Противовоспалительное средство

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики. Первый объект представляет собой жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или слизистую оболочку десны для облегчения и/или предупреждения воспаления, включающую от 0,01 до 1,5% (масс./об.) оланексидина или его фармакологически приемлемой соли, полоксамер, выбранный из полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic P-123), полиоксиэтилен (54) полиоксипропилен (39) гликоля (Pluronic P-85) и полиоксиэтилен (196) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic F-127). Второй объект – применение композиции, включающей от 0,01 до 1,5% (масс./об.) оланексидина или его фармакологически приемлемой соли для облегчения и/или предупреждения воспаления. Технический результат заключается в противовоспалительном действии композиции оланексидина или его соли, применимой для слизистой оболочки полости рта. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 9 табл., 12 пр., 21 ил.

 

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к противовоспалительному средству, включающему оланексидин или его фармакологически приемлемую соль в качестве активного ингредиента.

Уровень техники

[0002]

Оланексидин представляет собой соединение с высокой бактерицидной активностью, имеющее химическое название 1–(3,4–дихлорбензил)–5–октилбигуанид. Оланексидин глюконат, который является его глюконатом, обладает широким бактерицидным спектром. Его бактерицидный эффект проявляется в течение короткого времени, и в дальнейшем активность сохраняется в течение длительного времени. Кроме того, водный раствор оланексидин глюконата обладает высокой стабильностью, может сохраняться в течение длительного периода, кроме того, обладает низким раздражающим действием или малотоксичен для кожи, а также обладает превосходной безопасностью. Кроме того, водный раствор оланексидин глюконата не имеет проблем с цветом, запахом и вкусом и, как таковой, его легко получить в виде лекарственной формы (патентный документ 1). Следовательно, оланексидин глюконат в основном используют при антисептическом воздействии на кожу на оперируемом участке (область операции).

[0003]

Однако до сих пор не было известно, что оланексидин или его соль обладает противовоспалительным действием. Кроме того, поскольку оланексидин глюконат обладает раздражающим действием на слизистую оболочку, оланексидин глюконат трудно наносить на слизистую оболочку, такую как слизистая оболочка полости рта.

Документ предшествующего уровня техники

Патентный документ

[0004]

Патентный документ 1: публикация японской не прошедшей экспертизу патентной заявки No. 2005–289959

Сущность изобретения

Задача, решаемая изобретением

[0005]

Задачей настоящего изобретения является создание композиции, которая может быть использована в качестве нового противовоспалительного средства.

Средства для решения задачи

[0006]

Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования для достижения поставленной цели и в результате обнаружили, что неожиданно оланексидин или его соль проявляют противовоспалительное действие. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что оланексидин глюконат применим к слизистой оболочке, такой как слизистая оболочка полости рта, путем использования композиции, включающей оланексидин глюконат и полоксамер, который представляет собой блок–сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP, что приводит к завершению настоящего изобретения.

[0007]

В частности, настоящее изобретение заключается в следующем.

(1) Композиция для облегчения и/или профилактики воспаления, включающая оланексидин или его фармакологически приемлемую соль.

(2) Композиция по (1), где оланексидин или его фармакологически приемлемая соль представляет собой оланексидин глюконат.

(3) Композиция по (1) или (2), дополнительно включающая полоксамер, который представляет собой блок–сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP.

(4) Композиция по любому из (1) – (3), где воспаление выбрано из стоматита, орального мукозита, гингивита и пневмонии.

(5) Композиция по любому из (1) – (4), где

воспаление представляет собой оральный мукозит, вызванный лечением рака, и

композиция включает

0,01–1,5% (масс./об.) оланексидин глюконата, и

полоксамер, который представляет собой блок–сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP.

(6) Композиция по любому из (3) – (5), где полоксамер выбран из полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic P–123), полиоксиэтилен (54) полиоксипропилен (39) гликоля (Pluronic P–85) и полиоксиэтилен (196) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic F–127).

(7) Композиция по (6), где полоксамер представляет собой полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоль (Pluronic P–123).

(8) Композиция по любому из (1) – (7), где концентрация оланексидин глюконата составляет 0,05–0,5% (масс./об.).

(9) Композиция по любому из (3) – (8), где концентрация полоксамера составляет 0,1–5,0% (масс./об.).

(10) Композиция по любому из (1) – (9), где композиция находится в форме жидкости или полоскания.

(11) Композиция по любому из (5) – (10), где лечение рака представляет собой химиотерапию, лучевую терапию или сочетанную химиолучевую терапию.

[0008]

Другие примеры способа осуществления настоящего изобретения могут включать способ облегчения или профилактики (лечения) воспаления путем введения композиции для облегчения и/или профилактики воспаления по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в облегчении или профилактики (лечении) воспаления, способ облегчения или профилактики (лечения) орального мукозита, вызванного лечением рака, путем введения композиции для облегчения и/или профилактики орального мукозита, вызванного лечением рака, по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в облегчении или профилактике (лечении) орального мукозита, вызванного лечением рака, композиции, включающей оланексидин или его фармакологически приемлемую соль, для применения в облегчении или профилактике (лечении) воспаления, композиции, включающей 0,01–1,5% (масс./об.) оланексидин глюконата и полоксамер, который представляет собой блок–сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP, для использования в облегчении или профилактике (лечении) орального мукозита, вызванного лечением рака, применения оланексидина или его фармакологически приемлемой соли для получения композиции для облегчения и/или профилактики воспаления по настоящему изобретению и использования 0,01–1,5% (масс./об.) оланексидин глюконата и полоксамера, который представляет собой блок–сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP, для получения композиции для облегчения и/или профилактики орального мукозита, вызванного лечением рака, по настоящему изобретению.

Эффект изобретения

[0009]

Настоящее изобретение предоставляет новую композицию для облегчения и/или профилактики воспаления. Композиция по настоящему изобретению применима для широкого спектра воспалений, таких как стоматит, оральный мукозит, гингивит и пневмония. Кроме того, композиция для облегчения и/или профилактики воспаления (противовоспалительное средство) по настоящему изобретению может облегчать и/или предотвращать оральный мукозит у пациента, который получает химиотерапию, лучевую терапию или сочетанную химиотерапию и лучевую терапию рака, и, таким образом, композиция может предотвращать снижение качества жизни, такое как угнетение функции общения, нарушение сна, боль или дисфагия (затруднение глотания), у пациента или нарушение соответствия дозы химиотерапии и/или радиотерапии.

Краткое описание фигур

[0010]

[Фигура 1] Фигура 1 представляет собой диаграмму, показывающую результаты измерения количества бактерий в полости рта с помощью аэробной культуры в примере 1. Количество бактерий на ординате обозначено логарифмическим значением.

[Фигура 2] На фигуре 2 представлена схема, показывающая результаты измерения количества бактерий в полости рта путем культивирования в селективной среде стрептококка в Примере 1. Количество бактерий на ординате обозначено логарифмическим значением.

[Фигура 3] Фигура 3 представляет собой диаграмму, показывающую результаты измерения количества бактерий в полости рта с помощью анаэробной культуры в Примере 1. Количество бактерий на ординате обозначено логарифмическим значением.

[Фигура 4] Фигура 4 представляет собой диаграмму, показывающую результаты измерения количества бактерий в полости рта с использованием счетчика бактерий в примере 1. Количество бактерий на ординате обозначено логарифмическим значением.

[Фигура 5] Фигура 5 представляет собой диаграмму, показывающую результаты теста сравнения между антисептическими растворами (OPB) оланедина(R) и другими средствами в Примере 2. Количество бактерий на ординате обозначено логарифмическим значением.

[Фигура 6] Фигура 6 представляет собой диаграмму, показывающую результаты изучения влияния концентрации оланексидина на бактерицидную эффективность в примере 3. Количество бактерий на ординате обозначено логарифмическим значением.

[Фигура 7] Фигура 7 представляет собой диаграмму, показывающую изменение массы тела каждой группы в примере 4.

[Фигура 8] Фигура 8 представляет собой таблицу, показывающую результаты макроскопического наблюдения в примере 4. Числовые значения в таблице представляют степени стоматита, и заштрихованные области представляют группы с симптомами, подобными лейкоплакии (повышенный кератоз, утолщение и т.п.).

[Фигура 9] Фигура 9 представляет собой фотографию защечного мешка каждой группы в последний день в примере 4.

[Фигура 10] Фигура 10 представляет собой таблицу, показывающую результаты гистопатологического исследования в Примере 4.

[Фигура 11] Фигура 11 представляет собой таблицу результатов макроскопического наблюдения в примере 5. Числовые значения в таблице представляют степени стоматита, и заштрихованные области представляют группы с симптомами, подобными лейкоплакии (повышенный кератоз, утолщение и т.п.).

[Фигура 12] Фигура 12 представляет собой таблицу, показывающую результаты гистопатологического исследования в примере 5.

[Фигура 13] Фигура 13 представляет собой диаграмму, показывающую количество выживших бактерий в полости рта хомячка в Примере 6. Количество бактерий на ординате обозначено логарифмическим значением.

[Фигура 14] Фигура 14 представляет собой диаграмму, показывающую степень стоматита в примере 6. Степень стоматита указана на ординате.

[Фигура 15] Фигура 15 представляет собой диаграмму, показывающую степень стоматита в примере 7. Степень стоматита указана на ординате.

[Фигура 16] Фигура 16 представляет собой диаграмму, показывающую степень стоматита в примере 8. Степень стоматита указана на ординате.

[Фигура 17] Фигура 17 представляет собой диаграмму, показывающую результаты патологического обследования в примере 9.

[Фигура 18] Фигура 18 представляет собой микрофотографию HE–окрашенного образца в примере 9.

[Фигура 19] Фигура 19 представляет собой диаграмму, показывающую результаты гематологического исследования и биохимического исследования в примере 10.

[Фигура 20] Фигура 20 представляет собой диаграмму, показывающую степень ингибирования экспрессии SEAP антисептическим раствором (OPB) оланедина(R) в примере 11.

[Фигура 21] Фигура 21 представляет собой диаграмму, показывающую ингибирование продуцирования NO антисептическим раствором (OPB) оланедина(R) в примере 12.

Способ осуществления изобретения

[0011]

Композиция по настоящему изобретению представляет собой композицию для облегчения и/или профилактики воспаления, включающая оланексидин или его фармакологически приемлемую соль. В качестве фармакологически приемлемой соли оланексидина может быть использована соль, фармакологически известная в данной области техники. Их примеры могут включать гидрохлорид, карбонат, бикарбонат, цитрат, глюконат, лактат, ацетат, глюцептат и тартрат. Оланексидин глюконат является предпочтительным с точки зрения растворимости в воде.

[0012]

В композиции по настоящему изобретению оланексидин может находиться в концентрации, которая может проявлять противовоспалительное действие. Их примеры могут включать 0,001–20% (масс./об.), предпочтительно 0,005–15% (масс./об.), более предпочтительно 0,01–10% (масс./об.), еще более предпочтительно 0,1–5% (масс./об.) в пересчете на оланексидин глюконат. В случае нанесения композиции по настоящему изобретению на слизистую оболочку, такую как слизистая оболочка полости рта, концентрация оланексидина составляет предпочтительно 0,01–1,5% (масс./об.), более предпочтительно 0,05–0,5% (масс./об.), еще более предпочтительно 0,1–0,3% (масс./об.) в пересчете на оланексидин глюконат. В случае нанесения композиции по настоящему изобретению на слизистую оболочку полости рта нежелательно, когда бактерицидная эффективность в отношении бактерий полости рта не может быть получена в достаточной степени, если концентрация оланексидин глюконата ниже 0,01% (масс./об.), а раздражение слизистой оболочки полости рта является слишком сильным, если концентрация оланексидин глюконата превышает 1,5% (масс./об.).

[0013]

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать один или несколько полоксамеров для уменьшения раздражения в месте применения. В этом контексте полоксамер конкретно не ограничен, при условии, что полоксамер представляет собой блок–сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP, и уменьшает раздражение в месте применения. Один или несколько полоксамеров, выбранных из полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic P–123), полиоксиэтилен (54) полиоксипропилен (39) гликоля (Pluronic P–85) и полиоксиэтилен (196) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic F–127) являются предпочтительными. Среди прочего, их примеры могут включать полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоль (Pluronic P–123), полиоксиэтилен (3) полиоксипропилен (17) гликоль (Pluronic L–31), полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль (Pluronic L–44), полиоксиэтилен (120) полиоксипропилен (40) гликоль (Pluronic F–87) и полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) гликоль (Pluronic F–68).

[0014]

Среди полоксамеров, описанных выше, один или несколько полоксамеров, выбранных из полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic P–123), полиоксиэтилен (54) полиоксипропилен (39) гликоля (Pluronic P–85) и полиоксиэтилен (196) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic F–127) являются предпочтительными. Среди них, полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоль (Pluronic P–123) является более предпочтительным.

[0015]

Примеры концентрации полоксамера могут включать, но не ограничиваются ими, 0,1–5,0% (масс./об.), предпочтительно 0,1–4,0% (масс./об.), более предпочтительно 0,1–3,0% (масс./об.), еще более предпочтительно 0,1–2,0% (масс./об.), наиболее предпочтительно 0,1–1,5% (масс./об.). Отношение концентраций между оланексидин глюконатом и полоксамером предпочтительно составляет 1:2–1:20, более предпочтительно 1:5–1:10. В случае нанесения композиции по настоящему изобретению на слизистую оболочку полости рта раздражение слизистой оболочки полости рта оланексидин глюконатом является сильным в диапазоне высоких концентраций, равном или превышающем концентрацию оланексидин глюконата 0,3% (масс./об.). Следовательно, большее количество полоксамера является более предпочтительным для подавления раздражения (повышенного кератоза) оланексидин глюконатом.

[0016]

В настоящем описании «воспаление» означает биологическую реакцию, вызывающую такой признак, как покраснение, ощущение жара, отечность или боль, вызванный внутренним фактором, таким как аутоиммунное заболевание, или внешним фактором, таким как бактериальная или вирусная инфекция, травма, физическое раздражение (тепло, холод, радиация, электричество и т.п.) или химическое вещество. Воспаление в соответствии с настоящим изобретением конкретно не ограничивается при условии, что композицию по настоящему изобретению можно применять для воспаления. Примеры воспаления могут предпочтительно включать воспаление, вовлекающее Toll–подобный рецептор, более предпочтительно воспаление, возникшее в результате бактериальной инфекции. Примеры очага воспаления могут включать мозг, глаз, трахею, васкулярный сосуд, легкое, печень, сердце, поджелудочную железу, желудок, кишечник, брыжейку, почку, кожу, слизистую оболочку носа, слизистую оболочку полости рта, десну и сустав. Конкретные примеры воспаления могут включать энцефалит, бронхит, ангиит, пневмонию, гепатит, миокардит, панкреатит, энтерит, гастрит, перитонит, нефрит, стоматит, оральный мукозит, гингивит, артрит, воспаление, вызванное реперфузионным повреждением после ишемии, воспаление, вызванное иммунным отторжением после трансплантации, воспаление, вызванное ожогом или полиорганной недостаточностью, воспаление, возникшее после операции, и воспаление, вызванное атеросклерозом. Среди них предпочтительные примеры могут включать стоматит, оральный мукозит, гингивит и пневмония. В настоящем описании оральный мукозит относится к воспалению, развившемуся в слизистой оболочке полости рта при лечении рака, и стоматит относится к воспалению, развившемуся в слизистой оболочке полости рта независимо от лечения рака. Альтернативно, композиция по настоящему изобретению может представлять собой композицию, имеющую конкретную цель облегчения и/или профилактики орального мукозита, вызванного лечением рака. В одном аспекте настоящее изобретение исключает композицию, предназначенную для облегчения и/или профилактики орального мукозита, вызванного лечением рака.

[0017]

Композиция по настоящему изобретению может быть нанесена на кожу, слизистую оболочку полости рта или слизистую оболочку десны, желудочно–кишечного тракта, трахеи, легкого или тому подобное в месте воспаления. Примеры способа введения могут включать инъекцию (внутривенную, внутримышечную, подкожную, внутрикожную, внутрибрюшинную и т.п.), пероральное введение, чрескожное введение, ингаляцию, введение в полость рта, введение в десну и полоскание. Препараты могут быть получены соответствующим образом в соответствии с этими способами введения. Выбираемая лекарственная форма конкретно не ограничена, и лекарственная форма может быть широко выбрана, например, из инъекции (раствор, суспензия, эмульсия, твердая композиция для растворения при использовании и т.п.), таблетки, капсулы, гранулы, порошка, жидкости, полоскания, липосомальной лекарственной формы, мази, геля, средства для наружного применения, спрея и ингаляционного порошка. Кроме того, компоненты, обычно используемые в лекарственных средствах, такие как обычный эксципиент, стабилизатор, связующее, смазывающее вещество, эмульгатор, регулятор осмотического давления, регулятор рН, краситель и дезинтегрант, могут быть использованы для получения этих лекарственных форм.

[0018]

В случае использования композиции по настоящему изобретению в полости рта может быть использована любая лекарственная форма, подходящая для использования в полости рта. Предпочтительные примеры этого могут включать жидкость и полоскание. В качестве альтернативы может быть использована твердая композиция, постепенно растворяющаяся или распадающаяся во рту, такая как пастилки, леденцы, жевательные конфеты, троше или жевательные резинки. Более того, при необходимости, композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать различные добавки, которые используются с целью придания вкуса или окраски. Примеры добавки с целью придания вкуса могут включать синтетический ароматизатор, природный ароматизатор и подсластитель, такой как аспартам, ацесульфам калия, сукралоза, алитам, неотам, экстракт корня солодки (глицирризин), сахарин, сахарин натрия, экстракт стевии и порошок стевии. Примеры добавки для окрашивания могут включать карамель, натуральный краситель и синтетический краситель. Также композиция по настоящему изобретению может включать добавку, такую как эмульгатор (сложный эфир глицерина и жирной кислоты, сложный эфир сорбитана и жирной кислоты, сложный эфир пропиленгликоля и жирной кислоты, сложный эфир сахарозы и жирной кислоты, лецитин и т.п.), стабилизатор или консервант. Эти вспомогательные вещества могут быть использованы по отдельности или в комбинации двух или более из них.

[0019]

В случае введения композиции по настоящему изобретению в виде жидкости или полоскания, разовая доза может быть произвольно определена в зависимости от места, где возникло воспаление, или от степени тяжести. Их примеры могут включать 1–100 мл, предпочтительно 2–50 мл, более предпочтительно 5–40 мл, наиболее предпочтительно 10–30 мл.

[0020]

Время введения композиции по настоящему изобретению может быть произвольно определено в зависимости от места, где развивалось воспаление, тяжести или степени облегчения воспаления. Его примеры могут включать после еды, после пробуждения и перед сном. Альтернативно, композицию по настоящему изобретению можно вводить с интервалами от 2 до 8 часов, предпочтительно с интервалами от 4 до 6 часов. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может предотвращать воспаление путем введения пациенту перед операцией или пациенту после ухода за полостью рта.

[0021]

Период введения композиции по настоящему изобретению может быть произвольно определен в зависимости от степени облегчения воспаления. Их примеры могут включать от 1 недели до 3 месяцев, предпочтительно от 1 недели до 2 месяцев, более предпочтительно от 1 недели до 1 месяца, наиболее предпочтительно от 1 до 2 недель.

[0022]

В настоящем изобретении примеры лечения рака могут включать химиотерапию, лучевую терапию или сочетанную химиолучевую терапию рака. Химиотерапия рака относится к общему лечению рака противораковым средством. Примеры противоракового средства, используемого в настоящем изобретении, могут включать антиметаболит на основе пиримидинфторида, такой как фторурацил (5–FU), тегафур/гимерацил/отерацил калия (S–1) и тегафур/урацил (UFT), антагонист фолата такой как метотрексат, противоопухолевый антибиотик, такой как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, блеомицин, пепломицин и актиномицин D, алкалоид растительного происхождения, такой как паклитаксел, доцетаксел, винкристин и этопозид, а также платиносодержащее лекарственное средство, такое как такие как цисплатин, карбоплатин и недаплатин, которые легко вызывают оральный мукозит. Особенно предпочтительные примеры этого могут включать антиметаболит на основе пиримидинфторида, такой как 5–FU. Эти противораковые средства могут быть использованы отдельно или в комбинации двух или более из них.

[0023]

В настоящем изобретении радиотерапия представляет собой лечение с целью подавления пролиферации раковых клеток путем облучения участка злокачественной опухоли радиацией. Примеры излучения для использования в лечении включают рентгеновское излучение и электронное излучение. Сочетанная химиолучевая терапия относится к способу лечения, который усиливает эффект облучения с помощью лучевой терапии, которая является локализованной терапией рака, и противоопухолевого средства в комбинации. Участок–мишень лучевой терапии особо не ограничен. Примеры лучевой терапии могут включать лучевую терапию в области головы и шеи, в частности, в полости рта или фарингеальной области.

[0024]

Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно со ссылкой на примеры. Однако технический объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

Пример 1

[0025]

1. Тест на бактерицидную эффективность в полости рта с использованием обезьяны Cynomolgus

В этом тесте бактерицидная эффективность в отношении бактерий в полости рта обезьян Cynomolgus сравнивали и изучали с использованием простого счетчика бактерий и метода культивирования в комбинации, а также с использованием тестируемых материалов (0,1% (масс./об.) оланексидин глюконат и 0,47% повидон–йода в качестве бактерицидных антисептиков и физиологического раствора в качестве препарата отрицательного контроля).

[0026]

1–1 Тестируемое вещество

Тестируемое вещество получали путем разбавления антисептического раствора оланедина(R) 1,5% (далее именуемый "1,5% OPB", и т.п.; раствор, содержащий 1,508% (масс./об.) оланексидин глюконата, производства Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) в 15 раз, чтобы концентрация оланексидин глюконата составляла 0,1% (масс./об.) (0,1% OPB). Контрольное вещество раствор Isodine Gargle Solution 7% (далее именуемый "7% PVP–I", и т.п.; производства Meiji Seika Pharma Co., Ltd.) разбавляли в 15 раз (0,47% PVP–I), и физиологический раствор (производства Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) использовали как он есть.

[0027]

1–2 Подопытное животное

Использовали обезьян Cynomolgus (самец, выведенный в Камбодже, полученный EveBioscience Co., Ltd.), которым было от 2 лет и 11 месяцев до 3 лет и 11 месяцев при использовании.

[0028]

1–2–1 Конфигурация группы

Полость рта каждого животного использовали в качестве области для исследования. Использовали девять животных, и количество областей для исследования на группу было установлено на 3, для нанесения 0,1% OPB, 0,47% PVP–I и физиологического раствора. Бактерии собирали в общей сложности 4 раза (до нанесения исследуемого вещества и через 10 минут, 6 часов и 24 часа после нанесения).

[0029]

1–2–2 Номер животного и номер образца

Номера животных и номера образцов были присвоены, как показано в Таблице 1 ниже. Измеряли количество исходных бактерий животных No. 1–3, и животных подвергали тестам с использованием физиологического раствора, 0,1% OPB и 0,47% PVP–I в порядке убывания количества бактерий. Аналогично, животных No. 4–6 подвергали тестам с использованием 0,1% OPB, 0,47% PVP–I и физиологического раствора в порядке убывания количества бактерий, и животных No. 7–9 подвергали тестам с использованием 0,47% PVP–I, физиологический раствор и 0,1% OPB в порядке убывания количества бактерий.

[0030]

[Таблица 1]

[0031]

1–3 Способ тестирования

[0032]

1–3–1 Анестезия

Обезьян cynomolgus системно анестезировали путем внутримышечной инъекции смешанного раствора в соотношении 2:1 кеталара (50 мг/мл в пересчете на кетамин, производства Daiichi Sankyo Propharma Co., Ltd.) и 2% раствора для инъекций Seractal (2,0 г/100 мл в пересчете на ксилазин, производства Bayer Yakuhin, Ltd.) в количестве 0,5 мл на кг массы тела.

[0033]

1–3–2 Нанесение

[1] 100 мл каждого тестируемого вещества выливали в контейнер (250 мл, изготовленный Corning Inc.), в который помещали две чистых спонжа для ухода за полостью рта (производства Kawamoto Corp.).

[2] Воздух удаляли из спонжей и спонжи достаточно пропитывали в тестируемом материале.

[3] Полученное вещество наносили в полость рта в течение примерно 2 минут.

[0034]

1–3–3 Сбор бактерий 1

[1] Бактерии собирали из полости рта обезьяны, используя стерилизованную перчатку и стерильный тампон–зонд для взятия образцов (обе боковые стенки в полости рта дважды соскребали, проводя взад и вперед).

[2] Тампон–зонд помещали в 5 мл раствора для проб (10% (масс./об.) полисорбата 80, 0,04% (масс./об.) дигидрофосфата калия, 0,1% (масс./об.) Тритона X–100, 1,01% (масс./об.) безводный моногидрофосфат натрия, 2% (масс./об.) соевый лецитин, 5% (масс./об.) полиоксиэтилен (20) цетиловый эфир, pH 7,8–7,9).

[0035]

1–3–4 Сбор бактерий 2

[1] Расходные материалы для измерения в виде тампонов–зондов (DU–AC02NP–H, производства Panasonic Healthcare Co., Ltd.) вставляли в прибор для отбора проб с постоянным давлением (DU–AE01NT–H, производства Panasonic Healthcare Co., Ltd.).

[2] Тампоны–зонды прижимали с постоянным давлением к языку обезьяны, который затем скребли три раза взад и вперед с интервалом примерно в 1 см.

[0036]

1–3–5 Измерение количества бактерий в полости рта методом культивирования на чашках

Метод посева заливкой на чашки с агаром и поверхностный метод посева на чашки с агаром проводили со ссылкой на новые методы тестирования микроорганизмов GMP и стандартные методы анализа в правилах безопасности пищевых продуктов.

[1] Каждый раствор для проб, в котором бактерии были восстановлены в 1–3–3, интенсивно перемешивали, и полученный продукт использовали в качестве восстановленной бактериальной суспензии.

[2] 0,5 мл восстановленной бактериальной суспензии разбавляли в 10 раз, и затем повторяли разбавление аналогичными манипуляциями для получения серии 10–кратных разведений (5 шкал).

[3] 1 мл каждой из восстановленной бактериальной суспензии и серийных разведений распределяли в каждую чашку. Приблизительно 15 мл среды для измерения (TSA+), сохраненной при температуре приблизительно 47°С, добавляли к этому для получения чашек с заливкой. Кроме того, 100 мкл каждого из восстановленной бактериальной суспензии и серийных разведений распределяли в каждую среду с кровяным агаром или каждую среду с агаром MS, и поверхность размазывали, используя бактериологический шпатель.

[4] После затвердевания среды для измерения (TSA+) чашки с заливкой переворачивали и культивировали до подсчета колоний. Также, чашки с поверхностным посевом переворачивали и культивировали в анаэробных условиях до подсчета колоний.

[5] Колонии, которые пролиферировали в чашках с заливкой и чашках с поверхностных посевом, подсчитывали с помощью счетчика колоний (DC–3, AS ONE Corp.). Чашку с заливкой, в которой число колоний было слишком большим, чтобы различать колонии, считали как TNTC (сплошной рост) без подсчета.

[0037]

1–3–6 Измерение количества бактерий в полости рта с помощью счетчика бактерий

[1] Открывали счетчик бактерий (DU–AA01, производства Panasonic Healthcare Co., Ltd.).

[2] Расходные материалы в виде сенсорного чипа для измерения устанавливали в счетчик бактерий.

[3] Расходные материалы в виде одноразового стаканчика для измерения загружали в счетчик бактерий.

[4] Тампон–зонд на который были собраны бактерии, помещали в центр одноразового стакана.

[5] Счетчик бактерий закрывали.

[0038]

1–4 Результаты

[0039]

1–4–1 Измерение количества бактерий в полости рта методом культивирования на чашках

[0040]

(1) Аэробная культура

Результаты показаны на фиг. 1. Количество исходных бактерий в полости рта составляло 1,73 × 105–4,20 × 10⁶. Количество бактерий в полости рта после нанесения физиологического раствора было практически постоянным. Количество жизнеспособных бактерий составило 6,48 × 10⁵ КОЕ, 4,65 × 10³ КОЕ и 2,35 × 10⁴ КОЕ через 10 минут после нанесения тестируемого вещества, 1,66 × 10⁶ КОЕ, 1,47 × 10³ КОЕ и 4,93 × 10⁵ КОЕ через 6 часов после нанесения, и 4,67 × 10⁵ КОЕ, 5,58 × 10⁴ КОЕ и 1,22 × 10⁶ КОЕ через 24 часа после нанесения, для физиологического раствора, 0,1% OPB и 0,47% PVP–I, соответственно.

[0041]

(2) Культура в селективной среде streptococcus

Результаты показаны на фиг. 2. Количество исходных бактерий в полости рта составляло 2,85 × 105–7,60 × 10⁷. Количество бактерий в полости рта после нанесения физиологического раствора было практически постоянным. Количество жизнеспособных бактерий составило 1,26 × 10⁶ КОЕ, 5,97 × 10³ КОЕ и 7,33 × 10⁴ КОЕ через 10 минут после нанесения тестируемого вещества, 5,51 × 10⁶ КОЕ, 2,79 × 10⁴ КОЕ и 2,20 × 10⁶ КОЕ через 6 часов после нанесения, и 1,71 × 10⁶ КОЕ, 4,30 × 10⁵ КОЕ и 7,81 × 10⁶ КОЕ через 24 часа после нанесения, для физиологического раствора 0,1% OPB и 0,47% PVP–I, соответственно.

[0042]

(3) Анаэробная культура

Результаты показаны на фиг. 3. Количество исходных бактерий в полости рта составляло 2,45 × 105–1,65 × 10⁷. Количество бактерий в полости рта после нанесения физиологического раствора было практически постоянным. Количество жизнеспособных бактерий составило 2,70 × 10⁶ КОЕ, 1,33 × 10⁴ КОЕ и 7,33 × 10⁴ КОЕ через 10 минут после нанесения тестируемого вещества, 3,22 × 10⁶ КОЕ, 1,38 × 10⁴ КОЕ и 1,80 × 10⁶ КОЕ через 6 часов после нанесения, и 1,71 × 10⁶ КОЕ, 3,04 × 10⁵ КОЕ и 1,40 × 10⁶ КОЕ через 24 часа после нанесения, для физиологического раствора 0,1% OPB и 0,47% PVP–I, соответственно.

[0043]

1–4–2 Измерение количества бактерий в полости рта с помощью счетчика бактерий

Результаты показаны на фиг. 4. Количество исходных бактерий в полости рта составляло от 1,29 × 10⁶ до > 1,00 × 10⁸. Количество жизнеспособных бактерий составило 2,84 × 10⁶ КОЕ, < 3,49 × 10⁵ КОЕ и 5,09 × 10⁵ КОЕ через 10 минут после нанесения тестируемого вещества, 2,04 × 10⁷ КОЕ, 5,58 × 10⁵ КОЕ и 8,98 × 10⁶ КОЕ через 6 часов после нанесения, и 4,10 × 10⁷ КОЕ, 3,14 × 10⁷ КОЕ и 3,14 × 10⁷ КОЕ через 24 часа после нанесения, для физиологического раствора 0,1% OPB и 0,47% PVP–I, соответственно.

[0044]

Результаты, имеющие сходную тенденцию, были получены как при измерении количества бактерий методом культивирования на чашках, так и при измерении количества бактерий с использованием счетчика бактерий. А именно, в группе с 0,1% OPB сохранялось количество бактерий на низком уровне до 6 часов после нанесения, тогда как в группе с 0,47% PVP–I просто проявлялся эффект до 10 минут после нанесения. Однако количество бактерий восстанавливалось через 24 часа после нанесения в обеих группах. В группе с 0,47% PVP–I персистенция не наблюдалась, вероятно, потому, что PVP–I подвержен инактивации органическим веществом в полости рта. Считалось, что 0,1% OPB обладает более стойким бактерицидным антисептическим эффектом в полости рта и превосходит его.

Пример 2

[0045]

2. Бактерицидный тест в полости рта с использованием хомячка – 1

Этот тест был направлен на сравнительное изучение бактерицидной эффективности полоскания (бактерицидного антисептика) на слизистой оболочке полости рта здоровых хомячков с другими средствами. Для изучения стойкости бактерицидной активности были установлены временные точки от начала полоскания тестируемого вещества до 24 часов спустя (до, сразу после, через 8 часов после и через 24 часа после полоскания), и количество бактерий измеряли с использованием счетчика бактерий и способа культивирования.

[0046]

2–1 Тестируемое вещество

Тестируемые вещества и контрольные вещества совместно использовали в качестве тестируемых веществ.

[0047]

2–1–1 Тестируемое вещество 1

Обозначение: 0,1% OPB–1

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0048]

2–1–2 Тестируемое вещество 2

Обозначение: 0,1% OPB–2

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

Липидур(R) ... 1,0% масс./об.

[0049]

2–1–3 Контрольное вещество 1

Обозначение/сокращенное наименование: основа/Основа

Формула:

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0050]

2–1–4 Контрольное вещество 2

Обозначение/сокращенное наименование: Перидекс(R)/0,12% CHG

Формула: хлоргексидин глюконат ... 0,12% масс./об.

[0051]

2–1–5 Контрольное вещество 3

Обозначение/сокращенное наименование: раствор Isodine Gargle 0,47%/0,47% PVP–I

Формула: 15–кратное разбавление раствора для полоскания Isodine 7% (7% PVP–I, производства Meiji Seika Pharma Co., Ltd.)

[0052]

2–2 Используемое животное

Самец Slc: Использовали для проведения теста сирийских хомячков в возрасте 6 недель по получению, 4 животных на группу.

[0053]

2–3 Способ тестирования

[0054]

2–3–1 Анестезия

Проводили газовую анестезию [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (производство Mylan Seiyaku Ltd.), концентрация длительной анестезии была соответствующим образом скорректирована].

[0055]

2–3–2 Введение исследуемого вещества

Каждого хомячка фиксировали в положении лежа на спине под наркозом, и 1 мл каждого тестируемого вещества вводили в один защечный мешок. Тридцать секунд спустя тестируемое вещество удаляли, и из защечного мешка извлекали избыточное тестируемое вещество, используя стерильный тампон–зонд.

[0056]

2–3–3 Сбор бактерий

Бактерии собирали из обеих защечных мешков под наркозом с использованием стерильного тампона–зонда в общей сложности в 4 момента времени (до введения исследуемого вещества, 0 ч, 8 ч и 24 ч). Тампон–зонд после сбора погружали в 5 мл среды SCDLP, затем перемешивали и использовали в качестве образца для подсчета бактерий.

[0057]

2–3–4 Измерение количества выживших бактерий

Метод посева заливкой на чашки с агаром проводили со ссылкой на новые методы тестирования микроорганизмов GMP 1) и стандартные методы анализа в правилах безопасности пищевых продуктов 2).

[1] Отбирали 500 мкл образца для подсчета бактерий и проводили 10–кратные серии разведений от 10¹–кратного до 10⁶–кратного с использованием 4,5 мл раствора для разведения.

[2] 1 мл каждого неразбавленного образца для подсчета бактерий и разведенных бактериальных суспензий распределяли в каждую стерильную чашку.

[3] 15 мл среды для измерения (TSA+), инкубированной на термостатирующей бане при приблизительно 47°С, быстро дозировали в чашку.

[4] После затвердевания среды для измерения, полученные чашки с заливкой переворачивали в инкубаторе и культивировали при 35°С до тех пор, пока колонии не могли быть подсчитаны (приблизительно 2 дня).

[5] После культивирования, колонии, которые пролиферировали в чашках с заливкой визуально подсчитывали. Чашку с заливкой, в которой число колоний было слишком большим, чтобы различать колонии, считали как TNTC (сплошной рост) без подсчета.

[6] Количество колоний умножали на степень разведения, чтобы рассчитать количество выживших бактерий.

[0058]

2–4 Результаты

Результаты показаны на фиг. 5 и таблице 2.

[0059]

[Таблица 2]

Количество выживших бактерий в полости рта хомячка

тестируемое вещество	n	Количество выживших бактерий {Среднее ±SD[Log10(КОЕ/тампон–зонд)]}
исходное	0 ч	8 ч	24 ч
основа	4	6,09 ± 0,87	5,26 ± 0,50	5,55 ± 0,52	5,86 ± 0,53
0,1%OPB–1	4	6,13 ± 0,40	3,13 ± 0,52	3,98 ± 1,03	5,57 ± 0,69
0,1%OPB–2	4	6,16 ± 0,27	3,24 ± 0,34	4,52 ± 0,65	6,24 ± 0,22
Перидекс	4	6,17 ± 0,65	4,04 ± 0,69	3,86 ± 0,92	5,68 ± 0,49
0,47% PVP–I	4	6,50 ± 0,39	4,35 ± 0,33	5,79 ± 0,31	6,08 ± 0,47

[0060]

Количество бактерий в полости рта до введения тестируемого вещества не отличалось между группами. Бактерицидная эффективность составляла 0,1% OPB–1=0,1% OPB–2 > 0,12% CHG > 0,47% PVP–I > Основа сразу после введения тестируемого вещества, составляла 0,1% OPB–1=0,1% OPB–2=0,12% CHG > 0,47% PVP–I=основа через 8 часов после введения и не различалась среди групп через 24 часа после введения. Исходя из этих результатов, бактерицидная эффективность в ротовой полости была эквивалентна между 0,1% OPB и 0,12% CHG, и 0,47% PVP–I имел слабый немедленный эффект без наблюдаемой постоянной активности.

[0061]

Причина, по которой бактерицидная активность 0,47% PVP–I была низкой в этом тесте, заключалась в том, что инактивация белками и т.п. в полости рта, вероятно, внесла существенный вклад в это. 0,12% CHG, как в 0,1% OPB, рассматривали как бактерицидный антисептик, обладающий стойкой активностью в полости рта.

Пример 3

[0062]

3. Бактерицидный тест в полости рта с использованием хомячка – 2

Этот тест был направлен на изучение влияния концентрации оланексидина на бактерицидную эффективность полоскания (бактерицидного антисептика) на слизистую оболочку полости рта здоровых хомячков.

[0063]

3–1 Тестируемое вещество

Тестируемые вещества и контрольное вещество совместно использовали в качестве тестируемых веществ.

[0064]

3–1–1 Тестируемое вещество 1

Обозначение: 0,1% OPB–1

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль ... 0,07% масс./об.

полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) гликоль ... 0,10% масс./об.

[0065]

3–1–2 Тестируемое вещество 2

Обозначение: 0,1% OPB–2

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль ... 0,07% масс./об.

полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) ... 1,00% масс./об.

[0066]

3–1–3 Тестируемое вещество 3

Обозначение: 0,5% OPB–3

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,50% масс./об.

полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) ... 0,36% масс./об.

полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) ... 5,00% масс./об.

[0067]

3–1–4 Тестируемое вещество 4

Обозначение: 1% OPB–2

Формула:

оланексидин глюконат ... 1,00% масс./об.

полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль ... 0,72% масс./об.

полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) гликоль ... 10,00% масс./об.

[0068]

3–1–5 Контрольное вещество

Обозначение: основа

Формула:

полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль ... 0,07% масс./об.

полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) гликоль ... 0,10% масс./об.

[0069]

3–2 Используемое животное

Самец Slc: Использовали для проведения теста сирийских хомячков в возрасте 6 недель по получению, 3 животных на группу.

[0070]

3–3 Способ тестирования

[0071]

3–3–1 Анестезия

Проводили газовую анестезию [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (производство Mylan Seiyaku Ltd.), концентрация длительной анестезии была соответствующим образом скорректирована].

[0072]

3–3–2 Введение тестируемого вещества

Каждого хомячка фиксировали в положении лежа на спине под наркозом, и 1 мл каждого тестируемого вещества вводили в один защечный мешок. Через одну минуту тестируемое вещество удаляли, и из защечного мешка удаляли избыточное тестируемое вещество, используя стерильный тампон–зонд.

[0073]

3–3–3 Сбор бактерий

Бактерии собирали из обеих защечных мешков под наркозом с использованием стерильного тампона–зонда в общей сложности в 5 моментов времени (до введения исследуемого вещества, 0 часов, 1 ч, 3 ч и 6 ч). Тампон–зонд после сбора погружали в 5 мл среды SCDLP, затем перемешивали и использовали в качестве образца для подсчета бактерий.

[0074]

3–3–4 Измерение количества выживших бактерий

Количество выживших бактерий измеряли так же, как в 2–3–4.

[0075]

3–4 Результаты

Результаты показаны на фиг. 6. Как видно из результатов, 0,1% OPB может персистентно снижать количество бактерий до низкого значения (до 6 часов спустя). Устойчивая активность была лучше при концентрации OPB 0,5% масс./об. или выше.

Пример 4

[0076]

4. Тест на раздражение слизистой оболочки полости рта с использованием хомячка – 1

В этом тесте исследуемые лекарственные формы с различными базовыми формулами 0,1% оланексидин глюконата многократно вводили в защечные мешки хомячков в течение 14 дней и сравнительно изучали на предмет степени раздражения.

[0077]

4–1 Тестируемое вещество

[0078]

4–1–1 Тестируемое вещество 1

Обозначение: 0,1% OPB–1

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

[0079]

4–1–2 Тестируемое вещество 2

Обозначение: 0,1% OPB–2

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic L–31 ... 1,0% масс./об.

[0080]

4–1–3 Тестируемое вещество 3

Обозначение: 0,1% OPB–3

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0081]

4–1–4 Тестируемое вещество 4

Обозначение: 0,1% OPB–4

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–85 ... 1,0% масс./об.

[0082]

4–1–5 Тестируемое вещество 5

Обозначение: 0,1% OPB–5

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic F–127 ... 1,0% масс./об.

[0083]

4–1–6 Тестируемое вещество 6

Обозначение: 0,1% OPB–6

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,14% масс./об.

Pluronic F–68 ... 1,0% масс./об.

[0084]

4–1–7 Тестируемое вещество 7

Обозначение: 0,1% OPB–7

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Трегалоза ... 5,0% масс./об.

[0085]

4–2 Используемое животное

Самец Slc: Использовали для проведения теста сирийских хомячков в возрасте 8 недель по получению, 3 животных на группу.

[0086]

4–3 Способ тестирования

[0087]

4–3–1 Способ нанесения тестируемого вещества

[0088]

(1) Количество для нанесения

1 мл каждого тестируемого вещества наносили на правый защечный мешок.

[0089]

(2) Способ применения

[1] Анестезию вызывали с помощью газовой анестезии [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (производство Mylan Seiyaku Ltd.)].

[2] Каждое животное фиксировали в положении лежа на спине под поддерживающим наркозом (концентрацию соответствующим образом регулировали). Защечный мешок животного вытягивали с помощью тампона–зонда, и вытянутый защечный мешок слегка зажимали одной рукой.

[3] Посторонние вещества, такие как корм, прикрепленный к слизистой оболочке защечного мешка, удаляли с помощью физиологического раствора и тампона–зонда для хорошей гигиены. Затем защечный мешок возвращали на место.

[4] 1 мл каждого тестируемого вещества наносили на правый защечный мешок с помощью шприца на 1 мл и зонда для перорального введения, и свободный зонд для перорального введения, помещенный в шприц на 1 мл, вводили в левый защечный мешок и деканулировали.

[5] Через тридцать секунд после нанесения животное возвращали в положение лежа, чтобы предотвратить обратный поток тестируемого вещества в дыхательные пути, и тестируемое вещество удаляли. Все избыточное тестируемое вещество в полости рта удаляли с помощью тампона–зонда.

[6] Наблюдали и регистрировали цветовой тон и подобное слизистой оболочки щеки в месте нанесения. Воротник для хомяков надевали на шею животного, а затем животное возвращали в клетку.

[7] Манипуляции, описанные выше, повторяли дважды в день (утром и вечером) в течение 14 дней.

[0090]

4–3–2 Обследование и наблюдение

[0091]

(1) Наблюдение за общим состоянием

Общее состояние наблюдали у всех животных каждой группы до применения тестируемого вещества и по завершении применения в период применения (с 1–го по 14–й день). Наблюдение также проводили на следующий день после окончания периода применения (День 15).

[0092]

(2) Измерение массы тела

Массу тела измеряли для всех животных каждой группы перед применением тестируемого вещества в период применения (с 1–го по 14–й день). Измерение также проводили на следующий день после окончания периода применения (День 15). Тем не менее, масса тела не была измерена в дни 13 и 14 из–за ухудшения шкалы массы тела.

[0093]

(3) Макроскопический метод наблюдения в месте применения

Состояние слизистой оболочки защечного мешка наблюдали и оценивали по защечным мешкам всех животных каждой группы перед применением тестируемого вещества и по завершении применения в период применения (день 1 – день 14). Наблюдение также проводили в день (24±2 часа) после окончания периода применения (день 15). Место наблюдения устанавливали на слизистой оболочке щеки в месте, контактирующем с каждым тестируемым веществом. Что касается методики оценки макроскопического наблюдения, степени образования эритемы и струпа были численно оценены (степень стоматита) в соответствии с критериями наблюдения и числовыми оценками, описанными в таблице 3 ниже (ISO 10993–10, Annex B.3 "Table B.2 Grading system for oral and penile reactions"). Другие обнаруженные проявления также регистрировали. На основании полученных результатов наблюдений соответствующие числовые оценки для слизистой оболочки животных каждой группы были добавлены для каждого тестируемого вещества, и сумма была разделена на количество наблюдений и количество животных для определения среднего значения (округленного до единицы), которое использовали в качестве справочного материала для комплексной оценки.

[0094]

[Таблица 3]

Таблица B.2 Система оценок для реакций, относящихся к полости рта и к половому члену
(Образование эритемы и струпа)	Числовая оценка
Нет эритемы	0
Очень слабая эритема (едва заметная)	1
Хорошо различимая эритема	2
Умеренная эритема	3
Резко выраженная эритема (темно–красная) с образованием струпа предотвращение градации эритемы	4

[0095]

(4) Патологическое исследование

Каждое животное умерщвляли путем кровопускания под наркозом изофлурана после завершения макроскопического наблюдения на следующий день после окончания периода применения, и правый и левый защечные мешки собирали и фиксировали в растворе нейтрального забуференного 10% формалина. HE–окрашенные образцы, получали в соответствии с обычной методикой и проводили патологическое исследование. Что касается методики оценки макроскопического наблюдения, проявления или степени были зарегистрированы для каждого элемента эпителия, инфильтрации лейкоцитов, гиперемии и отека в соответствии с критериями, описанными в ISO 10993–10, Annex B.3 "Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction". Другие наблюдаемые проявления также регистрировали.

[0096]

(5) Комплексная оценка

Влияние каждого тестируемого вещества на слизистую оболочку полости рта оценивали комплексно на основании степени реакции по каждому тестируемому веществу, полученной на основании результатов макроскопического наблюдения и результатов патологического наблюдения за слизистой оболочкой щеки, с учетом изменений общего состояния и массы тела в период наблюдения.

[0097]

4–4 Результаты

[0098]

4–4–1 Общее состояние

Никаких отклонений от нормы не наблюдали ни у одного из животных.

[0099]

4–4–2 Масса тела

Результаты показаны на фиг. 7. Масса тела группы 0,1% OPB–5 практически не изменялась. Средние значения других групп постепенно увеличивались.

[0100]

4–4–3 Макроскопическое наблюдение места нанесения

Результаты показаны на фиг. 8, и защечный мешок каждой группы в последний день показан на фотографиях 1–8 фиг. 9. Раздражение, такое как эритема, почти не наблюдали во всех лекарственных формах. Тем не менее, симптом, подобный лейкоплакии (повышенный кератоз или утолщение), наблюдали в 0,1% OPB–1, –2, –6, –7 и –8. С другой стороны, никакого нарушения не наблюдали в 0,1% OPB–3, –4 и –5.

[0101]

4–4–4 Гистологическое исследование

Результаты показаны на фиг. 10. Средний индекс воспаления у каждого индивидуума и средний индекс воспаления в каждой группе рассчитывали по классификации эпителия (дегенерация клеток, метаплазия и эрозия), инфильтрации лейкоцитов, гиперемии и отека в соответствии с критериями оценки, описанными в ISO 10993–10, Annex B.3 "Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction". Проявления, отличные от критериев оценки, также регистрировали. В результате не наблюдали никаких изменений в среднем значении в группе 0,1% OPB–3. Дегенерацию клеток эпителия и минимальную до умеренной инфильтрацию лейкоцитов наблюдали в других группах, включая группу 0,1% OPB–1, и индекс воспаления оценивали как минимум от 1 до 3. В этих группах в качестве проявлений, отличных от критериев оценки, наблюдали очень незначительный межклеточный отек и очень незначительный или незначительный гиперкератоз.

[0102]

Эти результаты позволяют предположить, что основа Pluronic P–123, используемая для 0,1% OPB–3, особенно полезна в качестве основы для лекарственной формы для нанесения оланексидин глюконата на слизистую оболочку полости рта. Результаты также показали, что Pluronic P–85 и Pluronic F–127, используемые для 0,1% OPB–4 и –5, которые, как было обнаружено, не имеют аномалий при макроскопическом наблюдении, также могли использоваться в качестве основы для лекарственной формы для применения оланексидин глюконата на слизистую оболочку полости рта.

Пример 5

[0103]

5. Тест на раздражение слизистой оболочки полости рта с использованием хомячка – 2

Тест на раздражение из примера 4 показал, что основа Pluronic P–123 является полезной в качестве основы для лекарственной формы для применения оланексидин глюконата на слизистую оболочку полости рта. Соответственно, в этом тесте Pluronic P–123 был принят в качестве основы для получения лекарственной формы, не вызывающей раздражения, и впоследствии были изучены концентрация OPB и концентрация основы. Тест–систему проводили путем повторного введения в защечный мешок хомячка и продления периода от 2 недель до 4 недель.

[0104]

5–1 Тестируемое вещество

[0105]

5–1–1 Тестируемое вещество 1

Обозначение: 0,1% OPB–1

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 0,50% масс./об.

[0106]

5–1–2 Тестируемое вещество 2

Обозначение: 0,1% OPB–2

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0107]

5–1–3 Тестируемое вещество 3

Обозначение: 0,1% OPB–3

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 0,50% масс./об.

Липидур(R) ... 1,0% масс./об.

[0108]

5–1–4 Тестируемое вещество 4

Обозначение: 0,1% OPB–4

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

Липидур(R) ... 1,0% масс./об.

[0109]

5–1–5 Тестируемое вещество 5

Обозначение: 0,3% OPB–1

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,30% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,22% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,50% масс./об.

[0110]

5–1–6 Тестируемое вещество 6

Обозначение: 0,3% OPB–2

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,30% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,22% масс./об.

Pluronic P–123 ... 3,0% масс./об.

[0111]

5–1–7 Тестируемое вещество 7

Обозначение: 0,3% OPB–3

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,30% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,22% масс./об.

Pluronic P–85 ... 1,50% масс./об.

[0112]

5–1–8 Тестируемое вещество 8

Обозначение: 0,3% OPB–4

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,30% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,22% масс./об.

Pluronic P–85 ... 3,0% масс./об.

[0113]

5–1–9 Тестируемое вещество 9

Обозначение: 0,5% OPB–1

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,50% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,36% масс./об.

Pluronic P–123 ... 2,50% масс./об.

[0114]

5–1–10 Тестируемое вещество 10

Обозначение: 0,5% OPB–2

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,50% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,36% масс./об.

Pluronic P–123 ... 5,0% масс./об.

[0115]

5–1–11 Тестируемое вещество 11

Обозначение: 0,5% OPB–3

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,50% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,36% масс./об.

Pluronic P–123 ... 2,50% масс./об.

Липидур(R) ... 1,0% масс./об.

[0116]

5–1–12 Тестируемое вещество 12

Обозначение: 0,5% OPB–4

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,50% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,36% масс./об.

Pluronic P–123 ... 5,0% масс./об.

Липидур(R) ... 1,0% масс./об.

[0117]

5–2 Используемое животное

Самец Slc: Использовали для проведения теста сирийских хомячков в возрасте 8 недель по получению, 3 животных на группу.

[0118]

5–3 Способ тестирования

[0119]

5–3–1 Способ нанесения тестируемого вещества

[0120]

(1) Количество для нанесения

1 мл каждого тестируемого вещества наносили на левый защечный мешок.

[0121]

(2) Способ применения

[1] Анестезию вызывали с помощью газовой анестезии [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (производства Mylan Seiyaku Ltd.)].

[2] Каждое животное фиксировали в положении лежа на спине под поддерживающим наркозом (концентрацию соответствующим образом регулировали). Защечный мешок животного вытягивали с помощью тампона–зонда, и вытянутый защечный мешок слегка зажимали одной рукой.

[3] Посторонние вещества, такие как корм, прикрепленный к слизистой оболочке защечного мешка, удаляли с помощью физиологического раствора и тампона–зонда для хорошей гигиены. Затем защечный мешок возвращали на место.

[4] 1 мл каждого тестируемого вещества наносили на левый защечный мешок с помощью шприца на 1 мл и зонда для перорального введения, и свободный зонд для перорального введения, помещенный в шприц на 1 мл, вводили в правый защечный мешок и деканулировали.

[5] Через тридцать секунд после нанесения животное возвращали в положение лежа, чтобы предотвратить обратный поток тестируемого вещества в дыхательные пути, и тестируемое вещество удаляли. Все избыточное тестируемое вещество в полости рта удаляли с помощью тампона–зонда.

[6] Наблюдали и регистрировали цветовой тон и подобное слизистой оболочки щеки в месте нанесения, и затем животное возвращали в клетку.

[7] Манипуляции, описанные выше, повторяли дважды в день (утром и вечером) в течение 28 дней.

[0122]

5–3–2 Обследование и наблюдение

[0123]

(1) Наблюдение за общим состоянием

Общее состояние наблюдали у всех животных каждой группы до применения тестируемого вещества и по завершении применения в период применения (с 1–го по 28–й день). Наблюдение также проводили на следующий день после окончания периода применения (День 29).

[0124]

(2) Измерение массы тела

Массу тела измеряли для всех животных каждой группы перед применением тестируемого вещества в период применения (с 1–го по 28–й день). Измерение также проводили на следующий день после окончания периода применения (День 29).

[0125]

(3) Макроскопический метод наблюдения в месте применения

Состояние слизистой оболочки защечного мешка наблюдали и оценивали по защечным мешкам всех животных каждой группы перед применением тестируемого вещества и по завершении применения в период применения (день 1 – день 28). Наблюдение также проводили в день (24±2 часа) после окончания периода применения (день 29). Место наблюдения устанавливали на слизистой оболочке щеки в месте, контактирующем с каждым тестируемым веществом. Что касается методики оценки макроскопического наблюдения, степени образования эритемы и струпа были численно оценены (степень стоматита) в соответствии с критериями наблюдения и числовыми оценками, описанными в таблице 3 выше (ISO 10993–10, Annex B.3 "Table B.2 Grading system for oral and penile reactions"). Другие обнаруженные проявления также регистрировали. На основании полученных результатов наблюдений соответствующие числовые оценки для слизистой оболочки животных каждой группы были добавлены для каждого тестируемого вещества, и сумма была разделена на количество наблюдений и количество животных для определения среднего значения (округленного до единицы), которое использовали в качестве справочного материала для комплексной оценки.

[0126]

(4) Патологическое исследование

Каждое животное умерщвляли путем кровопускания под наркозом изофлурана после завершения макроскопического наблюдения на следующий день после окончания периода применения, и правый и левый защечные мешки собирали и фиксировали в растворе нейтрального забуференного 10% формалина. HE–окрашенные образцы, получали в соответствии с обычной методикой и проводили патологическое исследование. Что касается методики оценки макроскопического наблюдения, проявления или степени были зарегистрированы для каждого элемента эпителия, инфильтрации лейкоцитов, гиперемии и отека в соответствии с критериями, описанными в ISO 10993–10, Annex B.3 "Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction". Другие наблюдаемые проявления также регистрировали.

[0127]

(5) Комплексная оценка

Влияние каждого тестируемого вещества на слизистую оболочку полости рта оценивали комплексно на основании степени реакции по каждому тестируемому веществу, полученной на основании результатов макроскопического наблюдения и результатов патологического наблюдения за слизистой оболочкой щеки, с учетом изменений общего состояния и массы тела в период наблюдения.

[0128]

5–4 Результаты

[0129]

5–4–1 Общее состояние

Никаких отклонений от нормы не наблюдали ни у одного из животных.

[0130]

5–4–2 Масса тела

Масса тела увеличивалось с течением времени во всех группах и практически не различалась между группами.

[0131]

5–4–3 Макроскопическое наблюдение места нанесения

Результаты показаны на фиг. 11. Раздражение, такое как эритема, не наблюдали во всех лекарственных формах (числовая оценка: 0). Тем не менее, симптом, подобный лейкоплакии (повышенный кератоз или утолщение), наблюдали в OPB с концентрацией 0,3% или выше. С другой стороны, никакого нарушения не наблюдали в OPB с концентрацией 0,1%.

[0132]

5–4–4 Гистологическое исследование

Результаты показаны на фиг. 12. Средний индекс воспаления у каждого индивидуума и средний индекс воспаления в каждой группе рассчитывали по классификации эпителия (дегенерация клеток, метаплазия и эрозия), инфильтрации лейкоцитов, гиперемии и отека в соответствии с критериями оценки, описанными в ISO 10993–10, Annex B.3 "Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction". Проявления, отличные от критериев оценки, также регистрировали. В результате в каждой группе 0,1% OPB воспалительной реакции не наблюдали. Дегенерацию эпителия и инфильтрацию лейкоцитов наблюдали в каждой группе OPB, имеющей концентрацию 0,3% или выше, и все реакции были минимальными с индексом воспаления от 1 до 3. Гиперкератоз от очень слабого до легкого наблюдали как проявления, отличные от критериев оценки, у некоторых индивидуумов в группе с 0,1% OPB, и также очень слабый или умеренный гиперкератоз и очень слабый рост шиловидных клеток наблюдали в каждой группе OPB, имеющей концентрацию 0,3% или выше. Кроме того, внутриэпидермальные микроабсцессы, наблюдаемые в контрольной группе (правая защечный мешок: ложная сторона), по–видимому, являются естественным поражением.

Пример 6

[0133]

6. Тест эффективности в модели 5–FU–индуцированного стоматита у хомяка – 1

В этом тесте эффективность лекарственной формы OPB была протестирована на моделях 5–FU–индуцированного стоматита. В частности, измерения количества бактерий в полости рта с течением времени и оценку стоматита проводили путем полоскания в полости рта с 0,1% OPB в моделях 5–FU–индуцированного стоматита.

[0134]

6–1 Тестируемое вещество

Тестируемое вещество и контрольное вещество совместно использовали в качестве тестируемых веществ.

[0135]

6–1–1 Тестируемое вещество

Обозначение: 0,1% OPB

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль ... 0,14% масс./об.

полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) гликоль ... 0,10% масс./об.

[0136]

6–1–2 Контрольное вещество

Обозначение: основа

Формула:

полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль ... 0,07% масс./об.

полиоксиэтилен (160) полиоксипропилен (30) гликоль ... 0,10% масс./об.

[0137]

6–2 Используемое животное

Самец Slc: Использовали для проведения теста сирийских хомячков в возрасте 6 недель по получению, 5 животных на группу.

[0138]

6–3 Способ тестирования

[0139]

6–3–1 Анестезия

Проводили газовую анестезию [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (производство Mylan Seiyaku Ltd.), концентрация длительной анестезии была соответствующим образом скорректирована].

[0140]

6–3–2 Получение модели стоматита

5–FU вводили интраперитонально в дозе 60 мг/кг хомякам под наркозом. Введение осуществляли в общей сложности дважды в день 0 и день 2.

[0141]

На день 4 у каждого хомяка под наркозом извлекали защечный мешок. Корм и напольный коврик для лабораторных животных, накопленные в защечном мешке, удаляли, и защечный мешок промакивали ватным тампоном, пропитанным физиологическим раствором. Поверхностный слой (роговой слой) защечного мешка чистили прецизионным ершиком (ϕ2,34 мм, производства Sumflex. Co., Ltd.). Почищенный таким образом защечный мешок возвращали в ротовую полость.

[0142]

6–3–3 Введение исследуемого вещества

Каждого хомячка фиксировали в положении лежа на спине под наркозом, и 1 мл каждого тестируемого вещества вводили в один защечный мешок. Через тридцать секунд тестируемое вещество удаляли, и из защечного мешка удаляли избыточное тестируемое вещество, используя стерильный тампон–зонд. Это введение путем полоскания осуществляли два раза в день. Введение не осуществляли после того, как стоматит достиг пика.

[0143]

6–3–4 Сбор бактерий

В дни 0, 4, 7, 10 и 17 бактерии собирали из обеих защечных мешков под наркозом с использованием тампона–зонда в общей сложности в 4 временные точки (до первого введения исследуемого вещества, 0 часов и 6 часов спустя). Однако в дни 10 и 17 без применения исследуемого вещества бактерии собирали только один раз. Тампон–зонд после сбора погружали в 5 мл среды SCDLP, затем перемешивали и использовали в качестве образца для подсчета бактерий.

[0144]

6–3–5 Измерение количества выживших бактерий

Метод посева заливкой на чашки с агаром проводили со ссылкой на новые методы тестирования микроорганизмов GMP 1) и стандартные методы анализа в правилах безопасности пищевых продуктов 2).

[1] Отбирали 500 мкл образца для подсчета бактерий и проводили 10–кратные серии разведений от 10¹–кратного до 10⁶–кратного с использованием 4,5 мл раствора для разведения.

[2] 1 мл каждого неразбавленного образца для подсчета бактерий и разведенных бактериальных суспензий распределяли в каждую стерильную чашку.

[3] 15 мл среды для измерения (TSA+), инкубированной на термостатирующей бане при приблизительно 47°С, быстро дозировали в чашку.

[4] После затвердевания среды для измерения, полученные чашки с заливкой переворачивали в инкубаторе и культивировали при 35°С до тех пор, пока колонии не могли быть подсчитаны (приблизительно 2 дня).

[5] После культивирования, колонии, которые пролиферировали в чашках с заливкой, визуально подсчитывали. Чашку с заливкой, в которой число колоний было слишком большим, чтобы различать колонии, считали как TNTC (сплошной рост) без подсчета.

[0145]

6–3–6 Расчет количества выживших бактерий

Количество колоний, принятых на основании раздела 6–3–5, делили на степень разведения для определения количества выживших бактерий (КОЕ/мл). Количество принятых колоний было округлено до одного десятичного знака и показано. Количество выживших бактерий (КОЕ/тампон–зонд) рассчитывали согласно следующему выражению.

A: количество принятых колоний

Количество выживших бактерий (КОЕ/тампон–зонд) = A × степень разведения × Количество жидкости образца (5 мл)

[0146]

Логарифмическое уменьшение далее определяли в соответствии с приведенным ниже выражением из логарифмической величины числа выживших бактерий. Логарифмическое уменьшение было округлено до двух десятичных знаков и показано. Когда число выживших бактерий составляло 1 или меньше, логарифмическое значение устанавливали равным 0.

B: логарифмическое значение числа жизнеспособных бактерий на исходном уровне

C: логарифмическое значение количества жизнеспособных бактерий после введения тестируемого вещества

Log уменьшение=B – C

[0147]

6–3–7 Статистический анализ

Среднее и стандартное отклонение определяли по количеству жизнеспособных бактерий (КОЕ/тампон–зонд) каждой группы и по их логарифмическому значению. Количество жизнеспособных бактерий округляли до единицы и отображали в виде целого числа. Логарифмическое значение числа жизнеспособных бактерий округляли до двух знаков после запятой и отображали. Когда число жизнеспособных бактерий равнялось 0, логарифмическое значение числа жизнеспособных бактерий устанавливали равным 0. Анализ не проводили из–за поискового теста.

[0148]

6–3–8 Оценка стоматита

Степень стоматита оценивали на основании приведенной ниже таблицы 4.

[0149]

[Таблица 4]

Степень	Состояние
0	Ни эритемы, ни вазодилатации
1	Эритема и вазодилатация
2	Серьезная эритема, сопровождающаяся поверхностной эрозией слизистой оболочки
3	Изъязвление слизистой оболочки (25%)
4	Изъязвление слизистой оболочки (50%)
5	Изъязвление слизистой оболочки (100%)

[0150]

6–4 Результаты

[0151]

6–4–1 Количество бактерий

Результаты показаны в таблице 5 и на фиг. 13. Уменьшение количества бактерий после введения было отмечено в группе 0,1% OPB в дни 0, 4 и 10, тогда как величина уменьшения количества бактерий была очень мала в день 7, когда отмечали увеличение тяжести стоматита.

[0152]

[Таблица 5]

Количество выживших бактерий в полости рта хомячка

Тестируемое вещество

n

Количество выживших бактерий {Среднее ± SD [Log10 (КОЕ/тампон–зонд)]}

0 день

4 день

7 день

10 день

17 день

до

0ч

6ч

до

0ч

6ч

до

0ч

6ч

до

0ч

6ч

до

Нет процедуры

5

6,78 ± 0,43

6,72 ± 0,38

6,79 ± 0,22

7,07 ± 0,49

6,97 ± 0,53

6,82 ± 0,20

7,03 ± 0,48

6,84 ± 0,35

6,90 ± 0,21

6,59 ± 0,26

6,54 ± 0,30

6,54 ± 0,18

6,65 ± 0,16

Основа

5

6,61 ± 0,52

5,95 ± 0,39

6,10 ± 0,39

6,62 ± 0,42

6,08 ± 0,09

6,30 ± 0,20

7,12 ± 0,07

6,89 ± 0,29

6,68 ± 0,23

6,61 ± 0,59

6,67 ± 0,57

6,85 ± 0,31

6,68 ± 0,56

0,1%OPB

5

6,86 ± 0,42

4,69 ± 0,15

4,78 ± 0,68

6,78 ± 0,30

5,32 ± 0,25

6,31 ± 0,55

7,02 ± 0,19

6,36 ± 0,44

6,84 ± 0,35

6,60 ± 0,35

5,82 ± 0,27

6,54 ± 0,32

6,50 ± 0,27

[0153]

6–4–2 Степень стоматита

Результаты показаны на фиг. 14. Степень стоматита была заметно низкой в группе 0,1% OPB.

[0154]

В этом тесте величина пониженного количества бактерий была низкой на 7–й день в группе с 0,1% OPB, вероятно, из–за снижения бактерицидной активности из–за метода сбора бактерий или избытка выпота. Этот тест показал, что увеличение тяжести стоматита смягчается введением 0,1% OPB и тем самым сохраняя чистоту полости рта.

Пример 7

[0155]

7. Тест эффективности в модели 5–FU–индуцированного стоматита у хомяка – 2

В этом тесте, стоматит–смягчающие эффекты 0,1% оланексидин глюконата и 0,1% CHG были сравнительно изучены в моделях 5–FU–индуцированного стоматита у хомяка.

[0156]

7–1 Тестируемое вещество

Тестируемые вещества и контрольное вещество совместно использовали в качестве тестируемых веществ.

[0157]

7–1–1 Тестируемое вещество 1

Обозначение: 0,1% OPB

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

[0158]

7–1–2 Тестируемое вещество 2

Обозначение: Перидекс(R)/0,1% CHG

Производитель: 3M ESPE Dental Products

Формула: хлоргексидин глюконат ... 0,12% масс./об.

[0159]

7–1–3 Контрольное вещество

Обозначение: основа

Формула: полиоксиэтилен (20) полиоксипропилен (20) гликоль ... 0,07% масс./об.

[0160]

7–2 Используемые бактерии

В этом тесте использовали Staphylococcus aureus (ATCC No: 6538, производства Microbiologics, Inc.), который является нормальным обитателем полости рта.

[0161]

7–3 Используемое животное

Самец Slc: Использовали для проведения теста сирийских хомячков в возрасте 6 недель по получению, 5 животных на группу.

[0162]

7–4 Способ тестирования

[0163]

7–4–1 Получение тестируемой бактериальной суспензии

[1] Хранившийся флакон с бактериальными сгустками вынимали и возвращали к комнатной температуре.

[2] Один бактериальный сгусток извлекали из флакона и переносили в стерильную пробирку.

[3] К нему добавляли 0,5 мл физиологического раствора.

[4] Бактериальный сгусток раздавливали стерильным тампоном для приготовления суспендированной бактериальной жидкости.

[5] Суспендированную бактериальную жидкость инокулировали в круглую область диаметром приблизительно 2 см в чашке с TSA с помощью стерильного тампона–зонда и отделяли от области инокуляции с помощью платиновой петли.

[6] Чашку со штрихами TSA переворачивали и культивировали до образования колоний.

[7] Из сформированных колоний отбирали одну колонию, собирали платиновой иглой и наносили в казитоновую среду.

[8] Казитоновую среду, в которую был нанесен инокулянт, культивировали до тех пор, пока пролиферация бактерий не стала подтвержденной.

[9] После подтверждения пролиферации бактерий, бактерии охлаждали (установленное значение: от 2 до 8°C).

[10] Часть тестируемых бактерий, охлажденных в казитоновой среде, собирали с помощью платиновой иглы, переносили в стерильную пробирку объемом 14 мл, содержащую 5 мл среды MHB, и культивировали в статическом состоянии до пролиферации бактерий.

[11] После культивирования 10 мкл культурального раствора собирали стерильным наконечником, снова переносили в стерильную пробирку объемом 14 мл, содержащую 5 мл среды MHB, и культивировали в статическом состоянии до пролиферации бактерий.

[12] После культивирования приблизительно 5 мл тестируемого бактериального культурального раствора, субкультивированного в среде MHB, извлекали в коническую пробирку объемом 15 мл. После добавления 8 мл физиологического раствора смесь осторожно перемешивали.

[13] Пробирку центрифугировали при 3000 об/мин при 23°С в течение 10 минут (охлаждаемая центрифуга 5800, ротор RS–720, производство Kubota Corp.) и супернатант отбрасывали.

[14] Осажденные тестируемые бактерии суспендировали добавлением 1 мл дистиллированной воды (Otsuka Distilled Water, производства Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.).

[15] Суспендированную бактериальную жидкость переносили в стерильную пробирку объемом 14 мл и определяли мутность с использованием стандарта МакФарланда (продукт No. 70900, производство Sysmex–Biomerieux Co., Ltd."). Концентрацию бактериальной суспензии регулировали добавлением физиологического раствора таким образом, чтобы достичь МакФарланда 5.

[16] Суспендированную бактериальную жидкость, доведенную до МакФарланда 5, использовали в качестве тестируемой бактериальной суспензии.

[0164]

7–4–2 Анестезия

Проводили газовую анестезию [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (Mylan Seiyaku Ltd.), концентрация длительной анестезии была соответствующим образом скорректирована].

[0165]

7–4–3 Получение модели стоматита

5–FU вводили интраперитонально в дозе 60 мг/кг хомякам под наркозом. Введение осуществляли в общей сложности дважды в день 0 и день 2. На день 4 у каждого хомяка под наркозом извлекали защечный мешок. Корм и напольный коврик для лабораторных животных, накопленные в защечном мешке, удаляли, и защечный мешок промакивали ватным тампоном, пропитанным физиологическим раствором. Поверхностный слой (роговой слой) защечного мешка чистили прецизионным ершиком (ϕ2,34 мм, производства Sumflex. Co., Ltd.). Почищенный таким образом защечный мешок возвращали в ротовую полость.

[0166]

7–4–4 Введение тестируемого вещества

Каждый исследуемый материал наносили два раза в день в защечный мешок хомяка под наркозом с помощью тампона–зонда (в течение 4 дней со дня распределения по группам). Однако на 4–й день введение осуществляли один раз (только утром).

[0167]

7–4–5 Нанесение тестируемой бактериальной суспензии

Тестируемую бактериальную суспензию, полученную в 7–4–1, наносили один раз в день перед введением тестируемого вещества утром в защечный мешок хомяка под наркозом с использованием платиновой петли (в течение 5 дней со дня распределения по группам).

[0168]

7–4–6 Оценка стоматита

Степень стоматита оценивали на основании приведенной выше таблицы 4.

[0169]

7–4–7 Статистический анализ

Среднее значение и стандартное отклонение определяли для оценки каждой группы, а график был создан с использованием только среднего значения. Анализ не проводили из–за поискового анализа.

[0170]

7–5 Результаты

Результаты показаны на фиг. 15. Тенденция к уменьшению увеличения тяжести стоматита была замечена в группе с 0,1% OPB по сравнению с группами основы и 0,1% CHG. Степень была почти такой же, без различия между группой основы и группой с 0,1% CHG. Из–за эффекта уменьшения увеличения тяжести стоматита 0,1% OPB считался превосходящим по бактерицидной эффективности в отношении нанесенных бактерий или нормального обитателя в слизистой оболочке защечного мешка до 0,1% CHG.

Пример 8

[0171]

8. Тест эффективности в модели стоматита у хомяка, вызванного использованием 5–FU и радиационного облучения в комбинации

В этом тесте лекарственную форму 0,1% OPB, содержащую Pluronic P–123 в качестве основы, применяли методом полоскания в модели стоматита у хомяков, индуцированного использованием 5–FU и радиационного облучения в сочетании, и сравнительно изучали в отношении стоматит–смягчающего эффекта.

[0172]

8–1 Тестируемое вещество

Тестируемое вещество и контрольное вещество совместно использовали в качестве тестируемых веществ.

[0173]

8–1–1 Тестируемое вещество

Обозначение: OPB

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0174]

8–1–2 Контрольное вещество

Обозначение/сокращенное наименование: основа/Основа

Формула:

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0175]

8–2 Используемое животное

Самец Slc: Использовали для проведения теста сирийских хомячков в возрасте 6 недель по получению, 8 животных на группу.

[0176]

8–3 Способ тестирования

[0177]

8–3–1 Анестезия

[0178]

(1) Момент радиационного облучения

Сомнопентил(R) (производство Kyoritsuseiyaku Corp.) вводили интраперитонально в дозе 40 мг/кг.

[0179]

(2) Момент оценки стоматита и введения тестируемого вещества

Проводили газовую анестезию [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (производство Mylan Seiyaku Ltd.), концентрация длительной анестезии была соответствующим образом скорректирована].

[0180]

8–3–2 Получение модели стоматита

[0181]

(1) Радиационное облучение

В день 0 с помощью тампона–зонда вынимали защечный мешок у каждого хомяка под наркозом. Корм и напольный коврик для лабораторных животных, накопленные в защечном мешке, удаляли, и защечный мешок промакивали ватным тампоном, пропитанным физиологическим раствором. Тело и защечный мешок закрепляли на формованной акриловой пластине. Область, не относящуюся к защечному мешку в месте облучения, закрывали свинцом, а защечный мешок облучали излучением (40 Гр) в условиях [расстояние между пластины: 12,5 см, напряжение трубки: 160 кВ, ток трубки: 6,2 мА]. Однако, облучение проводили для одного защечного мешка на индивида, и каждой группе назначали четыре животных с облученным левым защечным мешком и четыре животных с облученным правым защечным мешком.

[0182]

(2) Введение 5–FU

5–FU вводили интраперитонально в дозе 60 мг/кг хомякам в общей сложности три раза в дни 0, 5 и 10.

[0183]

8–4–3 Введение исследуемого вещества

Каждого хомячка фиксировали в положении лежа на спине под наркозом, и 1 мл каждого тестируемого вещества вводили в один защечный мешок. Через тридцать секунд тестируемое вещество удаляли, и из защечного мешка удаляли избыточное тестируемое вещество, используя стерильный тампон–зонд. Это введение путем полоскания осуществляли два раза в день. Введение не осуществляли после того, как стоматит достиг пика.

[0184]

8–4–4 Оценка стоматита

Степень стоматита оценивали на основании приведенной выше таблицы 4.

[0185]

8–4–5 Статистический анализ

Среднее значение и стандартное отклонение определяли для степени стоматита в каждой группе, и строили график. Анализ не проводили из–за поискового анализа.

[0186]

8–5 Результаты

Результаты показаны на фиг. 16. Максимальное значение степени стоматита составляло 4,9 для группы основы и 4,3 для группы OPB, и, кроме того, степень начала повышаться раньше в группе основы. Группа OPB, очевидно, была излечена ранее, хотя все животные не были полностью излечены, потому что язва у некоторых особей не заживала даже на 40–й день из–за влияния большой степени моделей.

Пример 9

[0187]

9. Тест эффективности на модели гингивита у крыс

В этом тесте терапевтический эффект 0,1% оланексидин глюконата на гингивит изучали на моделях гингивита у крыс.

[0188]

9–1 Тестируемое вещество

Тестируемое вещество и контрольное вещество совместно использовали в качестве тестируемых веществ.

[0189]

9–1–1 Тестируемое вещество

Обозначение: OPB

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0190]

9–1–2 Контрольное вещество

Обозначение/сокращенное наименование: основа/Основа

Формула:

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0191]

9–2 Используемые бактерии

В этом тесте использовали Porphyromonas gingivalis (ATCC No: 33277, производства Microbiologics, Inc.), которая является бактериальной причиной гингивита.

[0192]

9–3 Используемое животное

Самец Jcl: Использовали для проведения теста крыс линии Вистар в возрасте 5 недель по получению, 5 животных на группу.

[0193]

9–4 Способ тестирования

[0194]

9–4–1 Получение тест–бактерии (все манипуляции за исключением консервирования проводили в анаэробной камере)

[1] Хранившийся флакон с бактериальными сгустками вынимали и помещали в анаэробную камеру.

[2] Один бактериальный сгусток извлекали из флакона и переносили в стерильную пробирку.

[3] К этому добавляли 0,5 мл подготовленной среды TSB.

[4] Бактериальный сгусток раздавливали стерильным тампоном для приготовления суспендированной бактериальной жидкости.

[5] Суспендированную бактериальную жидкость инокулировали в среду с кровяным агаром из овечьей крови для анаэробов CDC.

[6] Культивирование проводили в течение 3–4 дней в анаэробных условиях (37°C).

[7] Из сформированных колоний отбирали одну колонию, и аналогичным образом снова инокулировали в среду с кровяным агаром из овечьей крови для анаэробов CDC.

[8] После подтверждения пролиферации бактерий туда добавляли 3 мл приготовленной среды TSB, и бактерии суспендировали, используя шпатель для получения глицеринового исходного раствора.

[9] Исходный раствор криоконсервировали.

[10] Исходный раствор инокулировали в среду с агаром из овечьей крови для анаэробов CDC и культивировали в анаэробных условиях.

[11] После подтверждения пролиферации бактерий бактерии суспендировали в соответствующем количестве приготовленной среды TSB. Часть суспензии вынимали, и мутность доводили до МакФарланда 5 с использованием стандарта МакФарланда. Рассчитывали степень разведения, и концентрацию бактериальной суспензии доводили до 1×10¹⁰ КОЕ/мл от оставшейся суспензии.

[12] Полученную смесь использовали в качестве тестируемой бактериальной суспензии.

[0195]

9–4–2 Анестезия

[0196]

(1) Момент введения хлопковых швейных ниток и аутопсии

Водный раствор пентобарбитал натрия вводили интраперитонально в дозе 40 мг/кг.

[0197]

(2) Бактериальная инокуляция и введение тестируемого вещества

Проводили газовую анестезию [вводный наркоз: 1,0 л/мин воздуха с 5% изофлураном (Mylan Seiyaku Ltd.), концентрация длительной анестезии была соответствующим образом скорректирована].

[0198]

9–4–3 Введение хлопковой швейной нити

После анестезии каждое животное фиксировали в положении лежа на спине на специальном столе, и хлопковую швейную нить вставляли между верхним правым первым и вторым коренными зубами с приподнятой нижней челюстью.

[0199]

9–4–4 Бактериальная инокуляция

После анестезии 0,2 мл тестируемой бактериальной суспензии инокулировали в место введения хлопковой швейной нити. Эту манипуляцию проводили каждые 2 часа.

[0200]

9–4–5 Введение тестируемого вещества

После анестезии вводили 1 мл каждого тестируемого вещества для очистки полости рта. Эту манипуляцию проводили два раза в день.

[0201]

9–4–6 Наблюдение и анализ

[0202]

(1) Общее состояние

Общее состояние наблюдали один раз в день, начиная со дня введения хлопковых швейных ниток и заканчивая днем аутопсии.

[0203]

(2) Измерение массы тела

Массу тела измеряли в общей сложности дважды от дня введения хлопковой швейной нитки до дня аутопсии.

[0204]

(3) Аутопсия

Каждое животное умерщвляли путем кровопускания из разрезанной брюшной аорты под наркозом, и осуществляли аутопсию.

[0205]

(4) Гистологическое исследование

Иссеченную верхнюю челюсть фиксировали в растворе нейтрального забуференного 10% об./об. формалина, обезжиривали и декальцинировали, после чего получали НЕ–окрашенные образцы. Воспалительные изменения подвергали патологическому исследованию для каждого образца.

[0206]

9–4–7 Статистический анализ

Среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по массе тела каждой группы. Анализ не проводили.

[0207]

9–5 Результаты

Никаких отклонений в общем статусе не наблюдали, и масса тела не различалась между группами.

Результаты патологического обследования показаны на фиг. 17. Микрофотографии HE–окрашенных образцов показаны на фиг. 18.

В группе введения OPB многослойный плоский эпителий десны наблюдали с инфильтрацией нейтрофилов в 8 из 10 случаев, межклеточным отеком в 1 из 10 случаев и язвой в 1 из 10 случаев, причем все они были очень незначительными. Собственный слой десны наблюдали с инфильтрацией нейтрофилов в 8 из 10 случаев и и кровотечением в 1 из 10 случаев, причем все они были очень незначительными. С другой стороны, в группе введения основы многослойный плоский эпителий десны наблюдали с инфильтрацией нейтрофилов, которая была очень незначительной в 8 из 10 случаев и незначительной в 2 из 10 случаев. Многослойный плоский эпителий десны наблюдали с межклеточным отеком в 2 из 10 случаев, гиперкератозом в 2 из 10 случаев, акантозом в 2 из 10 случаев и язвой в 1 из 10 случаев, причем все они были очень незначительными. Собственный слой десны наблюдали с инфильтрацией нейтрофилов, которая была очень незначительной в 6 из 10 случаев и незначительной в 3 из 10 случаев. Собственный слой десны наблюдали с кровотечением и развитие отека, которые были очень незначительными в 1 из 10 случаев.

[0208]

9–6 Обсуждение

Все инфильтрация нейтрофилов, межклеточный отек, гиперкератоз и акантоз в многослойном плоском эпителии десны, а также инфильтрация нейтрофилов и развитие отека в собственном слое были изменениями, связанными с воспалением, и считались происходящими вследствие процедур. Все эти изменения имели тенденцию быть низкими с точки зрения как частоты, так и степени в группе введения OPB по сравнению с группой введения основы. Таким образом, наблюдали эффект уменьшения воспаления, вызванный введением OPB.

Пример 10

[0209]

10. Тест эффективности на модели пневмонии у крыс

В этом тесте терапевтический эффект 0,1% оланексидин глюконата на пневмонию изучали на моделях аспирационной пневмонии у крыс.

[0210]

10–1 Тестируемое вещество

Тестируемое вещество и контрольное вещество совместно использовали в качестве тестируемых веществ.

[0211]

10–1–1 Тестируемое вещество

Обозначение: OPB

Формула:

оланексидин глюконат ... 0,10% масс./об.

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0212]

10–1–2 Контрольное вещество

Обозначение/сокращенное наименование: основа/Основа

Формула:

Pluronic L–44 ... 0,07% масс./об.

Pluronic P–123 ... 1,0% масс./об.

[0213]

10–2 Используемое животное

Самцы линии Crl: Крыс CD (SD) возрастом 7 недель по получению использовали для проведения теста.

[0214]

10–3 Конфигурация группы

Массу тела измеряли утром в день внутритрахеального введения, и животных распределяли методом стратифицированной рандомизации на 4 группы (группы 1–4), показанные в таблице 6 ниже. Шесть животных, исключенных из исследования, распределяли методом стратифицированной рандомизации на 2 группы (группы 5 и 6), представленные в таблице 6 ниже, и использовали в качестве индивидов для сбора слюны.

[0215]

[Таблица 6]

[0216]

10–4 Способ тестирования

[0217]

10–4–1 Анестезия

[0218]

(1) Очищение полости рта и сбор слюны

Сомнопентил вводили интраперитонально в дозе 40 мг/кг.

[0219]

(2) Момент внутритрахеального введения и сбора бронхоальвеолярной лаважной жидкости (BALF)

Проводили газовую анестезию [вводный наркоз: 3,0 л/мин воздуха с 3% изофлураном (Mylan Seiyaku Ltd.), концентрация длительной анестезии была соответствующим образом скорректирована].

[0220]

10–4–2 Очищение полости рта

Стерильный тампон–зонд пропитывали каждым тестируемым веществом, который затем эмболизировали в достаточном количестве в полость рта под анестезией.

[0221]

10–4–3 Сбор слюны

0,1% пилокарпин гидрохлорид (5 мг/кг) вводили интраперитонально под анестезией. Получали избыточную слюну. Выделенную слюну добавляли в питательную среду, содержащую нейтрализующий агент, и оставляли стоять. Затем осуществляли центрифугирование (к.т., 3000 об/мин, 10 мин) и осадки суспендировали в том же количестве физиологческого раствора для получения раствора для внутритрахеального введения.

[0222]

10–4–4 Внутритрахеальное введение

После сбора слюны в трахею под наркозом вводили трубку для введения с помощью фарингоскопа и вводили туда 0,1 мл слюны или физиологического раствора.

[0223]

10–4–5 Сбор BALF

Медианный разрез делали под анестезией через 6 или 24 часа после внутритрахеального введения, и каждое животное подвергали эвтаназии путем кровопускания из разреза в брюшной аорте. Затем обнажали легкое, и катетер вставляли в начало бронха. Лаваж проводили три раза (инфузию и восстановление повторяли дважды каждый раз) с 8 мл раствора PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,05 мМ EDTA–2Na (далее именуемый PBS) через линию, и собирали лаважную жидкость (BALF). BALF центрифугировали (200 g, 4°C, 10 мин), и супернатант разделяли на другие пробирки для хранения и использовали для измерения концентрации LDH и измерения цитокинов (ELISA). Осадки суспендировали в 1 мл PBS и использовали для гематологического исследования.

[0224]

10–4–6 Обработка животного для сбора слюны

После завершения внутритрахеального введения каждое животное для сбора слюны подвергали эвтаназии путем кровопускания под избыточной анестезией.

[0225]

10–4–7 Измерение концентрации цитокинов (TNF–α и IL–6)

Измерение проводили по протоколам, включенным в наборы.

[0226]

10–4–8 Гематологическое исследование

Гематологический анализ проводили на взвешенных осадках с использованием автоматического счетчика форменных элементов крови по нескольким позициям.

[0227]

10–4–9 Биохимическое исследование

Концентрацию LDH в собранном супернатанте BALF измеряли с использованием автоматического анализатора 7180 (Hitachi High–Technologies Corp.).

[0228]

10–4–10 Статистический анализ

Анализ не проводили из–за поискового анализа.

[0229]

10–5 Результаты

Результаты гематологического исследования и биохимического исследования показаны на фиг. 19.

При гематологическом исследовании различий между обеими группами не выявлено. 24–часовое значение IL–6 было ниже в 2,5 раза в группе OPB. Значение TNF–α было ниже в группе OPB в оба момента времени.

Эти результаты позволяют предположить, что воспалительная реакция в легких вследствие аспирации слюны ниже при контакте полости рта с OPB.

Пример 11

[0230]

11. Исследование противовоспалительного действия оланексидина с использованием репортерной клеточной линии TLR

Примеры 6–10 показали, что оланексидин обладает противовоспалительным действием на стоматит, гингивит и пневмония. Было обнаружено, что воспаления связаны с иммунным ответом, опосредованным Toll–подобным рецептором 4 (TLR–4) и Toll–подобным рецептором 2 (TLR–2), которые являются рецепторами, распознающими LPS или LTA (ChemMedChem. 2016 Jan 19; 11 (2): 154–65; Biotechnol Adv. 2012 Jan–Feb; 30 (1): 251–60; and J Dent Res. 2016 Jul; 95 (7): 725–33).

Оланексидин обладает способностью подавлять воспаление за счет антагонистического (антагонистоподобного) действия на TLR–4 и TLR–2. Соответственно, в этом тесте, чтобы выяснить это, антагонистическое (антагонистоподобное) действие оланексидина на TLR–4 и TLR–2 было подтверждено репортерным анализом с использованием клеток человеческого происхождения, стабильно экспрессирующих TLR–4, TLR–2, и репортерные (SEAP) гены.

[0231]

11–1 Тестируемое вещество

Обозначение: 1,5% OPB

Формула: оланексидин глюконат ... 1,5% масс./об.

[0232]

11–2 Клетка

Использовали клетки, описанные в таблице 7 ниже.

[0233]

[Таблица 7]

Обозначение (сокращенное наименование)	клетка хозяина	Экспрессируемый ген	No. по каталогу/ поставщик	Среда
TLR4/MD–2/CD14 репортерная клеточная линия (HEK–TLR4)	HEK293 (полученная из эмбриональных почек человека)	Toll–подобный рецептор 4 человека (TLR4), MD–2 человека, CD14 человека, репортерный ген секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) под транскрипционным контролем NF–κB элемента ответа	NBP2–26503/Novus Biologicals, LLC	DMEM (4,5 г/л глюкозы)+ 10% FBS+4 мM L–глутамина+1 мM пирувата натрия+100 ед./мл пенициллина* + 100 мкг/мл стрептомицина* + 10 мкг/мл бластцидина*† + 2 мкг/мл пуромицин*† + 200 мкг/мл зеоцин*† + 500 мкг/мл G418*†
TLR2 репортерная клеточная линия (HEK–TLR2)	HEK293 (полученная из эмбриональных почек человека)	Toll–подобный рецептор 2 человека (TLR2), репортерный ген секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) под транскрипционным контролем NF–κB элемента ответа	NBP2–26274/Novus Biologicals, LLC	DMEM (4,5 г/л глюкозы) + 10% FBS+4 мM L–глутамина+1 мM пирувата натрия+100 ед./мл пенициллина* + 100 мкг/мл стрептомицина* + 10 мкг/мл бластцидина*† + 500 мкг/мл G418*†

*Добавляли, при необходимости

†Подбор реагента

[0234]

11–3 Способ тестирования

[0235]

11–3–1 Исследование антагонистического (антагонистоподобного) действия оланексидина на TLR–4

[0236]

– Используемая клетка: клетки HEK293, экспрессирующие TLR4

– Используемая среда

Прекультура: DMEM+FBS (конечная концентрация: 10%) + пенициллин (конечная концентрация: 100 единиц/мл) + стрептомицин (конечная концентрация: 100 мкг/мл)

Образец введения и культура после введения: DMEM+FBS (конечная концентрация: 5%)

– Измерение активности: набор для анализа SEAP (производство Novus Biologicals)

– Количественная оценка белка: анализ белка BCA (производство Funakoshi Co., Ltd.)

[0237]

[1] Клетки доводили до 1,0×10⁵ клеток/лунку/100 мкл с помощью DMEM, содержащей 10% FBS, высевали на 96–луночный планшет (покрытый коллагеном) и культивировали в течение 40 часов (37°C, 5% CO₂).

[2] 1,5% OPB разбавляли до концентраций, указанных в таблице 8 ниже, с использованием 5% FBS.

[0238]

[Таблица 8]

	Концентрация OPB (мкг/мл)
Концентрация препарата	20, 10, 5, 2
Конечная концентрация	10, 5, 2,5, 1

[0239]

[3] LPS получали при 20 нг/мл (конечная концентрация: 10 нг/мл) с использованием 5% FBS.

[4] После удаления среды к клеткам добавляли среду в порядке 50 мкл среды OPB и 50 мкл среды LPS с последующим культивированием в течение 8 часов (37°C, 5% CO₂).

[5] После культивирования 50 мкл супернатанта переносили в каждую лунку другого 96–луночного планшета и проводили анализ SEAP.

[6] 50 мкл 0,1% SDS–0,1 н NaOH добавляли в каждую лунку 96–луночного планшета, из которого удаляли оставшийся супернатант, и замораживали в течение ночи (–20°C). После оттаивания проводили анализ белка BCA.

[7] Уровень экспрессии репортерного гена SEAP калибровали по концентрации белка для расчета степени ингибирования при каждой концентрации OPB.

[0240]

11–3–2 Исследование антагонистического (антагонистоподобного) действия оланексидина на TLR–2

[0241]

– Используемая клетка: клетки HEK293, экспрессирующие TLR2

– Используемая среда

Прекультура: DMEM+FBS (конечная концентрация: 10%) + пенициллин (конечная концентрация: 100 единиц/мл) + стрептомицин (конечная концентрация: 100 мкг/мл)

Образец введения и культура после введения: DMEM+FBS (конечная концентрация: 1%)

– Измерение активности: набор для анализа SEAP (производство Novus Biologicals)

– Количественная оценка белка: анализ белка BCA (производство Funakoshi Co., Ltd.)

[0242]

[1] Клетки доводили до 1,0×10⁵ клеток/лунку/100 мкл с помощью DMEM, содержащей 10% FBS, высевали на 96–луночный планшет (покрытый коллагеном) и культивировали в течение 36 часов (37°C, 5% CO₂).

[2] 1,5% OPB разбавляли до концентраций, указанных в таблице 8 выше, с использованием 1% FBS.

[3] LTA получали при 2 мкг/мл (конечная концентрация: 1 мкг/мл) с использованием 1% FBS.

[4] После удаления среды к клеткам добавляли среду в порядке 50 мкл среды OPB и 50 мкл среды LPS с последующим культивированием в течение 12 часов (37°C, 5% CO₂).

[5] После культивирования 50 мкл супернатанта переносили в каждую лунку другого 96–луночного планшета и проводили анализ SEAP.

[6] 50 мкл 0,1% SDS–0,1 н NaOH добавляли в каждую лунку 96–луночного планшета, из которого удаляли оставшийся супернатант, и замораживали в течение ночи (–20°C). После оттаивания проводили анализ белка BCA.

[7] Уровень экспрессии репортерного гена SEAP калибровали по концентрации белка для расчета степени ингибирования при каждой концентрации OPB.

[0243]

11–4 Результаты

Результаты показаны на фиг. 20.

Степень ингибирования SEAP увеличивалась с повышением концентрации OPB (IC₅₀: приблизительно 10 мкг/мл), демонстрируя, что OPB проявляет антагонистическое (антагонистоподобное) действие на TLR4 и TLR2. Эти результаты позволяют предположить, что OPB обладает противовоспалительным действием, ингибируя иммунный ответ, опосредованный TLR4 и TLR2.

Пример 12

[0244]

12. Исследование противовоспалительного действия оланексидина с использованием мышиных макрофагоподобных клеточных линий RAW264.7

Мышиная макрофагоподобная клеточная линия RAW264.7 при раздражении LPS или LTA начинает иммунный ответ через рецептор, распознающий его, чтобы продуцировать медиатор воспаления NO. Соответственно, будет ли оланексидин оказывать противовоспалительное действие на воспаление из–за раздражения LPS, было подтверждено с использованием продукции NO из клеток RAW264.7 в качестве индикатора.

[0245]

12–1 Тестируемое вещество

Обозначение: 1,5% OPB

Формула: оланексидин глюконат ... 1,5% масс./об.

[0246]

12–2 Клетка

Использовали клетки, описанные в таблице 9 ниже.

[0247]

[Таблица 9]

обозначение	Виды животных	Ткань	No.по каталогу/ поставщик	Среда
RAW 264.7	Мышь, BALB/c	Лейкозный моноцит	EC91062702–F0/DS Pharma Biomedical Co., Ltd.	DMEM+10% FBS+100 ед./мл пенициллина* + 100 мкг/мл стрептомицина*

* Добавляли, при необходимости

[0248]

12–3 Способ тестирования

[0249]

12–3–1 Исследование противовоспалительного действия оланексидина на раздражение LPS

[0250]

– Используемая клетка: RAW264.7

– Используемая среда

Прекультура: DMEM+FBS (конечная концентрация: 10%) + пенициллин (конечная концентрация: 100 единиц/мл) + стрептомицин (конечная концентрация: 100 мкг/мл)

Образец введения и культура после введения: DMEM+FBS (конечная концентрация: 5%)

– Измерение активности: набор для колориметрического анализа нитраты/нитриты (производство Griess Reagents)

– Количественная оценка белка: не измеряли, потому что клетки были трудно окрашивать и дестабилизировать значения.

[0251]

[1] Клетки доводили до 1,0×10⁵ клеток/лунку/100 мкл с помощью DMEM, содержащей 10% FBS, высевали на 96–луночный планшет (непокрытый) и культивировали в течение 24 часов (37°C, 5% CO₂).

[2] 1,5% OPB разбавляли до концентраций, указанных в таблице 8 выше, с использованием 5% FBS.

[3] LPS получали при 200 нг/мл (конечная концентрация: 100 нг/мл) с использованием 5% FBS.

[4] После удаления среды к клеткам добавляли среду в порядке 50 мкл среды OPB и 50 мкл среды LPS с последующим культивированием в течение 8 часов (37°C, 5% CO₂).

[5] После культивирования 50 мкл супернатанта переносили в каждую лунку другого 96–луночного планшета и проводили колориметрический анализ нитраты/нитриты.

[0252]

12–3–2 Исследование противовоспалительного действия оланексидина на раздражение E. coli (LPS–продуцирующей бактерии)

[0253]

– Используемая клетка: RAW264.7

– Используемая среда

Прекультура: DMEM+FBS (конечная концентрация: 10%) + пенициллин (конечная концентрация: 100 единиц/мл) + стрептомицин (конечная концентрация: 100 мкг/мл)

Образец введения и культура после введения: DMEM+FBS (конечная концентрация: 1%)

– Измерение активности: набор для колориметрического анализа нитрата/нитрита (производства Griess Reagents)

– Количественная оценка белка: не измеряли, потому что клетки были трудно окрашивать и дестабилизировать значения.

[0254]

[1] Клетки доводили до 1,0×10⁵ клеток/лунку/100 мкл с помощью DMEM, содержащей 10% FBS, высевали на 96–луночный планшет (непокрытый) и культивировали в течение 24 часов (37°C, 5% CO₂).

[2] 1,5% OPB получали при концентрациях, указанных в таблице 8 выше, с использованием 1% FBS.

[3] После удаления среды к клеткам добавляли 50 мкл среды OPB, которую затем оставляли стоять при 37°C под 5% CO₂.

[4] E. coli, культивированный в течение ночи в MHB, получали в McF 1 и разводили в 300 раз 5% DMEM. Кроме того, к нему добавляли ампициллин для достижения конечной концентрации 50 мкг/мл.

[5] Полученную бактериальную культуральную среду дополнительно добавляли при 50 мкл/лунку в планшет, дополненный средой OPB, и культивировали в течение 24 часов (37°C, 5% CO₂) с герметично закрытым планшетом.

[6] После культивирования 50 мкл супернатанта переносили в каждую лунку другого 96–луночного планшета и проводили колориметрический анализ нитрата/нитрита.

[0255]

12–4 Результаты

Результаты показаны на фиг. 21.

Продукция NO снижалась с увеличением концентрации OPB, демонстрируя, что OPB проявляет действие, ингибирующее продукцию NO (IC₅₀: приблизительно 10 мкг/мл). Эти результаты свидетельствуют о том, что OPB обладает противовоспалительным действием.

Промышленная применимость

[0256]

Настоящее изобретение предоставляет композицию для облегчения и/или профилактики воспаления, которая применима при широком спектре воспалительных заболеваний. Более того, использование композиции по настоящему изобретению в качестве композиции для облегчения и/или профилактики орального мукозита, вызванного лечением рака, может предотвращать снижение качества жизни, такое как угнетение функции общения, нарушение сна, боль или дисфагия (затруднение глотания), у пациента, который получает химиотерапию и/или радиотерапию, или нарушение соответствия дозы химиотерапии и/или радиотерапии. Следовательно, настоящее изобретение имеет высокую промышленную полезность.

1. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или слизистую оболочку десны для облегчения и/или предупреждения воспаления, включающая от 0,01 до 1,5% (масс./об.) оланексидина или его фармакологически приемлемой соли, полоксамер, выбранный из полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic P-123), полиоксиэтилен (54) полиоксипропилен (39) гликоля (Pluronic P-85) и полиоксиэтилен (196) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic F-127).

2. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или в слизистую оболочку десны по п. 1, где оланексидин или его фармакологически приемлемая соль представляет собой оланексидин глюконат.

3. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или в слизистую оболочку десны по п. 1 или 2, где воспаление выбрано из стоматита, орального мукозита, гингивита и пневмонии.

4. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или слизистую оболочку десны по любому из пп. 1-3, где воспаление представляет собой оральный мукозит, вызванный лечением рака.

5. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или в слизистую оболочку десны по любому из пп. 1-4, где полоксамер представляет собой полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоль (Pluronic P-123).

6. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или в слизистую оболочку десны по любому из пп. 1-5, где концентрация оланексидин глюконата составляет 0,05-0,5% (масс./об.).

7. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или слизистую оболочку десны по любому из пп. 1-6, где концентрация полоксамера составляет 0,1-5,0% (масс./об.).

8. Жидкость для полоскания или жидкость для введения в слизистую оболочку ротовой полости или в слизистую оболочку десны по п. 4, где лечение рака представляет собой химиотерапию, лучевую терапию или сочетанную химиолучевую терапию.

9. Применение композиции, включающей от 0,01 до 1,5% (масс./об.) оланексидина или его фармакологически приемлемой соли для облегчения и/или предупреждения воспаления.

10. Применение по п. 9, где оланексидин или его фармакологически приемлемая соль представляет собой оланексидин глюконат.

11. Применение по п. 9 или 10, где композиция дополнительно включает полоксамер, который представляет собой блок-сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP.

12. Применение по любому из пп. 9-11, где воспаление выбрано из стоматита, орального мукозита, гингивита и пневмонии.

13. Применение по любому из пп. 9-12, где

воспаление представляет собой оральный мукозит, вызванный лечением рака, и

композиция включает

0,01-1,5% (масс./об.) оланексидин глюконата, и

полоксамер, который представляет собой блок-сополимер, состоящий из цепи полиоксипропилена (POP) и двух цепей полиоксиэтилена (POE), фланкирующих POP.

14. Применение по любому из пп. 11-13, где полоксамер выбран из полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic P-123), полиоксиэтилен (54) полиоксипропилен (39) гликоля (Pluronic P-85) и полиоксиэтилен (196) полиоксипропилен (67) гликоля (Pluronic F-127).

15. Применение по п. 14, где полоксамер представляет собой полиоксиэтилен (42) полиоксипропилен (67) гликоль (Pluronic P-123).

16. Применение по любому из пп. 9-15, где концентрация оланексидин глюконата составляет 0,05-0,5% (масс./об.).

17. Применение по любому из пп. 11-16, где концентрация полоксамера составляет 0,1-5,0% (масс./об.).

18. Применение по любому из пп. 9-17, где композиция в форме жидкости или жидкости для полоскания.

19. Применение по п. 13, где лечение рака представляет собой химиотерапию, лучевую терапию или сочетанную химиолучевую терапию.