Способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста
Владельцы патента RU 2739515:
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы" (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В. СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста. Проводят забор венозной крови пациента, оценку содержания в крови тромбоцитов с гранулами и отбор проб, содержащих не менее 35% тромбоцитов с гранулами. Осуществляют двухэтапное центрифугирование пробы крови, сначала при 300-500 g в течение 5-10 минут для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов, затем при 700-1000 g в течение 5-20 минут для осаждения тромбоцитов. Проводят удаление надосадка с последующим ресуспендированием тромбоцитов фосфатно-солевым раствором PBS с pH, равным 7,3, или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия до исчезновения тромбоцитарных конгломератов. Далее осуществляют криодеструкцию полученных тромбоцитов с последующим центрифугированием размороженных образцов тромбоцитарных лизатов при 3000-4000 g в течение 10-20 минут при температуре 4-6 °С для удаления всех клеточных фрагментов из конечного препарата. Способ обеспечивает возможность получения лизата тромбоцитов в бесплазменной среде с высоким содержанием ростовых факторов за счет приготовления концентрата тромбоцитов при определенном режиме в бесплазменной среде без нарушения качества клеток (уровень тромбоцитов с гранулами, морфофункциональная активность тромбоцитов, адгезивная активность тромбоцитов) с высоким содержанием ростовых факторов (PDGF, EGF, FGF) и низким содержанием провоспалительных факторов. 5 ил., 4 табл., 1 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно регенеративной медицины, и может быть использовано для стимуляции репаративных и регенеративных процессов в поврежденных тканях.
Уровень техники
Тромбоциты человека содержат большое количество биологически активных веществ, включая факторы роста и дифференцировки клеток, факторы ангиогенеза, цитокины, которые потенциально имеют очень высокую ценность для различных направлений регенеративной медицины [Golebiewska E.M., Poole A.W. Platelet secretion: From hemostasis to wound healing and beyond // Blood Rev. 2015 May; 29(3):153-62]. В настоящее время в регенеративной медицине распространено использование тромбоцитарных лизатов, полученных путем разрушения аутологичных тромбоцитов пациента при низких или ультранизких температурах. Тромбоцитарные лизаты могут быть приготовлены из образцов с очень высоким содержанием тромбоцитов, что позволяет получать препараты, насыщенные ростовыми факторами. Процедура изготовления тромбоцитарного лизата позволяет одномоментно выделять из клеток все ростовые факторы.
Известен способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток [Патент РФ № 2648162], включающий нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов посредством центрифугирования и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема, трехкратный температурный лизис нормированного образца путем замораживания на сутки до -80°С и размораживания при +37°С, осаждение клеточного дебриса посредством центрифугирования, сбор супернатанта с получением индивидуального образца лизата тромбоцитов. Изобретение позволяет получить стандартизованные образцы нексеногенной ростовой добавки для культивирования клеток человека разных типов с функциональной активностью образцов, определяемой по скорости прироста тест-культур, различающейся не более чем на 10,0%. Однако данный способ требует нормирования исходной тромбоцитарной массы в очень узком диапазоне концентраций, включает 3-кратное замораживание и размораживание препарата, что может сопровождаться потерей биологически активных компонентов в плазме, требует пулирования готовых образцов лизата, не учитывает возможное разрушение тромбоцитарных компонентов в размороженной плазме.
Известен способ приготовления тромбоцитарного лизата, насыщенного ростовыми факторами, с целью ускорения репарации и регенерации связок [Klatte-Schulz F., Schmidt T., Uckert M., Scheffler S., Kalus U., Rojewski M., Schrezenmeier H., Pruss A., Wildemann B. Comparative Analysis of Different Platelet Lysates and Platelet Rich Preparations to Stimulate Tendon Cell Biology: An In Vitro Study. Int J Mol Sci. 2018 Jan 10;19(1). pii: E212], включающий заготовку тромбоцитных концентратов у доноров крови с помощью аферезного аппарата Trima Accel®, аликвотирование тромбоцитных концентратов на дозы объемом 5 мл, заморозку аликвот при -80°С в течение 30 минут, разморозку аликвот при 37°С на водяной бане и удаление клеточного дебриса путем центрифугирования при 1600 g. Однако предложенная методика требует предварительной заготовки тромбоцитных концентратов путем аппаратного афереза, не учитывает возможной деструкции ростовых факторов в процессе разморозки при 37°C, не позволяет удалить из плазмы вещества, разрушающие ростовые факторы, выделенные из тромбоцитов, не отражает уровень про-воспалительных цитокинов и хемокинов в составе готовых лизатов, не позволяет получить лизат с высоким содержанием факторов роста и репарации тканей и низким содержанием про-воспалительных факторов.
Наиболее близким к заявляемому решению является способ изготовления тромбоцитарного лизата из аутологичной крови для лечения пациентов с переломом шейки плеча [Патент РФ № 2681753], включающий забор у пациента 30 мл венозной крови в стерильные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА, центрифугирование крови с ускорением 300 g в течение 5 минут, отбор плазмы в стерильных условиях таким образом, чтобы над осадком клеток ее осталось не менее 1 мм, перенос плазмы с тромбоцитами в новую стерильную градуированную пробирку, центрифугирование плазмы с ускорением 700 g в течение 17 минут с целью осаждения тромбоцитов, отбор в стерильных условиях верхней части плазмы в таком количестве, чтобы над осадком клеток ее осталось 3,1 мл, ресуспендирование осадка тромбоцитов в остаточной плазме с получением богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), криодеструкцию тромбоцитов БоТП и хранение тромбоцитных лизатов при температуре от -40°С до -80°С, медленную разморозку лизатов при температуре 2-6°С, центрифугирование лизатов с ускорением 3000 g в течение 20 минут. Для изготовления лизата используют БоТП с концентрацией функционально полноценных тромбоцитов более 240×109/л, в случае меньшей концентрации - допускается дополнительное центрифугирование с ускорением 700 g в течение 17 минут, отбор излишка плазмы и повторное определение концентрации функционально полноценных тромбоцитов.
Однако предложенный способ не учитывает возможной деструкции ростовых факторов в плазме, не учитывает адсорбции ростовых факторов на белках плазмы с их последующей инактивацией, не позволяет получить лизат с высоким содержанием факторов роста и репарации тканей и низким содержанием про-воспалительных факторов.
Технической проблемой является разработка способа приготовления лизата тромбоцитов в бесплазменной среде с высоким содержанием ростовых факторов.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение концентрата тромбоцитов в бесплазменной среде без нарушения качества клеток (уровень тромбоцитов с гранулами, морфофункциональная активность тромбоцитов, адгезивная активность тромбоцитов) с высоким содержанием ростовых факторов (PDGF, EGF, FGF) и низким содержанием про-воспалительных факторов.
Технический результат достигается при осуществлении способа приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста (PDGF, FGF, EGF), включающего забор венозной крови пациента, оценку содержания в крови тромбоцитов с гранулами и отбор проб, содержащих не менее 35% тромбоцитов с гранулами от общего количества тромбоцитов, двухэтапное центрифугирование пробы крови, сначала при 300-500 g для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов, затем 700-1000 g для осаждения тромбоцитов; удаление надосадка с последующим ресуспендированием (отмыванием) тромбоцитов фосфатно-солевым раствором PBS с pH=7,3 или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия до исчезновения тромбоцитарных конгломератов; далее осуществляют криодеструкцию полученных тромбоцитов, с последующим центрифугированием размороженных образцов тромбоцитарных лизатов при 3000-4000 g для удаления всех клеточных фрагментов из конечного препарата. Объем среды, вносимой для ресуспендирования, равен от 50%.до 200% объема удаленной плазмы.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется иллюстративным материалом, где на фиг. 1 представлены фотографии A-Г витально окрашенных (трипафлавином-родамином С) фибробластов человека линии М-22 через 3 суток культивирования в отсутствие и в присутствие разных доз лизата БоТП и ОтмТР. Увеличение х100. А - культура без лизата (контроль); Б - 20 мкл лизата БоТП; В - 50 мкл лизата БоТП; Г - 20 мкл лизата ОтмТР; Д - 50 мкл лизата ОтмТР.
Осуществление изобретения
Получение бесплазменного лизата тромбоцитов с высоким содержанием ростовых факторов включает следующие этапы.
1. Забор венозной крови пациента в стандартную пробирку с антикоагулянтом цитратом или ЭДТА.
2. Оценка содержания в крови тромбоцитов с гранулами (%). Наиболее пригодными для получения лизата являются пробы, содержащие не менее 35% тромбоцитов с гранулами. При этом БоТП может быть исследована любыми известными из уровня техники способами, например, описанным в статье Amable PR et al. "Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors" (Stem Cell Res Ther. 2013 Jun 7;4(3):67), или в патенте на изобретение РФ №2485502 «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека».
3. Центрифугирование крови при 300-500 g в течение 5-10 минут для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов.
4. Центрифугирование плазмы с тромбоцитами при 700-1000 g в течение 5-20 минут с целью осаждения тромбоцитов на дне пробирки.
5. Удаление надосадка (плазменной части) из пробирки с тромбоцитами.
6. Ресуспендирование тромбоцитов фосфатно-солевым раствором PBS (pH=7,3) или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия. Объем среды, вносимой для ресуспендирования, равен от 50% до 200% объема удаленной плазмы. Ресуспендирование тромбоцитов предпочтительно проводить с помощью автоматической пипетки со съемным пластиковым наконечником на 5-1000 мкл до полного исчезновения в пробе визуально различимых конгломератов тромбоцитов. Не рекомендуется ресуспендирование с помощью системы Vortex или с помощью горизонтального шейкера.
7. Заморозка тромбоцитов в буферном растворе при температуре -минус 40 - минус 80°С Замороженные тромбоциты хранят при температуре -минус 40- минус 80°С в течение 1-14 суток.
8. Разморозка тромбоцитов при температуре 2-6°С в течение 10-12 часов. Полученный продукт представляет собой суспензию лизированных тромбоцитов (лизат тромбоцитов) в буферном растворе.
9. Центрифугирование лизата тромбоцитов в буферном растворе при 3000-4000 g в течение 10-20 мин при температуре 4°-6С и отбор надосадка (буферный раствор, содержащий ростовые факторы тромбоцитов), который распределяют по стерильным пробиркам, герметично закрывают и помещают в холодильник до применения.
Способ приготовления лизата тромбоцитов в бесплазменной среде с высоким содержанием ростовых факторов был разработан по итогам проведенных исследований по оценке влияния процедур выделения богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) на качество тромбоцитов и содержание факторов роста и их дифференцировки в тромбоцитах, полученных по способу-прототипу и по заявляемому способу, в соответствии с которым после двухэтапного центрифугирования перед криодеструкцией дополнительно осуществляют отмывку тромбоцитов от плазмы.
В настоящее время во всех методиках получения БоТП используется центрифугирование. Ранее нами было показано, что при «мягком» центрифугировании (300-500g) не происходит видимого изменения морфофункционального статуса тромбоцитов. «Мягкое» центрифугирование позволяет получить плазму с тромбоцитами без примеси эритроцитов и лейкоцитов. Однако общая концентрация тромбоцитов в такой плазме обычно варьирует от 300 до 800×109/л, тогда как по общепринятым стандартам содержание тромбоцитов в БоТП должно быть не ниже 1000×109/л. Таким образом, после «мягкого» центрифугирования необходимо удалить избыток плазмы из суспензии тромбоцитов. В большинстве работ осаждение тромбоцитов проводится при ускорении 3000-4000 g. Однако наши исследования показывают, что центрифугирование крови или плазмы при 3000-4000 g снижает уровень тромбоцитов с гранулами в конечной БоТП на 20-25%, а также способно вызывать спонтанную активацию тромбоцитов. В производственной трансфузиологии выделение тромбоцитных концентратов проводится при ускорении 1000-1200 g, которое не снижает морфофункциональный статус тромбоцитов [Макаров М.С., Кобзева Е.Н., Высочин И.В., Боровкова Н.В. Хватов В.Б. Применение витального окрашивания для морфофункционального анализа тромбоцитов человека короткого хранения // Альманах клинической медицины. -2014. -№30. -С. 83-87.]. Наше наблюдение показало, что массовое осаждение тромбоцитов на дно флакона наблюдается уже при ускорении 700-800 g, при этом в супернатанте остаются только биологически неполноценные клетки, лишенные гранул, и не происходит нарушения качества тромбоцитов в осадке. При двухэтапном центрифугировании качество тромбоцитов снижается незначительно (табл. 1). Наше исследование показало, что двухэтапное центрифугирование при 300-500 g и 700-1000 g с последующим ресуспендированием осадка тромбоцитов плазмой позволяет получить БоТП с общей концентрацией клеток 1200-1800×109/л и нормальным уровнем их морфофункционального статуса (табл. 1). Таким образом, двухэтапное центрифугирование является адекватным для получения БоТП, ускорение 700-1000 g позволяет осаждать тромбоциты с гранулами без их массового повреждения или активации и может быть использовано для отмывания тромбоцитов от плазмы.
Таблица 1. Влияние режимов центрифугирования на морфофункциональный статус тромбоцитов человека
| Режим центрифугирования | Морфофункциональные параметры тромбоцитов доноров крови (N=10), М ± σ | ||
| Доля тромбоцитов с гранулами, % (норма 35-75%) |
Морфофункциональная активность тромбоцитов, баллы (норма 35-60 баллов) |
Адгезивная активность тромбоцитов, баллы (норма 30-75 баллов) |
|
| Исходная кровь | 50±5 | 48±5 | 47±6 |
| Однократное центрифугирование | |||
| 300 g в течение 5мин |
50±4 | 48±5 | 47±5 |
| 500 g в течение 10 мин |
50±5 | 48±5 | 47±5 |
| 700 g в течение 10-20 мин |
47±4 | 47±4 | 46±4 |
| 800 g в течение 5-20 мин |
49±4 | 46±4 | 46±4 |
| 1000 g в течение 5-10 мин |
49±4 | 46±3 | 46±4 |
| Двукратное центрифугирование. 1-й этап - центрифугирование крови 300-500 g в течение 5-10 мин и отбор первичной плазмы с тромбоцитами 2-й этап - центрифугирование первичной плазмы с целью получения осадка тромбоцитов и ресуспендирование тромбоцитов в плазме |
|||
| 700 g в течение 15-20 мин | 46±5* | 44±5* | 44±5* |
| 700 g в течение 30 мин | 38±4 | 34±3 | 30±2* |
| 1000 g в течение 5-10 мин | 47±6* | 45±5* | 45±5* |
| 1500 g в течение 5-10 мин | 42±6* | 40±5* | 40±4* |
| 2000 в течение 5-10 мин | 39±4* | 35±3* | 30±2* |
| *Достоверно относительно исходной крови при p<0,05 |
На следующем этапе оценивали содержание факторов роста и дифференцировки в тромбоцитах, отмытых от плазмы (ОтмТР). В норме гранулы тромбоцитов содержат большое количество веществ, обладающих протеолитической активностью (кислые фосфатазы, металлопротеазы, гликозидазы), которые в условиях плазмы крови могут вызывать быстрое расщепление факторов роста как при 37°C, так и при 20-22°C. Кроме того, значительная часть ростовых факторов может быть сорбирована молекулами альбумина. Показано, что альбуминовые наночастицы интенсивно сорбируют на своей поверхности лекарственные препараты, включая белки разных типов [Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparticles for cerebral cancer // Tumori. -2008. -94. -Р. 271-277]. Данные о содержании основных ростовых факторов в тромбоцитарных лизатах сильно варьируют у разных авторов: так, концентрации PDGF и EGF в лизатах, полученных разными исследователями, могут отличаться более чем в 10 раз. По всей видимости, этот эффект вызван недостаточной стабильностью ростовых факторов в составе плазмы. Также необходимо учитывать, что еще до криодеструкции тромбоцитов часть тромбоцитарных компонентов может выходить в плазму. По нашим данным, после центрифугирования плазмы с ускорением 700-1000 g в образующемся супернатанте (плазма, бедная тромбоцитами, БедПл) наблюдаются высокие концентрации про-воспалительных цитокинов - фактора некроза опухолей TNF-α, интерлейкинов 1/6/8. В конечных лизатах, полученных из БоТП и БедПл, уровень TNF-α и интерлейкинов 1/6/8 значимо не различался (p<0,05). Следовательно, концентрация этих про-воспалительных факторов в лизате определялась их содержанием в бесклеточной плазме, а не в составе тромбоцитов, подвергшихся криодеструкции. При этом концентрации PDGF и других ростовых факторов в БоТП были в 3-7 раз выше, чем в БедПл. Таким образом, после центрифугирования 700-1000 g основная часть ростовых факторов сохранялась в составе тромбоцитарных гранул и высвобождалась только после криодеструкции тромбоцитов, тогда как про-воспалительные факторы выходили в плазму еще до криодеструкции. Этот эффект является очень важным при получении тромбоцитарных лизатов с высоким содержанием факторов роста и низким содержанием про-воспалительных факторов. Таким образом, для удаления про-воспалительных факторов и повышения сохранности ростовых факторов необходимо отмывать тромбоциты от плазмы после центрифугирования 700-1000 g.
Ниже представлен конкретный пример реализации изобретения, демонстрирующий достижение заявленного результата.
Образцы крови доноров-добровольцев центрифугировали при 300-500 g, отбирали аликвоты плазмы с тромбоцитами и центрифугировали при 700-1000 g с целью осаждения тромбоцитов, затем удаляли весь надосадок и ресуспендировали тромбоциты фосфатно-солевым раствором PBS (pH=7,3) или изотоническим 0,9% раствором хлоридом натрия. Объем среды, вносимой для ресуспендирования, был равен объему удаленной плазмы. В полученных аликвотах ОтмТР общая концентрация тромбоцитов и их качество были сопоставимы с тем, что наблюдалось в БоТП (табл. 2). Также возможно ресуспендирование осадка тромбоцитов PBS (pH=7,3) или изотоническим 0,9% раствором хлоридом натрия в объемах, составляющих от 50 до 200% от исходного объема плазмы.
Большое значение имеет отсутствие визуально различимых конгломератов тромбоцитов в суспензии. По нашим наблюдениям, при осаждении тромбоциты формируют очень тесные конгломераты, которые часто не распадаются при простом взбалтывании пробы. Такие структуры обычно имеют вид хлопьев и могут достигать диаметра 1000 мкм. Пребывание в составе конгломератов само по себе не влияет на морфофункциональные свойства тромбоцитов, с другой стороны, тесный контакт тромбоцитов увеличивает риск их спонтанной активации и дегрануляции, что приводит к снижению качества клеток и потере ими секреторных гранул. В частности, заготовка пулированных тромбоцитных концентратов, в процессе которой формируется очень большой осадок тромбоцитов, приводит к тому, что конечный продукт имеет более низкое качество клеток по сравнению с аферезным тромбоцитным концентратом или плазмой, выделенной из крови при 300-500 g. Тромбоцитарные конгломераты удерживают остаточную плазму и могут препятствовать адекватному выходу ростовых факторов в процесс криодеструкции тромбоцитов. Таким образом, для исследования тромбоцитов в бесплазменной среде, а также для получения лизата необходимо максимально снизить уровень тромбоцитарных конгломератов в бесплазменной суспензии. Наши наблюдения показывают, что система взбалтывания суспензии клеток Vortex и горизонтальные шейкеры для перемешивания крови и ее компонентов не являются эффективными для ресуспендирования тромбоцитов в бесплазменной среде. Для ресуспендирования отмытых тромбоцитов предпочтительно использовать автоматические или механические пипетки со съемным пластиковым наконечником на 5-1000 мкл до полного исчезновения в пробе визуально различимых конгломератов тромбоцитов. Перед заморозкой суспензии тромбоцитов желательно добиться полного исчезновения тромбоцитарных конгломератов.
Таблица 2. Оценка качества клеток в тромбоцитных концентратах до и после отмывания от плазмы (до этапа заморозки).
| Тип образца. | Морфофункциональные параметры, М ± σ | |||
| Общая концентрация тромбоцитов, 109/л | Концентрация лейкоцитов, 109/л | Доля тромбоцитов с гранулами, % (норма 35-75%) | Адгезивная активность тромбоцитов, баллы (норма 30-75 баллов) |
|
| БоТП (метод-прототип) | 1491±76 | 1,0 [0,2; 3,0] | 44±5 | 40±5 |
| Тромбоциты, отмытые от плазмы (предлагаемый метод) | 1433±68 | 1,0 [0; 2,0] | 42±4 | 40±5 |
| *Достоверно относительно БоТП при p<0,05 |
Тромбоцитарный лизат получали путем криодеструкции тромбоцитов в буферном растворе при -40 - -80°С с последующей разморозкой. Общее время хранения тромбоцитов в буферном растворе при -40 - -80°С составляло 1-14 суток. Замораживание и размораживание вызывает лизис тромбоцитов и выход из них ростовых факторов и других секреторных компонентов. Размораживание проб проводили при температуре +2 - +6°С в течение 10-12 часов (медленная разморозка). После разморозки полученные пробы представляют собой суспензию лизированных тромбоцитов в буферном растворе, который также содержит ростовые факторы, вышедшие из тромбоцитов в результате криодеструкции и разморозки. Образцы тромбоцитарных лизатов центрифугировали при 3000-4000 g в течение 10-20 мин и температуре 4-6°С для удаления всех клеточных фрагментов из конечного препарата. Ускорение 3500-4500 g является общепринятым при выделении бесклеточной плазмы из цельной крови. Наши наблюдения показывают, что после разморозки бесплазменных лизатов клеточный дебрис целиком удаляется при центрифугировании 3000-4000 g.
Содержание цитокинов оценивали с помощью мультиплексного анализа на платформе Luminex 200 (технология xMAP). Определяли концентрацию тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста эндотелия (EGF), фактора некроза опухолей (TNF-α), интерлейкина 1-альфа, 6 и 8 (IL1-alfa, IL6, IL8), в пг/мл. В лизате БоТП концентрация исследуемых цитокинов варьировалась в широком диапазоне значений. После отмывания тромбоцитов от плазмы регистрируемая концентрация PDGF в конечном лизате ОтмТР была увеличена в 3,2 раза, FGF - в 1,2 раза, EGF - в 6,1 раза соответственно (р<0,05) по сравнению с БоТП (табл. 3). Одновременно с этим в лизатах ОтмТР значительно снижалось содержание про-воспалительных интерлейкинов - уровень IL1-alfa был снижен в 3 раза, IL6 - в 457 раз, IL8 - в 1,5 раза по сравнению с исходной БоТП (р<0,05). Уровень фактора TNF-α значимо не различался между БоТП и ОтмТР. Таким образом, отмывание тромбоцитов от плазмы позволило заметно увеличить содержание ростовых факторов и одновременно с этим снизить содержание про-воспалительных интерлейкинов в конечном тромбоцитарном лизате.
Таблица 3. Содержание секретируемых тромбоцитами факторов в тромбоцитных лизатах до и после отмывания тромбоцитов от плазмы
| Тип лизата | Концентрация тромбоцитарных цитокинов, пг/мл | ||||||
| PDGF | FGF-2 | EGF | TNF-α | IL1-alfa | IL6 | IL8 | |
| Лизат, полученный из БоТП (метод-прототип) | 1303 [918; 2591,] |
582 [316; 825] |
695 [424; 929] |
39,0 [23,0; 78,5] |
11,4 [5,3;26,2] | 18,3 [3,3; 54,4] |
12,0 [7,2; 21,7] |
| Лизат, полученный из тромбоцитов, отмытых от плазмы (предлагаемый метод) | 4110* [2769; 5369] |
724* [387; 1443] |
4297* [4213; 8465] |
36,3 [22,5; 46,9] |
3,8* [3,8; 10,3] |
0,04* [0,01; 0,06] |
7,9* [7,8; 9,0] |
| *Достоверно относительно БоТП при p<0,05 |
Необходимо особо подчеркнуть, что образцы бесплазменного тромбоцитарного лизата с высоким содержанием ростовых факторов были получены из проб с нормальным содержанием тромбоцитов с гранулами (35-75%). При многих патологиях содержание в крови тромбоцитов с гранулами снижается и одновременно с этим увеличивается число тромбоцитов с повреждениями мембран, способными разрушать форменные элементы крови, а также секретируемые ими вещества. По нашим данным, в лизатах, полученных из БоТП с уровнем тромбоцитов с гранулами ниже 20%, уровень PDGF и других ростовых факторов резко снижен по сравнению с лизатами здоровых доноров. Таким образом, для получения бесплазменного тромбоцитарного лизата с высоким содержанием ростовых факторов наиболее адекватно использовать кровь, содержащую не менее 35% тромбоцитов с гранулами.
Рост-стимулирующий эффект бесплазменных тромбоцитарных лизатов исследовали на примере культуры фибробластов человека линии М-22. Лизаты тромбоцитов вносили в лунки 12-луночного планшета с общим объемом среды 2 мл, содержавшие 8-10 тыс клеток. Клетки культивировали в среде DMEM добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США) при 37°С и концентрации CO2 5% в течение 3 суток. Анализ клеток проводили с помощью метода, основанного на витальном окрашивании клеток и их исследовании во флуоресцентном микроскопе (Патент РФ на изобретение № 2484472). Оценивали содержание клеток на дне лунки (тыс/см2), общую структурную целостность клеточных мембран (ЦКМ) (в баллах). В норме ЦКМ диплоидных клеток человека составляет 28-42 балла. Лизаты БоТП и ОтмТр объемом 10-50 мкл вызывали стимуляцию роста клеток в 1,2-1,5 раза без нарушения их структурной целостности (табл. 4, рис. 1А, Б, Г). При использовании 50 мкл лизата БоТП отмечено незначительное снижение ЦКМ, при этом общее количество клеток достоверно не отличалось от контроля (табл. 4, рис. 1В). Напротив, в опытах с 50 мкл ОтмТр рост-стимулирующий эффект сохранялся и сопоставим с тем, что наблюдался 20 мкл, снижение ЦКМ не происходило (рис. 1Д). В присутствии 100-500 мкл БоТП в культуре М-22 отмечено доза-зависимое подавление роста клеток, а также заметное нарушение их структурной целостности. При 200-500 мкл БоТП практически все клетки в культуре имели измененную морфологию, не содержали секреторных везикул. Напротив, при использовании 100-500 мкл ОтмТр, рост-стимулирующий эффект сохранялся, как и при 10-50 мкл (табл. 4), выраженных структурных и функциональных изменений в клетках отмечено не было.
Таблица 4. Морфофункциональный анализ фибробластов линии М-22 через 3 суток культивирования в присутствии лизата тромбоцитов
| Объем лизата тромбоцитов, внесенный в культуру М-22 | Источник лизата тромбоцитов | |||||
| Контроль (без тромбоцитов) |
Лизат, полученный из БоТП (метод-прототип) | Лизат, полученный из тромбоцитов, отмытых от плазмы (предлагаемый метод) | ||||
| Тыс/см2 | ЦКМ, баллы | Тыс/см2 | ЦКМ, баллы | Тыс/см2 | ЦКМ, баллы | |
| 10 мкл | 15,0 | 35,2 | 18,0* | 35,3 | 18,8* | 35,0 |
| 20 мкл | 21,2* | 35,0 | 20,7* | 35,0 | ||
| 50 мкл | 15,0 | 33,1* | 20,0* | 34,9 | ||
| 100 мкл | 10,8* | 31,0* | 19,5* | 34,5 | ||
| 200 мкл | 6,0* | 29,0* | 22,0* | 35,0 | ||
| 500 мкл | 2,9* | 27,3* | 21,7* | 34,7 | ||
| *Достоверно относительно контроля при p<0,05 |
Таким образом, заявляемый способ приготовления бесплазменных тромбоцитарных лизатов позволяет получать препараты с высоким уровнем ростовых факторов и обладающие рост-стимулирующим эффектом.
Способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста, включающий забор венозной крови пациента, оценку содержания в крови тромбоцитов с гранулами и отбор проб, содержащих не менее 35% тромбоцитов с гранулами, двухэтапное центрифугирование пробы крови, сначала при 300-500 g в течение 5-10 минут для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов, затем при 700-1000 g в течение 5-20 минут для осаждения тромбоцитов; удаление надосадка с последующим ресуспендированием тромбоцитов фосфатно-солевым раствором PBS с pH, равным 7,3, или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия до исчезновения тромбоцитарных конгломератов; далее осуществляют криодеструкцию полученных тромбоцитов с последующим центрифугированием размороженных образцов тромбоцитарных лизатов при 3000-4000 g в течение 10-20 минут при температуре 4-6 °С для удаления всех клеточных фрагментов из конечного препарата.
