Способ качественного и количественного определения антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке и молочных изделиях
Владельцы патента RU 2739074:
Общество с ограниченной ответственностью "Тестер-М" (RU)
Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ качественного и количественного определения антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке и молочных изделиях. Способ включает использование потенциостата и модифицированного диоксидом рутения рабочего электрода. Рабочий электрод обеспечивает селективное связывание с антибиотиками тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке и молочных изделиях без предварительного их выделения. При этом воспроизводимый электрохимический отклик регистрируют в течение 1÷2 с при потенциале процесса –1,05 В относительно насыщенного хлорсеребряного электрода, скорости развертки потенциала 100÷200 мВ/с, концентрации антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в диапазоне 10-8–10-4 моль/л. Изобретение обеспечивает селективное количественное детектирование антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда. 4 ил., 4 табл.
Изобретение относится к пищевой промышленности, объединяющей предприятия по выработке из молока различных молочных продуктов, и может быть использовано для селективного количественного детектирования антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке на фермерских хозяйствах, разводящих крупный рогатый скот.
Пищевые продукты могут загрязняться остатками различных лекарственных веществ, в том числе и антибиотиков, применяемых для лечения животных, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов. Некоторые лекарственные вещества достаточно долго сохраняются в продуктах животноводства и могут с этими продуктами попадать в организм человека. При этом антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, подавлять активность ферментов, изменять микрофлору организма, способствовать распространению устойчивых видов микрофлоры, вызывать дисбактериоз. Высокое содержание антибиотиков в пищевых продуктах обусловлено их широким применением в промышленном животноводстве, птицеводстве и рыболовстве. Антибиотики стимулируют отдельные биохимические процессы в организме животных, что приводит к улучшению их общего состояния, ускорению роста, повышению продуктивности, активизации защитных реакций. Поэтому их используют не только для лечения, но и стимулирования роста, откорма животных, повышения их продуктивности.
Антибиотики применяют также при консервировании овощей, фруктов, молока, рыбы, мяса, птицы, кормов для животных. Антибиотики дают животным с питьевой водой непосредственно перед убоем либо вводят путем инъекции. Это позволяет увеличить срок хранения свежего мяса на 2–3 сут и улучшить его внешний вид, запах, цвет. Эффективна также обработка мясных туш растворами антибиотиков. Добавка антибиотика увеличивает срок хранения мясного фарша, свежей рыбы. При этом рыбу опускают в раствор антибиотика (50 мг/л), либо хранят во льду с антибиотиком (5 мг/кг). Антибиотики негативно влияют на микробиологические процессы кисломолочного производства, вследствие чего возможно изготовление опасной продукции. Основной причиной этого является тот факт, что их применяют в ветеринарной практике для лечения заболеваний микробиального, в том числе вирусного происхождения. Следствие этих заболеваний – наличие в молоке больных животных токсинов, попадание которых в организм человека крайне нежелательно. Исследование динамики ферментации кисломолочных продуктов, таких как сметана, кефир, позволило выявить замедление или полное отсутствие процесса сквашивания в образцах молока, которые содержали остаточные количества антибиотиков. Молоко от одной коровы, пролеченной антибиотиками, способно сделать непригодным для переработки тонну молока. Основной документ, регламентирующий показатели безопасности пищевых продуктов и продовольственного сырья в Украине, лимитирующий содержание антибиотиков, – «Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов».
Антибиотики входят в группу ингибирующих веществ наряду с химическими ингибиторами микробиологических процессов. Развитие методов контроля ингибирующих веществ тесно связано с их применением для установления фальсификации пищевых продуктов. Методы определения содержания ингибирующих веществ разделяют на микробиологические, иммунологические, химические и физико-химические.
Для определения антибиотиков в молочной промышленности известны иммунологические и микробиологические тесты производства датской компании «Христиан Хансен»: «Beta Star®»,«Tetra Star®», «Beta Star® Combo», «Copan Test®».«Beta Star®» – экспресс-тест, основанный на анализе специфических рецепторов бета–лактамов: белков, связанных с частицами золота. Для проведения одного определения требуется 5 мин, тест чувствителен к антибиотикам группы бета–лактамов. Чувствительность определения в зависимости от вида антибиотика составляет в основном от 2 до 20 мкг/кг.
«Tetra Star®» – экспресс–тест, основанный на анализе специфического рецептора тетрациклиновой группы, имеет высокую чувствительность к антибио-тикам группы тетрациклина. Чувствительность составляет 60-80 мкг/кг. «Beta Star® Combo» – экспресс–тест, обладающий чувствительностью к антибиотикам двух групп: бета–лактамов и тетрациклинов. Чувствительность теста – от 2 до 50 мкг/кг.
Экспресс-тесты удобны и просты в применении, не требуют дополнительного оборудования или считывающего устройства, позволяют проводить анализ в полевых условиях. Тестовые полоски с результатами анализа долго сохраняются и могут быть использованы для сравнительной оценки определений достаточно длительный срок. Широкое применение в производстве нашли также микробиологические методы, основанные на непосредственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов. Содержание антибиотиков выявляют при их диффузии в агар по величине торможения роста различных тест–культур, внесенных в питательные среды. Микробиологический тест «Copan Test®» –включает споры Bacillus stearothermophilus calidolactis, с высокой чувствительностью определяет антибиотики группы бета–лактамов, тетрациклинов, аминогликозидов, макролидов и других антибиотиков. Возможность определения полного спектра антибиотиков в молоке, сравнительно невысокая стоимость, большой срок хранения и простота в использовании обеспечили тесту широкое применение на предприятиях молочной промышленности, а также в ветеринарных лабораториях, выдающих ветсвидетельства и осуществляющих государственный контроль заготавливаемого молока. Тест, включающий микроорганизмы вида Streptocoecus thermophilus предложен в для определения пенициллина, стрептомицина и тетрациклина в молоке. Минимально определяемая концентрация составляет 0,05 мкг/мл. Основными недостатками метода являются низкая избирательность, продолжительность (термостатирование образцов проводят в течение 18-24 ч) и трудоемкость определения.
Для быстрого определения в молоке беталактамных антибиотиков (пенициллина, ампициллина и др.) применяется также ферментативный колориметрический тест Penzym–100. Тест содержит энзим -карбоксилазу, которая гидролизует синтетические субстраты типа которая в то же время быстро реагирует с антибиотиками беталактамного типа с образованием окрашенного комплекса. Предел обнаружения составляет 0,008 UС/мл. С помощью биосенсора проводят определение пенициллина в молоке, основанное на образовании устойчивого комплекса между белком рецептора и антибиотиком, что приводит к ингибированию ферментативной активности белка. Предел обнаружения пенициллина G составляет 2,6 мг/кг молочного продукта. Предложена методика определения антибактериального препарата хлорамфеникола методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.
Выбраны оптимальные пары антител и антигена, меченого флуоресцеином, и определены аналитические характеристики методики. Оптимизирована экспрессная методика подготовки проб молока с использованием насыщенного раствора сульфата аммония. Общее время пробоподготовки и определения хлорамфеникола в молоке не превышает 10 мин. Пределы обнаружения в воде и молоке составили 10 нг/мл и 20 мкг/кг соответственно. Разработанная методика апробирована на модельных и реальных образцах молока.
Показано, что некоторые образцы молока содержат хлорамфеникол в концентрациях 38-41 мкг/кг, что в несколько раз превышает ПДК (10 мкг/кг). Новый вариант иммуноферментного анализа с помощью амперометрического иммуносенсора предложен для определения аминогликозидного антибиотика гентамицина. Биочувствительная часть иммуноферментного сенсора включает совместно иммобилизованные фермент холинэстеразу и антитела против гентамицина. Нижняя граница концентрации антибиотика, определяемая данным методом, составляет 1· 10–9 мг/мл, время определения 20 мин. Наибольшее количество гентамицина обнаружено в образцах молока, предназначенного для перевозки и реализации в течение достаточно длительного времени (2 мес.), например, молоко «Домик в деревне» содержит 7,5 мг/мл гентамицина, а «Милая мила» – 5,8 мг/мл. Иммунофлуоресцентный сенсор для определения гентамицина в молоке, использующий в качестве метки глюкозооксидазу описан в. Диапазон рабочих концентраций гентамицина 10-200 мкг/кг, время анализа 10 мин. Для определения остаточных количеств антибиотиков стрептомицина и дигидрострептомицина в пробах цельного молока, меде, почках и мясе свиней применен оптический иммунологический метод, основанный на ингибировании эффекта поверхностного резонанса. Пределы обнаружения в молоке, меде, почках и мясе свинины составляют 30, 15, 50 и 70 мкг/л соответственно.
Определению антибиотиков в пищевых продуктах посвящено большое число исследований, основанных на использовании сенсибилизированной люминесценции ионов Eu (III) и Tb (III). Эти работы относятся, в основном, к антибиотикам тетрациклинового и хинолонового ряда, которые наиболее широко применяются в животноводстве. Обладая высокими значениями молярных коэффициентов поглощения, органические лиганды в том числе и антибиотики, эффективно поглощают энергию возбуждения. Если при этом энергия триплетного состояния лиганда больше энергии резонансного уровня иона лантанида, то она может передаваться ему. Ион переходит в возбужденное состояние, а затем высвечивает, выделяя кванты света. Антибиотики тетрациклинового и фторхинолонового ряда образуют с ионами лантанидов комплексные соединения, в которых ионы Eu (III) и (III) обнаруживают интенсивную люминесценцию при λ=615 нм (переход 5D0 →7F2) и при λ=545 нм (переход 5D4 →7F5) соответственно. Для снижения предела обнаружения при люминесцентном определении антибиотиков в качестве аналитических форм часто используют разнолигандные комплексы, в которых в качестве второго лиганда вводятся органические основания, донорно-активные или поверхностно–активные вещества. Увеличение интенсивности люминесценции в данном случае является следствием возрастания микроупорядоченности и жесткости структуры образующихся соединений, а также вытеснения молекул воды из внутренней среды комплекса и снижения безызлучательных потерь энергии возбуждения. Так, для определения ветеринарных антибиотиков энрофлоксацина и ципрофлоксацина в мышечных тканях животных и рыб использована сенсибилизированная антибиотиками люминесценция ионов тербия в мицеллярной среде – в присутствии лаурилсульфата натрия. Интенсивность люминесценции ионов Tb (III) при этом значительно возрастает, что является результатом не только вхождением анионного ПАВ во внутреннюю сферу комплекса и вытеснения молекул воды, но и защитного действия мицелл от процессов дезактивации ионов Tb(III). Метод предполагает экстракцию антибиотиков из пробы молока в CH2Cl2, выпаривание экстракта и добавление к аликвотной части полученного водного раствора ионов Tb(III), лаурилсульфата натрия и ацетатного буферного раствора с рН 6,0. Градуировочный график линеен в интервале концентрации антибиотиков 5–50 мкг/мл. Предел обнаружения составляет 3,5 мкг/кг. В качестве второго лиганда также могут быть применены 1,10–фенантролин, триоктилфосфиноксид (ТОФО), ß–дикетоны, ЭДТА, ß–циклодекстрин, оксикарбоновые кислоты и другие лиганды. Так, методика определения окситетрациклина в молоке основана на регистрации Iлюм Eu (III) в комплексе Eu (III) – окситетрациклин – цитрат-ион. Методика разработана на модельных растворах, предусматривает предварительное отделение белковых компонентов молока. Предел обнаружения – 5 нг/мл. Для определения окситетрациклина в молоке предложена сенсибилизированная люминесценция Eu (III) в присутствии β–циклодекстрина. Предел обнаружения составляет 6,7·10–9 моль/л.
Сочетание разнолигандного комплексообразования с использованием мицеллярных сред позволяет в ряде случаев снизить пределы обнаружения антибиотиков. Применение ТОФО в качестве второго лиганда и мицеллярных сред использовано при определении хлортетрациклина по люминесценции иона Eu (III) в пищевых продуктах, биологических жидкостях человека, в том числе и грудном молоке. Пределы обнаружения хлортетрациклина составляют 2,0·10–9 моль/л и 9,8·10–9 моль/л. Использование кинетической спектрофлуориметрии и разрешенной во времени люминесценции дает возможность существенно повысить избирательность определения. Методика кинетического флуоресцентного определения антибиотиков с использованием Eu (III) – тетрациклин (ампициллин) – теноилтрифторацетон в присутствии тритона Х–100, позволяет определять ампициллин и тетрациклин в молоке с пределом обнаружения 0,04 и 0,125 мкг/мл соответственно без предварительного разделения. В некоторых исследованиях в качестве аналитического сигнала используют собственную молекулярную люминесценцию антибиотиков тетрациклинового и хинолонового ряда. В работе предложена мембрана для предварительного концентрирования и фосфориметрического определения флюмехина в молоке. Мембрана имеет кольцевую зону, закрепленную на поверхности полимембранной ленты на основе сложных полиэфиров, которая представляет собой область предварительного концентрирования. Интенсивность фосфоресценции флюмехина регистрируется непосредственно на твердой фазе при λвозб = 358 нм и λизлуч = 459 нм. Градуировочный график линеен в интервале концентраций 0,1 – 2,0 мг/л, предел обнаружения – 0,03 мг. Описано определение налидиксовой кислоты в грудном молоке с применением фосфориметрического сенсора при λвозб =332 нм, λизлуч = 412нм, градуировочный график линеен в интервале 0,06–1,5 мкг/мл, с пределом обнаружения 0,02 мкг/мл. Разработана экстракционно-флуориметрическая методика косвенного определения пятнадцати аминогликозидных антибиотиков в биологических жидкостях (кровь, молоко, моча), основанная на образовании трехкомпонентых комплексов антибиотиков с паразеодимом и флуоресцеинкомплексоном в водном растворе при рН 5,8–6,2, экстракции этих нефлуоресцирующих комплексов смесью (1:1) изоамилового спирта с бензолом, реэкстракции флуоресцеинком – плексона раствором фторида натрия и измерении интенсивности свечения красителя. Предел обнаружения от 0,01 до 10 мкг антибиотиков
Известны методики электрохимического определения антибиотиков тетрациклинового ряда (окситетрациклина, метациклина и тетрациклина) в молоке с использованием амперометрического титрования и ионометрии. При этом в качестве электродно-активного вещества мембран ионселективных электродов использованы ионные ассоциаты антибиотиков тетрациклинового ряда с гетерополианионами структуры Кеггина. В случае амперометрического определения в качестве титранта применяют 12-молибдофосфорную кислоту. Методики отличаются высокой чувствительностью, простотой и селективностью. Предложены ионселективные электроды с мембраной на основе электродно-активных соединений из аниообменников, азосоединений и фталоцианатов металлов для определения антибиотиков. Дана сравнительная оценка электрохимических и эксплуатационных характеристик датчиков. Определены пределы обнаружения для бензпенициллина – 1,0·10–5 моль/л,ампициллина – 3,1·10–5 моль/л и оксалина натриевой соли – 8,0·10–6 моль/л. Разработаны методики вольтамперометрического определения стрептомицина и азитромицина в лекарственных препаратах и стрептомицина в молоке на уровне наноконцентраций. Метод капиллярного электрофореза со спектрофотометрическим – детектированием предложен для одновременного определения спарфлоксацина, ципрофлоксацина, энрофлоксацина и флумехина в молоке. Предел обнаружения составляет 19,8, 15,2, 13,3 и 15,9 мг/кг соответственно. Методика одновременного определения оксалиниевой кислоты и флумехина методом капиллярного электрофореза с использованием диодноматричного детектора. Аналит экстрагируют дихлорметаном и гидроксидом натрия и проводят предварительное концентрирование с помощью твердофазной экстракции. Предел обнаружения составляет 15 мкг/кг и 10 мкг/кг для оксалиниевой кислоты и флумехина соответственно. Методика позволяет определять антибиотики ниже предела, установленного Европейским Союзом. Метод капиллярного электрофореза является альтернативным по пределу обнаружения методу жидкостной хроматографии при определении антибиотиков в пищевых продуктах животного происхождения.
Анализ известных из уровня техники решений показывает, что на предприятиях молочной промышленности нашли применение, в основном, иммунологические и микробиологические тесты импортного производства. Поскольку остаточные количества антибиотиков в молоке, как правило, имеют низкие значения ПДК, то методы их определения должны быть селективными, экспрессными и высокочувствительными и к тому же работать в режиме реального времени (on-line) требуют дорогостоящего лабораторного оборудования, что не позволяет потребителю в режиме «on-line» определить «чистоту» молока на наличие антибиотиков. Наиболее перспективными методами для «on-line» анализа являются электрохимические. Основным сдерживающим фактором, в настоящее время, является отсутствие подходящих каталитических систем, поскольку электрохимический отклик антибиотиков тетрациклинового ряда содержащихся в молоке на «стандартных» электродах не позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ. Таким образом, разработка новых материалов обладающих высокой электрокаталитической активностью и избирательностью при определении антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда непосредственно в молоке актуальная задача.
Таким образом, в связи с тем, что молоко и молочные продукты являются основой рациона питания россиян, поэтому систематический контроль молока по показателям безопасности чрезвычайно важен для обеспечения здоровья населения. Однако, очень часто, для профилактики, а также для лечения животных используют различные ветеринарные препараты, прежде всего антибиотики, чаще всего тетрациклинового и пенициллинового ряда. При несоблюдении требуемых мер, остатки ветеринарных препаратов могут попадать в молоко, предназначенное для употребления в пищу человеком. Контроль по содержанию опасных антибиотиков в молоке важная, социально значимая задача. В настоящее время известно много методов определения антибиотиков в молоке, однако все они требуют дорогостоящего лабораторного оборудования, что не позволяет потребителю в режиме «on-line» определить «чистоту» молока на наличие антибиотиков. Наиболее перспективными методами для «on-line» анализа являются электрохимические. Основным сдерживающим фактором, в настоящее время, является отсутствие подходящих каталитических систем, поскольку электрохимический отклик антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда содержащихся в молоке на «стандартных» электродах не позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ.
В литературе имеются единичные работы по применению вольтамперометрического метода в исследовании и анализе антибиотиков тетрациклинового ряда. Наиболее близким к заявленному изобретению является метод адсорбционной катодной инверсионной вольтамперометрии на стационарном ртутном капельном электроде [JoseptWang, Jawad S.Mahmoud. Determination of traces of streptomycin and related antibiotics by adsorptive stripping voltammetry. // AnalyticaChimicaActa. – 1986. – 186. – P.31-38]. Определение антибиотиков тетрациклинового ряда основано на его способности накапливаться на стационарном ртутном капельном электроде при потенциале –1,2 В за счет адсорбции в течение 60-300 с с последующим электрохимическим восстановлением накопленного вещества на фоне 0,01 М NaOH в дифференциальном импульсном режиме при скорости развертки потенциала 50 мВ/с. При этом на вольтамперограмме регистрировали два пика с потенциалами –1,58 и –1,70 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода (нас.х.с.). Для количественного определения использовали пик с потенциалами –1,58 В. Нижняя граница определяемых опытным путем содержаний CH=1·10-8моль/л, относительное среднеквадратичное отклонение для концентрации 4·10-8моль/л равно 5,1 %. Показана возможность определения антибиотиков тетрациклинового ряда в моче на уровне 1·10-6моль/л (и более) после разбавления мочи 0,01 М NaOH. Авторы отмечали, что для определения более низких концентраций лекарственного вещества в моче (< 1·10-6моль/л) или в других жидкостях организма, требуются разработки процедуры пробоподготовки вместо шага разбавления.
В данных условиях определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах, невозможно на уровне наномолярных концентраций. Поэтому разработка экспрессных, селективных и высокочувствительных методов определения антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в сложных смесях представляет интерес.
Задачей заявленного изобретения является снижение минимально определяемой опытным путем концентрации, повышение селективности и экспрессности определения антибиотиков тетрациклиновой и пенициллиновой групп с использованием электрохимического подхода с применением специально подобранных селективных рабочих электродов для каждого типа антибиотиков методом вольтамперометрии.
Целью создания изобретения является создание материалов для рабочего электрода способных к селективному связыванию с антибиотиками тетрациклиновой и пенициллиновой групп и тем самым их детектирования в молоке и молочных изделиях.
Технический результат заявленного изобретения заключается в селективном количественном детектировании антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке и молочных изделиях за счет получения селективного редокс-отклика от детектируемого антибиотика на рабочем электроде, состоящего из графита с нанесенным на его поверхность нанослоем диоксида рутения.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе качественного и количественного определения антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке и молочных изделиях используют потенциостат и модифицированный наноразмерный материал (диоксид рутения) рабочего электрода, который способен к селективному связыванию с антибиотиками тетрациклинового и пенициллинового ряда непосредственно в молоке или молочных изделиях, без предварительного их выделения. Воспроизводимый электрохимический отклик регистрируют в течении 1ч2 с при потенциале процесса –1,05 В (относительно насыщенного хлорсеребряного электрода) при скорости развертки потенциала 100ч200 мВ/с, при концентрации антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в диапазоне 10-8 – 10-4 моль/л.
При адсорбции детектируемые молекулы антибиотиков на поверхность рабочего электрода, взаимодействуют с ним по механизму π-π – стекинга при этом происходит формирования суперпозиции с новым набором энергетических уровней, отличной от первоначальной молекулы. Сформированные энергетические суперпозиции являются уникальными, для конкретного антибиотика, что позволяет его детектировать в условиях электрохимического воздействия.
На фиг. 1 представлены ТЕМ изображение пленки диоксида рутения, полученной методом АСО (700 циклов), на фиг. 2 – ТЕМ изображение пленки диоксида рутения, полученной методом АСО (1200 циклов), на фиг. 3 – электрохимические характеристики электродов, на фиг. 4 – калибровочные прямые полученные для детектирования антибиотиков тетрациклинового (-) и пенициллинового ряда (-). В табл. 1 показаны данные элементного состава синтезируемой пленки при температуре процесса 280 °С, полученные при использовании РЭМ, в табл. 2 – данные элементного состава синтезируемой пленки при температуре процесса 200 °С, полученные при использовании РЭМ, в табл. 3 – данные элементного состава синтезируемой пленки при температуре Ru(EtCp)2 115 °С, полученные при использовании РЭМ, в табл. 4 – данные элементного состава синтезируемой пленки при температуре Ru(EtCp)2 80 °С и температуре процесса 220 °С, полученных при использовании РЭМ.
Способ осуществляют следующим образом.
Диоксид рутения на поверхность рабочего электрода наносился с использованием метода атомно-слоевого осаждения. На сегодняшний день многие процессы атомно-слоевого осаждения для пленок диоксида рутения были широко изучены с использованием многочисленных металлорганических прекурсоров, таких как бис(циклопентадиенил) рутений, бис(этилциклопентадиенил) рутений, трис(тетраметилгептандионато) рутений, (этилциклопентадиенил) (пирролил) рутений, (метилциклопентадиенил) (пирролил) рутений, (изопропиметилбензин)(циклогексидин) рутений и кислорода в качестве реагента.
Работая с Ru(Cp)2 и кислородом, показали, что процесс кислород-рутений основан на диссоциации хемосорбированного кислорода на поверхности рутения во время импульса кислорода для того, чтобы произошло окисление лигандов прекурсора. Однако было установлено, что система кислород-рутений не может быть использована в качестве верхнего high-k электрода для диэлектриков, поскольку взаимодействие между кислород-рутений и high-k диэлектриками уязвимы еще до отжига. Более того, исследование альтернативных вышеперечисленных прекурсоров рутения для процесса АСО показало относительно длительные задержки нуклеации и низкие темпы роста. Задержки нуклеации для пленок рутения успешно решены путем замены газа кислорода на плазменный NН3, который более легко инициировал рост пленок диоксида рутения, и что способствовало получению более гладкой пленки соединения.
Прекурсор Ru(Cp)2 (Cp = C5H5) был широко использован в первоначальных исследованиях. Основным недостатком Ru(Cp)2 является то, что прекурсор является твердым веществом с точкой плавления 200°C. Данный параметр исключает использование прекурсора Ru(Cp)2 в нашей работе, так как технические параметры установки Beneq TFS 200 не предусматривают использование твердых прекурсоров и нагревание прекурсоров выше 150°C.
Другие прекурсоры являются сложнодоступными или также не подходящими по техническим характеристикам ĸ установке Beneq TFS 200.
В качестве прекурсора рутения для синтеза диоксида рутения методом атомно-слоевого осаждения на установке Beneq TFS 200 (производство Финляндия), был выбран жидкий прекурсор бис (этилциклопентадиенил)рутений (Ru (EtCp)2). Данный прекурсор имеет преимущества по сравнению с другими имеющимися в продаже прекурсорами рутения. В частности, это жидкость при комнатной температуре с высоким давлением пара 10 торр или 0.013332 бара на 120 °C. Эти свойства исключают потребность в газе-носителе при транспортировке прекурсора к реактору
Основываясь на литературных данных, скорость роста пленки RuO2 очень низкая – 0,2-1 А/цикл. Это говорит о том, что реакция проходит очень медленно и достигнуть равномерной пленки за небольшое количество циклов невозможно, даже при увеличении времени напуска прекурсоров в камеру. Первые «слои» пленки образуются очень медленно за счет небольшого количества активных центров (молекул, которые провзаимодействовали с поверхностью подложки) и поэтому происходит задержка нуклеации. Часто процесс приводит к образованию неравномерных «островковых» пленок (фиг. 1). Которые не удается полностью сгладить, даже при увеличении количества циклов (фиг. 2).
Таким образом, основной задачей является создание условий для равномерного зарождения центров роста (нуклеации). Достичь равномерного роста пленки в методе АСО возможно только при оптимизации всех параметров процесса. Для этого методически варьировались условия по напуску прекурсоров в камеру, температура процесса и прекурсора, а также количество циклов.
При увеличении температуры процесса (до 280 °С) происходит быстрая деструкция прекурсора Ru(EtCp)2 на поверхности реактора с образованием металлического рутения и смеси оксидов. При температурах ниже 220 °С скорость процесса сильно замедляется, вследствие понижения реакционной способности прекурсора. Механизм разложения прекурсора Ru(EtCp)2 сильно зависит от температуры. При температуре 220 °С вероятным продуктом разложения прекурсора является дикатион [RuCpCH2CH]2+, который является высоко-реакционноспособным и легко реагирует с атомами кислорода, что приводит к зарождению и формированию пленки RuO2.
Были подготовлены два образца при температуре процесса 280 и проведен элементный анализ на выявление присутствия элементов рутения и связанного с ним кислорода. Как видно из табл. 1 и 2, при температуре 280 и 200 °С образование пленки RuO2 не происходит
Таким образом, оптимальная температура процесса составляет 220 °С, что подтверждается наличием рутения при элементном анализе (табл. 2).
Большое значение на процесс синтеза диоксида рутения методом АСО, также имеет температура нагреваемого прекурсора. Высокая температура Ru(EtCp)2 (90-115 °С) приводит к вскипанию прекурсора, с дальнейшим разложением, не достигая реакционной камеры.
Также был проведен элементный анализ образцов, полученных при температуре горячего источника (Ru(EtCp)2) 115 °С и 80 °С (табл. 3, 4).
Таким образом, оптимальная температура подогреваемого прекурсора 80 °С, что подтверждается наличием рутения при элементном анализе (табл. 4).
ЦВА антибиотиков обеих групп на модифицированном электроде содержит одну одноэлектронную волну в катодной области при потенциалах, близких к потенциалам антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда исходных соединений в растворе в анодной области для пенициллиновой группы –1,1 В, для тетрациклиновоной –1,05 В, в катодной области –1.1 для пенициллиновой группы, и –1.1 и –1,05 В для тетрациклиновой группы (фиг. 3).
Важно отметить, что при повторном сканировании потенциала (50 циклов) для всех электродов ток в пике для антибиотиков тетрациклиновой группы не уменьшался, а для соединения пенициллиновой группы с увеличением числа циклов сканирования, значение тока в пике уменьшается. Вероятно, это связанно с тем, что та часть молекул, которая адсорбировалась на поверхности за счет кулоновской стабилизации поверхностными функциональными группами, вымывается с поверхности в раствор, что и приводит к уменьшению концентрации катализатора на поверхности электрода и, как следствие, уменьшению значения тока в пике. Постоянное значение тока в пике указывает на стабильность электродов в процессе электрохимических реакций и отсутствию процесса вымывания соединений с поверхности электрода. Следует отметить, что для создания эффективных электрокаталитических систем передача электрона из электрода в каталитические центры, расположенные на поверхности электрода, должна быть достаточно быстрой и не ограничиваться скоростью переноса электронов между окислительно-восстановительным центрами. В противном случае мы получим неэффективную каталитическую систему. Для всех иммобилизованных соединений была найдена линейная зависимость logIp vs logν с наклоном, близким к 1, что характерно для систем, в которых лимитирующий стадией является перенос электрона от поверхности электрода к катализатору, а не перенос заряда между окислительно-восстановительными центрами.
Таким образом, электрохимические данные показывают, что иммобилизованные на углеродном носителе – рабочем электроде диоксида рутения (4), могут действовать как эффективные каталитические системы, что позволяет детектировать антибиотики пенициллиновой и тетрациклиновой группы в области следующего редокс отклика:
– Антибиотики тетрациклиновой группы 0: –1.05 В,
– Антибиотики пенициллиновой группы 0: –1.1 В.
Определение корреляции концентрации антибиотиков от значения тока в диапазоне 10-3 – 10-8 моль/л.
Редокс активность антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового рядя связана с наличием в их структуре функциональных групп, способных участвовать в электрохимических процессах. Градуировку проводили для каждого типа антибиотиков готовя растворы с заданной концентрацией в диапазоне концентраций 10-3 – 10 -8 моль/л (фиг. 4) в присутствии рабочих электродов модифицированных диоксидом рутения.
Как видно из фиг. 4 в случае обоих типов антибиотиков наблюдается качественная корреляция, которую можно использовать в дальнейшей работе.
Разработка устройства для детектирования антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке.
Рабочие электроды – планарные электроды подвергшиеся модификации диоксидом рутения (RuO2), производимые методом трафаретной печати. Рабочий электрод имеет диаметр 125 мкм, состоит из углеродной графитизированной пасты и покрыт наноструктурированным катализатором – диоксидом рутения. Изготовлены электродные материалы из углеродного материала марки Vulcan имеет следующие характеристики: удельная электропроводимость от 2*102 до 5*104 см/м, соотношение sp2/sp3 1.75. Электроды после прессования имеют черный цвет и следующие габаритные характеристики длина, ширина, высота (глубина) (ГОСТ 2.321-84) 2 мм×30 мм×1 мм.
Произведено модифицирование рабочих электродов путем иммобилизации на них нанослоев диоксида рутения с заданной структурой и геометрией.
Для обеих групп антибиотиков в присутствии модифицированных электродов получены корреляции: концентрация – значение тока (отклика) в диапазоне 10-3 – 10-8 моль/л. Значение потенциала при котором проводилась регистрация каталитического отклика для антибиотиков тетрациклинового ряда –1,05 В, а для пенициллинового ряда –1,1 В.
Процесс детектирования антибиотиков осуществляется следующим образом: в емкость (ячейку) помещаем 10 мл молока, затем в нее опускаем модифицированный диоксидом рутения рабочий электрод. Затем в течение е 1ч2 с при потенциале процесса –1,05 В (относительно насыщенного хлорсеребряного электрода) при скорости развертки потенциала 100ч200 мВ/с проводи измерения и регистрируем значение тока. Далее, по калибровочной прямой определяем концентрацию антибиотиков в молоке.
По сравнению с известным решением заявленное изобретение позволяет экспрессно (1-2 сек), селективно и высокочувствительно (позволяет определять тетрациклин и пенициллин в молоке и молочных изделиях на уровне ПДК или 0,5 мг/кг), проводить качественный и количественный анализ на содержание антибиотиков тетрациклиновой и пенициллиновой групп в молоке, без предварительного их выделения. Способ может быть применен для контроля качества сырья пищевых продуктов: молока, молочных смесей, творога.
Источники информации:
1. Lewis NS, Nocera DG (2007) Powering the planet: chemical challenges in solar energy utilization. Proc Natl Acad Sci USA 103:15729–15735.
2. Turner JA (2004) Sustainable hydrogen production. Science 305:972–974.
3. Walte MG, Warren EL, McKone JR, Boettcher SW, Qixi M, Santori EA, Lewis NS (2010) Solar water splitting cells. Chem Rev 110:6446–6473.
4. Conway BE, Tilak BV (2002) Interfacial processes involving electrocatalytic evolution and oxidation of H2, and the role of chemisorbed. Electrochim Acta 47: 3571–3594.
5. Subbaraman R, Tripkovic D, Strmcnik, Chang K, Uchimura M, Paulikas AP, Stamenkovic V, Markovic NM (2010) Enhancing hydrogen evolution activity in water splitting by tailoring Li þ -Ni(OH)2-Pt interfaces. Science 334:1256–1260.
6. Goff A, Artero V, Jousselme B, Guillet, Métayé R, Fihri A, Palacin S, Fontecave M (2009) From hydrogenases to noble metal-free catalytic nanomaterials for H2 production and uptake. Science 326:1384–1387.
7. Zhuo J, Wang T, Zhang G, Liu L, Gan L, Li M (2013) Salts of C60(OH)8 electrodeposited onto a glassy carbon electrode: surprising catalytic performance in the hydrogen evolution reaction. Angew Chem Int.Ed 52:10867–10870.
8. Cook T, Dogutan DK, Reece SY, Surendranath Y, Teets TS, Nocera DG (2010) Solar energy supply and storage for the legacy and nonlegacy worlds. Chem Rev 110:6474–6502
9. Artero V, Chavarot-Kerlidou M, Fontecave M Splitting water with cobalt. Angew Chem Int.Ed 50:7238–7266.
10. DuBois MR, DuBois DL (2009) The roles of the first and second coordination spheres in the design of molecular catalysts for H2 production and oxidation. Chem Soc Rev 38:62–72.
11. Cobo S, Heidkamp J, Jacques P, Fize J, Guetaz L, Jousselme B, Ivanova V, Dau H, Palacin S, Fontecave M, Artero V (2012) A Janus cobalt-based catalytic material for electro-splitting of water. Nat Mater 11: 802–807
12. Du P, Eisenberg R (2012) Catalysts made of earth-abundant elements (Co, Ni, Fe) for water splitting: recent progress and future challenges. Energy Environ Sci 5: 6012–6021.
13. Popczun E, McKone JR, Read CG, Biacchi AJ, Wiltrout AM, Lewis NS, Schaak RE (2013) Nanostructured nickel phosphide as an electrocatalyst for the hydrogen evolution reaction. J Am Chem Soc 135:9267–9270.
14. Jaramillo, T. F. et al. (2007) Identification of active edge sites for electrochemical H2 evolution from MoS2 nanocatalysts. Science 317:100–102.
15. Kibsgaard J, Chen Z, Reinecke BN, Jaramillo (2012) TF Engineering the surface structure of MoS2 to preferentially expose active edge sites for electrocatalysis. Nat Mater 11:963–969.
16. Voiry D, Yamaguchi H, Li J, Silva R, Alves DCB, Fujita T, Mingwei M, Asefa T, Shenoy VB, Ed G, Chhowalla M (2013) Enhanced catalytic activity in strained chemically exfoliated WS2 nanosheets for hydrogen evolution. Nat Mater 12:850–855.
17. Najmaei S, Liu Z, Zhou W, Zou X, Shi G, Lei S, Yakobson BI, Idrobo J-C, Ajayan PM Lou J (2013) Vapour phase growth and grain boundary structure of molybdenum disulphide atomic layers. Nat Mater 12:754–759.
18. Laursen AB, Kegnæs S, Dahla S, Chorkendorff I (2012) Molybdenum sulfides – efficient and viable materials for electro- and photoelectrocatalytic hydrogen evolution. Energy Environ Sci 5:5577–5591
19. Merki D, Hu X (2011) Recent developments of molybdenum and tungsten sulfides as hydrogen evolution catalysts. Energy Environ Sci 4:3878–3888.
20. Gong K, Du F, Xia Z., Durstock M, Dai L (2009) Nitrogen-doped carbon nanotube arrays with high electrocatalytic activity for oxygen reduction. Science 323:760–764.
21. Mirzakulova E, Khatmullin R, Walpita J, Corrigan T, Vargas-Barbosa NM, Vyas , Oottikkal S, Manzer SF, Hadad HM, Glusac KD (2012) Electrode-assisted catalytic water oxidation by a flavin derivative. Nat Chem 4:794–801.
22. Zhao Y, Nakamura R, Kamiya K, Nakanishi S, Hashimoto K (2013) Nitrogendoped carbon nanomaterials as non-metal electrocatalysts for water oxidation. Nat Commun 4:2390-2393.
23. Voloshin YZ, Chornenka NV, Varzatskii OA. Belov AS. Grigoriev SA, ,Pushkarev AS, Kalinichenko VN, Millet P, Belaya IG, Bugaenko MG, Dedov AG (2018) Immobilization of functionalized iron(II) clathrochelates with terminal (poly)aromatic group(s) on carbonaceous materials and their detailed cyclic voltammetry study. Electrochim Acta 269:590-609.
24. P Serp, J.L. Figueiredo, Carbon Materials for Catalysis, (Hoboken. New Jersey: Wiley 2009) p. 579.
Таблица 1
| Элемент | Wt, % | At, % |
| O | 00.97 | 01.70 |
| Ta | 98.77 | 98.03 |
| Ru | 00.00 | 00.00 |
Таблица 2
| Элемент | Wt, % | At, % |
| O | 01.04 | 01.82 |
| Ta | 98.70 | 97.92 |
| Ru | 00.00 | 00.00 |
Таблица 3
| Элемент | Wt, % | At, % |
| O | 12.83 | 20.53 |
| Ta | 87.17 | 79.47 |
| Ru | 00.00 | 00.00 |
Таблица 4
| Элемент | Wt, % | At, % |
| O | 08.97 | 19.10 |
| Ta | 57.37 | 69.56 |
| Ru | 33.66 | 11.34 |
Способ качественного и количественного определения антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке и молочных изделиях с использованием потенциостата и модифицированного наноразмерным материалом диоксидом рутения рабочего электрода, который способен к селективному связыванию с антибиотиками тетрациклинового и пенициллинового ряда в молоке и молочных изделиях без предварительного их выделения, при этом воспроизводимый электрохимический отклик регистрируют в течение 1÷2 с при потенциале процесса –1,05 В относительно насыщенного хлорсеребряного электрода, скорости развертки потенциала 100÷200 мВ/с, концентрации антибиотиков тетрациклинового и пенициллинового ряда в диапазоне 10-8–10-4 моль/л.
