Терапевтический биопрепарат для лечения гепатоцеллюлярной карциномы

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгату, который специфически связывает эпитоп внеклеточного домена PLVAP, и может быть использовано в медицине. Полученный конъюгат может быть использован для создания лекарственного средства для эффективной терапии гепатоцеллюлярной карциномы (HHC) с PLVAP-положительной сосудистой системой. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр., 24 ил.

 

Родственная заявка

Данная заявка испрашивает приоритет патентной заявки США 61/904,951 поданной 15 ноября 2013 г. Полное содержание вышеупомянутой заявки включено в настоящее описание посредством ссылки.

Включение материала из текстового файла в формате ASCII посредством ссылки

Данная заявка включает посредством ссылки список последовательностей в следующем текстовом файле в формате ASCII, который подается одновременно с данным документом:

а) Название файла: SEQUENCELISTING.txt; создан 28 октября 2014 г., размер 38 кБ.

Уровень техники

Первичный рак печени является пятым по распространенности раком у мужчин и седьмым по распространенности у женщин во всем мире. В мировом масштабе он является второй основной причиной смертности от рака у мужчин и шестой основной причиной смертности от рака у женщин. Гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) составляет 85% случаев первичного рака печени. HCC является эндемичной в юго-восточной Азии и Центральной Африке. Частота заболевания в западных странах возросла в последние годы и, как ожидается, будет продолжать расти. HCC является пятой и девятой основной причиной смертности от рака у мужчин и женщин в США. Общий уровень пятилетней выживаемости при HCC составляет только 15%.

С точки зрения значительной частоты встречаемости данного заболевания и его огромного влияния на пациентов, систему поддержки пациентов и общество в целом, срочно требуется дальнейшее усовершенствование лечения пациентов с HCC промежуточной или распространенной стадии, в частности, существует потребность в агентах, которые специфично действуют на HCC опухоли и, например, уменьшают объем опухолей для лечения HCC и/или уничтожения опухолей, а также в способах их создания и применения.

Сущность изобретения

Изобретение inter alia предоставляет агенты, которые специфично действуют на клетки сосудистого эндотелия в HCC опухолях и лечат HCC, а также связанные способы применения данных агентов. В первом аспекте изобретение предоставляет конъюгаты, содержащие коагулирующий агент, конъюгированный с антителом, в котором антитело специфично связывает эпитоп внеклеточного домена белка PLVAP млекопитающих.

В некоторых вариантах осуществления изобретения коагулирующий агент является коагулирующим белком. В более частных вариантах осуществления изобретения коагулирующий агент является тканевым фактором. В еще более частных вариантах осуществления изобретения тканевой фактор содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 1; например, по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 1; например, по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 1.

В родственном аспекте изобретение предоставляет конъюгаты, содержащие тканевой фактор с аминокислотной последовательностью с по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 1, конъюгированный посредством пептидной связи с антителом, в котором антитело специфично связывает эпитоп внеклеточного домена белка PLVAP человека.

В любом из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения белок PLVAP млекопитающих может содержать аминокислотную последовательность с по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 2; более предпочтительно, по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 2; еще более предпочтительно, по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 2.

Для любого из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения антитело может специфично связывать эпитоп, выбранный из PPAGIPVAPSSG (SEQ ID NO: 25) или LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM (SEQ ID NO: 26). В более частных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело специфично связывает эпитоп PPAGIPVAPSSG (SEQ ID NO: 25).

Для конъюгатов из любого из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения в некоторых вариантах осуществления изобретения коагулирующий белок и антитело химически сшиты. В других вариантах осуществления изобретения коагулирующий белок и антитело связаны пептидной связью.

В конъюгатах по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения антитело может быть иммуноглобулином, содержащим вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В более частных вариантах осуществления изобретения коагулирующий белок и антитело связаны пептидной связью между карбоксильным концом белка, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, и аминоконцом коагулирующего белка. В других вариантах осуществления изобретения коагулирующий белок и антитело связаны пептидной связью между карбоксильным концом белка, содержащего вариабельный участок легкой цепи, и аминоконцом коагулирующего белка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в конъюгате по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения коагулирующий белок и антитело связаны пептидной связью через линкерный пептид. В более частных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид включает (Gly₄-Ser)_n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6; более предпочтительно, где n равно 3.

В определенных вариантах осуществления изобретения в конъюгате из любого из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой иммуноглобулин, содержащий:

i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR вариабельной области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, необязательно, где вариабельная легкая цель и вариабельная тяжелая цепь содержат до 1, 2, 3 или 4 консервативных аминокислотных замен в каждом CDR; или

ii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR вариабельной области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR вариабельной области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, необязательно, где вариабельная легкая цель и вариабельная тяжелая цепь содержат до 1, 2, 3 или 4 консервативных аминокислотных замен в каждом CDR.

В более частных вариантах осуществления изобретения вариабельная область легкой цепи и/или вариабельная область тяжелой цепи гуманизированы. В еще более частных вариантах осуществления изобретения вариабельная область легкой цепи и/или вариабельная область тяжелой цепи описываются следующим:

i) вариабельная область тяжелой цепи, выбранная из SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 или 11, более конкретно, где вариабельная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 11; и вариабельная область легкой цепи, выбранная из SEQ ID NO: 12, 13 или 14, более конкретно, где вариабельная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 13; или

ii) вариабельная область тяжелой цепи, выбранная из SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18 или 19, более конкретно, где вариабельная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 19; и вариабельная область легкой цепи, выбранная из SEQ ID NO: 20, 21 или 22, более конкретно, где вариабельная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 22.

В определенных вариантах осуществления изобретения любого из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения конъюгат содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере 80, 85, 90, 96, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 23.

В родственном аспекте изобретение предоставляет нуклеиновую кислоту, кодирующую конъюгат по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения. В частном варианте осуществления изобретения нуклеиновые кислоты, предоставленные изобретением, содержатся в векторе. В родственном варианте осуществления изобретения вектор может быть в клетке-хозяине, а в определенных вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин является бактерией (такой как Escherichia coli). В других вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой (например, грибком, таким как дрожжи, включая почкующиеся дрожжи; клеткой насекомых, такой как Sf0, Sf21 или клетки High Five; или клетками млекопитающих, такими как клетки CHO, VERO или COS).

В другом родственном аспекте изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие конъюгат по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения, где композиция дополнительно содержит подходящий носитель, вспомогательное вещество или контрастную среду. В более частных вариантах осуществления изобретения композиция представлена в виде лекарственной формы, подходящей для введения объекту.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы создания конъюгата по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения посредством культивирования клеток-хозяев по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения в условиях, которые поддерживают экспрессию конъюгата хозяином и выделение экспрессированного конъюгата.

В еще одном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение предоставляет способы лечения опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой, лечения гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), уменьшения объема опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой или индукции тромбоза и некроза опухоли в опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой у нуждающегося в этом субъекта, относящегося к млекопитающим. В данных способах терапевтически эффективное количество конъюгата по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления изобретения вводят (например, вводят при помощи подходящих средств) субъекту (например, человеку).

В некоторых вариантах осуществления изобретения объем HCC опухоли уменьшается после тромбоза и некроза опухоли, индуцированных конъюгатом.

В определенных вариантах осуществления изобретения конъюгат вводят интраваскулярно в опухоль, например, HCC, субъекта. В более частных вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат вводят путем инфузии напрямую в одну или несколько питающих опухоль артерий.

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает одновременное или последовательное лечение одним или более химиотерапевтическими агентами, радиотерапией, инъекцией спирта в опухоль, хирургическими способами, криотерапией, радиочастотной абляцией или комбинацией одного или более из перечисленного выше. В более частных вариантах осуществления изобретения конъюгат вводят субъекту вместе с одним или более химиотерапевтическими агентами. В еще более частных вариантах осуществления изобретения один или более химиотерапевтические агенты включают терапевтически эффективное количество сорафениба (см., например, PubChem 216239), бевацизумаба или других антиангиогенных лекарственные средств. В определенных вариантах осуществления изобретения конъюгат вводят субъекту в виде фармацевтической композиции, дополнительно содержащей один или более химиотерапевтических агентов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат вводят в дозе от приблизительно 5 до приблизительно 200 мкг/см³ опухоли, более конкретно от приблизительно 10 до приблизительно 150 мкг/см³ опухоли и еще более конкретно от приблизительно 15 до приблизительно 100 мкг/см³ опухоли.

В определенных вариантах осуществления изобретения конъюгат вводят в виде однократной дозы. В других вариантах осуществления изобретения конъюгат вводят в виде 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 доз или более. В более частных вариантах осуществления изобретения дозы вводят в течение периода 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев или более.

Краткое описание чертежей

Данный файл патента или заявки содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии данного патента или заявки на патент с цветным чертежом(-ами) будут предоставлены Офисом по запросу и после произведения оплаты.

Вышеизложенное станет очевидным из следующего более подробного описания примеров вариантов осуществления изобретения, что проиллюстрировано сопутствующими чертежами.

ФИГ. 1 является изображением геля для электрофореза, которое показывает анализ в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) очищенного слитого с GST белка тканевого фактора человека. Применяли 10% полиакриламидный гель. Три микрограмма рекомбинантного тканевого фактора человека, слитого с GST (GST-hTF), наносили на гель.

ФИГ. 2 является графиком зависимости оптической плотности при 450 нм от концентрации белка, показывающим связывание MECA32, химически конъюгированного с тканевым фактором человека (MECA32-hTF), с PLVAP человека с помощью иммуноферментного анализа. Каждую лунку плашки для анализа покрывали водорастворимым внеклеточным доменом мышиного белка PLVAP. После блокировки покрытые лунки инкубировали в присутствии возрастающих концентраций MECA32-hTF. Одну лунку инкубировали с человеческим тканевым фактором (hTF). Связывание MECA32-hTF с PLVAP определяли с помощью биотинилированного антитела к hTF производства R&D Systems Inc. (Миннеаполис, штат Миннеаполис) и конъюгатом стрептавидина с щелочной фосфатазой производства Thermo Scientific, Inc. (Рокфорд, штат Иллинойс). Результат показал, что MECA32-hTF связывался с мышиным PLVAP и содержал hTF, детектируемый антителами к hTF. Контрольный растворимый hTF без антитела (черный кружок) не мог связаться с PLVAP и не детектировался.

ФИГ. 3А и 3В являются диаграммами, показывающими конструкцию экспрессионных векторов MECA32-Fab-TF.

ФИГ. 4 является диаграммой экспрессионной конструкции CSRO2-Fab-TF.

ФИГ. 5 представляет собой изображение SDS-PAGE с рекомбинантным человеческим PLVAP и мышиным PLVAP. Рекомбинантный человеческий PLVAP (5 мкг) и мышиный PLVAP (2,5 мкг) анализировали в 12% полиакриламидном геле.

ФИГ. 6А и 6В представляют собой микрофотографии, показывающие иммуногистохимическое (IHC) окрашивание экспрессии PLVAP в клетках сосудистого эндотелия ксенотрансплантата опухоли Hep3B у мышей SCID. Моноклональное антитело MECA32 к мышиному PLVAP (10 мкг/мл) применяли для IHC окрашивания (панель В). Левая панель представляла собой срез того же блока, окрашенный нормальными крысиными иммуноглобулинами G в той же концентрации, что и в отрицательном контроле (панель А). Результат показывает, что окрашивание клеток сосудистого эндотелия в ксенотрансплантате опухоли Hep3B, как и человеческой HCC, на экспрессию PLVAP было положительным (темно-коричневые преципитаты, показанные стрелками на панели В). Таким образом, можно воздействовать на PLVAP, экспрессируемый клетками сосудистого эндотелия опухоли, для достижения терапевтических эффектов MECA32-hTF и MECA32-Fab-TF. Те же сосуды не окрашивались контрольными крысиными иммуноглобулинами G (стрелки на панели А).

ФИГ. 7 показывает изображения кровотока в опухолях, полученные с помощью сонографии, иллюстрирующие эффект моноклонального антитела (mAb) MECA32 к PLVAP, конъюгированного с рекомбинантным тканевым фактором человека (MECA32-TF), на кровоток в опухоли. Кровоток в опухоли оценивали с помощью 3D энергетической доплерографии. Энергетическую доплерографию проводили за 48 часов до и через 48 часов после лечения. Результат показывает, что кровоток был значительно снижен в группе, обработанной 20 мкг MECA32-TF (белые стрелки), но не в контрольной группе, обработанной 24 мкг mAb MECA32. Красные сигналы кровотока присутствовали внутри опухолей перед лечением.

ФИГ. 8 представляет собой линейный график зависимости объема опухоли от времени, показывающий эффект инфузии MECA32-TF на рост опухоли. Результат, показанный на данной фигуре, получен в эксперименте, описанном на ФИГ. 7. Мышей SCID, содержащих ксенотрансплантат опухоли Hep3B, обрабатывали посредством инфузии 20 мкг MECA32-TF в питающую опухоль артерию. Контрольную группу обрабатывали 24 мкг mAb MECA32. За объемами опухоли следили с помощью 3D сонографии до и после лечения в день 0. Одна из мышей в контрольной группе умерла на 20 день после первоначальной обработки из-за быстро прогрессирующего роста опухоли (†). Скорости роста в экспериментальной группе и в контрольной группе сравнивали с помощью линейной модели смешанных эффектов, и они достоверно отличались (p=0,0002). Результаты данного исследования (ФИГ. 7 и 8) показали, что антитело к PLVAP, конъюгированное с тканевым фактором, обладало способностью блокировать кровоток в опухоли и эффективно ингибировать рост опухоли. Черный кружок (•): контроль mAb MECA32 (n=3); крестик (×): группа обработанных MECA32-TF (n=3).

ФИГ. 9 предоставляет диаграммы структуры рекомбинантных конъюгатов MECA32-Fab-TF к мышиному PLVAP и CSRO2-Fab-TF к PLVAP человека. Основным различием Fab-TF к двум PLVAP является наличие гистидиновой метки (His-метка) на С-конце легкой каппа-цепи MECA32-Fab-TF. Гистидиновую метку вводили с целью очистки. CSRO2-Fab-TF не нуждается в гистидиновом маркере для очистки.

ФИГ. 10 представляет собой линейный график зависимости оптической плотности при 450 нм от концентрации конкурирующего антитела, показывающий связывание MECA32-Fab-TF с мышиным PLVAP с помощью конкурентного иммуноферментного анализа. Лунки плашки для ELISA покрывали рекомбинантным водорастворимым мышиным PLVAP (2,5 мкг/мл) на протяжении ночи. После блокировки лунок буфером, содержащим бычий сывороточный альбумин, возрастающие концентрации крысиных IgG (от 0,5 мкг/мл до 50 мкг/мл), MECA32-Fab-TF (от 0,5 мкг/мл до 50 мкг/мл) или mAb MECA32 (от 0,0 мкг/мл до 5 мкг/мл) инкубировали с 0,25 мкг/мл биотинилированного mAb MECA32. Связывание биотинилированного mAb MECA32 с PLVAP измеряли с помощью конъюгата стрептавидина с щелочной фосфатазой и хромогенного субстрата. Результаты показывают, что и mAb MECA32, и MECA32-Fab-TF могли конкурировать с биотинилированным mAb MECA32 за связывание мышиного PLVAP, но не крысиных контрольных IgG. Как и ожидалось, mAb MECA32 было приблизительно на порядок сильнее, чем MECA32-Fab-TF по связыванию с мышиным PLVAP, поскольку аффинность связывания MECA32-Fab-TF на порядок меньше, чем у mAb MECA32.

ФИГ. 11 представляет собой ряд микрофотографий, показывающих индукцию некроза опухоли в ксенотрансплантате опухоли Hep3B с помощью MECA32-Fab-TF (3, 6 и 12 мкг) и контрольных моноклональных антител MECA32 (12 мкг). После инфузии MECA32-Fab-TF или mAb MECA32 в питающую опухоль артерию через 72 часа после обработки отбирали ксенотрансплантаты опухоли и готовили гистологические срезы. Приведенные микрофотографии показывают обширный некроз опухоли (области, выделенные розовым) для всех трех различных доз MECA32-Fab-TF. Оставшиеся области живой опухолевой ткани выделены голубым. Все три опухоли в контроле были на 100% живыми, что показано в правой колонке. Площади некроза обработанных опухолей рассчитывали, взвешивая вырезанные фрагменты изображений целой опухоли и областей некроза, и выражали в процентах. Границы опухоли обведены красными и синими линиями. В каждой обработанной группе было по три мыши.

ФИГ. 12 представляет собой ряд микрофотографий, показывающих индукцию некроза опухоли в ксенотрансплантате опухоли Hep3B с помощью MECA32-Fab-TF (2,5, 5 и 10 мкг) и контрольных моноклональных антител MECA32 (10 мкг). Данное исследование было схожим с описанным на ФИГ. 11. Здесь также собирали опухоли через 72 часа после инфузии питающих опухоль артерий и готовили гистологические срезы. В каждой группе было по две мыши. Здесь результаты также показали значительный некроз опухоли после обработки всеми тремя дозами. Область некроза в каждой обработанной опухоли, выделенную розовым, определяли как процент от всего среза опухоли, как описано на ФИГ. 11. Граница опухоли обведена красными и синими линиями. Площади квадрата увеличивали (40× и 100×) и приводили справа, чтобы показать оставшиеся живые клетки опухоли (стрелки). Процент, показанный для каждой опухоли, является отношением области некроза к поперечному срезу всей опухоли.

ФИГ. 13А и 13В представляют собой ряд микрофотографий, показывающих изменения гистологии опухоли через 2, 4, 24, 48 и 72 часа после инфузии 10 мкг MECA32-Fab-TF. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. На ФИГ. 13А появление фибриновых тромбов (стрелки) в кровеносных сосудах отмечали через 2 часа после инфузии. После этого количество кровеносных сосудов, содержащих фибриновые тромбы, становилось более значительным (стрелки). Фибриновые тромбы не обнаруживали в кровеносных сосудах перед обработкой (0 часов). Опухолевая ткань становилась полностью некротизированной через 48 и 72 часа. Микрофотографии делали при 100-кратном увеличении. На ФИГ. 13В опухолевые клетки демонстрировали небольшое расхождение с увеличенным свободным пространством между клетками через 4 часа после обработки. Данное изменение становилось более выраженным через 24 часа. Полный некроз с исчезновением синего окрашивания ядра становился видимым через 48 часов после обработки и более выраженным через 72 часа. Микрофотографии делали при 200-кратном увеличении.

ФИГ. 14 представляет собой ряд фотографий кровотока в опухоли, сделанных посредством сонографии, показывающих изменения скорости кровотока в опухоли в разных временных точках после инфузии 10 мкг MECA32-Fab-TF. Кровоток в опухоли оценивали с помощью 3D энергетической доплерографии до и после лечения. В каждой временной точке было по две мыши. Мышей умерщвляли сразу после проведения 3D энергетического доплерографического исследования после обработки. Здесь показывали сонографы с высоким уровнем сигнала энергетической доплерографии (красный) от одной или двух мышей в каждой временной точке до и после обработки. Сонографы опухолей, полученные за 48 часов до обработки, показаны слева. Справа показаны данные, полученные после обработки, в которых сигнал кровотока в опухоли исчезал через 2 часа и сохранялся вплоть до 72 часов после обработки.

ФИГ. 15 представляет собой линейный график зависимости объема опухоли от времени, показывающий эффект внутриартериальной инфузии MECA32-Fab-TF на рост ксенотрансплантатов опухоли Hep3B. Мышам SCID, содержащим ксенотрансплантаты человеческой гепатоцеллюлярной карциномы Hep3B, делали однократную инфузию 10 мкг контрольных моноклональных антител (mAb) MECA32 и 5 или 10 мкг MECA32-Fab-TF в день 0. Объемы опухоли измеряли при помощи 3D сонографии на -2, 9 и 24 дни, считая от дня 0 обработки. Средние первоначальные объемы опухоли, измеренные в день -2 в контрольной группе mAb MECA32 и в двух группах, обработанных MECA32-Fab-TF (10 и 5 мкг), составляли 26,8, 29,0 и 23,1 мм³, соответственно. Объем опухоли в каждой группе выражен как среднее±SD (стандартное отклонение) в мм³. Разные скорости роста в обработанных группах и в контрольной группе сравнивали с помощью линейной модели смешанных эффектов. Значения Р составляли 0,0003 и 0,0001 для сравнений между группой обработанных 5 мкг и контрольной группой, и между группой обработанных 10 мкг и контрольной группой, соответственно.

ФИГ. 16А показывает фотографии и вес вырезанных опухолей Hep3B через 25 дней после первоначальной обработки mAb MECA32 или MECA32-Fab-TF (панель А). Средние веса опухоли в каждой обработанной группе и в контрольных группах (среднее±SEM (стандартная ошибка среднего)) показаны на ФИГ. 16В в виде столбчатой диаграммы. Вес опухолей в каждой группе обработанных MECA32-Fab-TF сравнивали с таковым в контрольной группе с помощью t-критерия Стьюдента. Значения Р составляли 0,01 и 0,03 для групп, обработанных 10 мкг и 5 мкг MECA32-Fab-TF, соответственно.

ФИГ. 17 представляет собой линейный график зависимости объема опухоли от времени, показывающий эффект системного введения MECA32-Fab-TF на рост ксенотрансплантатов опухоли Hep3B. Мышам системно вводили в хвостовую вену MECA32-Fab-TF в качестве обработки или PBS в качестве контроля. За ростом опухоли наблюдали, проводя измерения циркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях до и после обработки в день 0. Конечный объем опухолей во всех трех группах сравнивали при помощи дисперсионного анализа. Результат показал отсутствие достоверных отличий между всеми тремя группами, при р, равном 0,96. Средний объем опухолей (среднее±SEM) во всех трех группах составлял 1844±840 мм³ (контроль), 1867±602 мм³ (20 мкг MECA32-Fab-TF) и 1617±559 мм³ (10 мкг MECA32-Fab-TF).

ФИГ. 18 представляет собой ряд микрофотографий, показывающих иммуногистохимическое окрашивание срезов всех трех случаев гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) человека и соседней неопухолевой ткани печени биотинилированными CSRO2-Fab-TF. Все кровеносные сосуды на трех срезах HCC, показанные в левой колонке, положительно окрашивались (стрелки) на PLVAP с образованием преципитата коричневого цвета в клетках сосудистого эндотелия. Напротив, эндотелиальные клетки, выстилающие синусоиды печени, воротную вену и печеночные вены (ромбики), демонстрировали отрицательный результат окрашивания и отсутствие детектируемой экспрессии PLVAP.

ФИГ. 19 представляет собой аннотированную последовательность SEQ ID NO: 2, в которой подчеркнута внеклеточная область полноразмерной NP_112600.1 (hPLVAP).

ФИГ. 20 представляет собой аннотированную последовательность SEQ ID NO: 3 >KFCC-GY4_VH_домен_4, в которой подчеркнуты CDR.

ФИГ. 21 представляет собой аннотированную последовательность SEQ ID NO: 4 >KFCC-GY4_VL_домен_9, в которой подчеркнуты CDR.

ФИГ. 22 представляет собой аннотированную последовательность SEQ ID NO: 5 >KFCC-GY5_VH_домен_14, в которой подчеркнуты CDR.

ФИГ. 23 представляет собой аннотированную последовательность SEQ ID NO: 6 >KFCC-GY4_VL_домен_19, в которой подчеркнуты CDR.

ФИГ. 24 представляет собой аннотированную последовательность SEQ ID NO: 23, вставку CSR02-Fd-TF, в которой подчеркнут вариабельный домен Fd (1-114), жирным выделен СН1 домен Fd (115-216), двойным подчеркиванием выделена шарнирная область (217-225), строчными буквами выделен линкерный участок (226-239), косым шрифтом выделен внеклеточный домен тканевого фактора человека 9240-458).

Подробное описание изобретения

Ниже следует описание примеров вариантов осуществления настоящего изобретения. Определения некоторых терминов будут справедливы на протяжении всей заявки.

Конъюгаты и композиции, предоставленные настоящим изобретением

Настоящее изобретение предоставляет конъюгаты, содержащие коагулирующий агент, конъюгированный с антителом, в которых антитело специфично связывает эпитоп внеклеточного домена белка PLVAP млекопитающих. Такие конъюгаты называются «конъюгатом(-ами), предоставленным изобретением», «конъюгатом(-ами) по изобретению» и т.п., в то время как содержащие их композиции, такие как фармацевтические композиции, известны как «композиция(-и), предоставленная изобретением» и подобные. В заявке также можно применять название «конъюгат(-ы), предоставленный изобретением» для описания «конъюгата(-ов), предоставленного изобретением» и «композиции(-ий), предоставленной изобретением».

«Коагулирующий агент» способствует формированию тромба in vivo в кровеносной системе млекопитающих, т.е. при наличии функционального каскада свертывания и пути активации тромбоцитов. Пептидный «коагулирующий агент» является «коагулирующим белком». Примеры элементов каскада свертывания включают, например, тканевой фактор, фактор Хагемана (ген человека GeneID No. 2161), тромбопластический фактор плазмы (ген человека GeneID No. 2160), тромбин (ген человека GeneID No. 2147), фактор IX (ген человека GeneID No. 2158), стабильный фактор VII (ген человека GeneID No. 2155) и стабилизирующий фибрин фактор (гены человека GeneID No. 2162, 2165); см. также гены человека GeneID No. 2156, 2157 и 2159. Примеры элементов пути активации тромбоцитов включают, например, ADP, серотонин, фактор активации тромбоцитов (PAF; ген человека GeneID No.7941), фактор Виллебранда (vWF; ген человека GeneID No. 7450), тромбоцитарный фактор 4 (ген человека GeneID No. 5196) и тромбоксан А₂ (TXA₂). Коагулирующий агент может быть компонентом или продуктом каскада свертывания (т.е. компонентом внутреннего, внешнего или обычного пути) или пути активации тромбоцитов, а также гетерологичным белком, включающим коагулирующие яды, такие как конвульксин (см., например, uniprot ID O93426 и O93427 для ссылок на последовательность белка α- и β-субъединиц, соответственно) и Russellysin (см., например, uniprot Q7LZ61), при условии, что агент способствует тромбообразованию, например, при наличии функционального каскада свертывания и пути активации тромбоцитов.

В частных вариантах осуществления изобретения коагулирующий агент является коагулирующим белком. Коагулирующий белок может быть в конъюгате в виде мономера или олигомера, такого как димер или триммер; в виде полимера со структурой более высокого порядка. В более частных вариантах осуществления изобретения коагулирующий агент является тканевым фактором. «Тканевой фактор», также известный как фактор III, тромбопластин и CD142, является рецептором фактора VII, который способствует тромбообразованию. Примером тканевого фактора является ген человека GeneID No. 2152, и известны многочисленные гомологи (см. HomoloGene ID 1511), включающие белки человека NP_001984.1, мыши NP_034301.3, шимпанзе XP_001156450.1 и собаки NP_001019811.1. Человеческий белок включает мотивы, такие как пара фибронектиновых доменов типа 3 (cl00065), консервативных среди гомологов, а также пару WKS мотивов (Uniprot P13726.1) и интерферон-связывающий участок (консервативный домен CDD:204189). В частных вариантах осуществления изобретения тканевой фактор является последовательностью SEQ ID NO: 1, которая представляет собой 33-251 аминокислоты NP_001984.1, и соответствующими последовательностями, которые выявляются при выравнивании гомологичных последовательностей из других организмов, а также их функциональными вариантами, включающими замены и укороченные варианты (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 остатков или более). В некоторых вариантах осуществления изобретения тканевой фактор содержит аминокислотные последовательности с по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью c SEQ ID NO: 1; более предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью c SEQ ID NO: 1; еще более предпочтительно по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью c SEQ ID NO: 1. Также в изобретении можно применять варианты тканевого фактора с измененными уровнями активности, либо в виде мономеров, либо, в некоторых вариантах осуществления изобретения, в виде мультимеров, таких как димеры. Такие варианты включают тканевой фактор с «дефектом коагуляции», как описано в патенте США № 6,156,321, полное содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки, которые являются в 100 раз или более менее активными, чем нативный тканевой фактор, например, в отношении активации фактора VII.

«Антитело» включает как иммуноглобулины (а также их антигенсвязывающие фрагменты), так и неиммуноглобулиновые основы, которые можно адаптировать и применять подобно иммуноглобулинам - так называемые антитело-миметики. Примеры антитело-миметиков включают соединения на основе фибронектиновых доменов типа 3 (Fn3 домены; также известные как моноантитела; см., например, Koide and Koide, Methods Mol. Biol. 352: 95-109) (2007)), Z-домены белка А (также известные как аффитела; см., например, Nygren FEBS J. 275 (11): 2668-76 (2008)), гамма-В-кристаллин или убиквитин (аффины; см., например, Ebersbach, et al., J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85 (2007)), липокалины (антикалины; см., например, Skerra, FEBS J., 275 (11): 2677-83(2008)); А-домены мембранных рецепторов (авимеры; см., например, Silverman, et al. Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 (2005)); анкириновые повторы (дарпины; см., например, Stumpp et al., Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701 (2008)); SH3-домены белка Fyn (финомеры; см., например, Grabulovski et al., J Biol Chem 282 (5): 3196-3204(2007)) и домены Кунитца (пептиды домена Кунитца; см., например, Nixon and Wood CR, Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8 (2006)).

Антитела для применения в конъюгатах, представленных изобретением, специфично связывают эпитоп внеклеточного домена белка PLVAP млекопитающих. Примеры эпитопа внеклеточного домена белка PLVAP млекопитающих включают области, соответствующие (например, по оценке посредством выравнивания последовательностей, такой как BLASTp, Clustal W, COBALT и т.п., с применением параметров по умолчанию) внеклеточному домену PLVAP (приблизительно от 49 аминокислоты и далее в последовательности SEQ ID NO: 2), или более конкретно, С-концу PLVAP, такому как приблизительно от 238 аминокислоты и далее в последовательности SEQ ID NO: 24 (NP_115774.2; стандартной последовательности PLVAP мыши, например, такой как пептид, состоящий из аминокислотной последовательности из аминокислот 238-413 в SEQ ID NO: 24), или последовательностей, содержащихся от приблизительно 370 до приблизительно 442 аминокислотами в SEQ ID NO: 2 (стандартная последовательность PLVAP человека NP_112600.1), такой как аминокислоты от 378 до 404 в SEQ ID NO: 2 или аминокислоты от 431 до 442 в SEQ ID NO: 2. В частных вариантах осуществления изобретения антитела для применения в конъюгатах, представленных изобретением, специфично связывают эпитоп в аминокислотах с 378 по 404 в SEQ ID NO: 2 или аминокислотах с 431 по 442 в SEQ ID NO: 2; и/или в соответствующем гомологе любого из них у приматов, таком как соответствующие последовательности от Macaca fascicularis (XP_005588437.1) и Macaca mulatta (AFH29537.1).

В частных вариантах осуществления изобретения антитело является иммуноглобулином. «Иммуноглобулин» относится как к полноразмерным иммуноглобулинам, так и к антигенсвязывающим фрагментам иммуноглобулинов, таким как Fab, F(ab’)2, Fv, scFV, Fd, dAb и другим фрагментам иммуноглобулинов, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию. Иммуноглобулины будут обладать по меньшей мере 3 CDR в антигенсвязывающем домене, и в более частных вариантах осуществления изобретения 4, 5 или 6 CDR, а в еще более частных вариантах осуществления 6 CDR в антигенсвязывающем домене. Иммуноглобулины для применения в изобретении включают, например, антитела человека, орангутанга, мыши, крысы, козы, овцы, кролика и курицы. Иммуноглобулины могут быть поликлональными, моноклональными, моноспецифичными, полиспецифичными, неспецифичными, гуманизированными, камелизированными, одноцепочечными, химерными, синтетическими, рекомбинантными, гибридными, мутированными или CDR-привитыми. Частные случаи иммуноглобулинов для применения в настоящем изобретении включают иммуноглобулины CDR антител, продуцируемых мышиной гибридомой KFCC-GY4 (Указание на размещение патента Американской коллекции типовых культур ATCC PTA-9963) или мышиной гибридомой (Указание на размещение патента Американской коллекции типовых культур ATCC PTA-9964) или их консервативными заменами, например, в частных вариантах осуществления настоящего изобретения содержащих вплоть до примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 консервативных аминокислотных замен (более конкретно 1, 2, 3, 4, 5 или более замен) в антигенсвязывающем участке, например, вплоть до примерно 1, 2, 3 или 4 консервативных замен в каждом CDR; более конкретно вплоть до 1 или 2 консервативных замен в каждом CDR. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин включает гуманизированные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей. Антитела KFCC-GY4 и KFCC-GY5, включая аминокислотные последовательности их вариабельных доменов и CDR, описаны в публикациях патентных заявок США US 2011/0085973 (впервые описывающая моноклональные антитела, полученные в мыши) и US 2011/0262349 (описывающая конкретные химерные и гуманизированные варианты), полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. См. также SEQ ID NO: 3-22, представляющие последовательности вариабельных доменов и идентифицированных гипервариабельных участков в этих антителах.

«PLVAP», также известный как белок, ассоциированный с везикулами плазмалеммы, PV1, FELS и gp68, является белком, экспрессируемым в сосудах опухоли, таких как сосуды HCC опухоли, и описываемым человеческим геном GeneID No. 83483. Белки PLVAP были идентифицированы в разных организмах (см. HomoloGene ID 10578), таких как человек (NP_112600.1, см. также SEQ ID NO: 2), шимпанзе (XP_512490.3), мышь (NP_115774.2)и собака (XP_541953.3) и включают домен PV-1 (pfam06637). Антитела, которые специфично связывают PLVAP, такой как PLVAP млекопитающих, в некоторых вариантах осуществления изобретения связывают внеклеточный домен PLVAP, который соответствует приблизительно 49-442 или 51-442 аминокислотам в SEQ ID NO: 2. В частных вариантах осуществления изобретения PLVAP млекопитающих включает аминокислотные последовательности с по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 2 (или ее внеклеточному домену); более предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 2 (или ее внеклеточному домену); еще более предпочтительно по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с SEQ ID NO: 2 (или ее внеклеточному домену). В некоторых вариантах осуществления изобретения белок PLVAP включает замены (например, 1, 2, 3, 4, 5 оснований или более) и/или укороченные варианты (например, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 оснований или более) по сравнению с SEQ ID NO: 2 или ее внеклеточным доменом.

Линкерный пептид для применения согласно изобретению может соединять антитело и коагулирующий агент, например, коагулирующий белок, посредством пептидной связи - например, антитело (например, один из вариабельных доменов иммуноглобулина) и коагулирующий белок можно экспрессировать в виде единой полипептидной цепи. Длина линкерного пептида может варьировать от, например, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот или более, например, примерно 75, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкер включает шарнирную область, аналогичную цистеин-обогащенному и пролин-обогащенному доменам, найденным в природных иммуноглобулинах, и необязательно включающую дополнительный линкерный пептид, такой как (Gly₄-Ser)₃, для разнесения антитела (например, иммуноглобулина) и коагулирующего агента (например, коагулирующего белка).

Конъюгаты, предоставленные настоящим изобретением, могут при необходимости включать метку, такую как детектируемая метка, такая как флуоресцентная, ферментная или радиометка. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат, предоставленный изобретением, биотинилирован.

В родственном аспекте изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие конъюгаты, предоставленные изобретением, векторы, содержащие нуклеиновые кислоты и клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты и векторы. Примеры нуклеиновых кислот включают нуклеиновые кислоты, кодирующие белки с по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с конъюгатом, предоставленным изобретением, включая в частных вариантах осуществления изобретения конъюгат, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота может гибридизоваться в очень строгих гибридизационных условиях с нуклеиновой кислотой, кодирующей конъюгат, предоставленный изобретением. «Очень строгие гибридизационные условия» следующие: по меньшей мере 6× SSC и 1% SDS при 65°С с первой промывкой в течение 10 минут приблизительно при 42°С 20% (об/об) формамидом в 0,1× SSC с последующей промывкой 0,2× SSC и 0,1% SDS при 65°С. В частных вариантах осуществления изобретения в нуклеиновой кислоте, представленной изобретением, могут быть модифицированы кодоны, например, для определенных хозяйских клеток, применяемых для продукции конъюгата. Векторы, кодирующие нуклеиновую кислоту, предоставленную изобретением, могут содержать дополнительные последовательности, которые требуются, например, для экспрессии конъюгата, предоставленного изобретением (такие как регуляторные последовательности, промоторы и энхансеры), а также определенные подходящие вспомогательные последовательности, такие как одна или более точек начала репликации, один или более маркеров селекции, последовательности для интеграции (например, для интеграции в хозяйский геном посредством случайной интеграции, мобильных элементов или сайт-специфичной интеграции, например, посредством гомологичной рекомбинации, такой как с помощью специфичных нуклеаз).

В родственных аспектах изобретение предоставляет способы создания конъюгатов, представленных изобретением, например, посредством культивирования хозяйских клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, предоставленную изобретением, в условиях, которые поддерживают экспрессию конъюгата хозяином (например, в случае индуцируемого промотора при добавлении индуцирующего агента, и т.п.), а затем выделения экспрессированного конъюгата. Подходящие хозяева включают бактерии (например, Escherichia coli), а также эукариотические клетки, такие как грибки, такие как дрожжи, включая почкующиеся дрожжи; клетки насекомых, такие как Sf0, Sf21 или клетки High Five; или клетки млекопитающих, такие как клетки CHO, VERO или COS, или мезенхимальные стволовые клетки (MSC).

Конъюгаты, предоставленные изобретением, могут быть эффективно включены в состав композиций, таких как фармацевтические композиции, например, такие, в которых конъюгат, предоставленный изобретением, дополнен подходящим носителем или вспомогательным веществом. Любой подходящий фармацевтический носитель можно применять в изобретении. В частных вариантах осуществления настоящего изобретения носитель будет усиливать стабильность конъюгата, например, при лиофилизации для хранения и транспортировки, поддерживать стабильность конъюгатов, представленных изобретением, при нахождении в растворе, таком как водный раствор после разведения, в соответствии с наилучшей фармацевтической практикой. Фармацевтические композиции могут включать одно или более из следующего: буфер (такой как гистидиновый, фосфатный или сукцинатный буфер), объемообразующий агент или агент, предотвращающий слипание (такой как глицин или сорбитол, или сахар, такой как сахароза, декстроза, лактоза или фруктоза), модификатор тоничности (такой как неорганическая соль, такая как хлорид натрия, фосфат калия или фосфат натрия), консервант, увлажняющие агенты, эмульгаторы и т.п.

В частных вариантах осуществления изобретения конъюгаты, предоставленные изобретением, составляют в фармацевтическую композицию, подходящую для прямого введения в сосуды HCC опухоли, например, посредством трансваскулярного введения, такого как трансартериальное введение. В частных вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгаты, предоставленные изобретением, составляют в форме масла липидол. В других вариантах осуществления изобретения конъюгаты, предоставленные изобретением, можно составлять в виде микрочастиц со средним диаметром приблизительно от 45 мкм до 90 мкм, такой как эмболические частицы IVALON®. Инъекция в присутствии таких вспомогательных веществ может повысить доступность конъюгатов, представленных изобретением, при введении в обрабатываемые опухоли, например, посредством индукции застоя крови в кровеносных сосудах опухоли после инъекции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции, предоставленные изобретением, могут включать совместимую водорастворимую контрастную среду (для применения в радиографии, МРТ или ультразвуковом исследовании), например, для облегчения оценки распределения конъюгата, предоставленного изобретением, в обработанных опухолях с помощью флюроскопии и/или для оценки полноты экспонирования опухоли конъюгатам, предоставленным изобретением.

Фармацевтические композиции, предоставленные изобретением, могут быть получены в лекарственной форме(-ах) для распределения и введения нуждающемуся в них субъекту (согласно способам, предоставленным изобретением), включая наборы множественных лекарственных форм, которые могут содержать один или более контейнеров, наполненных одним или более ингредиентами фармацевтической композиции, являющейся предметом изобретения. При необходимости, такой контейнер(-ы) можно сопроводить уведомлением в форме, предписанной, правительственной организацией, регулирующей производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, содержащим разрешение агентства на производство, применение или продажу для введения человеку. Упаковку или набор можно снабдить информацией, касающейся способа введения, последовательности введения препарата (например, отдельно, последовательно или одновременно при применении мультиагентных наборов) или т.п. Упаковка или набор могут содержать однократную дозу для комбинированной терапии или множество единичных доз. В частности, соединение(-я) могут быть разделены, смешаны вместе в любой комбинации, могут присутствовать в одной форме, например, в ампуле или таблетке. В целях настоящего изобретения единичной дозой следует считать среднюю дозу, которая зависит от индивидуальной фармакодинамики каждого компонента и вводится в дозировке, одобренной Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств в стандартные сроки.

Конъюгаты, предоставленные изобретением, фармацевтические композиции, предоставленные изобретением, и содержащие их наборы, предоставленные изобретением, применимы в способах лечение субъекта с опухолью с PLVAP-положительной сосудистой системой, такой как HCC, а также в способах визуализации опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой.

Способы лечения

Конъюгаты и композиции, предоставленные изобретением, можно применять в способах, например, лечения опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой (таких как HCC или глиобластома), лечения гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), уменьшения объема опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой или индукции тромбоза и некроза опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой у нуждающихся в этом субъектов, относящихся к млекопитающим. Данные способы включают введение терапевтически эффективного количества конъюгатов, представленных изобретением, или композиций, представленных изобретением, субъекту.

«Субъект» относится к млекопитающим, более конкретно к людям (мужчинам или женщинам), более конкретно к пациентам с HCC, глиобластомой или любой опухолью с PLVAP-положительной сосудистой системой. В то время как субъекты могут быть на разных стадиях жизни и любого возраста, например, новорожденными, младенцами, детьми до 3 лет, детьми до 18 лет, молодыми людьми, взрослыми или пожилыми людьми; в частных вариантах осуществления настоящего изобретения субъект является взрослым, например, взрослым человеком, т.е. около 18 лет или старше, например, примерно 18-70, 20-60, 25-55, 25-50, 30-50, 25-65 лет, а также старше приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 лет. В более частных вариантах осуществления изобретения субъекту 60 лет или более, в частности, 65 лет или более. В еще более частных вариантах осуществления изобретения субъекту от приблизительно 70 до приблизительно 79 лет.

В данном контексте термины «лечить», «подвергнутый лечению» или «лечение» подразумевают такое воздействие на медицинское состояние (например, HCC или опухоли с PLVAP-положительной сосудистой системой), которое приводит к улучшению в соответствии с клинически приемлемым стандартом. Например, улучшение HCC включает уменьшение объема опухоли, уменьшение кровотока в опухоли, некроз опухоли и/или апоптоз, нормализацию функции печени и т.п.

«Терапевтически эффективное количество» является количеством, достаточным для достижения желаемого терапевтического или профилактического эффекта в условиях введения, таким как количество, достаточное для лечения HCC. Эффективность терапии может определить специалист в данной области техники, проводя стандартные измерения и применяя рутинные способы. В частных вариантах осуществления изобретения конъюгат вводят в дозе от приблизительно 5 до приблизительно 200 мкг/см³ опухоли, более конкретно от приблизительно 10 до приблизительно 150 мкг/см³ опухоли и более конкретно от приблизительно 15 до приблизительно 100 мкг/см³ опухоли. Дозировки, оказавшиеся эффективными в одном организме, например, мышей, приведенные здесь, можно преобразовать для применения в другом организме, например, человека, применяя известные методики. См., например, Reagan-Shaw et al., FASEB J. 22:659-61 (2008); Schein et al., Clin. Pharmacol. Ther. 11: 3-40 (1970); and Freireich et al., Cancer Chemother. Reports 50(4):219-244 (1966). Например, эквивалентная доза для человека (HED) в мг/кг на основе дозы для животного можно представить следующим уравнением: HED (мг/кг) = доза для животного (мг/кг)×(Km^{животного}/Km^{человека}), где Km = отношение вес/площадь поверхности (кг/м²). Примеры коэффициентов пересчета на основе приведенного выше уравнения показаны в Таблице А.

Таблица А
Из: В:	Мышь (20 г)	Крыса (150 г)	Обезьяна (3,5 кг)	Собака (8 кг)	Человек (60 кг)
Мышь	1	0,5	0,25	0,17	0,08
Крыса	2	1	0,5	0,25	0,14
Обезьяна	4	2	1	0,6	0,33
Собака	6	4	1,7	1	0,5
Человек	12	7	3	2	1

Конъюгаты, предоставленные изобретением, и композиции, предоставленные изобретением, можно предоставлять (например, вводить) субъекту с помощью любого подходящего средства, включая в частных вариантах осуществления изобретения внутрисосудистое введение в опухоль субъекта, например, прямую инфузию конъюгата в один или более питающих опухоль HCC сосудов.

Субъекты, получающие лечение способами, представленными изобретением, могут получать сопутствующую или последовательную терапию одним или более химиотерапевтическими агентами, радиотерапией, инъекцией спирта в опухоль, хирургическими способами, криотерапией, радиочастотной абляцией или комбинацией одного или более из перечисленных выше. В определенных вариантах осуществления изобретения один или более химиотерапевтических агентов включают терапевтически эффективное количество сорафениба (см., например, PubChem 216239), бевацизумаба или других антиангиогенных лекарственных средств. В комбинированных способах конъюгат, предоставленный изобретением (или композицию, предоставленную изобретением), можно вводить одновременно (в одной композиции или в отдельных композициях) или последовательно (до или после лечения).

В тех случаях, когда способ подразумевает применение композиции, представленной изобретением, которая включает контрастный агент, способы, предоставленные изобретением, могут в некоторых вариантах осуществления изобретения включать стадию визуализации опухоли (например, HCC или глиобластомы) с помощью контрастирующего агента, например посредством рентгенографии (включая компьютерную томографию), МРТ или ультразвукового исследования.

Субъектам можно вводить конъюгаты или композиции, предоставленные изобретением в виде однократной дозы или в других вариантах осуществления настоящего изобретения в виде многократных доз, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 доз или более. При введении многократных доз дозы можно вводить в течение периода в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев.

Группы с высоким риском развития HCC могут включать субъектов, которые положительны на вирус гепатита В, положительны на вирус гепатита С, с нарушением функции печени, страдают циррозом печени, имеют мутации в одном или более из TP53 (OMIM 191170), MET (OMIM 164860), CTNNB1 (OMIM 116806), CASP8 (OMIM 601763), PIK3CA (OMIM 171834), AXIN1 (OMIM 603816), PDGFRL (OMIM 604584) и APC (OMIM 611731); страдают дефицитом альфа-1-антитрипсина (OMIM 613490); гемохроматозом (OMIM 235200); тирозинемией (OMIM 276700); и комбинацией вышеупомянутого. Соответственно, в определенных вариантах осуществления изобретения способы, предоставленные изобретением, содержат стадию определения субъекта с HCC (или с подозрением на HCC), у которого есть одна или более данных мутаций, например, у субъекта идентифицируют одну из мутаций (или любую мутацию, которая ассоциирована с повышенной патогенностью HCC) перед введением конъюгата, предоставленного изобретением.

Конъюгаты, предоставленные изобретением, и композиции, предоставленные изобретением, можно вводить субъекту (такому как человек) с помощью любого подходящего способа и любого подходящего средства. Например, конъюгат или композицию можно вводить интраваскулярно в HCC субъекта, например, посредством прямой инфузии в один или более сосудов, питающих опухоль, таких как печеночная артерия или бедренная артерия, или через воротную вену печени. Конъюгаты, предоставленные изобретением, и композиции, предоставленные изобретением, можно вводить субъекту в отдельно или вместе с (в одной композиции или с помощью одновременного или последовательного введения) одним или несколькими химиотерапевтическими агентами, такими как один или более из следующих: сорафениб (см. например, PubChem 216239), бевацизумаб или другие антиангионенных лекарственные средства.

В любом из способов, представленных изобретением, конъюгат вводят в дозе от приблизительно 5 мкг/см³ опухоли до приблизительно 200 мкг/см³ опухоли, более конкретно от приблизительно 10 мкг/см³ опухоли до приблизительно 150 мкг/см³ опухоли, более конкретно от приблизительно 15 мкг/см³ опухоли до приблизительно 100 мкг/см³ опухоли. Конъюгаты, предоставленные изобретением, или композиции, предоставленные изобретением, можно вводить в виде однократной дозы или многократных доз, таких как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 доз или более. Многократные дозы можно вводить в течение периода 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев.

Примеры

Экспрессия PLVAP ограничена клетками сосудистого эндотелия HCC и не происходит в неопухолевых клетках печени. Белок PLVAP является структурным белком мембраны сосудистого эндотелия и кавеол. Нет данных о его участии в передаче сигнала. Недавно сообщалось о том, что обработка антителом к PLVAP нарушает проникновение лейкоцитов через клетки сосудистого эндотелия у мышей.

В данной патентной заявке описана разработка нового терапевтического биопрепарата для лечения HCC, используя дифференциальную экспрессию PLVAP в клетках сосудистого эндотелия HCC, но не в неопухолевых клетках печени. Для этого подхода был разработан терапевтический биопрепарат с помощью коэкспрессии белка тканевого фактора человека и антитела к PLVAP или его Fab-фрагмента. Белок тканевого фактора человека запускает свертывание крови. Инфузия такого терапевтического агента, разработанного авторами изобретения, в кровеносные сосуды HCC может привести к его связыванию с клетками сосудистого эндотелия опухоли и запустить образование кровяных сгустков во всех кровеносных сосудах HCC. Тромбоз кровеносных сосудов HCC приводит к истощению кровоснабжения опухоли и ишемическому некрозу. При применении модели ксенотрансплантата HCC у мышей SCID было показано, что инфузия в питающую опухоль артерию разработанного моноклонального антитела к PLVAP или его Fab-фрагмента с тканевым фактором человека успешно индуцировала обширный ишемический некроз ксенотрансплантатов опухоли и подавляла рост опухоли. Системное введение такого терапевтического агента через периферическую вену было неэффективным. Таким образом, для достижения терапевтического эффекта предпочтительно делать инфузию данного нового терапевтического агента в питающие опухоль артерии.

Материалы и методы

Крысиное моноклональное антитело (mAb) MECA32 к мышиному PLVAP

Гибридому MECA 32 получали из гибридомного банка Developmental Studies Hybridoma Bank при Университете штата Айова (Айова-сити, штат Айова). Клетки гибридомы культивировали в среде RPMI, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку с низким содержанием IgG, 1% GLUTA-Max (Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния), 1% антибиотиков-антимикотиков (Life Technologies) и 1% HEPES (Life Technologies). Крысиные mAb MECA 32 к мышиному PLVAP очищали из супернатаната культуры клеток гибридомы MECA32 с помощью колонки HiTrap с белком G производства GE Healthcare Life Sciences в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенное антитело диализовали в фосфатно-солевом растворе, pH 7,4. концентрацию антитела определяли по поглощению при длине волны 280 нм, применяя коэффициент экстинкции, равный 1,37 для 1 мг/мл.

Продукция водорастворимого внеклеточного домена белка тканевого фактора человека

Для продукции рекомбинантной водорастворимой внеклеточной части белка тканевого фактора человека (hTF) получали ПЦР-фрагмент внеклеточного домена кДНК тканевого фактора человека (аминокислотные остатки с 33 по 251) из полноразмерного клона кДНК тканевого фактора человека (NM001993.2) (OriGene Corp., Роквиль, штат Мэриленд). Праймеры, применяемые для ПЦР, содержали последовательности рестрикции для BamHI и SalI на 5'-концах прямого и обратного праймеров, соответственно. Амплифицированный фрагмент кДНК встраивали в плазмиду pGEX®-6P-1 (GE Heathcare Life Sciences) и метили глутатионтрансферазой (GST). Экспрессию конструкции, описанной выше, проверяли путем секвенирования ДНК и трансформации в Escherichia coli штамма SHuffle™ T7 Express (New England Biolabs, Inc. Ипсвич, штат Массачусетс) для продукции hTF. Трансформаты E. coli высаживали на селективную среду. Затем случайным образом выбирали 1-2 мм колонию и инокулировали в 4 мл 2× среду YT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, при 30°C и инкубировали на качалке с инкубатором при 230 об/мин в течение ночи. На следующий день ночную культуру инокулировали в 400 мл 2× среды YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и продолжали выращивать при 30°C на качалке с инкубатором при 230 об/мин в течение ночи. Когда поглощение при 600 нм составляло 0,6-0,8, добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 0,4 мМ для индукции синтеза белка. Продолжали встряхивание при 30°C на протяжении приблизительно 20 часов. После индукции IPTG клетки собирали центрифугированием (10000×g; 20 мин) и лизировали в 1× PBS с 0,2% Твин-80, содержащим лизоцим и нуклеазу бензоназу (Novagen) при комнатной температуре в течение 2 часов. Клеточный лизат центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин при 4°C. Супернатант собирали и фильтровали как растворимую фракцию.

Рекомбинантный тканевой фактор человека, меченный GST (GST-hTF), очищали на колонке GSTrap FF (GE Healthcare Life Sciences, Пискатавей, штат Нью-Джерси) в соответствии с инструкциями производителя. Элюированные фракции, содержащие GST-hTF, идентифицировали с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (электрофореза в SDS-PAGE), объединяли и диализовали в PBS. Концентрацию очищенного белка определяли по методу Бредфорда (Bio-Rad laboratories, Геркулес, штат Калифорния), применяя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Очищенный GST-hTF обнаруживали в виде полосы с ожидаемой молекулярной массой 50 кДа на SDS-PAGE геле (10% полиакриламид) (ФИГ. 1). Активность тканевого фактора в очищенном белке исследовали по сравнению с коммерческим тканевым фактором человека с помощью хромогенного анализа. Очищенный GST-hTF исследовали по сравнению с коммерческим hTF, активность hTF составила 3 мкг на микрограмм белка. Процедура данного исследования активности hTF подробно описана в следующем разделе.

Конъюгация рекомбинантного GST-hTF с крысиным моноклональным антителом MECA32 к мышиному PLVAP

Сначала диализовали очищенное mAb MECA32 в 0,1 М буфере MES, содержащем 0,5 M NaCl, при рН 6,0. MES представляет собой 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту. Концентрацию антитела доводили до 1 мг/мл с помощью такого же буфера MES. К 1 мл mAb MECA32 добавляли 1,2 мг EDC (гидрохлорид 1-этил-3-[3-диметиламинпропил]карбодиимида) и 3,3 мг сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид). После осторожного перемешивания для растворения добавленных реагентов смесь инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Применяли колонку для обессоливания Zeba, предварительно уравновешенную конъюгирующим фосфатно-солевым раствором для восстановления активированного mAb MECA32. Связывающий PBS состоял из 140 мМ NaCl, 10 мМ фосфата натрия и 3 мМ KCl при pH 7,4-7,5. Затем добавляли равное количество GST-hTF (0,33 мг в 0,66 мл) к активированному mAb MECA32. Смесь инкубировали на роторном смесителе в течение 3 часов при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением гидроксиламина в конечной концентрации 10 мМ. Антитело, конъюгированное с белком тканевого фактора человека, в течение продолжительного времени диализовали против 1× фосфатно-солевого буферного раствора для удаления всех малых органических соединений. Концентрацию антитела определяли по поглощению при 280 нм. Коэффициент экстинкции, равный 1,37 для 1 мг/мл, применяли для определения концентрации антитела. У антитела, конъюгированного с тканевым фактором человека, измеряли активность тканевого фактора с помощью хромогенного анализа. Исследовали связывание очищенного конъюгата TF с моноклональным антителом MECA32 (MECA32-TF) с мышиным PLVAP и наличие тканевого фактора человека на антителе, связанном с мышиным PLVAP (ФИГ. 2).

Разработка плазмидной конструкции для экспрессии Fab-фрагмента моноклонального антитела MECA32 к мышиному PLVAP с коэкспрессией hTF (MECA32-Fab-TF)

Получение плазмидной конструкции для продукции MECA32-Fab-TF проводили в четыре стадии. На первой стадии получали кДНК вариабельного домена легкой цепи mAb MECA32 (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи mAb MECA32 (VH), и определяли последовательности этих ДНК для получения праймеров для использования на второй стадии. На второй стадии получали полноразмерную кДНК легкой каппа-цепи mAb MECA32 с His-меткой на карбоксильном конце, и встраивали в плазмидный вектор pET26b. На третьей стадии получали кДНК доменов VH1 и CH1 (Fd) и шарнирной области тяжелой цепи mAb MECA32 с линкерной последовательностью на 3'-конце и кДНК hTF и линкерной последовательностью на 5-конце. Затем проводили ПЦР с перекрывающимися участками для связывания двух кДНК. Такую кДНК MECA32-Fd-шарнирная область-линкер-TF встраивали в плазмидный вектор pET26b. На четвертой стадии создавали бицистронный плазмидный вектор из плазмид, полученных на второй и третьей стадиях. Эти четыре стадии более подробно описаны ниже и кратко описаны на ФИГ. 3А и 3В.

Первая стадия: клонирование кДНК VL-домена легкой каппа-цепи (VL) mAb MECA32 и VH-домена тяжелой цепи mAb MECA32 для секвенирования нуклеотидной последовательности

кДНК, кодирующие вариабельные домены легкой цепи (VL) и тяжелой цепи (VH) mAb MECA3, получали с помощью набора реактивов FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Inc., Остин, штат Техас) в соответствии с инструкциями производителя. Кратко, общую РНК, выделенную из гибридомы MECA32, применяли в качестве матрицы для амплификации вариабельного домена легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей с помощью ПЦР с обратной транскрипцией, применяя праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям константного домена легкой каппа-цепи рядом с VL-доменом (5’ TGTCCTGATCAGTAACACTGTCC3’) (SEQ ID NO: 27) и CH1-домена тяжелой цепи рядом с VH-доменом (5’TGAGAGTGTAGAGTCCAGACTGCAGG3’) (SEQ ID NO: 28) по отдельности.

ПЦР-продукты анализировали и выделяли из 1,5% агарозного геля с помощью набора реактивов Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Миссиссауга, Онтарио, Канада). Очищенные ПЦР-фрагменты встраивали в плазмидный вектор pGEM-T-easy (Promega, Мэдисон, штат Висконсин, США) и трансформировали в Escherichia coli штамм YE707-J (Yeastern Biotech, Тайпей, Тайвань). Плазмиды, содержащие инсерции VL- и VH-доменов, получали из трансформированной E. coli и применяли для определения последовательностей ДНК VL- и VH-доменов. Последовательности затем применяли для разработки праймеров для применения на второй и третьей стадиях.

Вторая стадия: получение кДНК, состоящей из легкой каппа-цепи mAb MECA32 и His-метки, и инсерция в плазмидный вектор pET-26b

Последовательность VL-цепи из первой стадии применяли для разработки соответствующего праймера для получения последовательности полноразмерной кДНК легкой каппа-цепи антитела MECA32. Сначала получали кДНК полноразмерной легкой каппа-цепи mAb MECA32 с помощью ОТ-ПЦР из общей РНК гибридомных клеток MECA32, применяя праймеры, перечисленные ниже:

Прямой праймер: 5’GATCCTGACATCCAGATGACCCAGACTCC3’ (SEQ ID NO: 29) и

Обратный праймер: 5’CACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3’ (SEQ ID NO: 30).

Очищенный ПЦР-фрагмент с сайтами рестрикции для BamHI и SalI встраивали в плазмидный вектор pET26b с (His)₆-меткой на карбоксильном конце CK-домена; и данную плазмиду обозначали как pET26b-M32K (ФИГ. 3А).

Третья стадия: получение кДНК MECA32-Fd-шарнирная область-линкер-TF и инсерция в плазмидный вектор pET26b

Сначала получали кДНК, содержащую Fd mAb MECA32, шарнирную область и линкерную последовательность, с помощью ПЦР, применяя матрицу кДНК из гибдридомных клеток MECA32 и следующую пару праймеров:

Прямой праймер: 5’GACATCCAGATGACCCAGACTCC3’ (SEQ ID NO: 31) и

Обратный праймер для шарнирной области и линкера: 5’AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGTACATCCACAAGGATTGCATTCC3’ (SEQ ID NO: 32).

Затем получали кДНК, состоящую из линкерной последовательности (Gly₄Ser)₃ и внеклеточного домена тканевого фактора человека (а.к. 33-251) (hTF), с помощью ПЦР, применяя матрицу клонированной кДНК hTF и следующую пару праймеров:

Прямой праймер для линкера hTF: 5’GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACT GTGG3’ (SEQ ID NO: 33) и

Обратный праймер TF: 5’CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3’ (SEQ ID NO: 34).

Два ПЦР-продукта сшивали с помощью удлинения перекрывающихся фрагментов. Конечный сшитый ПЦР-продукт встраивали в вектор pET-26b. Вектор обозначали как pET26b-M32-Fd-TF (ФИГ. 3A).

Четвертая стадия: Конструкция бицистронного плазмидного вектора, содержащего MECA32 Fd-шарнирная область-(Gly₄Ser)₃ линкер-TF и легкую каппа-цепь MECA32 с His-меткой

Создавали фрагмент ДНК с помощью ПЦР, применяя в качестве матрицы pET26b-M32-Fd-TF и следующую пару праймеров:

26b-RBS-F: 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA3' (SEQ ID NO: 35) и

26b-Termination-R: 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG3' (SEQ ID NO: 36).

Данный фрагмент ДНК включал сайт связывания рибосом (rbs), VH1 и CH1 из тяжелой цепи mAb MECA32, шарнирную область, линкерная последовательность, hTF и стоп-кодон. Данный фрагмент затем вставляли в сайт рестрикции XbaI pET26b-M32K. Последовательность всей вставки проверяли секвенированием ДНК по Сэнгеру. Данную плазмидную конструкцию обозначали как pET26b MECA32-Fab-TF (ФИГ. 3B) и трансформировали в E. coli штамм SHuffle T7 Express (New England Biolabs Corp.) для экспрессии белка. Диаграмма, кратко описывающая стадии конструирования данного бицистронного плазмидного вектора для продукции MECA32-Fab-TF, показана на ФИГ. 3A и 3B.

Продукция Fab-фрагмента моноклонального антитела MECA32 к мышиному PLVAP с коэкспрессией тканевого фактора человека (MECA32-Fab-TF)

Для продукции MECA32-Fab-TF колонию (1-2 мм) свежей культуры E. coli инокулировали в 4 мл 2× среды YT, содержащей 30 мкг/мл канамицина, при 30°C, 230 об/мин в течение ночи. На следующее утро ночную культуру инокулировали в 400 мл 2× среды YT, содержащей 30 мкг/мл канамицина, и продолжали выращивать при 30°C, 250 об/мин. Когда поглощение при 600 нм достигало ~0,6-0,8, добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 0,4 мМ для индукции синтеза рекомбинантного белка. Встряхивание продолжали при 30°C на протяжении приблизительно 20 ч.

Клетки собирали центрифугированием при 10000×g в течение 20 мин при комнатной температуре и применяли для выделения телец включения. Клеточную массу суспендировали в 4 мл 10 мМ Трис/HCl, pH 7,5, содержащем 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 0,17 мг/мл PMSF и 2 мг/мл лизоцима белка куриного яйца (Sigma). Добавляли бензоназу (250 единиц; EM Science), и осторожно перемешивали суспензию при комнатной температуре в течение 1,5 часов, а затем центрифугировали при 12000×g в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мМ Трис/HCl, pH 7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА и 3% Nonidet P40 (2 мл), обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин при 50% мощности и центрифугировали при 12000 g в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в воде, обрабатывали ультразвуком в течение 20-30 секунд при 50% мощности и центрифугировали при 12000×g в течение 20 мин. Повторяли промывку водой, и конечный осадок, сильно обогащенный тельцами включения, суспендировали в буфере, содержащем 6 М хлорида гуанидиния, 0,5 М NaCl, 20 мМ фосфата и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 8, осторожно перемешивая при комнатной температуре в течение ночи. Раствор держали при комнатной температуре в течение ночи, затем разводили до концентрации белка около 1 мг/мл в 6М мочевине/50 мМ Трис/HCl, pH 8 и диализовали при 4°C в течение ночи против 10-20 объемов того же буфера. Затем диализный буфер меняли на буфер, содержащий 2 М мочевину, 50 мМ Трис/HCl, 300 мМ NaCl, 2,5 мМ GSH, 0,5 мМ GSSG, pH 8 (буфер для фолдинга). После диализа в течение 2 дней буфер заменяли свежим буфером для фолдинга и продолжали диализовать на протяжении еще 2 дней. Затем диализный буфер заменяли буфером, состоящим из 1 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 300 мМ NaCl pH8, и продолжали диализовать в течение еще одного дня. Диализ проводили в том же буфере с последовательно понижающейся концентрацией мочевины с 0,8 М мочевины в течение 6 часов, 0,56 М мочевины в течение ночи и 0,28 М мочевины в течение 6 часов. В конце диализ проводили в буфере для фолдинга без мочевины на протяжении ночи. Рефолдированный супернатнат наносили на никелево-нитрилтрехуксуснокислую колонку (Ni-NTA; GE Healthcare) и элюировали 500 мМ имидазолом в 50 мМ фосфате натрия и 0,3 М NaCl при pH 7,0. Рекомбинантный MECA32-Fab-TF затем очищали с помощью колоночной гель-фильтрационной препаративной хроматографии HiLoad 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare). Элюаты, содержащие целевой MECA32-Fab-TF, анализировали электрофорезом в SDS-PAGE и объединяли. MECA32-Fab-TF характеризовали с помощью ELISA, чтобы подтвердить связывание с мышиным PLVAP. Специфичную активность тканевого фактора MECA32-Fab-TF измеряли с помощью хромогенного анализа TF.

Разработка плазмидной конструкции для экспрессии рекомбинантного Fab-фрагмента моноклонального антитела CSRO2 к PLVAP человека с коэкспрессией водорастворимого тканевого фактора человека (CSRO2-Fab-TF)

Также продуцировали рекомбинантный белок CSRO2-Fab-TF к PLVAP человека, схожий с MECA32-Fab-TF. Данный белок разрабатывали на основе mAb CSRO2 к PLVAP человека. Структура данного рекомбинантного белка была по существу схожа с MECA32-Fab-TF, описанным выше, за исключением разных доменов антитела и отсутствия His-метки на карбоксильном конце легкой каппа-цепи. His-метка была удалена, поскольку his-метка не требовалась для очистки CSRO2-Fab-TF. CSRO2-Fab-TF очищали с помощью аффинной колоночной хроматографии человеческой легкой каппа-цепи KappaSelect (GE Healthcare Life Sciences, Пискатавей, штат Нью-Джерси). mAb CSRO2 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело к PLVAP человека.

Процедура, применяемая для получения плазмидной конструкции для продукции CSRO2-Fab-TF, была схожа с получением плазмидной конструкции для MECA32-Fab-TF с некоторыми модификациями. Первая стадия, описанная ранее для клонирования кДНК с получением последовательностей ДНК 5'-концов тяжелой цепи и легкой цепи антитела, была пропущена, поскольку последовательности кДНК для тяжелой цепи и легкой цепи mAb CSRO2 уже были известны. Таким образом, требовались только три стадии для получения экспрессионной конструкции CSRO2-Fab-TF. Эти три стадии описаны ниже.

Первая стадия: инсерция кДНК легкой цепи CSRO2 в плазмидный вектор pET26b

Общую РНК из клеточной линии NS0, продуцирующей mAb CSR02, обратно транскрибировали с получением кДНК, используя олиго-dT в качестве праймера. кДНК легкой каппа-цепи CSR02 получали с помощью ПЦР, применяя олиго-dT-праймированную кДНК в качестве матрицы и пару праймеров, показанных ниже:

CSR02-VK3F-26b F Nde I прямой праймер: 5'TATGGATGTTGTGATGACCCAATCTCCA3' (SEQ ID NO: 37)

Kappa-R-26b-Not I обратный праймер: 5'GGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTG3' (SEQ ID NO: 38).

Очищенный фрагмент ДНК легкой цепи mAb CSRO2, полученный в ПЦР, затем вставляли в сайты Nde I и Not I плазмидного вектора pET26b с получением pET26b-cVK3.

Вторая стадия: конструкция плазмидного вектора pET26b с инсерцией кДНК для экспрессии слитого полипептида, состоящего из VH1, CH1 и шарнирной области mAb CSRO2 с линкерной последовательностью (Gly₄Ser)₃ и внеклеточным доменом тканевого фактора человека (а.к. 33-251) (hTF)

Плазмиду конструировали посредством ПЦР с применением кДНК, полученной из клеточной линии NS0, и клонированной кДКН тканевого фактора человека в качестве матриц. Следующие пары праймеров применяли для ПЦР:

I) Пара праймеров для VH1-CH1-шарнирной области тяжелой цепи mAb CSRO2 и линкерной последовательности:

VH5-pro26b-NdeI-F прямой праймер: 5'TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG3' (SEQ ID NO: 39) и

Обратный праймер для шарнирной области и линкера (Hinge linker R): 5'AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGCATGATGGGCATGGGGGACC3' (SEQ ID NO: 40).

II) Пара праймеров для линкерной последовательности-hTF- плюс сайт рестрикции для инсерции: hTF линкер F: 5'GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG3' (SEQ ID NO: 41)

hTF R-Not I: 5'GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG3' (SEQ ID NO: 42).

ПЦР-фрагменты, полученные в двух реакциях ПЦР, описанных выше, затем сшивали и амплифицировали, удлиняя перекрывающиеся фрагменты. Сшитую кДНК встраивали в плазмидный вектор pET26b, который обозначали как pET26b-VH5-Fd-TF.

Третья стадия: конструкция бицистронного плазмидного вектора, содержащего кДНК и mAb CSRO2 Fd-петля-(Gly4Ser)3 линкер-TF, и легкой каппа-цепи mAb CSRO2

С помощью ПЦР создавали фрагмент ДНК, применяя pET-26b-VH5-Fd-TF в качестве матрицы и следующую пару праймеров:

26b-RBS-F: 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA3' (SEQ ID NO: 43) и

26b-Termination-R: 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG3' (SEQ ID NO: 44).

Амплифицированный фрагмент ДНК включал сайт связывания рибосом (rbs); VH1, CH1 и шарнирную область тяжелой цепи CSRO2, линкерную последовательность, растворимый тканевой фактор человека и стоп-кодон. Данный фрагмент ДНК вставляли в сайт Xba I вектора pET26b-cVK3 с получением нового бицистронного плазмидного вектора, обозначенного как pET26b CSR02-Fab-TF (ФИГ. 4). Данную плазмиду применяли для экспрессии как легкой каппа-цепи, так и слитой тяжелой цепи под контролем одного промотора. Последовательность всей вставки проверяли с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру.

Продукция рекомбинантного Fab-фрагмента моноклонального антитела CSRO2 к PLVAP человека с коэкспрессией водорастворимого тканевого фактора человека (CSRO2-Fab-TF)

Экспрессия рекомбинантного белка CSR02-Fab-TF. Трансформацию Escherichia coli Shuffle T7 Express (New England Biolabs) проводили посредством инкубации компетентных клеток с плазмидной ДНК pET-26b CSR02-Fab-TF на льду в течение 5 мин, нагревания в течения ровно 30 секунд на водяной бане при 42°C и затем помещали на лед на 2 минуты. Перед высеванием на селективную среду трансформанты инкубировали при 30°C на шейкере при 250 об/мин в среде SOC (0,5% дрожжевой экстракт; 2% триптон; 10 мМ NaCl; 2,5 мМ KCl; 10 мМ MgCl₂; 10 мМ MgSO₄; 20 mM глюкоза) в течение 60 мин. Экспрессию CSR02-Fab-TF индуцировали 0,05 М изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом в течение 16 часов при 30°C или 37°C. После индукции бактериальные клетки лизировали в 1× PBS с 0,2% Твин-80 в присутствии лизоцима и нуклеазы бентоназы при комнатной температуре в течение 2 часов. Лизат клеток собирали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут при 4°C. Супернатант собирали и фильтровали для выделения растворимой фракции.

Очистка CSR02-Fab-TF с помощью колоночной хроматографии KappaSelect и Capto AdhereMmultimodal. Колонку KappaSelect (1 мл) уравновешивали фосфатно-солевым буферным раствором, pH 7,4 (0,01 M фосфатного буфера, 0,0027 М KCl, 0,14 М NaCl). Лизат клеток E. coli, содержащий CSR02-Fab-TF, наносили при скорости потока 1 мл/мин. После нанесения образцов колонку промывали буфером для уравновешивания до снижения оптической плотности при 280 нм до исходного уровня. Остальные связавшиеся белки элюировали 0,1 М глициновым буфером, pH 2,7, содержащим 0,25 М сахарозу. Уровень рН в элюате доводили до физиологического уровня, добавляя 50 мкл 1 М Трис-основного буфера, pH 9,0 на 1 мл элюата.

CSRO2-Fab-TF, элюированный с колонки KappaSelect, затем очищали на колонке Capto Adhere (5 мл), предварительно уравновешенной буфером 20 мМ Трис, pH 7,5. Образец CSR02-Fab-TF, элюированный с колонки KappaSelect, разводили в 50 раз буфером 20 мМ Трис, pH 7,5 и затем наносили на колонку Capto Adhere при скорости потока 1 мл/мин. После нанесения образца колонку промывали буфером для уравновешивания до снижения оптической плотности при 280 нм до исходного уровня. Связанный белок CSRO2-Fab-TF затем элюировали буфером 20 мМ Трис, pH 7,5, содержащим 200 мМ NaCl.

Продукция растворимых рекомбинантных человеческих и мышиных белков PLVAP (hPLVAP и mPLVAP)

Продукция hPLVAP. Плазмиду pGEM®-T Easy-hPLVAP_51-442 создавали, вставляя ПЦР-фрагмент, представляющий укороченный PLVAP (аминокислотные остатки с 51 по 442, включающие внеклеточный домен мышиного PLVAP) в вектор pGEM^®-T Easy (Promega). Данный ПЦР-фрагмент создавали из клона кДНК PLVAP человека (NM_031310) (OriGene, Роквиль, штат Мэриленд) с помощью ПЦР, применяя следующую пару праймеров: 5’-CATATGAACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3’ (SEQ ID NO: 45) и 5’-GGATCCTGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3’ (SEQ ID NO: 46).

Для создания плазмиды pET-15b-hPLVAP_51-442 для получения рекомбинантного белка PLVAP фрагмент кДНК, кодирующий аминокислотные остатки с 51 по 442 PLVAP, с сайтами распознавания NdeI/Bam HI (последовательности в рамке) на концах, вырезали из pGEM^®-T Easy-hPLVAP_51-442 и вставляли в pET-15b (Novagen). Экспрессионную конструкцию, описанную выше, проверяли секвенированием ДНК и трансформировали в Escherichia coli (Rosetta-gami2(DE3)pLysS) (EMD Millipore Corp.).

Слитые белки hPLVAP, меченные His-меткой, продуцировали и очищали, как описано ниже. Колонию (1-2 мм) трансформированных E. coli из свежей культуры инокулировали в 4 мл среды TB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 34 мкг/мл хлорамфеникола, 12,5 мкг/мл тетрациклина, при 37°C, 230 об/мин в течение ночи. Ночную культуру инокулировали в 400 мл среды TB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 34 мкг/мл хлорамфеникола, 12,5 мкг/мл тетрациклина, и продолжали выращивать при 37°C, 250 об/мин. Когда поглощение при 600 нм достигало 0,6-0,8, добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 1,66 мМ для индукции синтеза белка. Встряхивание продолжали при 30°C в течение приблизительно 20 ч. клетки собирали центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут при 4°C. Осадок клеток ресуспендировали в 12 мл буфера для уравновешивания (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl, pH 7, 10 мМ имидазола) с добавлением 8 М мочевины и хранили при -20°C на протяжении по меньшей мере 2 часов. Размороженный образец обрабатывали ультразвуком в течение 10 секунд с 30 секундной паузой между обработками для снижения вязкости до получения прозрачного раствора. Суспензию клеток затем центрифугировали при 10000-12000×g в течение 20 мин при 4°C для осаждения любого нерастворимого материала. Супернатант из предыдущей стадии наносили на колонку TALON Resin (Clontech), уравновешенную буфером для уравновешивания и промывки с добавлением 8 М мочевины, объем которого был равен 10 объемам колонки. После промывки колонки 10-20 объемами 1× буфера для уравновешивания и промывки, рекомбинантный белок PLVAP человека, меченный полигистидином, элюировали 5 объемами колонки буфером для элюирования (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl, pH 7, 500 мМ имидазола), содержащим 6 М мочевину. Очищенный рекомбинантный белок в элюате диализовали против 1× буфера для уравновешивания и промывки, содержащего 3 М мочевину, при 4°C на протяжении по меньшей мере 4 часов, затем буфер заменяли 1× буфером для уравновешивания и промывки, содержащим 1М мочевину, и диализовали при 4°C на протяжении по меньшей мере 4 часов. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда (Bio-Rad, Геркулес, штат Калифорния). Затем белок разрезали 1 единицей биотинилированного тромбина (Novagen) на каждый мг рекомбинантного белка PLVAP при 23°C на протяжении 16 часов для удаления полигистидиновой метки. Биотинилированный тромбин удаляли из инкубации посредством твердофазной стрептавидин-агарозы. Полученный в результате рекомбинантный водорастворимый PLVAP человека (hPLVAP) диализовали против 1× буфера для уравновешивания и промывки (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl, pH 7) без мочевины. Определяли концентрацию белка и анализировали чистоту белка с помощью электрофореза в SDS-PAGE (ФИГ. 5).

Продукция mPLVAP (мышиного PLVAP). Плазмиду pGEM-T Easy-mPLVAP_48-438 создавали, вставляя ПЦР-фрагмент, представляющий укороченный PLVAP (аминокислотные остатки с 48 по 438, включающие внеклеточный домен мышиного PLVAP), в вектор pGEM^®-T Easy (Promega Corp.). Данный ПЦР-фрагмент получали из клона кДНК мышиного PLVAP (Invitrogen, Life Technologies Corp.) с помощью ПЦР и следующей пары праймеров:

mPLVAP CDS NdeI F: 5’CATATGTATGGCAATGTGCACGCCACC3’ (SEQ ID NO: 47) и

mPLVAP Stop Xho I R: 5’CTCGAGATCCACAGGTGGGCGATTCTGGC3’ (SEQ ID NO: 48).

Затем фрагмент кДНК, кодирующий аминокислотные остатки с 48 по 437 PLVAP, содержащий последовательности распознавания NdeI и XhoI на каждом конце, вырезали из pGEM®-T Easy-mPLVAP_48-438 и встраивали в pET-15b (Novagen-EMD Millipore, Дармштат, Германия) для экспрессии белка. После проверки путем секвенирования ДНК данную экспрессионную конструкцию трансформировали в Escherichia coli (Rosetta-gami2(DE3)pLysS). Экспрессию слитого His-меченного белка mPLVAP в Escherichia coli Rosetta-gami2(DE3)pLysS индуцировали 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом в течение 16 часов при 30°C. После индукции бактериальные клетки лизировали посредством обработки ультразвуком в буфере для уравновешивания (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl, pH 7) с добавлением 8 М мочевины и разделяли на растворимую и нерастворимую фракции с помощью центрифугирования при 15652×g в течение 30 минут при 4°C. Для очистки белка His-PLVAP_48-438 растворимую фракцию наносили на металл-аффинную смолу TALON® (Clontech, Пало Алто, штат Калифорния) и элюировали буфером для элюирования (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl, pH 7, 500 мМ имидазола). Полученный в результате мышиный белок PLVAP_48-438 в элюате диализовали против PBS. Анализ очищенного His-mPLVAP с помощью электрофореза в SDS-PAGE показан на ФИГ. 5.

Исследования связывания CSRO2-Fab-TF и MECA32-Fab-TF с соответствующими человеческим и мышиным PLVAP с помощью ELISA

Чтобы убедиться, что рекомбинантные белки анти-PLVAP-Fab-TF могут связываться с человеческим или мышиным белком PLVAP, разработали и применили ELISA. Сначала каждую лунку плашки для ELISA покрывали 50 мкг 2,5 мкг/мл человеческого или мышиного рекомбинантного белка PLVAP в PBS с азидом (0,02%) в течение ночи при 4°C. Затем проводили исследование при комнатной температуре. После трех промывок каждой лунки 150 мкл буфера для промывки (PBS, содержащий Твин-20) блокировали каждую лунку 150 мкл блокирующего буфера (PBS, содержащий 2% BSA и 0,05% Твин-20) в течение 30 минут. После трех промывок в каждую лунку в разных концентрациях в двух повторах добавляли 50 мкл CSRO2-Fab-TF к PLVAP человека или MECA32-Fab-TF к мышиному PLVAP. Все лунки инкубировали в течение 45 минут и трижды промывали. Затем промытую лунку инкубировали с 50 мкл биотинилированных антител к человеческому TF (R&D Systems Corp.) в разведении 1:500 блокирующим буфером в течение 45 минут. После трех промывок каждую лунку инкубировали с разведенным в 5000 раз конъюгатом стрептавидина с щелочной фосфатазой. Затем каждую лунку инкубировали с 100 мкл субстрата щелочной фосфатазы в течение 60 минут и измеряли поглощение в каждой лунке при 405 нм с помощью микропланшетного ридера.

Этот анализ также модифицировали в анализ конкурентного связывания. Для анализа конкурентного связывания возрастающие концентрации антител к PLVAP или Fab-TF инкубировали с оптимальным количеством биотинилированного моноклонального антитела к PLVAP для конкуренции за связывание с PLVAP. После инкубации и промывки проводили оценку количества биотинилированного антитела, связанного с PLVAP, с помощью конъюгата стрептавидина с щелочной фосфатазой и хромогенного субстрата.

Хромогенный анализ активности тканевого фактора человека

Активность тканевого фактора рекомбинантных mAb CSRO2-Fab-TF, MECA32-Fab-TF и MECA32, связанных с человеческим TF, измеряли с помощью хромогенного анализа. Данный анализ основан на связывании TF с фактором VIIa и на способности комплекса TF/FVIIa активировать фактор X (FX). Активность TF количественно оценивали косвенно по количеству продуцируемого FXa. Количество продуцируемого FXa измеряли кинетически в соответствии с высвобождением паранитроамилина (pNA) из FXa-специфичного хромогенного пептидного субстрата как повышение поглощения при 405 нм. Активность TF определяли по сравнению с коммерческим стандартом водорастворимого рекомбинантного TF (R&D systems Corp.). Хромогенный анализ активности TF был основан на процедуре, описанной Philipp et al.. See Philipp J, Dienst A, Unruh Maike, et al. “Soluble tissue factor induces coagulation on tumor endothelial cells in vivo if coadministered with low-dose lipopolysaccharides” Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 23:905-910 (2003).

Модель HCC ксенотрансплантата Hep3B в мышах SCID

Hep3B представляет собой клеточную линию HCC человека. Для демонстрации терапевтической эффективности анти-PLVAP Fab-TF разработали модель ксенотрансплантата HEP3B у мышей BALB/c C.B-17 SCID. HCC ксенотрансплантат Hep3B получали посредством подкожной инъекции 4 миллионов клеток Hep3B во внутреннюю верхнюю поверхность правого бедра самцов мышей C.B-17 SCID в возрасте 5 недель под общей анестезией ингаляцией изофлураном. Клетки суспендировали в 60 мкл ледяного 75% BD Mtrigel^TM (BD Bioscience Corp.), растворенного в модифицированной по способу Дульбеко среде Игла (DMEM) (Life Technologies Corp.) без сыворотки. Инъекцию делали с помощью инсулинового шприца 29 калибра.

Клетки Hep3 B, применяемые для инъекции, культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, 1% GLUTA-MAX, 1% антибиотиков-антимикотиков и 1% HEPES. Все реактивы закупали в Life Technologies. Клетки для инъекции собирали при достижении 80% конфлуентности. Клетки снимали с культурального флакона, используя раствор трипсина-ЭДТА от Life Technologies в соответствии с инструкциями производителя, и один раз промывали опухолевые клетки средой DMEM перед суспендированием в ледяном 75% BD Mtrigel^TM для инъекции. После инъекции проводили регулярные наблюдения за мышами на предмет роста опухолевого трансплантата. Обычно требовалось от пяти до шести недель для подготовки опухоли к исследованию.

Инфузия анти-PLVAP Fab-TF в питающую опухоль артерию

Для лечения опухолевого ксенотрансплантата Hep3B с помощью анти-PLVAP MECA32-Fab-TF мыши, несущей опухолевый ксенотрансплантат Hep3B, делали анестезию ингаляцией изофлураном с помощью прибора для анестезии MATRX^TM. Мышь укладывали в положение на спине под диссекционный микроскоп. Шерсть с паховой области справа удаляли при помощи средства для удаления волос Nair (Church & Dwight Co.) за день до инфузии. После протирания кожи 75% спиртом делали 0,5 см надрез на паховой поверхности справа выше опухоли. Рану углубляли, чтобы открыть правую бедренную артерию и вену. Затем делали петлю из правой бедренной артерии при помощи нейлоновой нити 6-0. Артерию осторожно вытягивали в проксимальном направлении. Артериотомию проводили микроножницами дистальнее от месте вытягивания, и вводили тонкую иглу 33 калибра с дистальной стороны. Медленно делали инфузию антителами MECA32-Fab-TF или контрольными антителами при скорости около 40 мкл в минуту. Инъекцию проводили при тщательном контроле отсутствия протечки. После инфузии иглу удаляли. Место артериотомии заклеивали Histoacryl (TissueSeal, Энн Арбор, штат Мичиган). Нейлоновую нить для вытягивания удаляли. После подтверждения нормальности гемостаза закрывали надрез непрерывным швом.

3D сонография и энергетическая доплерография объема опухоли и кровотока

Систему высокого разрешения Vevo 2100 High-Resolution Imaging System (Visual Sonics, Inc., Торонто, Канада) применяли для получения 3D изображений опухоли в соответствии с инструкциями производителя. Определяли три перпендикулярных размера опухоли, делая следующие измерения. Сначала измеряли два перпендикулярных размера наибольшего поперечного среза вдоль осей X и Y. Затем определяли наибольший размер по оси Z, перпендикулярной X и Y, применяя программное обеспечение, предоставленное поставщиком. Объем опухоли определяли по следующей формуле для эллипсоида: Объем=π/6×длина×ширина×высота. Изображения кровотока в опухоли получали при помощи 3D энергетической доплерографии в соответствии с инструкциями для системы высокого разрешения Vevo 2100 High-Resolution Imaging System.

Измерение аффинности связывания MECA32-Fab-TF и CSRO2-Fab-TF

Исследование для определения аффинности связывания анти-PLVAP-Fab-TF и целевого PLVAP было основано на хромогенном исследовании активности тканевого фактора, как описано в предыдущем разделе. Кратко, каждую лунку плашки для ELISA покрывали 2,5 мкг/мл водорастворимого рекомбинантного человеческого или мышиного PLVAP в течение ночи. После промывок и блокировки, как описано для ELISA для исследования связывания CSRO2-Fab-TF и MECA32-Fab-TF с PLVAP, лунки, покрытые человеческим или мышиным белком PLVAP, инкубировали с 50 мкл возрастающих концентраций CSRO2-Fab-TF или MECA32-Fab-TF, равных 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг/мл, в двух повторах. После инкубации в течение 3 часов при комнатной температуре лунки промывали, и исследовали количество активности TF, связанной с лунками, при помощи стандартной кривой TF, как описано в предыдущем разделе для хромогенного исследования активности TF. Общая концентрация CSRO2-Fab-TF или MECA32-Fab-TF, добавленных в каждую лунку, была известна, а концентрацию связанных CSRO2-Fab-TF или MECA32-Fab-TF в каждой лунке можно было рассчитать по результатам исследования. Эти значения затем анализировали с помощью распределения Скэтчарда для определения аффинности связывания CSRO2-Fab-TF или MECA32-Fab-TF. См., например, Scatchard G. “The attractions of proteins for small molecules and ions” Ann NY Acad Sci. 51:660-672(1949).

Иммуногистохимическое (IHC) окрашивание PLVAP в ксенотрансплантате опухоли HEP3B, используя моноклональные антитела MECA32 к PLVAP

Для исследования экспрессии PLVAP в мышином ксенотрансплантате Hep3B срезы парафиновых блоков фиксированной в формалине ткани подвергали иммуногистохимическому окрашиванию моноклональными антителами к PLVAP. После депарафинизации и регидратирования срезов ткани после рутинных процедур стекла со срезами ткани в штативе помещали в стакан и погружали в раствор Target Retrieval Solution (Dako, Inc. Карпинтерия, штат Калифорния). Стакан помещали в автоклав и нагревали при 121°C в течение 10 минут. После остывания стекла переносили в дистиллированную воду. Срез на каждом стекле затем обрабатывали 200-400 мкл пероксида водорода из набора реактивов Ventana iView DAB Detection kit (Ventana Medical Systems, Inc.) для инактивации эндогенной пероксидазы. После споласкивания стекол а Трис-забуференном растворе (TBS) (Dako) срезы инкубировали с 5 мкг моноклональных антител MECA32 к PLVAP, разведенных в TBS, содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (TBS-BSA), при 37°C в течение 60 минут. После промывания посредством трехкратного погружения в буфер TBS на 5 минут срезы инкубировали с биотинилированным вторичным антителом (например, биотинилированным овечьим антителом к крысиным IgG для mAb MECA32) в разведении, рекомендованном поставщиком, при комнатной температуре в течение 15 минут. Срезы на стеклах промывали, как описано выше. Срезы на стеклах инкубировали со свежеприготовленным субстратом DAB в наборе реактивов в течение 30 минут. Затем стекла несколько раз споласкивали дистиллированной водой. После высушивания срезов на воздухе срезы покрывали средой Permount и покровными стеклами.

Результаты

Экспрессия PLVAP в HCC и HEP3B ксенотрансплантате

Предыдущее исследование показало, что PLVAP дифференциально экспрессируется на поверхности клеток сосудистого эндотелия HCC и не экспрессируется на клетках сосудистого эндотелия неопухолевых тканей печени. Дифференциальная экспрессия PLVAP предоставила возможность направленного воздействия на HCC в терапевтических целях. Был создан новый подход, состоящий в применении моноклонального антитела к PLVAP или его Fab-фрагмента в качестве носителей коэкспрессируемого белка тканевого фактора, запускающего свертывание крови, для лечения HCC. Ожидалось, что инфузия такого терапевтического агента в питающую опухоль артерию приведет к связыванию данного терапевтического антитела или его Fab-фрагмента с клетками сосудистого эндотелия HCC, запустит образование кровяного сгустка в кровеносных сосудах опухоли и приведет к ишемическому некрозу опухоли.

Чтобы продемонстрировать возможность осуществления данного подхода разработали модель ксенотрансплантата HCC в мышах SCID, применяя клеточную линию HCC HEP3B. Затем определили, экспрессируют ли эндотелиальные клетки, растущие в опухолевом ксенотрансплантате HEP3B, мышиный PLVAP, с помощью иммуногистохимического (IHC) окрашивания mAb MECA32 к мышиному PLVAP. Как показано на ФИГ. 6B, клетки сосудистого эндотелия опухолевого ксенотрансплантата HEP3B в мышах SCID действительно экспрессировали PLVAP, подобно человеческой HCC. Следовательно, ксенотрансплантат HEP3B можно было применять в исследовании для демонстрации противоопухолевого эффекта mAb к PLVAP или его Fab-фрагмента, конъюгированных с тканевым фактором человека.

Действие mAb MECA32, конъюгированного с растворимым TF человека на ксенотрансплантат HEP3 B

Сначала обрабатывали SCID мышей, несущих опухоли ксенотрансплантата HEP3B, mAb MECA32, химически конъюгированными с рекомбинантным водорастворимым тканевым фактором человека (MECA32-TF). Применяли TF человека, поскольку TF человека эффективно запускает свертывание крови как у человека, так и у мыши, и его кДНК была коммерчески доступной. Каждую мышь с опухолью обрабатывали посредством инфузии 24 мкг MECA32-TF (группа обработанных животных) или 20 мкг mAb MECA32 (контрольная группа) в 100 мкл фосфатно-солевого буфера в питающую опухоль правую бедренную артерию в диссекционном микроскопе. Немного меньшее количество mAb MECA32 (мкг) применяли, чтобы компенсировать больший молекулярный вес MECA32-TF. 3D энергетическую доплерографию применяли для оценки кровотока за 48 часов до и после лечения. Результаты показали значительное снижение кровотока внутри опухоли после обработки MECA32-TF в группе обработанных животных, но не в контрольной группе (ФИГ. 7). Последующее наблюдение за ростом опухоли показало значительное подавление роста опухоли в группе обработанных MECA32-TF, но не в контрольной группе (ФИГ. 8). Результаты данного исследования подтверждают, что моноклональное антитело к PLVAP, конъюгированное с TF человека, было эффективным для лечения HCC ксенотрансплантатов.

Разработка и характеристика MECA32-Fab-TF

При химической конъюгации TF с mAb MECA32 было сложно последовательно и воспроизводимо контролировать число и места сшивок молекул белка TF с mAb MECA32. MECA32-TF, полученный путем химического сшивания, не был гомогенным продуктом. Высокий молекулярный вес конъюгата MECA32-TF (около 170 кДа) также обусловливает продолжительное время полувыведения из кровотока и повышенную вероятность возникновения нежелательных побочных эффектов.

Для получения гомогенного терапевтического биопрепарата с хорошо определенной структурой и более коротким периодом полувыведения для ограничения нецелевых побочных эффектов был разработан рекомбинантный белок, состоящий из Fab-части mAb к PLVAP и внеклеточного домена тканевого фактора человека, связанного с карбоксильным концом тяжелой цепи константного домена 1. Затем продуцироали рекомбинантный белок MECA32-Fab-TF к мышиному PLVAP (MECA32-Fab-TF). Диаграмма, описывающая структуру данного рекомбинантного белка, показана на ФИГ. 9.

Очищенный MECA32-Fab-TF применяли для конкуренции с биотинилированным mAb MECA32 за связывание с мышиным PLVAP. Эти результаты показывают, что MECA32-Fab-TF действительно сохраняет способность связывать PLVAP (ФИГ. 10). Анализ Скэтчарда шести разных партий MECA-32-Fab-TF также показал высокую аффинность связывания с мышиным PLVAP с Kd 5,7±1,4×10^-8 М. TF, связанный с карбоксильным концом MECA32 Fd, также был функциональным и мог взаимодействовать с фактором VIIa для активации фактора X. Измеренная активность тканевого фактора составляла 90±22 мкг (n=6) на каждый миллиграмм MECA32-Fab-TF.

Действие MECA32-Fab-TF на опухолевый трансплантат HEP3B у мышей SCID

Для демонстрации терапевтической эффективности рекомбинантного MECA32-Fab-TF сначала проводили два исследования влияния величины дозы. В обоих исследованиях делали инфузию MECA32-Fab-TF в питающую опухоль бедренную артерию. Через 72 часа после обработки обработанных мышей умерщвляли и собирали опухоли для гистологического анализа. Для первого исследования применяли три разные дозы MECA32-Fab-TF (3 мкг, 6 мкг и 12 мкг) для лечения мышей с опухолью, а контрольную группу обрабатывали 12 мкг моноклонального антитела MECA32 без тканевого фактора. Для каждой дозы было по три мыши. Для второго исследования применяемые дозы MECA32-Fab-TF были следующими: 2,5 мкг, 5 мкг и 10 мкг. Для каждой дозы было по две мыши. Результаты этих двух исследований обобщены на ФИГ. 11 и 12. Результаты этих исследований показали, что в опухолях у мышей, обработанных MECA32-Fab-TF, развивался обширный ишемический некроз при всех дозах. Однако доза в 10 мкг или выше давала более надежные результаты. Отсутствие или минимальный некроз опухоли наблюдали в контрольных группах. Результаты этих исследований показали, что анти-PLVAP-Fab-TF обладал довольно выраженной активностью и мог индуцировать значительный ишемический некроз опухоли в такой низкой концентрации как 2,5 мкг на мышь в течение 72 часов.

Действие анти-mPLVAP MECA32-Fab-TF на гистологию опухолевых ксенотрансплантатов в разные временные точки после инфузии

Описанные выше исследования указывали на то, что в опухоли развивается явный ишемический некроз через 72 часа после обработки. Чтобы узнать, как был индуцирован некроз после обработки анти-mPLVAP Fab с коэкспрессией TF, делали инфузию MECA32-Fab-TF в питающую опухоль артерию и отбирали опухоли HEP3B через 2 часа, 4 часа, 24 часа, 48 часов и 72 часа после инфузии 10 мкг MECA32-Fab-TF. В каждой временной точке было по две мыши с опухолью. Также в день эксперимента умерщвляли двух необработанных мышей в качестве контролей исходного уровня в 0 часов.

Как показано на ФИГ. 13A, результаты выявили, что фибриновые тромбы можно обнаружить в кровеносных сосудах опухоли через 2 часа после обработки. Количество кровеносных сосудов, содержащих фибриновые тромбы, становилось более выраженным через 4 часа и 24 часа после обработки. Клетки опухоли начинали отделяться друг от друга с увеличением свободного пространства через 4 часа, и это изменение становилось более выраженным через 24 часа (ФИГ. 13B). Явный ишемический некроз с исчезновением окрашивания ядра наблюдался через 48 часов после обработки и становился более выраженным через 72 часа (ФИГ. 13A и 13B). Фибриновые тромбы не наблюдали в кровеносных сосудах опухоли перед обработкой (0 часов) (ФИГ. 13A). Исследование с помощью энергетической доплерографии также выявило прекращение кровотока в основных кровеносных сосудах опухоли через 2 часа после инфузии и на протяжении 72 часов (ФИГ. 14). Эти результаты подтверждают, что анти-PLVAP-Fab-TF действительно мог связываться с PLVAP из клеток сосудистого эндотелия, индуцировать образование кровяного сгустка в сосудах опухоли, создавать препятствие для кровотока и вызывать некроз опухоли.

Действие анти-PLVAP MECA32-Fab-TF на рост опухолевых ксенотрансплантатов HEP3B

Затем исследовали терапевтический эффект обработки анти-PLVAP Fab-TF на рост опухоли. Проводили два разных исследования. Первое исследование проводили для наблюдения за ростом опухоли в течение 25 дней после обработки. Исследование завершали через 25 дней после обработки, поскольку большой объем опухолей в контрольной группе вынуждал остановить исследование. За размером опухоли следили при помощи 3D-сонографии. Результаты, кратко представленные на ФИГ. 15, 16A и 16B, показали, что однократная инфузия 5 мкг или 10 мкг MECA32-Fab-TF эффективно подавляла рост опухоли, но такого эффекта не оказывала инфузия 10 мкг контрольного антитела MECA32 без TF.

Во втором исследовании мышей SCID, несущих опухолевые ксенотрансплантаты HEP3B, обрабатывали посредством интраартериальной инфузии 10 мкг MECA32-Fab-TF (n=4) или 10 мкг моноклонального антитела MECA32 (n=2). За ростом опухоли следили с помощью 3D сонографии. Когда опухоли HEP3B вырастали до приблизительно 2000 кубических миллиметров, мышей с опухолью умерщвляли. Это исследование позволяло оценить задержку роста опухоли в группе обработанных животных. Результаты, кратко приведенные на ФИГ. 17, показывали существование значительной отсрочки роста опухоли после однократной инфузии 10 мкг MECA32-Fab-TF в питающую опухоль артерию. Потребовалось еще 42 дня, чтобы опухоль в группе обработанных животных выросла до 1600 мм³ по сравнению с контрольными мышами. Среднее время роста опухоли до 1600 мм³ в контрольной и в обработанной группе составляло 9,8±3,0 дней и 51,8±3,2 дней, соответственно (ФИГ. 17).

Таким образом, результаты этих двух разных исследований дополнительно подтвердили, что инфузия анти-PLVAP-Fab-TF в питающую опухоль артерию эффективно индуцировала некроз опухоли и контролировала рост опухоли.

Эффект системного введения анти-PLVAP-Fab-TF на рост опухоли

Чтобы выяснить, имеет ли системное введение MECA32-Fab-TF через периферическую вену такой же терапевтический эффект или нет, инъецировали 10 мкг или 20 мкг MECA32-Fab-TF в хвостовую вену мыши SCID, несущей опухолевый ксенотрансплантат HEP3B, и наблюдали за ростом опухоли после инъекции. Контрольным мышам делали инъекцию фосфатно-солевого буферного раствора. В каждой обработанной группе было по три мыши. Результаты, обобщенные на ФИГ. 17, показали, отсутствие значительного эффекта на объем опухоли при введении MECA32-Fab-TF через хвостовую вену. Таким образом, инфузия анти-PLVAP MECA32-Fab-TF в питающую опухоль артерию была необходима для индукции некроза опухоли и достижения терапевтического эффекта. Возможно, системное введение MECA32-Fab-TF приводило к разведению инъецированных MECA32-Fab-TF и связыванию MECA32-Fab-TF с PLVAP на клетках сосудистого эндотелия других органов (например, легких, почек или органов желудочно-кишечного тракта) перед попаданием в кровеносные сосуды опухоли.

Разработка и характеристика Fab-TF к PLVAP человека

Чтобы выяснить, можно ли разработать такой же терапевтический агент против PLVAP человека, применяли гуманизированное моноклональное антитело к PLVAP человека к антигенному эпитопу, находящемуся в аминокислотной последовательности PPAGIPVAPSS на карбоксильном конце PLVAP. Это гуманизированное моноклональное антитело к PLVAP человека было разработано ранее и описано в патентной заявке США No. US20110262349 A1. Этот конъюгат анти-человеческого PLVAP-Fab-TF обозначили как CSRO2-Fab-TF (ФИГ. 9). Затем проводили серию исследований для сравнения CSRO2-Fab-TF с MECA32-Fab-TF на предмет специфической активности тканевого фактора и аффинности связывания с целевым PLVAP. Результаты исследований показали, что CSRO2-Fab-TF к PLVAP человека проявлял большую активность TF на каждый миллиграмм анти-PLVAP Fab-TF по сравнению с MECA32-Fab-TF к мышиному PLVAP, и у обоих CSRO2-Fab-TF и MECA32-Fab-TF была схожая аффинность связывания (Таблица 1). Обнаруженные данные указывали на то, что CSRO2-Fab-TF, подобно MECA32-Fab-TF, мог связываться со своими целевыми PLVAP с достаточной аффинностью и обладал достаточной активностью TF для запуска свертывания крови для достижения терапевтического эффекта.

Таблица 1 Сравнение специфичной активности тканевого фактора (TF) на каждый миллиграмм анти-PLVAP Fab-TF и аффинности связывания с PLVAP у CSRO2-Fab-TF к человеческому PLVAP и MECA32-Fab-TF к мышиному PLVAP
	№ партии	Специфичная активность тканевого фактора (мкг/мг)	Kd (M)
Среднее±SD	Среднее±SD
CSR02-Fab-TF	3	156±16	3,07±1,25×10-8

MECA32-Fab-TF

6

90±22

5,72±1,40×10-8

Как обобщено в Таблице 1, исследовали три разные партии CSRO2-Fab-TF и шесть разных партий MECA32-Fab-TF. Результаты указывали на то, что оба Fab-TF обладали схожей аффинностью связывания. Тем не менее, CSRO2-Fab-TF обладал большей специфичной активностью TF, чем MECA32-Fab-TF. Результаты показывают, что CSRO2-Fab-TF обладает достаточной аффинностью связывания и специфичной активностью тканевого фактора для достижения терапевтического эффекта, подобно MECA32-Fab-TF для лечения гепатоцеллюлярной карциномы.

На основании оценки среднего объема опухоли во время обработки и доз MECA32-Fab-TF, которые требовались для эффективной индукции некроза опухоли в модели ксенотрансплантата Hep3B, выявили, что эффективная терапевтическая доза анти-PLVAP-Fab-TF для лечения HCC посредством инфузии в питающую опухоль артерию находится в пределах от 15 мкг до 100 мкг на каждый миллиметр (кубический сантиметр) опухоли.

Чтобы дальше показать, что разработанный CSRO2-Fab-TF может связываться с клетками сосудистого эндотелия человеческой HCC, биотинилировали CSRO2-Fab-TF и применяли этот Fab-TF для исследования связывания с клетками сосудистого эндотелия человеческой HCC. Результаты исследований показали, что биотинилированный CSRO2-Fab-TF действительно связывался с клетками сосудистого эндотелия HCC и не связывался с клетками сосудистого эндотелия неопухолевых тканей печени (ФИГ. 18). Результаты данного исследования подтвердили, что CSRO2-Fab-TF подобно MECA32-Fab-TF можно применять для лечения HCC у пациентов посредством инфузии в питающую опухоль артерию(-и).

На основании сведений о том, что PLVAP дифференциально экспрессируется в кровеносных сосудах HCC, но не в неопухолевых тканях печени, разработали новый терапевтический агент для лечения HCC посредством коэкспрессии белка тканевого фактора человека с моноклональным антителом к PLVAP или его Fab-фрагментом. Показали, что как целое антитело, так и его Fab-фрагмент, несущие растворимый внеклеточный домен тканевого фактора человека, действительно могли индуцировать некроз опухоли и подавляли рост опухоли после однократной инфузии в питающую опухоль артерию.

Поскольку химическая конъюгация растворимого тканевого фактора с антителом к PLVAP не позволяла воспроизводимо контролировать количество тканевого фактора, сшитого с каждым антителом по тем же сайтам, был создан рекомбинантный Fab-фрагмент моноклонального антитела к PLVAP, на карбоксильном конце Fd-цепи которого коэкспрессировался внеклеточный домен тканевого фактора человека, и применяли данный рекомбинантный белок в качестве терапевтического агента для лечения HCC. Чтобы показать, что такой терапевтический агент действительно можно применять для лечения HCC, сначала создали мышей SCID, несущих опухоль, происходящую из клеточной линии человеческой гепатоцеллюлярной карциномы HEP3B, и применяли их для исследования с целью подтверждения правильности концепции. Затем разработали версию мышей анти-PLVAP-Fab-TF, применяя гибридому MECA32 к мышиному PLVAP. Было необходимо разработать версию мышей анти-PLVAP-Fab-TF, поскольку кровеносные сосуды, растущие в ксенотрансплантате человеческой HCC, были мышиного происхождения и экспрессировали мышиный PLVAP. Экспрессировали человеческий тканевой фактор и в человеческой, и в мышиной версиях мышей анти-PLVAP Fab-TF, поскольку человеческий тканевой фактор может активировать мышиный фактор свертывания VII и индуцировать свертывание крови у мышей. Сравнительное исследование CSRO2-Fab-TF и MECA32-Fab-TF подтвердило, что они оба могут связывать свои целевые PLVAP с достаточной аффинностью и нести достаточное количество активности тканевого фактора для запуска свертывания крови и достижения терапевтического эффекта.

Результаты исследований показали, что рекомбинантный анти-PLVAP-Fab-TF, разработанный авторами изобретения, оказывал терапевтический эффект при лечении HCC посредством запуска образования кровяного сгустка в кровеносных сосудах опухоли, блокирования кровотока в опухоли и индукции некроза после инфузии данного нового терапевтического агента напрямую в питающую опухоль артерию, но не при системном внутривенном введении через периферическую вену. Исследования, описанные в данной заявке, также подтверждают, что моноклональное антитело к человеческому PLVAP или его Fab-фрагмент с коэкспрессией белка тканевого фактора можно было применять для лечения опухолей, демонстрирующих экспрессию PLVAP, ограничиваемую кровеносными сосудами опухоли, такой как глиобластома.

Следует понимать, что для всех численных интервалов, описывающих какой-либо параметр в данной заявке, таких как «приблизительно», «по меньшей мере», «менее чем» и «более чем», описание также обязательно включает любой интервал, ограниченный перечисленными значениями. В соответствии с этим, например, описание по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 также описывает, среди прочего, интервалы 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-3, 2-4, 2-5, 3-4, 3-5 и 4-5 и т.п.

Следует понимать, что все патенты, заявки или другие ссылки, процитированные здесь, такие как непатентная литература и ссылки на информацию о последовательностях, включены в настоящее изобретение в полном объеме посредством ссылки для всех целей, а также для процитированного утверждения. В случае конфликта между документом, включенным посредством ссылки, и настоящей заявкой, настоящая заявка будет приоритетнее. Вся информация, связанная со ссылкой на последовательности генов, раскрытых в данной заявке, такие как идентификационные номера генов (GeneID) или учетные номера (обычно ссылающиеся на учетные номера в базе национального центра биотехнологической информации (NCBI)), включающие, например, геномные локусы, геномные последовательности, функциональные аннотации, аллельные варианты и стандартные мРНК (включая, например, границы экзонов или чувствительные элементы) и белковые последовательности (такие как структуры консервативных доменов, входные данные для базы Homologene и т.п.), а также химические ссылки (например, входные данные для Pub Chem compound, Pub Chem substance или Pub Chem Bioassay, включая их аннотации, такие как структуры и исследовании и т.п.), включены в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

Заголовки, применяемые в данной заявке, приведены только для удобства и не влияют на интерпретацию данной заявки.

Предпочтительные свойства каждого из аспектов, представленных настоящим изобретением, применимы ко всем другим аспектам изобретения с необходимыми изменениями и без ограничений проиллюстрированы примерами зависимых пунктов формулы изобретения, а также включают комбинации и сочетания индивидуальных свойств (например, элементов, включая числовые интервалы и примеры вариантов осуществления настоящего изобретения) из определенных вариантов осуществления изобретения и аспектов изобретения, включая рабочие примеры. Например, определенные экспериментальные параметры, показанные в рабочих примерах, можно адаптировать для применения в заявленном изобретении по частям, не отклоняясь от изобретения. Например, для раскрытых материалов, в то время как конкретные ссылки на каждую отдельную и коллективную комбинацию и сочетание данных компонентов могут быть не раскрыты в явном виде, каждый материал специально рассматривается и описывается здесь. Таким образом, если раскрыт класс элементов A, B и C, а также класс элементов D, E и F и раскрыт пример комбинации элементов A-D, то даже если каждая комбинация в отдельности не была описана, каждая комбинация подразумевается в индивидуальном или коллективном виде. Таким образом, в данном примере каждая из комбинаций A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E и C-F специально подразумевается и должна считаться раскрытой из раскрытия A, B и C; D, E и F; и примера комбинации A-D. Аналогично подгруппа или комбинация из них также специально подразумевается и раскрывается. Таким образом, например, подгруппы A-E, B-F и C-E специально подразумеваются и должны считаться раскрытыми из раскрытия A, B и C; D, E и F; и примера комбинации A-D. Данная концепция применима ко всем аспектам данной заявки, включая элементы композиции, являющейся предметом изобретения, и стадии способа создания или применения композиций.

Вышеупомянутые аспекты изобретения, насколько известно среднему специалисту в данной области техники в соответствии с содержанием настоящего описания, могут быть заявлены в любой комбинации или сочетании в тех случаях, когда они являются новыми и неочевидными по сравнению с предыдущим уровнем техники, в случаях, когда элемент описывается одной или несколькими ссылками, известными среднему специалисту в данной области техники, их можно исключить из заявленного изобретения посредством inter alia отрицательной оговорки или заявления об отказе от свойств или комбинации свойств.

Несмотря на то что настоящее изобретение было подробно описано со ссылками на его примерные варианты осуществления, квалифицированными специалистам в данной области будет понятно, что могут быть внесены различные изменения формы и деталей, не выходящие за рамки объема изобретения, охваченного приложенной формулой изобретения.

--->

Список последовательностей

<110> Kao, Kuo-Jang

Wang, Yun-Hsin

<120> Терапевтический биопрепарат для лечения гепатоцеллюлярной

карциномы

<130> 4261.1003-001

<150> US 61/904,951

<151> 2013-11-15

<160> 48

<170> FastSEQ для Windows версия 4.0

<210> 1

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser

1 5 10 15

Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

20 25 30

Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

35 40 45

Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

50 55 60

Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala

65 70 75 80

Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

85 90 95

Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

100 105 110

Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

115 120 125

Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg

130 135 140

Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser

145 150 155 160

Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

165 170 175

Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

180 185 190

Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

195 200 205

Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu

210 215

<210> 2

<211> 442

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Gly Leu Ala Met Glu His Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ser Arg Gly Cys Trp Tyr Tyr Leu Arg Tyr Phe Phe Leu Phe Val

20 25 30

Ser Leu Ile Gln Phe Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Phe Met Val

35 40 45

Tyr Gly Asn Val His Val Ser Thr Glu Ser Asn Leu Gln Ala Thr Glu

50 55 60

Arg Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Ser Gln Leu Leu Gly Leu Thr Ala Ser

65 70 75 80

Gln Ser Asn Leu Thr Lys Glu Leu Asn Phe Thr Thr Arg Ala Lys Asp

85 90 95

Ala Ile Met Gln Met Trp Leu Asn Ala Arg Arg Asp Leu Asp Arg Ile

100 105 110

Asn Ala Ser Phe Arg Gln Cys Gln Gly Asp Arg Val Ile Tyr Thr Asn

115 120 125

Asn Gln Arg Tyr Met Ala Ala Ile Ile Leu Ser Glu Lys Gln Cys Arg

130 135 140

Asp Gln Phe Lys Asp Met Asn Lys Ser Cys Asp Ala Leu Leu Phe Met

145 150 155 160

Leu Asn Gln Lys Val Lys Thr Leu Glu Val Glu Ile Ala Lys Glu Lys

165 170 175

Thr Ile Cys Thr Lys Asp Lys Glu Ser Val Leu Leu Asn Lys Arg Val

180 185 190

Ala Glu Glu Gln Leu Val Glu Cys Val Lys Thr Arg Glu Leu Gln His

195 200 205

Gln Glu Arg Gln Leu Ala Lys Glu Gln Leu Gln Lys Val Gln Ala Leu

210 215 220

Cys Leu Pro Leu Asp Lys Asp Lys Phe Glu Met Asp Leu Arg Asn Leu

225 230 235 240

Trp Arg Asp Ser Ile Ile Pro Arg Ser Leu Asp Asn Leu Gly Tyr Asn

245 250 255

Leu Tyr His Pro Leu Gly Ser Glu Leu Ala Ser Ile Arg Arg Ala Cys

260 265 270

Asp His Met Pro Ser Leu Met Ser Ser Lys Val Glu Glu Leu Ala Arg

275 280 285

Ser Leu Arg Ala Asp Ile Glu Arg Val Ala Arg Glu Asn Ser Asp Leu

290 295 300

Gln Arg Gln Lys Leu Glu Ala Gln Gln Gly Leu Arg Ala Ser Gln Glu

305 310 315 320

Ala Lys Gln Lys Val Glu Lys Glu Ala Gln Ala Arg Glu Ala Lys Leu

325 330 335

Gln Ala Glu Cys Ser Arg Gln Thr Gln Leu Ala Leu Glu Glu Lys Ala

340 345 350

Val Leu Arg Lys Glu Arg Asp Asn Leu Ala Lys Glu Leu Glu Glu Lys

355 360 365

Lys Arg Glu Ala Glu Gln Leu Arg Met Glu Leu Ala Ile Arg Asn Ser

370 375 380

Ala Leu Asp Thr Cys Ile Lys Thr Lys Ser Gln Pro Met Met Pro Val

385 390 395 400

Ser Arg Pro Met Gly Pro Val Pro Asn Pro Gln Pro Ile Asp Pro Ala

405 410 415

Ser Leu Glu Glu Phe Lys Arg Lys Ile Leu Glu Ser Gln Arg Pro Pro

420 425 430

Ala Gly Ile Pro Val Ala Pro Ser Ser Gly

435 440

<210> 3

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ile Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Tyr Gln Glu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

100 105 110

<210> 4

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 4

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

<210> 6

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Phe Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ile Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Tyr Gln Glu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 8

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ile Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Tyr Gln Glu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 9

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ile Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Tyr Gln Glu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 10

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ile Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Tyr Gln Glu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 11

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ile Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Tyr Gln Glu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 12

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область легкой цепи

<400> 12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область легкой цепи

<400> 13

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область легкой цепи

<400> 14

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 16

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 17

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 18

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 19

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 20

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область легкой цепи

<400> 20

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область легкой цепи

<400> 21

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная вариабельная область легкой цепи

<400> 22

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 458

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Конъюгат антитела

<400> 23

Met Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys

50 55 60

Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Thr Arg Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys

115 120 125

Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

225 230 235 240

Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr

245 250 255

Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val

260 265 270

Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys

275 280 285

Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys

290 295 300

Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly

305 310 315 320

Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser

325 330 335

Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile

340 345 350

Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp

355 360 365

Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp

370 375 380

Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser

385 390 395 400

Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile

405 410 415

Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile

420 425 430

Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys

435 440 445

Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu

450 455

<210> 24

<211> 438

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 24

Met Gly Leu Ser Met Asp Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Thr Gly Asp Gln

1 5 10 15

Gln Arg Gly Cys Trp Tyr Tyr Leu Arg Tyr Phe Phe Leu Phe Val Ser

20 25 30

Leu Ile Gln Phe Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Phe Met Ile Tyr

35 40 45

Gly Asn Val His Ala Thr Thr Glu Ser Ser Leu Arg Ala Thr Glu Ile

50 55 60

Arg Ala Asp Ser Leu Tyr Ser Gln Val Val Gly Leu Ser Ala Ser Gln

65 70 75 80

Ala Asn Leu Ser Lys Gln Leu Asn Ile Ser Leu Leu Val Lys Glu Thr

85 90 95

Val Met Gln Gln Leu Leu Thr Thr Arg Arg Glu Met Glu Arg Ile Asn

100 105 110

Ala Ser Phe Arg Gln Cys Gln Gly Asp Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Tyr

115 120 125

Asn Arg Phe Ile Ala Ala Ile Ile Leu Ser Glu Lys Gln Cys Gln Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Glu Val Asn Lys Thr Cys Glu Ala Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Gly Glu Lys Val Lys Thr Leu Glu Met Glu Val Ala Lys Glu Lys Ala

165 170 175

Val Cys Ser Lys Asp Lys Glu Ser Leu Leu Ala Gly Lys Arg Gln Ala

180 185 190

Glu Glu Gln Leu Glu Ala Cys Gly Lys Ala Arg Glu Arg Gln Gln Gln

195 200 205

Glu Gln Gln Val Thr Glu Glu Asn Leu Arg Lys Val Gln Ser Leu Cys

210 215 220

Ile Pro Leu Asp Gln Glu Lys Phe Gln Ala Asp Val Leu Ser Ala Trp

225 230 235 240

Arg Asp Ser Leu Ile Tyr Arg Thr Leu Glu Thr Leu Pro Tyr His Tyr

245 250 255

Gln Leu Met Pro Glu Tyr Ala Ser Leu Arg Arg Thr Cys Glu Ser Leu

260 265 270

Pro Gly Ile Met Thr Thr Lys Ile Glu Glu Leu Ala Arg Gly Leu Arg

275 280 285

Ala Gly Ile Glu Arg Val Thr Arg Glu Asn Ala Glu Leu Arg Arg Gln

290 295 300

Lys Leu Glu Leu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Ala Gln Glu Ala Arg Ala

305 310 315 320

Arg Ala Gly Thr Glu Ala Gln Ala Arg Glu Thr Gln Leu Arg Ala Glu

325 330 335

Cys Ala Arg Gln Thr Gln Leu Ala Leu Glu Glu Lys Ala Ala Leu Arg

340 345 350

Ala Gln Arg Asp Asn Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ala Arg Lys Arg Glu

355 360 365

Leu Glu Gln Leu Arg Thr Glu Val Asp Val Arg Ile Ser Ala Leu Asp

370 375 380

Thr Cys Val Lys Ala Lys Ser Leu Pro Ala Val Pro Pro Arg Val Ser

385 390 395 400

Gly Pro Pro Pro Asn Pro Pro Pro Ile Asp Pro Ala Ser Leu Glu Glu

405 410 415

Phe Lys Lys Arg Ile Leu Glu Ser Gln Arg Leu Pro Val Val Asn Pro

420 425 430

Ala Ala Gln Pro Ser Gly

435

<210> 25

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 25

Pro Pro Ala Gly Ile Pro Val Ala Pro Ser Ser Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 26

Leu Ala Ile Arg Asn Ser Ala Leu Asp Thr Cys Ile Lys Thr Lys Ser

1 5 10 15

Gln Pro Met Met Pro Val Ser Arg Pro Met

20 25

<210> 27

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 27

tgtcctgatc agtaacactg tcc 23

<210> 28

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 28

tgagagtgta gagtccagac tgcagg 26

<210> 29

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 29

gatcctgaca tccagatgac ccagactcc 29

<210> 30

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 30

cacactcatt cctgttgaag ctcttg 26

<210> 31

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 31

gacatccaga tgacccagac tcc 23

<210> 32

<211> 55

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 32

agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgtacatcca caaggattgc attcc 55

<210> 33

<211> 52

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 33

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg tcaggcacta caaatactgt gg 52

<210> 34

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 34

cagtgtgagg tgcaactggt ggag 24

<210> 35

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 35

acaattcccc tctagatttt gtttaacttt aagaaggaga 40

<210> 36

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 36

caaaattatt tctagatttc gggctttgtt agcagccgg 39

<210> 37

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 37

tatggatgtt gtgatgaccc aatctcca 28

<210> 38

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 38

ggccgctaac actctcccct gttg 24

<210> 39

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 39

tatgcaggtc caactggtgc agtctgg 27

<210> 40

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 40

agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgggcatgat gggcatgggg gacc 54

<210> 41

<211> 52

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 41

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg tcaggcacta caaatactgt gg 52

<210> 42

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 42

ggccgctatt ctctgaattc ccctttctcc tgg 33

<210> 43

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 43

acaattcccc tctagatttt gtttaacttt aagaaggaga 40

<210> 44

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 44

caaaattatt tctagatttc gggctttgtt agcagccgg 39

<210> 45

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 45

catatgaacg tgcacgtgag cacagagtcc 30

<210> 46

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 46

ggatcctgag catatccctg catcctcc 28

<210> 47

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 47

catatgtatg gcaatgtgca cgccacc 27

<210> 48

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 48

ctcgagatcc acaggtgggc gattctggc 29

<---

1. Конъюгат для получения лекарственного средства для лечения опухоли гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) с сосудистой системой, которая экспрессирует белок, ассоциированный с везикулами плазмалеммы (PLVAP) у субъекта, где конъюгат специфически связывает эпитоп внеклеточного домена PLVAP млекопитающего и предназначен для внутрисосудистого или внутриартериального введения в опухоль гепатоцеллюлярной карциномы, причем конъюгат содержит:

слитый белок, содержащий SEQ ID NO: 23, где слитый белок содержит от N-конца до C-конца:

фрагмент тяжелой цепи антитела,

шарнирную область антитела,

линкер (Gly₄-Ser)_n, где n равно 3,

и внеклеточный домен фактора ткани человека, содержащий SEQ ID NO: 1,

где фрагмент тяжелой цепи антитела, шарнирная область антитела, линкер и внеклеточный домен фактора ткани человека соединены пептидными связями; и

фрагмент легкой цепи антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22,

где слитый белок и фрагмент легкой цепи антитела соединены дисульфидной связью.

2. Конъюгат по п.1, где внеклеточный домен фактора ткани человека содержит SEQ ID NO: 1.

3. Конъюгат по п.1, где конъюгат специфично связывает эпитоп, выбранный из PPAGIPVAPSSG или LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM.

4. Конъюгат по п.3, где конъюгат специфично связывает эпитоп PPAGIPVAPSSG.

5. Конъюгат по любому из пп.1-4, где фрагмент легкой цепи антитела состоит из SEQ ID NO: 22.

6. Конъюгат по любому из пп.1-5, где конъюгат состоит из SEQ ID NO: 23.

7. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли HCC с PLVAP-положительной сосудистой системой у субъекта, содержащая эффективное количество конъюгата по любому из предыдущих пунктов, где композиция дополнительно содержит подходящий носитель, вспомогательное вещество и/или контрастную среду.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, содержащая лекарственную форму конъюгата по любому из пп.1-6, которая подходит для введения субъекту.

9. Нуклеиновая кислота, кодирующая конъюгат по любому из пп.1-6.

10. Вектор экспресии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.9 для экспрессии конъюгата по любому из пп.1-6 в клетке-хозяине, не являющейся человеческой.

11. Клетка-хозяин, не являющаяся человеческой, содержащая вектор экспрессии по п.10 для экспрессии конъюгата по любому из пп.1-6.

12. Клетка-хозяин по п.11, где клетка-хозяин является бактериальной клеткой, более конкретно, где бактериальная клетка представляет собой Escherichia coli.

13. Клетка-хозяин по п.11, где клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, выбранную из грибков, таких как дрожжи, включая почкующиеся дрожжи; клетки насекомых, такие как Sf0, Sf21 или клеток High Five; или клетки млекопитающих, такие как клетки CHO, VERO или COS.

14. Способ получения конъюгата по любому из пп.1-6, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пп.11-13, в условиях, которые поддерживают экспрессию конъюгата в клетке-хозяина и выделение экспрессированного конъюгата.

15. Способ лечения опухоли HCC с PLVAP-положительной сосудистой системой, включающий введение внутрисосудисто или внутриартериально в опухоль терапевтически эффективного количества конъюгата по любому из пп.1-6 или фармацевтической композиции по п.7 или 8 субъекту.

16. Способ по п.15, где объем опухоли HCC уменьшается за счет тромбоза и некроза опухоли после введения конъюгата.

17. Способ по п.15 или 16, где субъект является человеком.

18. Способ по п.15 или 17, где проводят прямую инфузию конъюгата в одну или более питающих опухоль артерий.

19. Способ по п.15, где конъюгат вводят в дозе от приблизительно 5 до приблизительно 200 мкг/см³ опухоли, более конкретно от приблизительно 10 до приблизительно 150 мкг/см³ опухоли, и еще более конкретно от приблизительно 15 до приблизительно 100 мкг/см³ опухоли.

20. Способ по п.15, где конъюгат вводят в виде однократной дозы.

21. Способ по п.15, где конъюгат вводят в виде 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 доз или более.

22. Способ по п.21, где дозы вводят в течение периода, равного 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дням; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 неделям; или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцам или более.