и возникновения других кариотипических аберраций у женщин любого возраста, а особенно, это относится к женщинам старше 35 лет, причем, эти процедуры осуществляют по клинической программе снижения рисков при беременности.

Материалы и методы

Сбор ооцитов

Старые мыши (то есть мыши в возрасте свыше 45 недель) и молодые мыши (в возрасте 8 недель) были закуплены в лаборатории Jackson Laboratory. У старых и молодых мышей брали ооциты на стадии зародышевого пузырька (GV-ооциты). Ооциты молодых мышей использовали в качестве контроля.

Синтетическая мРНК

Синтез модифицированной мРНК осуществляли как описано Warren et al. (Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov. 5;7(5):618-30). В соответствии с протоколом, описанным Warren и др., мРНК синтезировали in vitro посредством транскрипции матричных ДНК, кодирующих человеческий ZSCAN4 или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP), вместе со смесями модифицированных dNTP для повышения стабильности РНК, а также для повышения эффективности трансляции в клетках млекопитающих. Были использованы следующие модифицированные dNTP: 3'-О-Ме-m7G(5')ppp(5')G-ARCA-кэпированный аналог, 5-метилцитидинтрифосфат и трифосфат псевдоуридина.

Векторы на основе вируса Сендай

Векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Такие векторы обозначены здесь «SeVmZscan4» или «SeVhZSCAN4», соответственно. В качестве контроля использовали тот же самый вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. В этих векторах Сендай отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+mZERT2/ΔF), или человеческий ZSCAN4, присоединенный к регулируемому тамоксифеном домену ERT2 (SeV18+hZERT2/ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Такие векторы обозначены здесь «SeVmZERT2» или «SeVhZERT2», соответственно. В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Кроме того, термочувствительные векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/TS15ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Такие векторы обозначены здесь «SeVmZscan4-TS15» или «SeVhZSCAN4-TS15», соответственно. Эти векторы Сендай являются функциональными при 35°C и неактивными при 37°C (Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(34): 14234-14239). В качестве контроля использовали тот же самый вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. Такой вектор обозначен здесь «SeVAG-TS15». В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Результаты

Ооциты на стадии зародышевого пузырька (GV-ооциты) собирали и доводили до состояния зрелости in vitro (IVM) с последующим развитием вплоть до стадии мейоза I и II. В процессе IVM, ооциты подвергали контактированию с биологическим агентом Zscan4 (например, экспрессируемым синтетическими мРНК, кодирующими Zscan4, или векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими Zscan4), а затем, подвергали in vitro оплодотворению спермой. Альтернативно, оплодотворенные ооциты/предварительно имплантированные эмбрионы, находящиеся на промежуточной стадии развития между одноклеточной стадией (зиготой) и стадией развития бластоциста, подвергали контактированию с биологическим агентом Zscan4 (например, экспрессируемым синтетическими мРНК, кодирующими Zscan4, или векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими Zscan4). Методы приведения в контакт могут включать стандартную трансфекцию синтетическими Zscan4-мРНК с использованием липофектамина; инфицирование векторами на основе вируса Сендай, экспрессирующими Zscan4; и инъекцию биологического агента Zscan4 в цитоплазму с помощью микроманипулятора.

Затем, Zscan4-обработанные и оплодотворенные ооциты культивировали в культуральной среде KSOM в течение 96 часов при 37°C, 5% CО₂.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь предполагают, что Zscan4-обработка, очевидно, будет приводить к развитию ооцитов у старых мышей, которые имеют такие же функции, как и ооциты молодых мышей с точки зрения числа зигот, способных успешно развиваться в бластоцисты. Полученные бластоцисты переносили самкам мышей-реципиентов для определения коэффициента рождаемости здоровых мышат. Очевидно, что обработка биологическими агентами Zscan4 будет способствовать более успешному достижению нормального развития эмбриона из ооцитов старых мышей благодаря улучшению кариотипа и качества эмбрионов.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь предполагают, что вышеописанный метод может быть также применен к человеческим ооцитам и оплодотворенным ооцитам/предварительно имплантированным эмбрионам для повышения успеха в достижении нормального развития эмбриона из ооцитов старых мышей и для улучшения кариотипа и качества эмбрионов (фиг. 18).

Пример 17: Экспрессия Zscan4 подавляет рост человеческих раковых клеток

В этом примере показано, что термочувствительный вектор на основе вируса Сендай, экспрессирующий мышиный Zscan4c или человеческий ZSCAN4, может подавлять пролиферацию раковых клеток. В этом примере также продемонстрировано, что векторы на основе вируса Сендай, экспрессирующие Zscan4c, могут быть использованы в качестве терапевтических биологических агентов.

Материалы и методы

Клеточная культура

Человеческие клетки карциномы прямой и ободочной кишки HCT116 закупали в Американской коллекции типовых культур (ATCC). Клетки HCT116 происходили от карциномы прямой и ободочной кишки взрослого мужчины. В соответствии с ATCC, «линии стволовых клеток являются почти диплоидными с модальным числом хромосом 45 (62%) и с количеством полиплоидов 6,8%. Эта клеточная линия имеет мутацию в кодоне 13 протоонкогена ras». Клетки HCT116 культивировали в соответствии с рекомендациями ATCC.

Векторы на основе вируса Сендай

Термочувствительные векторы Сендай, которые экспрессируют мышиный Zscan4c (SeV18+mZscan4/TS15ΔF) или человеческий ZSCAN4 (SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF), специально изготавливали в лаборатории MBL (Medical & Biological Laboratories Co, LTD). Эти векторы обозначены здесь «SeVmZscan4-TS15» или «SeVhZSCAN4-TS15», соответственно. Эти векторы Сендай являются функциональными при 35°C и неактивными при 37°C (Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(34): 14234-14239). В качестве контроля использовали тот же самый термочувствительный вектор Сендай, за исключением того, что этот вектор экспрессировал вариант белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, но не Zscan4. Такой вектор обозначен здесь «SeVAG-TS15». В этих векторах Сендай также отсутствует белок F, а поэтому они являются нетрансмиссивными (Inoue et al., J. Virol. 77: 23238-3246, 2003).

Результаты

Образцы клеток HCT116 (пассаж 9) культивировали при концентрации 8×l0⁴ клеток/лунку. Образцы клеток обрабатывали одним из нижеследующих векторов Сендай: SeVAG-TS15 (контроль), SeVmZscan4-TS15 или SeVhZSCAN4-TS15 при MOI=20, а затем инкубировали при 35°C (день 0). Каждый из трех образцов для обработки получали с тремя повторностями. На день 3, каждый образец для обработки пересевали и обрабатывали одним и тем же вектором Сендай. Число клеток подсчитывали на автоматическом счетчике клеток Moxi Z (ORFLO Technologies, Idaho, USA). На день 7, каждый образец для обработки пересевали и обрабатывали одним и тем же вектором Сендай. Затем, подсчитывали число клеток (день 7). На день 10, каждый образец для обработки пересевали и обрабатывали одним и тем же вектором Сендай. Затем подсчитывали число клеток (день 10). На день 14, каждый образец для обработки пересевали и обрабатывали одним и тем же вектором Сендай. Затем подсчитывали число клеток (день 14). Клетки культивировали при 35°C во время проведения всех экспериментов. Число клеток преобразовывали в PDL, начиная с PDL = 0 на день 0.

На фиг. 19 представлена кривая роста для образцов клеток HTC116. По сравнению с контрольными группами (то есть с необработанной группой и SeVAG-TS15-обработанной группой), обработка SeVmZscan4-TS15 или SeVhZSCAN4-TS15 приводила к подавлению пролиферации клеток HTC116. Как показано на фиг. 19, человеческий ZSCAN4 неожиданно давал лучшие результаты в отношении подавления роста раковых клеток, чем мышиный Zscan4. Таким образом, эти результаты продемонстрировали, что человеческий ZSCAN4 неожиданно обнаруживал более высокую эффективность по сравнению с мышиным Zscan4c. Полученные результаты также показали, что hZSCAN4-обработка может подавлять рост раковых клеток. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что Zscan4-экспрессирующие агенты могут быть использованы для лечения рака.

Пример 18: Экспрессия Zscan4, осуществляемая для повышения способности человеческих клеток или индивидуумов к репарации ДНК

В этом примере показано, что биологические агенты Zscan4 могут повышать способность человеческих клеток к репарации ДНК. Известно, что генотоксические агенты, такие как митомицин С или цисплатин, способны уничтожать человеческие клетки в зависимости от дозы. Клетки, обработанные генотоксическим агентом, а затем биологическим агентом Zscan4 (например, экспрессируемым синтетической мРНК, кодирующей Zscan4, или вектором на основе вируса Сендай, экспрессирующим Zscan4), становятся резистентными к генотоксическому агенту. Было обнаружено, что резистентность к генотоксическим агентам, сообщаемая биологическим агентом Zscan4, обусловлена повышенной способностью к репарации ДНК, индуцированной экспрессией Zscan4 в клетках. Таким образом, биологические агенты Zscan4 могут быть использованы: (1) для повышения способности к репарации ДНК у пациентов, страдающих заболеваниями, ассоциированными с нарушением репарации ДНК; (2) для защиты конкретных тканей и/или органов, таких как гонады, от поражения генотоксическими агентами, такими как противораковые терапевтические средства; и (3) для защиты тканей, органов и/или индивидуумов от вредного воздействия окружающей среды, такого как присутствие токсических химических веществ или выпадение радиоактивных осадков.

Пример 19: Подавление Zscan4 в некоторых раковых стволовых клетках для лечения рака

Известно, что раковые ткани (например, опухоли) содержат раковые стволовые клетки, которые не могут активно пролиферироваться и являются резистентными к противораковой химиотерапии (например, к лечению генотоксическими агентами, такими как цисплатин). Очевидно, что раковые стволовые клетки могут выживать после химиотерапии, а поэтому, они могут давать рецидивы рака после лечения. Поскольку присутствие Zscan4 может сообщать клеткам резистентность к генотоксическим агентам, то очевидно, что экспрессия эндогенного Zscan4, происходящая в некоторых раковых стволовых клетках, будет защищать клетки от воздействия генотоксических агентов. Таким образом, очевидно, что агенты, снижающие уровень экспрессии эндогенного Zscan4, такие как киРНК или кшРНК, специфичные к Zscan4, могут быть использованы для уничтожения раковых стволовых клеток у пациента, страдающего раком, для снижения или устранения резистентности раковых стволовых клеток к генотоксическим агентам и, тем самым, для повышения восприимчивости пациента к противораковой терапии.

--->

Список последовательностей

<110> Ko, Minoru S.H.

<120> Способы применения zscan4 для омоложения человеческих клеток

<130> 699442000840

<140> Еще не переуступлена

<141> При сем прилагается

<150> US 61/800,668

<151> 2013-03-15

<160> 44

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 2275

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 1

cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca cccttgaagt tcactggaga aagagttgag 60

gtggaggaat aggtaaactt cccttcctag tggtcttgaa tgtcttttac agtacatcca 120

tcaactgtta gcattttcgt aaagtcacaa aacagatatt aaactactat agttgaatct 180

ttcacaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240

acaatttaga gtttactcca actgatagtt ctggtgtgca gtgggcagaa gacatctcta 300

actcaccaag tgctcagcta aacttttccc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360

agctgcaaag tctctggaag atgttcaact cctggttgca gccagaaaag cagactaagg 420

agcagatgat ttctcaactg gtcttggagc agtttctcct cactgggcac tgcaaggaca 480

agtatgcttt gacagagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540

gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtctcaatg caaggacaag 600

aagccctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660

aatctgcaac aaggccaaca ccagataatg cacagatgcc agtagacacc acacaagata 720

gattattggc cacaggacaa gaaaacagtg aaaatgaatg caacacctct tgtaatgcta 780

ctgaaggaaa tgttggtgag agctgtagtg gaaatgaaat ggactcctct cttattatcc 840

agaaagaaca gtaccctgag catgaagagg ggaatgttgt ttgtcaattc cctcttgatg 900

ccagaagagc aagtcaaggc acctccagtc atcatgtaga cttcctgagt gctctgacta 960

ctgccgatgt ccccatggag gaacaaccaa aggatttatc cagagaaaac atctctgagg 1020

acaagaacaa ttgctataac acttccagga atgcagctac taaagtatat agtggtgata 1080

atattcccag gaaaaagaca gactcccttt ccattaacaa gaggatatat catcctgagc 1140

ctgaggtggg agatattcct tatggagttc ctcaggattc tacaagagca agtcaaggaa 1200

catctacatg cctgcaagag tcacttgggg gatgtttttc cgaaaaagac cctagggagg 1260

taccagggtt gcagtctagg taagagcagc ctatctctga tcctgtcctt cttggtaaga 1320

atcatgaggc aaacttacca tgtgaaagtc atcaaaagag attctgtaga gatgccaaac 1380

tatacaagtg tgaagaatgt tctaggatgt tcaaacatgc caggagcctt tcatcccacc 1440

agagaactca cctgaataag aagagtgaat tgctttgtgt cacctgtcag aaaattttca 1500

aacgagtctc tgaccgccga acccatgaga tcatacacat gccagaaaag cctttcaagt 1560

gcagcacatg tgaaaagtcc ttcagccaca agaccaacct gaagtctcat gagatgattc 1620

acacaggaga aatgccttat gtctgttccc tatgtagccg tcgctttcgc caatcatcca 1680

cttaccatcg tcacctgagg aattatcaca gatctgactg aagtatctaa catcctcagc 1740

agagactggt agggcttcag cctcagtatg tcatcttcaa agagagaaga atgttgcaag 1800

taaattgtac tgtcccaata atgatataac atgcttgtgg attgccactt ttatgttttg 1860

ttttgttttg ttttttattt tgtgtgtgtg tatgtaattt tttgtctgta tttccatagt 1920

tccacagcat aagttattag aatactttgc tgttaattct tgagttgctt cttgctttta 1980

gacagtgtct ttctggttgg cagctttata cacctgtctt tctggcacta gagtttccaa 2040

acattttctg atctccactt ttattttcta cagtggtcct gacagaggcc tgccattccc 2100

tctgacattt ttctacatgt tggggtttca tcccaagtct tagggttgca agttaaatgc 2160

attgcctctt cagacatctc atgtcatgtc tactgcttac agttcaagaa tatttctcta 2220

cattactaga acgacgttca aagtggaata ataaataaat aaataatcaa caatt 2275

<210> 2

<211> 1774

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 2

cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca cccttgaagt tcactggaga aagaggtgat 60

gtggagaagt aggtaaactt ccctttcttg tggtcttgaa tgtcttttac agtacatccg 120

tcaactgtta gcattttcct aaagtcacaa aacagatact aaactgctat agttgaatct 180

ttcagaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240

acaatttaga gtttactcca actgatagtt ctggtgtgca gtgggcagaa gacatctcta 300

actcaccaag tgctcagcta aacttttccc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360

agctgcaaag tctctggaag atgttcaact cctggttgca gccagaaaag cagactaagg 420

agcagatgat ttctcaattg gtcttggagc agtttctcct cactgggcac tgcaaggaca 480

agtatgcttt gacagagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540

gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600

aagccctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660

aatctgcaac aaggccaata ccagataatg cacagatgcc agtagacacc acacaagata 720

gattattggc cacaggcaag aaaacagtga aaatgaatgc aacacctctt gcaatgctac 780

tgaagtaaat gttggtgaaa gctgtagtgg aaatgaaaag gactcccttc ttattaccca 840

gaaagaacaa aaccatgagc atgaagaggg gaatgttgtt tgtcaattcc ctcgtggtgc 900

cagaagagca agtcaagaca cctccagtca tcatgtagac ttcccgagtg ctctgactcc 960

tgcagatgtc cccatggagg aacaaccaat ggatttatcc agagaaaaca tctctgagga 1020

caagaacaat tgctataaca cttccaggaa tgcagctact caagtatata gtggtgataa 1080

tattcccagg aacaagacag actccctttt cattaacaag agaatatatc atcctgagcc 1140

tgaggtggga gatattcctt atggagttcc tcaggattct acaagagcaa gtcaaggaac 1200

atctacatgc ctgcaagagt cacttgggga atgtttttct gaaaaagacc caagggaggt 1260

accagggttg cagtctaggc aagagcagcc tatctctgat cctgtccttg gtaagaatca 1320

tgaggcaaac ttaccatgtg aaagtcatca aaagagattc catagagatg ccaaactata 1380

caagtgtgaa gaatgttcta ggatgttcaa acatgccagg agcctttcat cccaccagag 1440

aactcacctg aataagaaga gtgaattgct ttgcatcacc tgtcagaaaa tattcaaacg 1500

agtttctgac cttcgaaccc atgagatcat acacatgtca gaaaagcctt tcaagtgcag 1560

cacatgtgaa aagtccttca gccacaagac caacctgaag tatcatgaga tgattcacac 1620

aggagaaatg ccttatgtct gttccctatg tagccgtcgc tttcgccaat catccactta 1680

ccatcgtcac ctgaggaatt accacagatc tgactgaagt atctaacatc ctcagcagag 1740

actggtaggg cttcagcctc agtatgtcat cttc 1774

<210> 3

<211> 2275

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 3

cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca cccttgaagt tcaccggaga aagcagtgag 60

gtggaggaat aggtaaactt tccttcctag tggtcttgaa tgtcttttac agtacatcca 120

tcaactgtta gcattttcgt aaagtcacaa aacagatatt aaactactat agttgaatct 180

ttcacaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240

acaatttaga gtttactcca actgatagtt ctggtgtgca gtgggcagaa gacatctcta 300

actcaccaag tgctcagcta aacttttccc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360

agctgcaaag tctctggaag atgttcaact cctggttgca gccagaaaag cagactaagg 420

agcagatgat ttctcaactg gtcttggagc agtttctcct cactgggcac tgcaaggaca 480

agtatgcttt gacagagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540

gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600

aagccctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660

aatctgcaac aaggccaaca ccagataatg agcagatgcc agtagacacc acacaagata 720

gattattggc cacaggacaa gaaaacagtg aaaatgaatg caacaactct tgtaatgcta 780

ctgaagcaaa tgttggtgaa agctgtagtg gaaatgaaat ggactccctt cttattatcc 840

agaaagaaca gcaccctgag catgaagagg ggaatgttgt ttgtcaattc cctcatggtg 900

ccagaagagc aagtcaaggc acccccagtc atcatgtaga cttcccgagt gctccgacta 960

ctgccgatgt ccccatggag gaacaaccaa aggatttatc cagagaaaac atctctgagg 1020

acaagaacaa ttgctataac acttccagaa atgcagctac tcaagtatat agtggtgata 1080

atattcccag gaacaagtca gactcccttt tcattaacaa gagaatatat catcctgagc 1140

ctgaggtggg agatattcct tatggagttc ctcaggattc tacaagagca agtcaaggaa 1200

catctacatg cctgcaagag tcacttgggg aatgtttttc tgaaaacgac ccaagggagg 1260

taccagggtt gcagtctagg caagagcagc ctatctctga tcctgtcctt cttggtaaga 1320

atcatgaggc aaacttacca tgtgaaagtc atcaaaagag attctgtaga gatgccaaac 1380

tatacaagtg tgaagaatgt tctaggatgt tcaaacatgc caggagcctt tcatcccacc 1440

agagaactca cctgaataag aagagtgaat tgctttgtgt cacctgtcag aaaatgttca 1500

aacgagtctc tgaccgccga acccatgaga tcatacacat gccagaaaag cctttcaagt 1560

gcagcacatg tgaaaagtcc ttcagccaca agaccaacct gaagtctcat gagatgattc 1620

acacaggaga aatgccttat gtctgttccc tatgtagccg tcgctttcgc caatcatcca 1680

cttaccatcg tcacctgagg aattaccaca gatctgactg aactatctaa catcctcagc 1740

agagactggt agggcttcag cctcagtatg tcatcttcaa agagagaaga atgttgcaag 1800

taaattgtac tgtcccaata atgatataac atgcttgtgg attgccactt ttatgttttg 1860

ttttgttttg ttwtttatkt tgtgtgtgtg tatgtaattt tttgtctgta tttccatatt 1920

tccacagcat aagttattag aatactttgc tgttaattct tgagttgctt cttgctttta 1980

gacagtgtct ttctggttgg cagctttata cacctgtctt tctggcacta gagtttccaa 2040

acattttctg atctccactt ttattttcta cagtgttctt gacagaagcc tggcattccc 2100

tctgacattt tctacatgtt ggggttttca tcccaagtct tagggttgca agttaaatgc 2160

attgcctctt cagacatctc atgccatgtc tactgcttac agttcaagaa tatttctcta 2220

cattactaga acgacgttca aagtggaata ataaataaat aaataatcaa caatt 2275

<210> 4

<211> 2268

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 4

cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca cccttgaagt tcactggaca aagaggtgag 60

gtggaggagt aggtaaactt cccttcctag tggtcgtgaa tgtcttttac agtacatcca 120

tcaactgtta gcattttcat aaagtcacaa aacagatact aaactgctat agttgaatct 180

ttcacaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240

acaatttaga gtttactcca tctcatagtt ctggtgtgca gtgggtagaa gacatctcta 300

actcaccaag tgctcagcta aacttttctc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360

agctgcaaag tctctggaag atgttcaact cctggttgca gccagaaaag cagactaagg 420

agcagatgat ttctcaactg gtcttggagc agtttctcct cattgggcac tgcaaggaca 480

agtatgcttt gacagagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540

gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600

aagctctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660

aatctgcaac aaggccaaca ccagataatg agcagatgcc agtagacacc acacaagata 720

gattattggc cacaggacaa gaaaacagtg aaaatgaatg caacaactct tgtaatgcta 780

ctgaagcaaa tgttggtgaa agctgtagtg gaaatgaaat ggactccctt cttattatcc 840

agaaagaaca gcaccctgag catgaagagg ggaatgttgt ttttcaattc cctcttgatg 900

ccagaagagc aagtcaaggc aactccagtc atcatgtaga cttccggagt gctccgactc 960

ctgcggatgt ccccatggag gaacaaccaa aggatttatc cagagaaaac atctctgagg 1020

acaagaacaa ttgctataac acttccagga atgcagctac tcaagtatat agaagtgata 1080

atattcccag gaaaaagaca gactcccttt ccattaacaa gagaatatat cattctgagc 1140

ctgaggaggg agatattcct tatggagttc ctcaggattc tacaagagca agtcaaggaa 1200

catctacatg cttgcaagag tcacttgggg aatgtttttc tgaaaaagac cctagggagc 1260

taccagggtt ggagtctagg caagaggagc ctatctctga tcctgtcttt cttggtaagg 1320

atcatgaggc aaacttacca tgtgaaagtc atcaaaagag attccgtaga gatgccaaac 1380

tattcaagtg tgaagaatgt tctaggatgt tcaaacatgc caggagcctt tcgtcccacc 1440

agagaactca cctgaataag aagagtgaat tgctttgtgt cacctgtcag aaaatgttca 1500

aacgagtctc tgaccgccga acccatgaga tcatacacat gccagaaaag cctttcaagt 1560

gcagcacatg tgaaaagtcc ttcagccaca agaccaacct gaagtctcat gagatgattc 1620

acacaggaga aatgccttat gtctgttccc tatgtagccg tcgctttcgc caatcatcca 1680

cttaccatcg tcacctgagg aattaccaca gatctgactg aagtatctaa catcctcagc 1740

agagactggt agggcttcag cctcagtatg tcatcttcaa agagagaaga atgttgcaag 1800

taaattgtac tgtcccaata atgatataac atgcttgtgg attgccactt ttatgttttg 1860

ttttttattg tgtgtgtgtg tgtatgtaat tttttgtctg taatttccat agttccacag 1920

cataagttat tagaatactt tgctgttaat tcttgagttg cttcttgctt ttagacagtg 1980

tctttctggt tggcagcttt atacacctgt ctttctggca ctagagtttc caaacatttt 2040

ctgatctcca cttttattct ctacagtggt cctgacagag gcctgccatt ccctctgaca 2100

ttttttaaca tgttggggtt tcatcccaag tcttagggtt gcaagttaaa tgcattgcct 2160

cttcagacat ctcatgtcat gtctactgct tacagttcaa gaatatttct ctacattact 2220

agaatgacgt tcaaagtgga ataataaata aaaaaataat caacaatt 2268

<210> 5

<211> 1774

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 5

cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca ccattgaagt tcactggaga aagaggtgag 60

gtggagaagt aggtaaactt ccctttcttg tggtcttgaa tgtcttttac agtacatccg 120

tcaactgtta gcattttcct aaagtcacaa aacagatact aaactgctat agttgaatct 180

ttcagaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240

acaatttaga gtttactcca actgatagtt ctggtgtgca gtgggcagaa gacatctcta 300

actcaccaag tgctcagcta aacttttccc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360

agctgcaaag tctctggaag atgttcaact cctggttgca gccagaaaag cagactaagg 420

agcagatgat ttctcaactg gtcttggagc agtttctcct cactgggcac tgcaaggaca 480

agtatgcttt gacagagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540

gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600

aagccctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660

aatctgcaac aaggccaata ccagataatg agcagatgcc agtagacacc acacaagata 720

gattattggc cacaggcaag aaaacagtga aaatgaatgc aacacctctt gcaatgctac 780

tgaagtaaat gttggtgaaa gctgtagtgg aaatgaaaag gactcccttc ttattaccca 840

gaaagaacaa aaccatgagc atgaagaggg gaatgttgtt tgtcaattcc ctcgtggtgc 900

cagaagagca agtcaagaca cctccagtca tcatgtagac ttcccgagtg ctctgactcc 960

tgcagatgtc cccatggagg aacaaccaat ggatttatcc agagaaaaca tctctgagga 1020

caagaacaat tgctataaca cttccaggaa tgcagctact caagtatata atggtgataa 1080

tattcccagg aacaagacag actccctttt cattaacaag agaatatatc atcctgagcc 1140

tgaggtggga gatattcctt atggagttcc tcaggattct acaagagcaa gtcaaggaac 1200

atctacatgc ctgcaagagt cacttgggga atgtttttct gaaaaagacc caagggaggt 1260

accagggttg cagtctaggc aagagcagcc tatctctgat cctgtccttg gtaagaatca 1320

tgaggcaaac ttaccatgtg aaagtcatca aaagagattc catagagatg ccaaactata 1380

caagtgtgaa gaatgttcta ggatgttcaa acatgccagg agcctttcat cccaccagag 1440

aactcacctg aataagaaga gtgaattgct ttgcatcacc tgtcagaaaa tattcaaacg 1500

agtttctgac cttcgaaccc atgagatcat acacatgtca gaaaagcctt tcaagtgcag 1560

cacatgtgaa aagtccttca gccacaagac caacctgaag tatcatgaga tgattcacac 1620

aggagaaatg ccttatgtct gttccctatg tagccgtcgc tttcgccaat catccactta 1680

ccatcgtcac ctgaggaatt accacagatc tgactgaagt atctaacatc ctcagcagag 1740

actggtaggg cttcagcctc agtatgtcat cttc 1774

<210> 6

<211> 2273

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 6

cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca cccttgaagt tcactggaga aagaggtgag 60

gtggaggaat aggtaaactt tccttcctag tggtcttgaa tgtcttttac agtacatcca 120

tcaactgtta gcattttcgt aaagtcacaa aacagatatt aaactactat agttgaatct 180

ttcacaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240

acaatttaga gtttactcca actgatagtt ctggtgtgca gtgggcagaa gacatctcta 300

actcaccaag tgctcagcta aacttttccc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360

agctgcaaag tctctggaag atgttcaact cctggttgca gccagaaaag cagactaagg 420

agcagatgat ttctcaactg gtcttggagc agtttctcct cactgggcac tgcaaggaca 480

agtatgcttt gactgagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540

gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600

aagccctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660

aatctgcaac aaggccaaca ccagataatg agcagatgcc agtagacacc acacaagata 720

gattattggc cacaggacaa gaaaacagtg aaaatgaatg caacaactct tgtaatgcta 780

ctgaagcaaa tgttggtgaa agctgtagtg gaaatgaaat ggactccctt cttattatgc 840

agaaagaaca gcaccctgag catgaagagg ggaatgttgt ttgtcaattc cctcatggtg 900

ccagaagagc aagtcaaggc acccccagtc atcatgtaga cttcccgagt gctccgacta 960

ctgccgatgt ccccatggag gaacaaccaa aggatttatc cagagaaaac atctctgagg 1020

acaagaacaa ttgctataac acttccagaa atgcagctac tcaagtatat agtggtgata 1080

atattcccag gaacaagtca gactcccttt tcattaacaa gagaatatat catcctgagc 1140

ctgaggtggg agatattcct tatggagttc ctcaggattc tacaagagca agtcaaggaa 1200

catctacatg cctgcaagag tcacttgggg aatgtttttc tgaaaaagac cctagggagg 1260

taccagggtt gcagtctagg caagagcagc ttatctctga tcctgtcctt cttggtaaga 1320

atcatgaggc aaacttacca tgtgaaagtc atcaaaagag attctgtaga gatgccaaac 1380

tatacaagtg tgaagaatgt tctaggatgt tcaaacatgc caggagcctt tcatcccacc 1440

agagaactca cctgaataag aagagtgaat tgctttgtgt cacctgtcag aaaatgttca 1500

aacgagtctc tgaccgccga acccatgaga tcatacacat gccagaaaag cctttcaagt 1560

gcagcacatg tgaaaagtcc ttcagccaca agaccaacct gaagtctcat gagatgattc 1620

acacaggaga aatgccttat gtctgttccc tatgtagccg tcgctttcgc caatcatcca 1680

cttaccatcg tcacctgagg aattaccaca gatctgactg aactatctaa catcctcagc 1740

agagactggt agggcttcag cctcagtatg tcatcttcaa agagagaaga atgttgcaag 1800

taaattgtac tgtcccaata atgatataac atgcttgtgg attgccactt ttatgttttg 1860

ttttgttttt tattttgtgt gtgtgtgtat gtaatttttt gtctgtattt ccatagttcc 1920

acagcataag ttattagaat actttgctgt taattcttga gttgcttctt gcttttagac 1980

agtgtctttc tggttgacag ctttataaac ctgtctttct ggcactagag tttccaaaca 2040

ttttctgatc tccactttta ttctctacag tgttcttgac agaagcctgg cattccctct 2100

gacatttttc tacatgttgg ggttttcatc ccaagtctta gggttgcaag ttaaatgcat 2160

tgcctcttca gacatctcat gccctgtcta ctgcttacag ttcaagaata tttctctaca 2220

ttactagaac gacattcaaa gtggaataat aaataaataa ataatcaaca att 2273

<210> 7

<211> 2260

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 7

ccttgtaatt cataaatctc tgaaaactta aaagtttgag caaaagtttg tcatgtttct 60

atgagtaatt tataataaaa cttgatcaga atttgtgaga ctaacgtttg tctttatatt 120

ttcctttttt tttttttttt ttttgagaca cagtctcgct ctgtcgtcca ggctggagtg 180

ccgtggcgta atctcggctc actgcaacct ctgcctcctg gattcaaaca attcttctgc 240

ctcagcctcc tgagtagctg ggattacagg accagtgatg gtatagaaca ctgtattaga 300

gacatggagc tggggctgga tgaagattcc atcagtaatt caatcaacag acaagtgtta 360

tccaatcacg tctttaaatc aatcactgac atggagctgg ggctggatga agattccatc 420

agtaattcaa tcaacagaca agtgttatcc aatcacgtct ttaaatcaat cactgatccc 480

agcccctata aaagggagca gccttaggag gcacatcaga taaacccagt gtggaaagct 540

agtcacacat cagctcagtg ttcggcccgg gattacccag tcaaccaagg agcttgcagt 600

tttaaagaat ccaccaactg ttgaaacaaa tccctagaga cacaaggcaa gagactgaat 660

catcaaagta aagtctctct gagaattatt gctaagaatg gctttagatc taagaaccat 720

atttcagtgt gaaccatccg agaataatct tggatcagaa aattcagcgt ttcaacaaag 780

ccaaggacct gctgttcaga gagaagaagg gatttctgag ttctcaagaa tggtgctcaa 840

ttcatttcaa gacagcaata attcatatgc aaggcaggaa ttgcaaagac tttataggat 900

ctttcactca tggctgcaac cagaaaagca cagcaaggat gaaattattt ctctattagt 960

cctggagcag tttatgattg gtggccactg caatgacaaa gccagtgtga aagagaaatg 1020

gaaatcaagt ggcaaaaact tggagagatt catagaagac ctgactgatg acagcataaa 1080

tccacctgcc ttagtccacg tccacatgca gggacaggaa gctctctttt ctgaggatat 1140

gcccttaaga gatgtcattg ttcatctcac aaaacaagtg aatgcccaaa ccacaagaga 1200

agcaaacatg gggacaccct cccagacttc ccaagatact tccttagaaa caggacaagg 1260

atatgaagat gaacaagatg gctggaacag ttcttcgaaa actactcgag taaatgaaaa 1320

tattactaat caaggcaatc aaatagtttc cctaatcatc atccaggaag agaacggtcc 1380

taggcctgaa gagggaggtg tttcttctga caacccatac aactcaaaaa gagcagagct 1440

agtcactgct agatctcagg aagggtccat aaatggaatc actttccaag gtgtccctat 1500

ggtgatggga gcagggtgta tctctcaacc agagcagtcc tcccctgagt ctgcccttac 1560

ccaccagagc aatgagggaa attccacatg tgaggtacat cagaaaggat cccatggagt 1620

ccaaaaatca tacaaatgtg aagaatgccc caaggtcttt aagtatctct gtcacttatt 1680

agctcaccag agaagacaca ggaatgagag gccatttgtt tgtcccgagt gtcaaaaagg 1740

cttcttccag atatcagacc tacgggtgca tcagataatt cacacaggaa agaagccttt 1800

cacatgcagc atgtgtaaaa agtccttcag ccacaaaacc aacctgcggt ctcatgagag 1860

aatccacaca ggagaaaagc cttatacatg tcccttttgt aagacaagct accgccagtc 1920

atccacatac caccgccata tgaggactca tgagaaaatt accctgccaa gtgttccctc 1980

cacaccagaa gcttcctaag ctgctggtct gataatgtgt ataaatatgt atgcaagtat 2040

gtatattcct atagtattta tctacttagg atataagata taatctcctg attatgcttt 2100

caatttattg tcttgcttca ttaaaatgta aggctaagga gagcatggaa tttgtcagtt 2160

ttgttcacta aagtattcca agtggttggg aaagtggaac atttccaaga accaataaat 2220

ttctgttgaa taaatgaatg aatccaaaaa aaaaaaaaaa 2260

<210> 8

<211> 1302

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 8

atggcttcag atatcagaat atcatttcag ggagaaccat ctatgaatga tcctgggtca 60

gaaaacctag agcataaact tagccaagga ccagccattc aggaggaaga cgagatctat 120

gagttcccaa gcactcagct cactttattg caaaacagta actcaagtgc aaggcaggaa 180

ctgcaaaatc tctataagtt atttcactca tggctgcaac cagagaaaca cagcaaggat 240

gagattattt ctcatctggt cttggaacag tttatgatca atggccactg cagtgacagg 300

tccatgttga aaaagaaatg gaatgcaagt ggcaggaacc tggagaaatt catggaagat 360

ctgactgatg atggcatgaa gctacctgga ttagtccacg tccacatgaa gggccaggac 420

gccctctttt ctgagaatat gcccttaaga gaagtcatcg ttcatttcat gaaacaattg 480

tcagcaggaa ccccaacaga agagaacatg gggacaccct cctggacttc ccaagatact 540

tccctggaaa caggacaagg tgagtgggat aaagcaaatg gctacaacat ttatcacaat 600

gacggtacta ctagtcaagg caatgcagta ccttccctgt tcattgtcca tgaggaggac 660

tgtcctcacc ctgaagagga cagtgtttct ttgaaggatc tgctcagccc tggaagaccg 720

ggtctaggta cgtccaattc ccaggaaggg tgcctgcaag gacgcccata tcaagatgtc 780

ctgatggagg gggcaccagg gtttcactct cggtcaaccg cagtcacccc tgaccctgtt 840

tctacccacc aaaaaaccga ggggaattcc acatgtgggg gacaccaaga aagattccgt 900

gacgcccaaa actcctacag atgtgaaaaa tgtcccagga tctttaggta tttctctcag 960

ctaaaagccc atcagagaag acacaacaat gagaggacat tcatttgtgc tgagtgtaac 1020

aaaggcttct tccaagcgtc agacctacac gtgcatcaga agattcacac agaagagaag 1080

cctttcaggt gcagcacatg tgaaaaatcc ttcagccaca aaaccaacct tctggcccat 1140

gagagaatcc acacgggtga gaagccctat gtatgtgcgc tttgccagag aagctaccgc 1200

cagtcatcca cctaccaccg ccacctgagg actcaccaga aaattgccgt caaaggtact 1260

ccttccacat cagaagcttc ctcagctgta gcctcagtgt aa 1302

<210> 9

<211> 1251

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 9

atggatttag gtttcagagc atcatttcag catgaaccat ccaatgagga cccaaagtca 60

gcaaatacag gctttatccc cagtcgagga cccactctgc aaacagcaga ggatatctct 120

cagttgcaaa acactcagcc cggcttattg caaaatggta ataactcacg tgcaaggcag 180

gaactgcaaa gactctataa gtcatttcac ttatggctgc agccagaaaa acacagcaag 240

catgaaatta tttttcaact tgccctggaa caatttatga tcaataagca ctgcagtgaa 300

aagtctactt tgaaagagaa atggaaagca agtggtggag acctggagaa attcacagaa 360

gacctgcatg atgactgcat aaagctacct gatttggtcc atgtccactt gcaggggcag 420

gaagccctct tttcagaaaa tatgtcctta aaagaaatca tctttcatct aaccaatcag 480

ttgtcaacag gaggggtgaa catgggaact ccgtcctgga ccatgcaaga tacatccctg 540

gaaacaggac aaagaaatga aggtaaagaa aatgatggca acatttctgt gaaaagtgac 600

agtattacta gtccaagcaa tcagatacct tccctaatca ttgtccaaga agagaatcac 660

ctgaggctgg aagaaggagg tgtttctctg gagaatccac ggaactccag aagaggagca 720

ggcccaggcc cctccaggcc tcaggatgga tccctgaaag gaccctcctc tcaagatgtc 780

ctcatggaag tggaacgaga ccaggtcacc cctgggcctg tttctaccct ccagagctct 840

gaggggactt ctgcacgtgg gaaacaccag gaaagatccc tcagagcccc agaagtatac 900

agatgtgaga gatgtcccaa gaccttcagg tattcctctc ggttcagagt tcaccagaaa 960

agacacgata atgagagaac atatatttgt gccgagtgtg gcaaaggctt ctttcaggcc 1020

tcagacctcc atgtgcatca gaggattcat acaggagaga agccctttgt gtgcagcaca 1080

tgtgaaatgg ccttcaccca caaaaccaac cttcgggctc acgagagaac ccacacggga 1140

gagaagccct atgagtgttc cctctgccag agacgcttcc gccagtcctc cacctaccac 1200

cgccatctta ggtttcacca gaaaactacc ctcaaaagtg ctccacacta a 1251

<210> 10

<211> 1713

<212> ДНК

<213> Equus caballus

<400> 10

atggctttag atctcagaat ctcatttcaa ggtgaaccat ccaggaatga tcctgggtca 60

gaaaatcatg agtttaatcc ccgtcaagta cctgctgtcc aggatgggga gaggatctcc 120

aagttcccga gcactcaaca cagcttattt caaaatggca agaattcatg tgcaaggcag 180

gaactgcaaa gactctataa gttatttcac tcctggctac agccagaaaa acacagcaag 240

gatgaaatga tttctcgttt ggtcctggag caatttatga tcaatggcta ctgcagtgac 300

aggtccatgt tgaaagagaa atgggaatca agtggcagaa acctggagaa attcatggaa 360

gatctgactg atgatggcat gaagccacct ggcttagtcc acgtctgcat gcaggggcag 420

gaagctctct tttctgagaa tatgccctta agagaagtca tagttcacct caggaaacag 480

ttctcaacag gaacccaaac tggagagaac atggggaccc ctttccagac tcccaaagat 540

cattctctgg aaacagaaca aggagatgaa gacaaagaaa atggtggcaa catatctttg 600

aaaacttgtc aagtaaatga cagtatgact agtcaaggca atcaaacacc ttccctactc 660

atcatccagg gagagaaccg tcctgggcct ggagagggag gtgttccttt ggagaatcca 720

ctcagctcca gaagagcagg tctaggcagc tgcaggtccc aggaagagtc cctgaaagga 780

cccccttatc aagatgtcct tatagaggtg agaccagggt ttctctcccg gccaaaccag 840

gttacgcctg agcgtgttcc tacccaccag agcattgagg gaaactcagc atgtggggga 900

caccaagaaa gatcccaggg agcccccaaa tcatacaaat gtgagaagtg tcccaggatc 960

tttaggtatc tgtctcggtt aaaagcccat caaagaagac acaataatga gaggacattt 1020

atttgtggcc agtgtgacaa aggcttcttc caggcatcag acctacgcat gcatcagaag 1080

attcacacag gagagaaacc tttcaagtgc agcacatgtg aaatgtcctt cagccacaaa 1140

accaaccttc gggctcatga gagaatccac acaggggaga agccctatgt gtgttccctt 1200

tgccagagaa gctaccgcca gtcatccacc taccaccgcc acctgaggac tcaccagaaa 1260

attgccttca aaagtgttcc ctctaggggg ctgtggcagc ataccagttc atggatcccc 1320

acacagcaga ttcccacaac tgtaagagga ggtgaggaca gcatgaccgg aaaacacttt 1380

tgggctctgg cccatgggag ggcccaacat gccatagtgg ccttgcctgt ggaaatgctc 1440

tacactgagt ggcggtggct cccctccacc ctagcacagt gcaggcaaga aggtgccctg 1500

cccgctcaga aggtgcccct gtctgcagag cacagtagcc agaaggatcc acagagtggt 1560

ggctcagccc ccgcatgggt gccctacacc cttagtgtag cgcaggcaag aaggcaccct 1620

gcccactcag aaggtacccc aacccacaga gcatggcagc ccacaggaac catcaagtgg 1680

cggctcagcc tctacatagc ctgcagcagc taa 1713

<210> 11

<211> 360

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu

1 5 10 15

Glu Phe Thr Pro Thr Asp Ser Ser Gly Val Gln Trp Ala Glu Asp Ile

20 25 30

Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser

50 55 60

Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu

65 70 75 80

Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Thr Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala

85 90 95

Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met

100 105 110

Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val

115 120 125

Ser Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Thr

145 150 155 160

Pro Asp Asn Ala Gln Met Pro Val Asp Thr Thr Gln Asp Arg Leu Leu

165 170 175

Ala Thr Gly Gln Glu Asn Ser Glu Asn Glu Cys Asn Thr Ser Cys Asn

180 185 190

Ala Thr Glu Gly Asn Val Gly Glu Ser Cys Ser Gly Asn Glu Met Asp

195 200 205

Ser Ser Leu Ile Ile Gln Lys Glu Gln Tyr Pro Glu His Glu Glu Gly

210 215 220

Asn Val Val Cys Gln Phe Pro Leu Asp Ala Arg Arg Ala Ser Gln Gly

225 230 235 240

Thr Ser Ser His His Val Asp Phe Leu Ser Ala Leu Thr Thr Ala Asp

245 250 255

Val Pro Met Glu Glu Gln Pro Lys Asp Leu Ser Arg Glu Asn Ile Ser

260 265 270

Glu Asp Lys Asn Asn Cys Tyr Asn Thr Ser Arg Asn Ala Ala Thr Lys

275 280 285

Val Tyr Ser Gly Asp Asn Ile Pro Arg Lys Lys Thr Asp Ser Leu Ser

290 295 300

Ile Asn Lys Arg Ile Tyr His Pro Glu Pro Glu Val Gly Asp Ile Pro

305 310 315 320

Tyr Gly Val Pro Gln Asp Ser Thr Arg Ala Ser Gln Gly Thr Ser Thr

325 330 335

Cys Leu Gln Glu Ser Leu Gly Gly Cys Phe Ser Glu Lys Asp Pro Arg

340 345 350

Glu Val Pro Gly Leu Gln Ser Arg

355 360

<210> 12

<211> 195

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu

1 5 10 15

Glu Phe Thr Pro Thr Asp Ser Ser Gly Val Gln Trp Ala Glu Asp Ile

20 25 30

Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser

50 55 60

Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu

65 70 75 80

Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Thr Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala

85 90 95

Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met

100 105 110

Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val

115 120 125

Ser Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Ile

145 150 155 160

Pro Asp Asn Ala Gln Met Pro Val Asp Thr Thr Gln Asp Arg Leu Leu

165 170 175

Ala Thr Gly Lys Lys Thr Val Lys Met Asn Ala Thr Pro Leu Ala Met

180 185 190

Leu Leu Lys

195

<210> 13

<211> 506

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu

1 5 10 15

Glu Phe Thr Pro Thr Asp Ser Ser Gly Val Gln Trp Ala Glu Asp Ile

20 25 30

Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser

50 55 60

Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu

65 70 75 80

Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Thr Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala

85 90 95

Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met

100 105 110

Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val

115 120 125

Ser Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Thr

145 150 155 160

Pro Asp Asn Glu Gln Met Pro Val Asp Thr Thr Gln Asp Arg Leu Leu

165 170 175

Ala Thr Gly Gln Glu Asn Ser Glu Asn Glu Cys Asn Asn Ser Cys Asn

180 185 190

Ala Thr Glu Ala Asn Val Gly Glu Ser Cys Ser Gly Asn Glu Met Asp

195 200 205

Ser Leu Leu Ile Ile Gln Lys Glu Gln His Pro Glu His Glu Glu Gly

210 215 220

Asn Val Val Cys Gln Phe Pro His Gly Ala Arg Arg Ala Ser Gln Gly

225 230 235 240

Thr Pro Ser His His Val Asp Phe Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ala Asp

245 250 255

Val Pro Met Glu Glu Gln Pro Lys Asp Leu Ser Arg Glu Asn Ile Ser

260 265 270

Glu Asp Lys Asn Asn Cys Tyr Asn Thr Ser Arg Asn Ala Ala Thr Gln

275 280 285

Val Tyr Ser Gly Asp Asn Ile Pro Arg Asn Lys Ser Asp Ser Leu Phe

290 295 300

Ile Asn Lys Arg Ile Tyr His Pro Glu Pro Glu Val Gly Asp Ile Pro

305 310 315 320

Tyr Gly Val Pro Gln Asp Ser Thr Arg Ala Ser Gln Gly Thr Ser Thr

325 330 335

Cys Leu Gln Glu Ser Leu Gly Glu Cys Phe Ser Glu Asn Asp Pro Arg

340 345 350

Glu Val Pro Gly Leu Gln Ser Arg Gln Glu Gln Pro Ile Ser Asp Pro

355 360 365

Val Leu Leu Gly Lys Asn His Glu Ala Asn Leu Pro Cys Glu Ser His

370 375 380

Gln Lys Arg Phe Cys Arg Asp Ala Lys Leu Tyr Lys Cys Glu Glu Cys

385 390 395 400

Ser Arg Met Phe Lys His Ala Arg Ser Leu Ser Ser His Gln Arg Thr

405 410 415

His Leu Asn Lys Lys Ser Glu Leu Leu Cys Val Thr Cys Gln Lys Met

420 425 430

Phe Lys Arg Val Ser Asp Arg Arg Thr His Glu Ile Ile His Met Pro

435 440 445

Glu Lys Pro Phe Lys Cys Ser Thr Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys

450 455 460

Thr Asn Leu Lys Ser His Glu Met Ile His Thr Gly Glu Met Pro Tyr

465 470 475 480

Val Cys Ser Leu Cys Ser Arg Arg Phe Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His

485 490 495

Arg His Leu Arg Asn Tyr His Arg Ser Asp

500 505

<210> 14

<211> 506

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu

1 5 10 15

Glu Phe Thr Pro Ser His Ser Ser Gly Val Gln Trp Val Glu Asp Ile

20 25 30

Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser

50 55 60

Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu

65 70 75 80

Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Ile Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala

85 90 95

Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met

100 105 110

Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val

115 120 125

Ser Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Thr

145 150 155 160

Pro Asp Asn Glu Gln Met Pro Val Asp Thr Thr Gln Asp Arg Leu Leu

165 170 175

Ala Thr Gly Gln Glu Asn Ser Glu Asn Glu Cys Asn Asn Ser Cys Asn

180 185 190

Ala Thr Glu Ala Asn Val Gly Glu Ser Cys Ser Gly Asn Glu Met Asp

195 200 205

Ser Leu Leu Ile Ile Gln Lys Glu Gln His Pro Glu His Glu Glu Gly

210 215 220

Asn Val Val Phe Gln Phe Pro Leu Asp Ala Arg Arg Ala Ser Gln Gly

225 230 235 240

Asn Ser Ser His His Val Asp Phe Arg Ser Ala Pro Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Val Pro Met Glu Glu Gln Pro Lys Asp Leu Ser Arg Glu Asn Ile Ser

260 265 270

Glu Asp Lys Asn Asn Cys Tyr Asn Thr Ser Arg Asn Ala Ala Thr Gln

275 280 285

Val Tyr Arg Ser Asp Asn Ile Pro Arg Lys Lys Thr Asp Ser Leu Ser

290 295 300

Ile Asn Lys Arg Ile Tyr His Ser Glu Pro Glu Glu Gly Asp Ile Pro

305 310 315 320

Tyr Gly Val Pro Gln Asp Ser Thr Arg Ala Ser Gln Gly Thr Ser Thr

325 330 335

Cys Leu Gln Glu Ser Leu Gly Glu Cys Phe Ser Glu Lys Asp Pro Arg

340 345 350

Glu Leu Pro Gly Leu Glu Ser Arg Gln Glu Glu Pro Ile Ser Asp Pro

355 360 365

Val Phe Leu Gly Lys Asp His Glu Ala Asn Leu Pro Cys Glu Ser His

370 375 380

Gln Lys Arg Phe Arg Arg Asp Ala Lys Leu Phe Lys Cys Glu Glu Cys

385 390 395 400

Ser Arg Met Phe Lys His Ala Arg Ser Leu Ser Ser His Gln Arg Thr

405 410 415

His Leu Asn Lys Lys Ser Glu Leu Leu Cys Val Thr Cys Gln Lys Met

420 425 430

Phe Lys Arg Val Ser Asp Arg Arg Thr His Glu Ile Ile His Met Pro

435 440 445

Glu Lys Pro Phe Lys Cys Ser Thr Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys

450 455 460

Thr Asn Leu Lys Ser His Glu Met Ile His Thr Gly Glu Met Pro Tyr

465 470 475 480

Val Cys Ser Leu Cys Ser Arg Arg Phe Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His

485 490 495

Arg His Leu Arg Asn Tyr His Arg Ser Asp

500 505

<210> 15

<211> 195

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu

1 5 10 15

Glu Phe Thr Pro Thr Asp Ser Ser Gly Val Gln Trp Ala Glu Asp Ile

20 25 30

Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser

50 55 60

Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu

65 70 75 80

Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Thr Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala

85 90 95

Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met

100 105 110

Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val

115 120 125

Ser Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Ile

145 150 155 160

Pro Asp Asn Glu Gln Met Pro Val Asp Thr Thr Gln Asp Arg Leu Leu

165 170 175

Ala Thr Gly Lys Lys Thr Val Lys Met Asn Ala Thr Pro Leu Ala Met

180 185 190

Leu Leu Lys

195

<210> 16

<211> 506

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu

1 5 10 15

Glu Phe Thr Pro Thr Asp Ser Ser Gly Val Gln Trp Ala Glu Asp Ile

20 25 30

Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser

50 55 60

Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu

65 70 75 80

Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Thr Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala

85 90 95

Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met

100 105 110

Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val

115 120 125

Ser Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Thr

145 150 155 160

Pro Asp Asn Glu Gln Met Pro Val Asp Thr Thr Gln Asp Arg Leu Leu

165 170 175

Ala Thr Gly Gln Glu Asn Ser Glu Asn Glu Cys Asn Asn Ser Cys Asn

180 185 190

Ala Thr Glu Ala Asn Val Gly Glu Ser Cys Ser Gly Asn Glu Met Asp

195 200 205

Ser Leu Leu Ile Met Gln Lys Glu Gln His Pro Glu His Glu Glu Gly

210 215 220

Asn Val Val Cys Gln Phe Pro His Gly Ala Arg Arg Ala Ser Gln Gly

225 230 235 240

Thr Pro Ser His His Val Asp Phe Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ala Asp

245 250 255

Val Pro Met Glu Glu Gln Pro Lys Asp Leu Ser Arg Glu Asn Ile Ser

260 265 270

Glu Asp Lys Asn Asn Cys Tyr Asn Thr Ser Arg Asn Ala Ala Thr Gln

275 280 285

Val Tyr Ser Gly Asp Asn Ile Pro Arg Asn Lys Ser Asp Ser Leu Phe

290 295 300

Ile Asn Lys Arg Ile Tyr His Pro Glu Pro Glu Val Gly Asp Ile Pro

305 310 315 320

Tyr Gly Val Pro Gln Asp Ser Thr Arg Ala Ser Gln Gly Thr Ser Thr

325 330 335

Cys Leu Gln Glu Ser Leu Gly Glu Cys Phe Ser Glu Lys Asp Pro Arg

340 345 350

Glu Val Pro Gly Leu Gln Ser Arg Gln Glu Gln Leu Ile Ser Asp Pro

355 360 365

Val Leu Leu Gly Lys Asn His Glu Ala Asn Leu Pro Cys Glu Ser His

370 375 380

Gln Lys Arg Phe Cys Arg Asp Ala Lys Leu Tyr Lys Cys Glu Glu Cys

385 390 395 400

Ser Arg Met Phe Lys His Ala Arg Ser Leu Ser Ser His Gln Arg Thr

405 410 415

His Leu Asn Lys Lys Ser Glu Leu Leu Cys Val Thr Cys Gln Lys Met

420 425 430

Phe Lys Arg Val Ser Asp Arg Arg Thr His Glu Ile Ile His Met Pro

435 440 445

Glu Lys Pro Phe Lys Cys Ser Thr Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys

450 455 460

Thr Asn Leu Lys Ser His Glu Met Ile His Thr Gly Glu Met Pro Tyr

465 470 475 480

Val Cys Ser Leu Cys Ser Arg Arg Phe Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His

485 490 495

Arg His Leu Arg Asn Tyr His Arg Ser Asp

500 505

<210> 17

<211> 433

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn

1 5 10 15

Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn

35 40 45

Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly

85 90 95

His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly

100 105 110

Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn

115 120 125

Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln

145 150 155 160

Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln

165 170 175

Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu

180 185 190

Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Ser Lys Thr Thr Arg Val Asn Glu Asn

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu

210 215 220

Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro

225 230 235 240

Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly

245 250 255

Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala

260 265 270

Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr

275 280 285

His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly

290 295 300

Ser His Gly Val Gln Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn

325 330 335

Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile

340 345 350

Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe

355 360 365

Thr Cys Ser Met Cys Lys Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg

370 375 380

Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe

385 390 395 400

Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg

405 410 415

Thr His Glu Lys Ile Thr Leu Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala

420 425 430

Ser

<210> 18

<211> 433

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 18

Met Ala Ser Asp Ile Arg Ile Ser Phe Gln Gly Glu Pro Ser Met Asn

1 5 10 15

Asp Pro Gly Ser Glu Asn Leu Glu His Lys Leu Ser Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Ile Gln Glu Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Phe Pro Ser Thr Gln Leu Thr

35 40 45

Leu Leu Gln Asn Ser Asn Ser Ser Ala Arg Gln Glu Leu Gln Asn Leu

50 55 60

Tyr Lys Leu Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys Asp

65 70 75 80

Glu Ile Ile Ser His Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Asn Gly His

85 90 95

Cys Ser Asp Arg Ser Met Leu Lys Lys Lys Trp Asn Ala Ser Gly Arg

100 105 110

Asn Leu Glu Lys Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Gly Met Lys Leu

115 120 125

Pro Gly Leu Val His Val His Met Lys Gly Gln Asp Ala Leu Phe Ser

130 135 140

Glu Asn Met Pro Leu Arg Glu Val Ile Val His Phe Met Lys Gln Leu

145 150 155 160

Ser Ala Gly Thr Pro Thr Glu Glu Asn Met Gly Thr Pro Ser Trp Thr

165 170 175

Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Glu Trp Asp Lys Ala

180 185 190

Asn Gly Tyr Asn Ile Tyr His Asn Asp Gly Thr Thr Ser Gln Gly Asn

195 200 205

Ala Val Pro Ser Leu Phe Ile Val His Glu Glu Asp Cys Pro His Pro

210 215 220

Glu Glu Asp Ser Val Ser Leu Lys Asp Leu Leu Ser Pro Gly Arg Pro

225 230 235 240

Gly Leu Gly Thr Ser Asn Ser Gln Glu Gly Cys Leu Gln Gly Arg Pro

245 250 255

Tyr Gln Asp Val Leu Met Glu Gly Ala Pro Gly Phe His Ser Arg Ser

260 265 270

Thr Ala Val Thr Pro Asp Pro Val Ser Thr His Gln Lys Thr Glu Gly

275 280 285

Asn Ser Thr Cys Gly Gly His Gln Glu Arg Phe Arg Asp Ala Gln Asn

290 295 300

Ser Tyr Arg Cys Glu Lys Cys Pro Arg Ile Phe Arg Tyr Phe Ser Gln

305 310 315 320

Leu Lys Ala His Gln Arg Arg His Asn Asn Glu Arg Thr Phe Ile Cys

325 330 335

Ala Glu Cys Asn Lys Gly Phe Phe Gln Ala Ser Asp Leu His Val His

340 345 350

Gln Lys Ile His Thr Glu Glu Lys Pro Phe Arg Cys Ser Thr Cys Glu

355 360 365

Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Leu Ala His Glu Arg Ile His

370 375 380

Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Val Cys Ala Leu Cys Gln Arg Ser Tyr Arg

385 390 395 400

Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Leu Arg Thr His Gln Lys Ile Ala

405 410 415

Val Lys Gly Thr Pro Ser Thr Ser Glu Ala Ser Ser Ala Val Ala Ser

420 425 430

Val

<210> 19

<211> 416

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 19

Met Asp Leu Gly Phe Arg Ala Ser Phe Gln His Glu Pro Ser Asn Glu

1 5 10 15

Asp Pro Lys Ser Ala Asn Thr Gly Phe Ile Pro Ser Arg Gly Pro Thr

20 25 30

Leu Gln Thr Ala Glu Asp Ile Ser Gln Leu Gln Asn Thr Gln Pro Gly

35 40 45

Leu Leu Gln Asn Gly Asn Asn Ser Arg Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Lys Ser Phe His Leu Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

His Glu Ile Ile Phe Gln Leu Ala Leu Glu Gln Phe Met Ile Asn Lys

85 90 95

His Cys Ser Glu Lys Ser Thr Leu Lys Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly

100 105 110

Gly Asp Leu Glu Lys Phe Thr Glu Asp Leu His Asp Asp Cys Ile Lys

115 120 125

Leu Pro Asp Leu Val His Val His Leu Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asn Met Ser Leu Lys Glu Ile Ile Phe His Leu Thr Asn Gln

145 150 155 160

Leu Ser Thr Gly Gly Val Asn Met Gly Thr Pro Ser Trp Thr Met Gln

165 170 175

Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Arg Asn Glu Gly Lys Glu Asn Asp

180 185 190

Gly Asn Ile Ser Val Lys Ser Asp Ser Ile Thr Ser Pro Ser Asn Gln

195 200 205

Ile Pro Ser Leu Ile Ile Val Gln Glu Glu Asn His Leu Arg Leu Glu

210 215 220

Glu Gly Gly Val Ser Leu Glu Asn Pro Arg Asn Ser Arg Arg Gly Ala

225 230 235 240

Gly Pro Gly Pro Ser Arg Pro Gln Asp Gly Ser Leu Lys Gly Pro Ser

245 250 255

Ser Gln Asp Val Leu Met Glu Val Glu Arg Asp Gln Val Thr Pro Gly

260 265 270

Pro Val Ser Thr Leu Gln Ser Ser Glu Gly Thr Ser Ala Arg Gly Lys

275 280 285

His Gln Glu Arg Ser Leu Arg Ala Pro Glu Val Tyr Arg Cys Glu Arg

290 295 300

Cys Pro Lys Thr Phe Arg Tyr Ser Ser Arg Phe Arg Val His Gln Lys

305 310 315 320

Arg His Asp Asn Glu Arg Thr Tyr Ile Cys Ala Glu Cys Gly Lys Gly

325 330 335

Phe Phe Gln Ala Ser Asp Leu His Val His Gln Arg Ile His Thr Gly

340 345 350

Glu Lys Pro Phe Val Cys Ser Thr Cys Glu Met Ala Phe Thr His Lys

355 360 365

Thr Asn Leu Arg Ala His Glu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr

370 375 380

Glu Cys Ser Leu Cys Gln Arg Arg Phe Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His

385 390 395 400

Arg His Leu Arg Phe His Gln Lys Thr Thr Leu Lys Ser Ala Pro His

405 410 415

<210> 20

<211> 570

<212> PRT

<213> Equus caballus

<400> 20

Met Ala Leu Asp Leu Arg Ile Ser Phe Gln Gly Glu Pro Ser Arg Asn

1 5 10 15

Asp Pro Gly Ser Glu Asn His Glu Phe Asn Pro Arg Gln Val Pro Ala

20 25 30

Val Gln Asp Gly Glu Arg Ile Ser Lys Phe Pro Ser Thr Gln His Ser

35 40 45

Leu Phe Gln Asn Gly Lys Asn Ser Cys Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Lys Leu Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Met Ile Ser Arg Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Asn Gly

85 90 95

Tyr Cys Ser Asp Arg Ser Met Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ser Ser Gly

100 105 110

Arg Asn Leu Glu Lys Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Gly Met Lys

115 120 125

Pro Pro Gly Leu Val His Val Cys Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asn Met Pro Leu Arg Glu Val Ile Val His Leu Arg Lys Gln

145 150 155 160

Phe Ser Thr Gly Thr Gln Thr Gly Glu Asn Met Gly Thr Pro Phe Gln

165 170 175

Thr Pro Lys Asp His Ser Leu Glu Thr Glu Gln Gly Asp Glu Asp Lys

180 185 190

Glu Asn Gly Gly Asn Ile Ser Leu Lys Thr Cys Gln Val Asn Asp Ser

195 200 205

Met Thr Ser Gln Gly Asn Gln Thr Pro Ser Leu Leu Ile Ile Gln Gly

210 215 220

Glu Asn Arg Pro Gly Pro Gly Glu Gly Gly Val Pro Leu Glu Asn Pro

225 230 235 240

Leu Ser Ser Arg Arg Ala Gly Leu Gly Ser Cys Arg Ser Gln Glu Glu

245 250 255

Ser Leu Lys Gly Pro Pro Tyr Gln Asp Val Leu Ile Glu Val Arg Pro

260 265 270

Gly Phe Leu Ser Arg Pro Asn Gln Val Thr Pro Glu Arg Val Pro Thr

275 280 285

His Gln Ser Ile Glu Gly Asn Ser Ala Cys Gly Gly His Gln Glu Arg

290 295 300

Ser Gln Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Lys Cys Pro Arg Ile

305 310 315 320

Phe Arg Tyr Leu Ser Arg Leu Lys Ala His Gln Arg Arg His Asn Asn

325 330 335

Glu Arg Thr Phe Ile Cys Gly Gln Cys Asp Lys Gly Phe Phe Gln Ala

340 345 350

Ser Asp Leu Arg Met His Gln Lys Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe

355 360 365

Lys Cys Ser Thr Cys Glu Met Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg

370 375 380

Ala His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Val Cys Ser Leu

385 390 395 400

Cys Gln Arg Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Leu Arg

405 410 415

Thr His Gln Lys Ile Ala Phe Lys Ser Val Pro Ser Arg Gly Leu Trp

420 425 430

Gln His Thr Ser Ser Trp Ile Pro Thr Gln Gln Ile Pro Thr Thr Val

435 440 445

Arg Gly Gly Glu Asp Ser Met Thr Gly Lys His Phe Trp Ala Leu Ala

450 455 460

His Gly Arg Ala Gln His Ala Ile Val Ala Leu Pro Val Glu Met Leu

465 470 475 480

Tyr Thr Glu Trp Arg Trp Leu Pro Ser Thr Leu Ala Gln Cys Arg Gln

485 490 495

Glu Gly Ala Leu Pro Ala Gln Lys Val Pro Leu Ser Ala Glu His Ser

500 505 510

Ser Gln Lys Asp Pro Gln Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Trp Val Pro

515 520 525

Tyr Thr Leu Ser Val Ala Gln Ala Arg Arg His Pro Ala His Ser Glu

530 535 540

Gly Thr Pro Thr His Arg Ala Trp Gln Pro Thr Gly Thr Ile Lys Trp

545 550 555 560

Arg Leu Ser Leu Tyr Ile Ala Cys Ser Ser

565 570

<210> 21

<211> 528

<212> ДНК

<213> Gorilla gorilla

<220>

<221> misc_feature

<222> 18, 19, 80, 211, 212, 519, 520, 521, 522

<223> n = A,T,C or G

<400> 21

aatggaatca ctttccanng tgtccctatg gtgatgggag cagggtgtat ctctcaacca 60

gagcagtcct cccctgagtn tgcccttacc caccagagca atgagggaaa ctccacatgt 120

gaggtacatc agaaaggatc ccatggagtc cgaaaatcat acaaatgtga agaatgcccc 180

aaggtcttta agtatcactg tcacttatta nntcaccaga gaagacacag gaatgagagg 240

ccatttgttt gtcccgagtg tcaaaaaggc ttcttccaga tatcagacct acgggtgcat 300

cagataattc acacaggaaa gaagcctttc acatgcagca tgtgtaaaaa gtccttcagc 360

cacaaaacca acctgcggtc tcatgagaga atccacacag gagaaaagcc ttatacatgt 420

cccttttgta agacaagcta ccgccagtca tccacatacc accgccatat gaggactcat 480

gagaaaatta ccctgccaag tgttccctcc acaccagann nntcctaa 528

<210> 22

<211> 1302

<212> ДНК

<213> Pan paniscus

<400> 22

atggctttag atctaagaac catatttcag tgtgaaccat ccgagaataa tcttggatca 60

gaaaattcag cgtttcaaca aagccaagga cctgctgttc agagagaaga agggatttct 120

gagttctcaa gaatggtgct caattcattt caagacagca ataattcata tgcaaggcag 180

gaattgcaaa gactttatag gatctttcac tcatggctgc aaccagaaaa gcacagcaag 240

gatgaaatta tttctctatt agtcctggag cagtttatga ttggtggcca ctgcaatgac 300

aaagccggtg tgaaagagaa atggaaatca agtggcaaaa acttggagag attcatagaa 360

gacctgactg atgacagcat aaatccacct gccttagtcc acgtccacat gcagggacag 420

gaagctctct tttctgagga tatgccctta agagatgtca ttgttcatct cacaaaacaa 480

gtgaatgccc aaaccacaag agaagcaaac atggggacac cctcccagac ttcccaagat 540

acttccttag aaacaggaca aggatatgaa gatgaacaag atggctggaa cagttctttg 600

aaaactactc aagtaaatga aaatattact aatcaaggcg atcaaatagt ttccctaatc 660

atcatccagg aagagaacag tcctaggcct gaagagggag gtgtttcttc tgacaaccca 720

tacaactcaa aaagagcaga gctagtcact gctagatctc aggaagggtc cataaatgga 780

atcactttcc aaggtgtccc tatggtgatg ggagcagggt gtatctctca accagagcag 840

tcctcccctg agtctgccct tacccaccag agcaatgagg gaaactccac atgtgaggta 900

catcagaaag gatcccatgg agtccgaaaa tcatacaaat gtgaagaatg ccccaaggtc 960

tttaagtatc tctgtcactt attagctcac cagagaagac acaggaatga gaggccattt 1020

gtttgtcccg agtgtcaaaa aggcttcttc cagatatcag acctacgggt gcatcagata 1080

attcacacag gaaagaagcc tttcacatgc agcatatgta aaaagtcctt cagccacaaa 1140

accaacctgc ggtctcatga gagaatccac acaggagaaa agccttatac atgtcccttt 1200

tgtaagacaa gctaccgcca gtcatccaca taccaccgcc atatgaggac tcatgagaaa 1260

attaccgtgc caagtgttcc ctccacacca gaagcttcct aa 1302

<210> 23

<211> 1302

<212> ДНК

<213> Bornean orangutan

<400> 23

atggctttag atctaagaac catatttcag tgtgaaccat ccgagaataa tcttggatca 60

gaaaattcag agtttcgaca aagccaagga cctgctgttc agagagaaga agggatttct 120

gagttctcaa gaatggtgct caattcattt caagacagca ataattcata tgcaaggcag 180

gaattgcaga gactttatag gatctttcac tcatggctgc aaccagaaaa gcacagcaag 240

gatgaaatta tttctctatt agtcctggag cagtttatga ttggtggcca ctgcaatgac 300

aaagccagtg tgaaagagaa atggaaatca agtggcaaaa acttggagag attcatggaa 360

gacctgactg atgacagcat aaatccacct gccttagtcc atgtccacat gcagggacag 420

gaagctctct tttctgagga tatgccctta aaagatgtca ttgttcatct cacaaaacaa 480

gtgtctgccc aaaccccaag agaagcaaat atggggacac cctcccagac ttcccaagat 540

acttccttag aaacaggaga aggatgtgaa gatgaacaag atggctgcaa cagttctttg 600

aaaactactc aagtaaatga aaatattact aatcaaggca atcaaatagt ttccctaatc 660

atcatccagg aagagaacgg tcctaggtct gaagagggag gtgtttcttc tgacaatcca 720

aacaactcaa aaagagcaga gctagtcact gctagatctc aggaagggtc cataaacgga 780

atcacttttc aaggtgtccc tatggagatg ggagcagggt gtatctctca gccagagcag 840

tcctcccctg agtctgccct tacccaccag agcaatgagg gaaactccac atgtgaggta 900

catcagaaag gatcccatgg agtccgaaaa tcctacaaat gtgaagaatg ccctaaggtc 960

tttaagtatc tctgtcactt attagctcac cagagaagac acaggaatga gaggccattt 1020

gtttgtcccg agtgtcaaaa aggcttcttc cagatatcag acctacgcgt gcatcagata 1080

attcacacag gaaagaagcc tttcacatgc agcatgtgtg aaaagtcctt cagccacaaa 1140

accaacctgc ggtctcatga gagaatccac acaggagaaa agccttatac atgtcccttt 1200

tgtaagacaa gctaccgcca gtcatccaca taccaccgcc atatgaggac tcatgagaaa 1260

attaccccgc caagtgttcc ctccacacca gaagcttcct aa 1302

<210> 24

<211> 1640

<212> ДНК

<213> Pongo abelii

<400> 24

tccaccaact gttgaaacaa atccctagag acacaaggca agagactgaa tcatcaaagt 60

aaagtctctc tgagaattat tgctaagaat ggctttagat ctaagaacca tatttcagtg 120

tgaaccatcc gagaataatc ttggatcaga aaattcagag tttcgacaaa gccaaggacc 180

tgctgttcag agagaagaag ggatttctga gttctcaaga atggtgctca attcatttca 240

agacagcaat aattcatatg caaggcagga attgcagaga ctttatagga tctttcactc 300

atggctgcaa ccagaaaagc acagcaagga tgaaattatt tctctattag tcctggagca 360

gtttatgatt ggtggccact gcaatgacaa agccagtgtg aaagagaaat ggaaatcaag 420

tggcaaaaac ttggagagat tcatggaaga cctgactgat gacagcataa atccacctgc 480

cttagtccat gtccacatgc agggacagga agctctcttt tctgaggata tgcccttaaa 540

agatgtcatt gttcatctca caaaacaagt gtctgcccaa accccaagag aagcaaatat 600

ggggacaccc tcccagactt cccaagatac ttccttagaa acaggagaag gatgtgaaga 660

tgaacaagat ggctgcaaca gttctttgaa aactactcaa gtaaatgaaa atattactaa 720

tcaaggcaat caaatagttt ccctaatcat catccaggaa gagaacggtc ctaggtctga 780

agagggaggt gtttcttctg acaatccaaa caactcaaaa agagcagagc tagtcactgc 840

tagatctcag gaagggtcca taaacggaat cacttttcaa ggtgtcccta tggagatggg 900

agcagggtgt atctctcagc cagagcagtc ctcccctgag tctgccctta cccaccagag 960

caatgaggga aactccacat gtgaggtaca tcagaaagga tcccatggag tccgaaaatc 1020

ctacaaatgt gaagaatgcc ctaaggtctt taagtatctc tgtcacttat tagctcacca 1080

gagaagacac aggaatgaga ggccatttgt ttgtcccgag tgtcaaaaag gcttcttcca 1140

gatatcagac ctacgcgtgc atcagataat tcacacagga aagaagcctt tcacatgcag 1200

catgtgtgaa aagtccttca gccacaaaac caacctgcgg tctcatgaga gaatccacac 1260

aggagaaaag ccttatacat gtcccttttg taagacaagc taccgccagt catccacata 1320

ccaccgccat atgaggactc atgagaaaat taccccgcca agtgttccct ccacaccaga 1380

agcttcctaa gctgctggtc tgataatgtg tataaatatg tatgcaagta tgtatattcc 1440

catagtattt atcgacttag gatataagat ataatttcct gattatgctt tcaatttatt 1500

gtcttgcttc attaaaatgt aaggctaagg agagcatgga atttgtcagt tttgttcact 1560

aaagtattcc aagtggttgg gaaagtggaa catttccaag aaccaataaa tttctgttga 1620

ataaatgaat gaatccaaaa 1640

<210> 25

<211> 1002

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратная трансляция SEQ ID NО: 35

<400> 25

ctgaaaattg atagctttct gtgcgaactg agcatggatg atccgggcag caaaaacaaa 60

gattttaaac cgagccaggg cccggcgctg cagaaagcgg aagaaattag cgaatttcag 120

gatagccagc atagcctgtt tcaggatggc aacaacagcc atgcgaaaca ggaactgcag 180

cgcctgtata aaagctttta tagctggctg cagccggaaa aacatagcaa agatgaaatt 240

atttttcagg tggtgctgga acagtttatg attaaccgcc attgcagcgg ccgcagcacc 300

ctgaaaaaaa aatgggaaag cagcggccgc aacctggaaa aatttatgga aagcctgagc 360

gaaagcagcc tgaaaccgcc ggatctggtg catgtgcata tgcagggcca ggaagcgctg 420

tttagcgaaa acatgccgct gaaagaagtg attgtgcatc tgaccaaaca gctgagcgtg 480

ggcagcccga ccggcaccga tatggaaacc ccgagctgga ccccgcagga taccagcctg 540

gaaaccggcc agggcgaatg gggcaaaaaa gaaaacggcg ataacattta tcatattaac 600

gatagcatta ccagccaggg caacgaaatt ccgagcctgc tgattattcg cgaagaagat 660

tatccgcgcc cggaagaaga tagcgtgagc ctgaaaaacc cgctgagcag ccgcaaagcg 720

ggcctgggca tgagcggcag ccaggaaggc agcctgaaag gcccgagcta tcaggatgtg 780

ctgatggaag gcggcccggg ctttctgagc cagagcattc aggtgagccc ggaaccggtg 840

ccgacccatc agcgcaccga aggcaacagc acccgcggcg gccatcagga acgctgccgc 900

gaagcgcaga acagctatcg ctgcgaaaaa tgcccgaaaa tttttcgcta ttttagccag 960

ctgaaagcgc atcagcgccg ccataacaac gaacgcacct tt 1002

<210> 26

<211> 1317

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратная трансляция SEQ ID NО: 36

<400> 26

atggatctgg atctgcgcct gagctttcag ggcgaaccga gccgcaacga tccgggcagc 60

gaaaacctgg cgctgaaagc gagccagggc tatgtgattc gcgatggcga aggcattagc 120

gaatttccga acacccgcct gagcctgttt cagaacagca gcaacagctt tgcgcgccgc 180

gaactgcagc gcctgtataa cctgtttcat agctggctgc agccggaaaa acgcagcaaa 240

gatgaaatga ttagctgcct ggtgctggaa cagtttgtga ttaacggcca ttgcagcgat 300

cgcagcaccc tgcaggaaaa atggaacgcg agcggccgca acctggaaaa atttatggaa 360

gatctgaccg atgatggcat gaaacagccg ggctttgtgc atgtgcatat gcagggccag 420

gaagcgctgt ttagcgaaaa catgccgctg cgcgaagtgc tggtgcattt tcgcaaacat 480

ctggcgaccg cgaccccgcg cggcgaaaac accaaagcgc cgctgtggac cccgcgcgat 540

gcgagcctgg aaaccggcca ggaaagcgaa ggcaaagaat gcggcggcaa caccagccgc 600

aaaacctgcc cggtgaccga aagcctgacc tggcagggca gccagacccc gtttctgctg 660

attattccgg aagaaacctg cccgggcctg gaagaagcgg gcgtgagccc ggaaaacccg 720

ctgggcagcc gcaccgcgga accgggcctg gcggtgagcc aggaaggcag cccggaaggc 780

ccgtttggcg gcgatgtgca tctggaagcg gaaccgggct ttctgagccg cccggatcag 840

gtgaccctgg aaccggtgag cgcgcatccg agcctggaag gcaacccggc gcgcggcaaa 900

agcccggaag gcctgccggg cgcgcagaaa gtgtttccgt gcgaaaaatg cagccaggtg 960

tttcgctatc tgagccgcct gaaagtgcat cagcgccgcc ataacgatga acgcccgttt 1020

gtgtgcgcga aatgcaaaaa aggctttttt cagaccagcg atctgcgcgt gcatcagcgc 1080

attcatacca aagaaaaacc gtttcgctgc agcacctgca aacgcccgtt tagccataaa 1140

accaacctgc gcgcgcatga acgcattcat accggcgaaa aaccgtatct gtgcagcctg 1200

tgccagcgcc gctatcgcca gagcagcacc tataaccgcc atctgaaaag ccatcagaaa 1260

ctggcgctga aaggcgatct gagcggcgtg ccggtggtgg cgcagcgcaa acgcatt 1317

<210> 27

<211> 1656

<212> ДНК

<213> Nomascus leucogenys

<400> 27

agattgcagt tttaaagaat ccaccaactg ttgaaacaaa tccctagaga cacaaggcaa 60

gagactgaat catcaaagtt aagtctctct gagaattatt gctaagaatg gctttagagc 120

taagaaccat atttcagtgt gaaccatccg agaataatct tggatcagaa aattcagagt 180

ttcgacaaag ccaaggacct gctgttcaga gagaagaagg gatttctgag ttctcaagaa 240

tggtgctcaa ttcatttcaa gacagcaata aatcatatgc aaggcaggaa ttgcaaagac 300

tttataggat ctttcactca tggctgcaac cagaaaagca cagcaaggat gaaattattt 360

ctctattagt cctggagcag tttatgattg gtggccactg caatgacaaa accagtgtga 420

aagagaaatg gaaatcaagt ggcaaaaact tggagagatt catggaagac ctgactgatg 480

acagcataaa tccacctgcc ttagtccacg tccacatgca gggacaggaa gctctctttt 540

ctgaggatat gcccttaaaa gatgtcattg ttcatctcac aaaacaagtg tctgcccaaa 600

tcccaagaga agcaaacatg gggacaccct tccagacttc ccaagatact tccttagaaa 660

caggacaagg acgtgaagat gaacaagatg gctgcaacag ttctttgaaa actactcaag 720

taaatgaaaa tattactaat caaggcaatc aaatagtttc cctaatcatc atccaggaag 780

agaatggtcc taggcctgaa gagggaggtg tttcttctga caacccatgc aactcaaaaa 840

gagcagagct agtcactgct agatcccagg aagggtccat aaacggaatc acttttcaag 900

gtgtccctat ggagatggga gcagggtgta tctctcagcc agagcagtcc tcccctgagt 960

ctgcccctac ccaccagagc aatgagggaa actccacatg tgaggtacat cagaaaggat 1020

cccatggagt ccgaaaatca tacaaatgtg aagaatgccc caaggtcttt aagtatctct 1080

gtcacttatt agctcaccag aggagacaca ggaatgagag gccatttgtt tgtcccgagt 1140

gtcagaaagg cttcttccag acatcagacc tacgcgtgca tcaggtgatt cacacaggaa 1200

agaagccttt cacatgcagc atgtgtgaaa agtccttcag ccacaaaacc aacctgcggt 1260

cccatgagag aatccacaca ggagaaaagc cttatacatg tccctattgt aagacaagct 1320

accgccagtc atccacatac caccgccata tgaggactca tgagaaaatt acctcaccaa 1380

gtgttccctc cacgccagaa gcttcctaag ctgctggtct gataatgtgt ataaatgtgt 1440

atgcaagtat gtatattccc atagtattta tctacttagg atataagata taatttcctg 1500

attatgcttt caatttattg tctgcttcat taaaatgtaa ggctaaggag agcatggaat 1560

ttgtcagttt tgctcactaa agtattccaa gtggttggga aagtgggaac atttccaaga 1620

accaataaat ttctgttgaa taaatgaatg aatcca 1656

<210> 28

<211> 1299

<212> ДНК

<213> Macaca mulatta

<400> 28

atggctttag atctaagaac catatttcag catgaaccat ccgagaataa tcttggatca 60

gaaaattcag agtttcgacg aagtcaagga cctgctgttc agacagaaga agggatttct 120

gagttctcaa gaatgatgct caattcattt caagacagca ataattcata tgcaaggcag 180

gaattgcaaa gactttatag gatctttcac tcatggctgc aaccagaaaa gcacagcaag 240

gatgaaatta tttctctatt agtcctggag cagtttatga ttggtggcca ctgcaatgac 300

aaagccactg tgaaagagaa atggaaatca agtggcaaaa acctggagag attcatggaa 360

gacctgactg atgacatcat aaatccacct gccttagtcc atgtccacat gcagggacag 420

gaagctctct tttctgacaa tatgccctta aaagatgtca ttgttcatct cacaaaacaa 480

gtgtctgcca aaactccaag agaagcaaac atggggacac ccttccagac ttcccaagac 540

acttcctcag aaacaggaca aggacgtgaa gatgaacaag atggctgcaa cagttctttg 600

aaaactactc aagtaaatga aagtaatact aatcaagaca atccaatagt ttctctaatc 660

atccaggaag agaatggccc taggcctaaa gagggaggtg tttcttctga caacccatac 720

aattcaagaa gaacagagct agacactgct agatcccagg aagggtccac gaacggaatt 780

atttttcaag gtgtccctat ggagatggga gcagggttta tctctcagcc agagcagtca 840

tcccctgagt ctgcccctac ccaccagagc aataagggga actccacatg tgaggtacat 900

cagaaaggat cccatggagt ccgaaaatca tacaaatgtg aagaatgccc caaggtcttt 960

aagtatctct gtcacttatt agctcaccag agaagacaca ggaatgagag gccatttgtt 1020

tgtcccaagt gtcaaaaagg cttcttccag atatcagacc tacgtgtgca tcagataatt 1080

cacacaggag agaaaccttt tacatgcagc atgtgtgaaa agtccttcag ccacaaaacc 1140

aacctgcggt ctcatgagag aatccacaca ggagaaaagc cttatacatg tccctattgt 1200

aagagaagct accgccagtc atccacatac caccgccata tgaggactca taagaaaatt 1260

actctgccaa ctgttccctc cacaccagaa gcttcctaa 1299

<210> 29

<211> 1008

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратная трансляция SEQ ID NО: 39

<400> 29

atggcgctgg atctgcgcaa aagcttttgc caggaactga gcagcaacaa cctggaaagc 60

gaagatctgg aatttagcag cacccagggc tttgcggtgc cgaaacgcga aattagcgcg 120

tttagcagca ttcagctgaa cagcctgcag tatagcgata acagcgaagc gcgcaaagaa 180

ctgcagcgcc tgtatgaatt ttttcatagc tggctgcagc cggaaaacca tagcaaagat 240

cagattattg cgcagctggc gatggaacag tttatgctga gcggccgctg ccgcgataaa 300

agcattctga aaaaaaaatg ggaaagcagc ggcaaaaacc tggaaaaact gctggaagat 360

ctgaccgatg attgcatgaa accgccggtg ctggtgcatg tgtgcatgca gggccaggaa 420

gcgctgttta gcgaagatat gccgctgaaa gaagtgattg cgcatctgac caaacagagc 480

agcgcgaaaa cctttaccgc gggcatgggc accgcgcatc aggtgagcca gaacgcgccg 540

ctgggcaccc gccagggcaa cgaacatgaa gaagatggct gcaccagcag ctgggaagtg 600

acccaggtga acgattatat taccaacccg ggcaaagaaa ttgtgagcct gctgattatt 660

ccggaagcga acgatccgac cccggtggaa gaaagcgcga gctgggaaaa cacccatagc 720

agccgcaaag cgcgcccggt gatttgcggc ctgcaggaag aaagccagaa aggcccgagc 780

tatcaggatg tgccgatgga tgtgggcccg ggcagcagca gcctgccgca tcagagcagc 840

agcgaaccgg tgagcaacca tcattgcagc gaaggcaaca gcgcgtgcga agaaagccag 900

gaacgctttc atgaaagccc gaaaagctat aaatgcgaag aatgcccgaa aacctttaaa 960

tatctgagcc attttctggc gcatcagcgc tgccatcgca gctttcgc 1008

<210> 30

<211> 990

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратная трансляция SEQ ID NО: 40

<400> 30

atgccgagca acctgaccaa cagctgccag tgcaaaacca gccagaacga ttttgaactg 60

ggcaacaccg aatttcgccg cacccagggc agcgcggtgc agaacggcga aatttttagc 120

gaatttagca gcagccagct gaacagcctg ccggataacg gcaacagcaa cgcgcgcaaa 180

gaactgcagc gcctgcatgg catttttcat agctggctgc agccggaaaa acatagcaaa 240

gatgaaatta ttagccgcct ggtgctggaa cagtttatga ttaacggcaa ctgccgcgat 300

cgcagcattc tgaaagaaaa atgggaaagc agcggccgca acctggaaaa actgatggaa 360

gatctgaccg atgattgcat ggaaccgccg gtgctggtgc gcgtgcatat gcagggccag 420

gaagcgctgt ttagcgaaaa catgccgctg aaagaagtga ttgtgcatct gaaaaaacag 480

ctgagcgcgg aaaacaccac cggcgaaaac aaaggcatga gcctgcaggc gccgcaggat 540

accccgctgg aaacccgcca gggcaacgaa gataaagaaa acgcgtgcaa caacttttgg 600

aaaaacaccc aggtggatga tagcattacc tgccagggca cccagacccc gagcctgctg 660

attattcagg aagatcattg cctgcgcctg gaagatggcg gcgcgagctg cgaaaacccg 720

cataacagcc gccgcggcgt gaccagccat agcgaaaaag gcccgctgga aggcccgagc 780

tatcagaaca ttccggtggg cgaacagccg gaatttctgc cgaccagcga tcagagcagc 840

agcgaatttg tgccggcgca tcagagcaac aaaggcgata gcacctgcgg cggccatcat 900

gaaaaatatc gcggcgcgca gaaaagctat aaatgcaaag aatgcccgaa aatttttcgc 960

tatctgtgcc attttctggc gcatcagcgc 990

<210> 31

<211> 175

<212> PRT

<213> Gorilla gorilla

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 6, 7, 27, 71, 173, 174

<223> Хаа = любая аминокислота

<400> 31

Asn Gly Ile Thr Phe Xaa Xaa Val Pro Met Val Met Gly Ala Gly Cys

1 5 10 15

Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Xaa Ala Leu Thr His Gln

20 25 30

Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly Ser His

35 40 45

Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val Phe Lys

50 55 60

Tyr His Cys His Leu Leu Xaa His Gln Arg Arg His Arg Asn Glu Arg

65 70 75 80

Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile Ser Asp

85 90 95

Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe Thr Cys

100 105 110

Ser Met Cys Lys Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg Ser His

115 120 125

Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe Cys Lys

130 135 140

Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg Thr His

145 150 155 160

Glu Lys Ile Thr Leu Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Xaa Xaa Ser

165 170 175

<210> 32

<211> 433

<212> PRT

<213> Pan paniscus

<400> 32

Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn

1 5 10 15

Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn

35 40 45

Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly

85 90 95

His Cys Asn Asp Lys Ala Gly Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly

100 105 110

Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn

115 120 125

Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln

145 150 155 160

Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln

165 170 175

Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu

180 185 190

Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Gly Asp Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu

210 215 220

Glu Asn Ser Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro

225 230 235 240

Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly

245 250 255

Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala

260 265 270

Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr

275 280 285

His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly

290 295 300

Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn

325 330 335

Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile

340 345 350

Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe

355 360 365

Thr Cys Ser Ile Cys Lys Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg

370 375 380

Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe

385 390 395 400

Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg

405 410 415

Thr His Glu Lys Ile Thr Val Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala

420 425 430

Ser

<210> 33

<211> 433

<212> PRT

<213> Pongo pygmaeus

<400> 33

Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn

1 5 10 15

Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Gln Ser Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn

35 40 45

Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly

85 90 95

His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly

100 105 110

Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn

115 120 125

Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asp Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln

145 150 155 160

Val Ser Ala Gln Thr Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln

165 170 175

Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Glu Gly Cys Glu Asp Glu

180 185 190

Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu

210 215 220

Glu Asn Gly Pro Arg Ser Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro

225 230 235 240

Asn Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly

245 250 255

Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala

260 265 270

Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr

275 280 285

His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly

290 295 300

Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn

325 330 335

Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile

340 345 350

Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe

355 360 365

Thr Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg

370 375 380

Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe

385 390 395 400

Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg

405 410 415

Thr His Glu Lys Ile Thr Pro Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala

420 425 430

Ser

<210> 34

<211> 433

<212> PRT

<213> Pongo abelii

<400> 34

Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn

1 5 10 15

Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Gln Ser Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn

35 40 45

Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly

85 90 95

His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly

100 105 110

Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn

115 120 125

Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asp Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln

145 150 155 160

Val Ser Ala Gln Thr Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln

165 170 175

Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Glu Gly Cys Glu Asp Glu

180 185 190

Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu

210 215 220

Glu Asn Gly Pro Arg Ser Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro

225 230 235 240

Asn Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly

245 250 255

Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala

260 265 270

Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr

275 280 285

His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly

290 295 300

Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn

325 330 335

Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile

340 345 350

Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe

355 360 365

Thr Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg

370 375 380

Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe

385 390 395 400

Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg

405 410 415

Thr His Glu Lys Ile Thr Pro Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala

420 425 430

Ser

<210> 35

<211> 334

<212> PRT

<213> Ailuropoda melanoleuca

<400> 35

Leu Lys Ile Asp Ser Phe Leu Cys Glu Leu Ser Met Asp Asp Pro Gly

1 5 10 15

Ser Lys Asn Lys Asp Phe Lys Pro Ser Gln Gly Pro Ala Leu Gln Lys

20 25 30

Ala Glu Glu Ile Ser Glu Phe Gln Asp Ser Gln His Ser Leu Phe Gln

35 40 45

Asp Gly Asn Asn Ser His Ala Lys Gln Glu Leu Gln Arg Leu Tyr Lys

50 55 60

Ser Phe Tyr Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys Asp Glu Ile

65 70 75 80

Ile Phe Gln Val Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Asn Arg His Cys Ser

85 90 95

Gly Arg Ser Thr Leu Lys Lys Lys Trp Glu Ser Ser Gly Arg Asn Leu

100 105 110

Glu Lys Phe Met Glu Ser Leu Ser Glu Ser Ser Leu Lys Pro Pro Asp

115 120 125

Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn

130 135 140

Met Pro Leu Lys Glu Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln Leu Ser Val

145 150 155 160

Gly Ser Pro Thr Gly Thr Asp Met Glu Thr Pro Ser Trp Thr Pro Gln

165 170 175

Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Glu Trp Gly Lys Lys Glu Asn

180 185 190

Gly Asp Asn Ile Tyr His Ile Asn Asp Ser Ile Thr Ser Gln Gly Asn

195 200 205

Glu Ile Pro Ser Leu Leu Ile Ile Arg Glu Glu Asp Tyr Pro Arg Pro

210 215 220

Glu Glu Asp Ser Val Ser Leu Lys Asn Pro Leu Ser Ser Arg Lys Ala

225 230 235 240

Gly Leu Gly Met Ser Gly Ser Gln Glu Gly Ser Leu Lys Gly Pro Ser

245 250 255

Tyr Gln Asp Val Leu Met Glu Gly Gly Pro Gly Phe Leu Ser Gln Ser

260 265 270

Ile Gln Val Ser Pro Glu Pro Val Pro Thr His Gln Arg Thr Glu Gly

275 280 285

Asn Ser Thr Arg Gly Gly His Gln Glu Arg Cys Arg Glu Ala Gln Asn

290 295 300

Ser Tyr Arg Cys Glu Lys Cys Pro Lys Ile Phe Arg Tyr Phe Ser Gln

305 310 315 320

Leu Lys Ala His Gln Arg Arg His Asn Asn Glu Arg Thr Phe

325 330

<210> 36

<211> 439

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 36

Met Asp Leu Asp Leu Arg Leu Ser Phe Gln Gly Glu Pro Ser Arg Asn

1 5 10 15

Asp Pro Gly Ser Glu Asn Leu Ala Leu Lys Ala Ser Gln Gly Tyr Val

20 25 30

Ile Arg Asp Gly Glu Gly Ile Ser Glu Phe Pro Asn Thr Arg Leu Ser

35 40 45

Leu Phe Gln Asn Ser Ser Asn Ser Phe Ala Arg Arg Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Asn Leu Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys Arg Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Met Ile Ser Cys Leu Val Leu Glu Gln Phe Val Ile Asn Gly

85 90 95

His Cys Ser Asp Arg Ser Thr Leu Gln Glu Lys Trp Asn Ala Ser Gly

100 105 110

Arg Asn Leu Glu Lys Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Gly Met Lys

115 120 125

Gln Pro Gly Phe Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asn Met Pro Leu Arg Glu Val Leu Val His Phe Arg Lys His

145 150 155 160

Leu Ala Thr Ala Thr Pro Arg Gly Glu Asn Thr Lys Ala Pro Leu Trp

165 170 175

Thr Pro Arg Asp Ala Ser Leu Glu Thr Gly Gln Glu Ser Glu Gly Lys

180 185 190

Glu Cys Gly Gly Asn Thr Ser Arg Lys Thr Cys Pro Val Thr Glu Ser

195 200 205

Leu Thr Trp Gln Gly Ser Gln Thr Pro Phe Leu Leu Ile Ile Pro Glu

210 215 220

Glu Thr Cys Pro Gly Leu Glu Glu Ala Gly Val Ser Pro Glu Asn Pro

225 230 235 240

Leu Gly Ser Arg Thr Ala Glu Pro Gly Leu Ala Val Ser Gln Glu Gly

245 250 255

Ser Pro Glu Gly Pro Phe Gly Gly Asp Val His Leu Glu Ala Glu Pro

260 265 270

Gly Phe Leu Ser Arg Pro Asp Gln Val Thr Leu Glu Pro Val Ser Ala

275 280 285

His Pro Ser Leu Glu Gly Asn Pro Ala Arg Gly Lys Ser Pro Glu Gly

290 295 300

Leu Pro Gly Ala Gln Lys Val Phe Pro Cys Glu Lys Cys Ser Gln Val

305 310 315 320

Phe Arg Tyr Leu Ser Arg Leu Lys Val His Gln Arg Arg His Asn Asp

325 330 335

Glu Arg Pro Phe Val Cys Ala Lys Cys Lys Lys Gly Phe Phe Gln Thr

340 345 350

Ser Asp Leu Arg Val His Gln Arg Ile His Thr Lys Glu Lys Pro Phe

355 360 365

Arg Cys Ser Thr Cys Lys Arg Pro Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg

370 375 380

Ala His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Ser Leu

385 390 395 400

Cys Gln Arg Arg Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr Asn Arg His Leu Lys

405 410 415

Ser His Gln Lys Leu Ala Leu Lys Gly Asp Leu Ser Gly Val Pro Val

420 425 430

Val Ala Gln Arg Lys Arg Ile

435

<210> 37

<211> 433

<212> PRT

<213> Nomascus leucogenys

<400> 37

Met Ala Leu Glu Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn

1 5 10 15

Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Gln Ser Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn

35 40 45

Ser Phe Gln Asp Ser Asn Lys Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly

85 90 95

His Cys Asn Asp Lys Thr Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly

100 105 110

Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn

115 120 125

Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asp Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln

145 150 155 160

Val Ser Ala Gln Ile Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Phe Gln

165 170 175

Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Arg Glu Asp Glu

180 185 190

Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu

210 215 220

Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro

225 230 235 240

Cys Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly

245 250 255

Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala

260 265 270

Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Pro Thr

275 280 285

His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly

290 295 300

Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn

325 330 335

Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Thr

340 345 350

Ser Asp Leu Arg Val His Gln Val Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe

355 360 365

Thr Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg

370 375 380

Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Tyr

385 390 395 400

Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg

405 410 415

Thr His Glu Lys Ile Thr Ser Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala

420 425 430

Ser

<210> 38

<211> 432

<212> PRT

<213> Macaca mulatta

<400> 38

Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln His Glu Pro Ser Glu Asn

1 5 10 15

Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Arg Ser Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Val Gln Thr Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Met Leu Asn

35 40 45

Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly

85 90 95

His Cys Asn Asp Lys Ala Thr Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly

100 105 110

Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ile Ile Asn

115 120 125

Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Asp Asn Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln

145 150 155 160

Val Ser Ala Lys Thr Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Phe Gln

165 170 175

Thr Ser Gln Asp Thr Ser Ser Glu Thr Gly Gln Gly Arg Glu Asp Glu

180 185 190

Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Ser

195 200 205

Asn Thr Asn Gln Asp Asn Pro Ile Val Ser Leu Ile Ile Gln Glu Glu

210 215 220

Asn Gly Pro Arg Pro Lys Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro Tyr

225 230 235 240

Asn Ser Arg Arg Thr Glu Leu Asp Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly Ser

245 250 255

Thr Asn Gly Ile Ile Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala Gly

260 265 270

Phe Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Pro Thr His

275 280 285

Gln Ser Asn Lys Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly Ser

290 295 300

His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val Phe

305 310 315 320

Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn Glu

325 330 335

Arg Pro Phe Val Cys Pro Lys Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile Ser

340 345 350

Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Thr

355 360 365

Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg Ser

370 375 380

His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Tyr Cys

385 390 395 400

Lys Arg Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg Thr

405 410 415

His Lys Lys Ile Thr Leu Pro Thr Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala Ser

420 425 430

<210> 39

<211> 336

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 39

Met Ala Leu Asp Leu Arg Lys Ser Phe Cys Gln Glu Leu Ser Ser Asn

1 5 10 15

Asn Leu Glu Ser Glu Asp Leu Glu Phe Ser Ser Thr Gln Gly Phe Ala

20 25 30

Val Pro Lys Arg Glu Ile Ser Ala Phe Ser Ser Ile Gln Leu Asn Ser

35 40 45

Leu Gln Tyr Ser Asp Asn Ser Glu Ala Arg Lys Glu Leu Gln Arg Leu

50 55 60

Tyr Glu Phe Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Asn His Ser Lys Asp

65 70 75 80

Gln Ile Ile Ala Gln Leu Ala Met Glu Gln Phe Met Leu Ser Gly Arg

85 90 95

Cys Arg Asp Lys Ser Ile Leu Lys Lys Lys Trp Glu Ser Ser Gly Lys

100 105 110

Asn Leu Glu Lys Leu Leu Glu Asp Leu Thr Asp Asp Cys Met Lys Pro

115 120 125

Pro Val Leu Val His Val Cys Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser

130 135 140

Glu Asp Met Pro Leu Lys Glu Val Ile Ala His Leu Thr Lys Gln Ser

145 150 155 160

Ser Ala Lys Thr Phe Thr Ala Gly Met Gly Thr Ala His Gln Val Ser

165 170 175

Gln Asn Ala Pro Leu Gly Thr Arg Gln Gly Asn Glu His Glu Glu Asp

180 185 190

Gly Cys Thr Ser Ser Trp Glu Val Thr Gln Val Asn Asp Tyr Ile Thr

195 200 205

Asn Pro Gly Lys Glu Ile Val Ser Leu Leu Ile Ile Pro Glu Ala Asn

210 215 220

Asp Pro Thr Pro Val Glu Glu Ser Ala Ser Trp Glu Asn Thr His Ser

225 230 235 240

Ser Arg Lys Ala Arg Pro Val Ile Cys Gly Leu Gln Glu Glu Ser Gln

245 250 255

Lys Gly Pro Ser Tyr Gln Asp Val Pro Met Asp Val Gly Pro Gly Ser

260 265 270

Ser Ser Leu Pro His Gln Ser Ser Ser Glu Pro Val Ser Asn His His

275 280 285

Cys Ser Glu Gly Asn Ser Ala Cys Glu Glu Ser Gln Glu Arg Phe His

290 295 300

Glu Ser Pro Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Thr Phe Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Ser His Phe Leu Ala His Gln Arg Cys His Arg Ser Phe Arg

325 330 335

<210> 40

<211> 330

<212> PRT

<213> Spermophilus tridecemlineatus

<400> 40

Met Pro Ser Asn Leu Thr Asn Ser Cys Gln Cys Lys Thr Ser Gln Asn

1 5 10 15

Asp Phe Glu Leu Gly Asn Thr Glu Phe Arg Arg Thr Gln Gly Ser Ala

20 25 30

Val Gln Asn Gly Glu Ile Phe Ser Glu Phe Ser Ser Ser Gln Leu Asn

35 40 45

Ser Leu Pro Asp Asn Gly Asn Ser Asn Ala Arg Lys Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Leu His Gly Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys

65 70 75 80

Asp Glu Ile Ile Ser Arg Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Asn Gly

85 90 95

Asn Cys Arg Asp Arg Ser Ile Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ser Ser Gly

100 105 110

Arg Asn Leu Glu Lys Leu Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Cys Met Glu

115 120 125

Pro Pro Val Leu Val Arg Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys Glu Val Ile Val His Leu Lys Lys Gln

145 150 155 160

Leu Ser Ala Glu Asn Thr Thr Gly Glu Asn Lys Gly Met Ser Leu Gln

165 170 175

Ala Pro Gln Asp Thr Pro Leu Glu Thr Arg Gln Gly Asn Glu Asp Lys

180 185 190

Glu Asn Ala Cys Asn Asn Phe Trp Lys Asn Thr Gln Val Asp Asp Ser

195 200 205

Ile Thr Cys Gln Gly Thr Gln Thr Pro Ser Leu Leu Ile Ile Gln Glu

210 215 220

Asp His Cys Leu Arg Leu Glu Asp Gly Gly Ala Ser Cys Glu Asn Pro

225 230 235 240

His Asn Ser Arg Arg Gly Val Thr Ser His Ser Glu Lys Gly Pro Leu

245 250 255

Glu Gly Pro Ser Tyr Gln Asn Ile Pro Val Gly Glu Gln Pro Glu Phe

260 265 270

Leu Pro Thr Ser Asp Gln Ser Ser Ser Glu Phe Val Pro Ala His Gln

275 280 285

Ser Asn Lys Gly Asp Ser Thr Cys Gly Gly His His Glu Lys Tyr Arg

290 295 300

Gly Ala Gln Lys Ser Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Pro Lys Ile Phe Arg

305 310 315 320

Tyr Leu Cys His Phe Leu Ala His Gln Arg

325 330

<210> 41

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 41

cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39

<210> 42

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39

<210> 43

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23

<210> 44

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

cccattctat catcaacggg tacaa 25

<---

1. Способ лечения индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры, где указанный индивидуум имеет заболевание или состояние, вызываемые укорочением теломеры, где способ включает:

i. выделение одной или более неэмбриональных человеческих клеток у индивидуума, нуждающегося в удлинении теломеры;

ii. приведение указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток в контакт с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует удлинение теломеры в указанных одной или более неэмбриональных человеческих клетках; и

iii. введение указанному индивидууму эффективного количества указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию.

2. Способ лечения заболевания или состояния, вызываемых укорочением теломеры, где указанный способ включает:

i. выделение одной или более неэмбриональных человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, вызываемыми укорочением теломеры;

ii. приведение указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток в контакт с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует удлинение теломеры в указанных одной или более неэмбриональных человеческих клетках; и

iii. введение эффективного количества указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, указанному индивидууму для лечения заболевания или состояния, вызываемых укорочением теломеры.

3. Способ лечения заболевания или состояния, вызываемых хромосомной аберрацией, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в указанных одной или более неэмбриональных человеческих клетках у индивидуума для лечения заболевания или состояния, вызываемых хромосомной аберрацией, где указанный метод не модифицирует клетки гамет у субъекта.

4. Способ лечения заболевания или состояния, вызываемых хромосомной аберрацией, где указанный способ включает:

i. выделение одной или более неэмбриональных человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, вызываемыми хромосомной аберрацией;

ii. приведение указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток в контакт с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в указанных одной или более неэмбриональных человеческих клетках; и

iii. введение эффективного количества указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, указанному индивидууму для лечения заболевания или состояния, вызываемых хромосомной аберрацией.

5. Способ лечения заболевания или состояния, вызываемых кариотипической аберрацией, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в указанных одной или более неэмбриональных человеческих клетках у индивидуума для лечения заболевания или состояния, вызываемых кариотипической аберрацией, где указанный метод не модифицирует клетки гамет у субъекта.

6. Способ лечения заболевания или состояния, вызываемых кариотипической аберрацией, где указанный способ включает:

i. выделение одной или более неэмбриональных человеческих клеток у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, вызываемыми кариотипической аберрацией;

ii. приведение указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток индивидуума в контакт с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует коррекцию кариотипической аберрации в указанных одной или более неэмбриональных человеческих клетках; и

iii. введение эффективного количества указанных одной или более неэмбриональных человеческих клеток, подвергнутых такому контактированию, указанному индивидууму для лечения заболевания или состояния, вызываемых кариотипической аберрацией.

7. Способ по п. 5 или 6, где кариотипическая аберрация выбрана из группы, состоящей из хромосомной нуллисомии, хромосомной моносомии, хромосомной трисомии, хромосомной тетрасомии и хромосомной пентасомии.

8. Способ по п. 5 или 6, где кариотипическая аберрация выбрана из группы, состоящей из трисомии по хромосоме 21, трисомии по хромосоме 16, трисомии по хромосоме 18, трисомии по хромосоме 13, моносомии по хромосоме X, анеуплоидии XXX, анеуплоидии XXY, анеуплоидии XYY и дупликации 1p36.

9. Способ по п. 5 или 6, где заболевание или состояние, вызываемое кариотипической аберрацией, выбрано из группы, состоящей из синдрома dup(17)(p11.2p11.2), болезни Пелициуса-Мерцбахера, синдрома dup(22)(q11.2q11.2), синдрома кошачьих глаз, синдрома кошачьего крика, синдрома Вольфа-Хиршхорна, синдрома Вильямса-Бейрена, болезни Шарко-Мари-Туфа, наследственной невропатии с предрасположенностью к параличу от сдавливания нерва, синдрома Смита-Маджениса, нейрофиброматоза, синдрома Аладжилля, синдрома ущемления небно-сердечно-челюстного нерва, синдрома Ди Георга, заболевания, ассоциированного с дефицитом стероид-сульфатазы, синдрома Кальмана, микрофтальмии, ассоциированной с дефектами клеточной линии кожи, гипоплазии коры надпочечника, заболевания, ассоциированного с дефицитом глицерин-киназы, болезни Пелициуса-Мерцбахера, заболевания, ассоциированного с фактором дифференцировки клеток яичек на хромосоме Y, азооспермии (фактора a), азооспермии (фактора b), азооспермии (фактора c) и заболевания, ассоциированного с делецией 1p36.

10. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием является одно или более заболеваний или состояний, выбранных из группы, состоящей из заболеваний, вызываемых укорочением теломеры; синдромов недостаточности костного мозга; возрастных заболеваний или расстройств, ассоциированных с укорочением теломеры; и заболеваний или расстройств, ассоциированных с преждевременным старением.

11. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием является заболевание, вызываемое укорочением теломеры и выбранное из группы, состоящей из врожденного дискератоза, синдрома Хейераала-Хрейдерсона, синдрома Ревеша, синдрома Коутса+, идиопатического фиброза легких, цирроза печени, фиброза поджелудочной железы, болезни Альцгеймера и остеоартрита.

12. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием является синдром недостаточности костного мозга, выбранный из группы, состоящей из анемии Фанкони, амегакариоцитарной тромбоцитопении, апластической анемии, анемии Даймонда-Блэкфана, врожденного дискератоза, ночной пароксизмальной гемоглобинурии (НПГ), синдрома Пирсона, синдрома Швахмана-Даймонда, тромбоцитопении и миелодиспластического синдрома.

13. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием является возрастное заболевание или расстройство, ассоциированное с укорочением теломеры; заболевание или расстройство, ассоциированное с преждевременным старением, или оба эти заболевания, выбранные из группы, состоящей из синдрома Вернера, синдрома Блума, синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированного со старением, кокаинового синдрома, пигментной ксеродермии, атаксии-телангиэктазии, синдрома Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофии, синдрома Юберга-Марсиди и синдрома Дауна.

14. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием являются одно или более заболеваний или состояний, выбранных из группы, состоящей из иммунодефицита, аутоиммунного заболевания, аутоиммунного расстройства, хронических язв, атеросклероза, рака, нервного расстройства, дегенеративного расстройства, нейродегенеративного расстройства, заболевания, ассоциированного с заживлением ран, регенерацией мышц и репарацией сердечной мышцы, заболевания, ассоциированного с замещением хрящевой ткани, артрита, остеоартрита, регенерации зубной ткани, слепоты, возрастной слепоты, вызываемой пролиферирующим разрушением пигментированных эпителиальных клеток сетчатки, глухоты, недостаточности костного мозга, заболевания, ассоциированного с трансплантацией костного мозга, диабета, мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшенна, генетического заболевания, генетической мутации и заболевания, ассоциированного с повреждением ДНК.

15. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием является рак, выбранный из группы, состоящей из рака сердца (например, ангиосаркомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, миксомы, рабдомиомы, фибромы, липомы и тератомы); рака легких (например, бронхогенной карциномы (плоскоклеточной карциномы, недифференцированной мелкоклеточной карциномы, недифференцированной крупноклеточной карциномы, аденокарциномы); альвеолярной (бронхолярной) карциномы, аденомы бронхов, саркомы, лимфомы, хондроматозной гамартомы, мезотелиомы); рака желудочно-кишечного тракта (например, рака пищевода (плоскоклеточной карциномы, аденокарциномы, лейомиосаркомы, лимфомы); рака желудка (карциномы, лимфомы, лейомиосаркомы)); рака поджелудочной железы (аденокарциномы протоков, инсулиномы, глюкагономы, гастриномы, карциноидных опухолей, апудомы); рака тонкого кишечника (аденокарциномы, лимфомы, карциноидных опухолей, саркомы Капоши, лейомиомы, гемангиомы, липомы, нейрофибромы, фибромы); рака толстого кишечника (аденокарциномы, аденомы канальцев, ворсинчатой аденомы, гамартомы, лейомиомы); рака мочеполовых путей (например, рака почек (аденокарциномы, опухоли Вильмса, нефробластомы, лимфомы, лейкоза); рака мочевого пузыря и уретры (плоскоклеточной карциномы, карциномы переходных клеток, аденокарциномы); рака предстательной железы (аденокарциномы, саркомы); рака яичек (семиномы, тератомы, эмбриональной карциномы, тератокарциномы, хориокарциномы, саркомы, карциномы интерстициальных клеток, фибромиы, фиброаденомы, аденоматоидных опухолей, липомы); рака печени (например, гепатомы (гепатоцеллюлярной карциномы), холангиокарциномы, гепатобластомы, ангиосаркомы, гепатоцеллюлярной аденомы, гемангиомы)); рака кости (например, остеогенной саркомы, (остеосаркомы), фибросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, злокачественной лимфомы (саркомы клеток ретикулума), множественной миеломы, злокачественной гигантоклеточной опухоли, хордомы, остеохондромы (остеоэкзостоза хряща), доброкачественной хондромы, хондробластомы, хондромиксофибромы, остеоидной остеомы и гигантоклеточных опухолей); рака нервной системы (например, рака черепа (остеомы, гемангиомы, гранулемы, ксантомы, деформирующего остеита); рака мозговой оболочки (менингиомы, менингиосаркомы, глиоматоза), рака головного мозга (астроцитомы, медуллобластомы, глиомы, эпиндимомы, герминомы, пинеаломы, мультиформной глиобластомы, олигодендроглиомы, шванномы, ретинобластомы, наследственных опухолей); рака спинного мозга (нейрофибромы, менингиомы, глиомы, саркомы)); рака женских половых органов (например, рака матки (карциномы эндометрия), рака шейки матки (карциномы шейки матки, предопухолевой дисплазии шейки матки); рака яичника (карциномы яичника, серозной цистаденокарциномы, цистаденокарциномы слизистой, эндометриоидных опухолей, опухоли Бреннера, светлоклеточной карциномы, неклассифицированной карциномы, гранулезных опухолей стромы яичника, клеточных опухолей Сертоли-Лейдига, дисгерминомы, злокачественной тератомы), рака вульвы (плоскоклеточной карциномы, интраэпителиальной карциномы, аденокарциномы, фибросаркомы, меланомы); рака влагалища (светлоклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, ботриоидной саркомы, эмбриональной рабдомиосаркомы, рака фаллопиевых труб (карциномы фаллопиевых труб)); рака системы кровообращения (например, рака крови (миелоидного лейкоза (острого и хронического), острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, миелопролиферативных заболеваний, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома); болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы (злокачественной лимфомы)); рака кожи (например, злокачественной меланомы, базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, саркомы Капоши, хориоаденомы, диспластических новообразований, липомы, ангиомы, дерматофибромы, келоидных рубцов, псориаза) и рака коры надпочечника (например, нейробластомы).

16. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием является аутоиммунное заболевание, выбранное из группы, состоящей из тиреоидита, болезни Гудпасчера, ревматоидного артрита, ювенильного олигоартрита, артрита, индуцированного коллагеном, артрита, индуцированного адъювантом, синдрома Сьегрена, рассеянного склероза, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, аутоиммунной атрофии желудка, вульгарной пузырчатки, псориаза, витилиго, диабета типа 1, диабета «тощих», тяжелой миастении, болезни Грейвса, тиреоидита Хашимото, склерозирующего холангита, склерозирующего сиаладенита, системной красной волчанки, аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, болезни Аддисона, системного склероза, полимиозита, дерматомиозита, аутоиммунной гемолитической анемии и пернициозной анемии.

17. Способ по любому из пп. 2-6, где указанным заболеванием или состоянием является нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из адренолейкодистрофии (AЛД), алкоголизма, болезни Александера, болезни Альпера, болезни Альцгеймера, амиотрофического бокового склероза, болезни Луи Герига, атаксии-телангиэктазии, болезни Баттена, болезни Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена, бычьей спонгиформной энцефалопатии (БСЭ), болезни Канавана, церебрального паралича, кокаинового синдрома, кортикобазальной дегенерации, болезни Крейцфельда-Якоба, наследственной злокачественной бессоницы, дегенерации передней височной доли, болезни Гентингтона, ВИЧ-ассоциированной деменции, болезни Кеннеди, болезни Краббе, деменции телец Леви, нейроборрелиоза, болезни Мачадо-Йозефа, атаксии спинного мозга и мозжечка типа 3, атрофии многих органов, рассеянного склероза, нарколепсии, болезни Ньюмана-Пика, болезни Паркинсона, болезни Пелициуса-Мерцбахера, болезни Пика, первичного бокового склероза, заболеваний, вызываемых прионами, прогрессирующего надъядерного паралича, болезни Рефсума, болезни Сандхоффа, болезни Шильдера, подострой дегенерации спинного мозга, вызывающей пернициозную анемию, болезни Шпильмейера-Фогта-Сьегрена-Баттена, болезни Баттена, атаксии спинного мозга и мозжечка, атрофии мышц спинного мозга, болезни Стила-Ричардсона-Ольшевского, сухотки спинного мозга и токсической энцефалопатии.

18. Способ по любому из пп. 1-6, где указанные одна или более неэмбриональных человеческих клеток были получены у новорожденного, ребенка, подростка или взрослого.

19. Способ по любому из пп. 1-6, где указанные одна или более неэмбриональных человеческих клеток представляют собой стволовые клетки взрослого человека, стволовые клетки ткани или клетки-предшественники.

20. Способ по любому из пп. 1-6, где указанные одна или более неэмбриональных человеческих клеток представляют собой одну или более стволовых клеток взрослого человека, стволовых клеток ткани или клеток-предшественников, выбранных из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток, стволовых клеток мезенхимы, стволовых клеток жировой ткани и стволовых клеток нервной системы.

21. Способ по любому из пп. 1-6, где указанные одна или более неэмбриональных человеческих клеток представляют собой соматические клетки, зрелые клетки или дифференцированные клетки.

22. Способ по любому из пп. 1-6, где указанные одна или более неэмбриональных человеческих клеток представляют собой одну или более соматических клеток, зрелых клеток или дифференцированных клеток, выбранных из группы, состоящей из эпидермальных клеток, фибробластов, лимфоцитов, гепатоцитов, эпителиальных клеток, миоцитов, хондроцитов, остеоцитов, адипоцитов, кардиомиоцитов, панкреатических β-клеток, кератиноцитов, эритроцитов, клеток периферической крови, нейроцитов, астроцитов, клеток зародышевой линии, клеток спермы и ооцитов.

23. Способ лечения заболевания или состояния, вызываемых укорочением теломеры, где указанный способ включает:

i. выделение человеческих клеток костного мозга или клеток крови у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, вызываемыми укорочением теломеры;

ii. приведение указанных человеческих клеток костного мозга или клеток крови в контакт с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует удлинение теломеры в указанных человеческих клетках костного мозга или клетках крови; и

iii. трансплантацию эффективного количества указанных человеческих клеток костного мозга или клеток крови, подвергнутых такому контактированию, указанному индивидууму для лечения заболевания или состояния, вызываемых укорочением теломеры.

24. Способ лечения заболевания или состояния, вызываемых хромосомной аберрацией, где указанный способ включает:

i. выделение человеческих клеток костного мозга или клеток крови у индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, вызываемыми хромосомной аберрацией;

ii. приведение указанных человеческих клеток костного мозга или клеток крови в контакт с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок Zscan4, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, индуцирует коррекцию хромосомной аберрации в указанных человеческих клетках костного мозга или клетках крови; и

iii. трансплантацию эффективного количества указанных человеческих клеток костного мозга или клеток крови, подвергнутых такому контактированию, указанному индивидууму для лечения заболевания или состояния, вызываемых хромосомной аберрацией.

25. Способ по п. 23 или 24, где указанным заболеванием или состоянием является одно или более заболеваний или состояний, выбранных из группы, состоящей из заболеваний, вызываемых укорочением теломеры; синдромов недостаточности костного мозга; возрастных заболеваний или расстройств, ассоциированных с укорочением теломеры; и заболеваний или расстройств, ассоциированных с преждевременным старением.

26. Способ по п. 23 или 24, где указанным заболеванием или состоянием является заболевание, вызываемое укорочением теломеры и выбранное из группы, состоящей из врожденного дискератоза, синдрома Хейераала-Хрейдерсона, синдрома Ревеша, синдрома Коутса+, идиопатического фиброза легких, цирроза печени, фиброза поджелудочной железы, болезни Альцгеймера и остеоартрита.

27. Способ по п. 23 или 24, где указанным заболеванием или состоянием является синдром недостаточности костного мозга, выбранный из группы, состоящей из анемии Фанкони, амегакариоцитарной тробмоцитопении, апластической анемии, анемии Даймонда-Блэкфана, врожденного дискератоза, ночной пароксизмальной гемоглобинурии (НПГ), синдрома Пирсона, синдрома Швахмана-Даймонда, тромбоцитопении и миелодиспластического синдрома.

28. Способ по п. 23 или 24, где указанным заболеванием или состоянием является возрастное заболевание или расстройство, ассоциированное с укорочением теломеры; заболевание или расстройство, ассоциированное с преждевременным старением; или оба эти заболевания, выбранные из группы, состоящей из синдрома Вернера, синдрома Блума, синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированного со старением, кокаинового синдрома, пигментной ксеродермии, атаксии-телангиэктазии, синдрома Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофии, синдрома Юберга-Марсиди и синдрома Дауна.

29. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, временно присутствует в одной или более неэмбриональных человеческих клетках или человеческих клетках костного мозга или клетках крови.

30. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, присутствует в одной или более неэмбриональных человеческих клетках или человеческих клетках костного мозга или клетках крови в течение периода времени приблизительно от 1 часа до 23 часов.

31. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, присутствует в одной или более неэмбриональных человеческих клетках или человеческих клетках костного мозга или клетках крови в течение периода времени приблизительно от 1 дня до 10 дней.

32. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный белок Zscan4, непосредственно взаимодействует с эндогенным Zscan4.

33. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты является синтетическая мРНК.

34. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит вектор.

35. Способ по п. 34, где указанным вектором является вирусный вектор.

36. Способ по п. 35, где указанным вирусным вектором является парамиксовирусный вектор, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор или аденовирусный вектор.

37. Способ по п. 35, где указанным вирусным вектором является парамиксовирусный вектор.

38. Способ по п. 37, где указанным парамиксовирусным вектором является вектор на основе вируса Сендай.

39. Способ по п. 34, где указанным вектором является плазмидный вектор.

40. Способ по п. 34, где указанный вектор кодирует Zscan4, функционально присоединенный к промотору.

41. Способ по п. 40, где указанным промотором является конститутивный промотор.

42. Способ по п. 40, где указанным промотором является индуцибельный промотор.

43. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID Nos: 1-10 и 21-30.

44. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 7.

45. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где белок Zscan4 представляет собой мышиный белок Zscan4, человеческий белок ZSCAN4 или его гомолог.

46. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где белок Zscan4 выбран из группы, состоящей из белка Zscan4a, белка Zscan4b, белка Zscan4c, белка Zscan4d, белка Zscan4e и белка Zscan4f.

47. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где белок Zscan4 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-20 и 31-40.

48. Способ по любому из пп. 1-6 и 23,24, где белок Zscan4 представляет собой человеческий белок ZSCAN4.

49. Способ по любому из пп. 1-6 и 23,24, где белок Zscan4 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 17.

50. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где белок Zscan4 представляет собой гибридный белок Zscan4-ERT2.

51. Способ по любому из пп. 1-6 и 23, 24, где белок Zscan4 представляет собой белок Zscan4-∆C.

52. Способ по п. 51, где белок Zscan4-∆C содержит мышиный белок Zscan4, человеческий белок ZSCAN4 или его гомолог, и где указанный белок Zscan4 включает делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец».

53. Способ по п. 51, где белок Zscan4-∆C содержит белок Zscan4, выбранный из группы, состоящей из белка Zscan4a, белка Zscan4b, белка Zscan4c, белка Zscan4d, белка Zscan4e и белка Zscan4f, и где указанный белок Zscan4 содержит делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец».

54. Способ по п. 51, где указанный белок Zscan4-∆C содержит человеческий белок ZSCAN4, и где указанный белок Zscan4 содержит делецию по меньшей мере одного домена белка «цинковый палец».

55. Способ по п. 23, где указанные заболевание или состояние, вызываемые укорочением теломеры, представляют собой синдром недостаточности костного мозга.

56. Способ по п. 55, где синдром недостаточности костного мозга выбран из группы, состоящей из анемии Фанкони, амегакариоцитарной тромбоцитопении, апластической анемии, анемии Даймонда-Блэкфана, врожденного дискератоза, ночной пароксизмальной гемоглобинурии (НПГ), синдрома Пирсона, синдрома Швахмана-Даймонда, тромбоцитопении и миелодиспластического синдрома.