Сухие композиции вакцин, стабильные при комнатной температуре

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для получения вакцины, которая содержит живой аттенуированный собачий вирус. Для этого сухая композиция вакцины содержит невосстанавливающие олигосахариды в количестве от 30% до 80% (вес/вес), аминокислотный стабилизатор от 5% до 40% (вес/вес), белковый стабилизатор от 2% до 20% (вес/вес), наполнитель-стабилизатор в количестве от 2% до 25% (вес/вес). При этом аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин, живой аттенуированный вирус представляет собой живой аттенуированный собачий вирус, выбранный из группы, состоящей из вируса чумы плотоядных, аденовируса, вируса парагриппа и любой их комбинации. Указанную сухую композицию получают в виде лепешки, получают на мембране или фильтре, высушивают в виде порошка путем сублимационной сушки в шариках, путем распылительной сушки или путем распылительной сушки с замораживанием. Группа изобретений относится также к способу получения данной вакцины. Использование данной группы изобретений позволяет при использовании данного состава вакцины получить стабильную при комнатной температуре сухую композицию вакцин, содержащих CDV, CAV2, CPV и CPI, а также данный состав может быть использован для вирусных вакцин, полученных сушкой в виде лепешек во флаконах. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 16 табл.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет согласно 35 U.S.C. § 119(е) по предварительной заявке на патент США, серийный номер 61/883,611, поданной 27 сентября 2013 г., содержание которой включено в данное изобретение в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к стабильным при комнатной температуре сухим композициям вакцин, которые содержат один или несколько живых ослабленных вирусов. Изобретение также относится к производству таких сухих композиций вакцин и к способам вакцинации животных этими вакцинами.

УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Живые ослабленные вирусы не являются устойчивыми при хранении при комнатной температуре в течение длительного периода времени. Таким образом, большинство вакцин на основе живых аттенуированных вирусов являются лиофилизированными и хранятся в холодильнике перед использованием. Вместе с тем, доставка и хранение таких вакцин приводит к значительным дополнительным затратам, которые должны возлагаться на пункты вакцинации, ветеринарных врачей, на фермеров и персонал, работающий с сельскохозяйственными животными, и в конечном счете на владельца домашнего животного или на потребителя. Такие затраты могут быть непомерно высокими для бедного населения и в странах третьего мира. В этой связи, согласно требованиям ВОЗ в отношении человеческой вакцины БЦЖ, минимальный срок выживания должен составлять > 20% после хранения в течение 28 дней при 37°С [см., например, Jin et al., Vaccine 29:4848-4852 (2011)].

Существует значительное количество вирусов, которые могут инфицировать или животных-компаньонов (например, собак, кошек и лошадей) или домашний скот (например, птиц, крупный рогатый скот и свиней). Например, симптомы, вызванные соответствующими вирусными инфекциями, могут включать легкие симптомы простуды, при этом другие симптомы могут стремительно становиться летальными, как в случаях заражения вирусом чумы плотоядных (CDV) [см., например, US2010/0196420]. Фактически, CDV запускает мультисистемную инфекцию, которая может охватывать дыхательную, пищеварительную и нервную системы, наружные покровы и зрение. Также относительно высок уровень смертности от парвовируса собак (CPV) [см., например, US2009/0010955]. Вирус CPV является преимущественно кишечным патогеном, который инфицирует собак, в особенности молодых собак, и характеризуется появлением острой диареи, лихорадки и лейкопении у собак и щенков в возрасте старше 4-5 недель. Поражение миокарда может возникать даже у щенков более раннего возраста. Вирус чумы плотоядных и парвовирус собак представляют собой два наиболее опасных собачьих вируса, от которых следует защищать щенков/собак.

Другие вирусы собак включают: вирус парагриппа собак (CPI), представляющий собой высоко контагиозный вирус, который вызывает заболевания дыхательных путей, вследствие чего возникают сужение верхних дыхательных путей и инфекционный трахеобронхит; собачий аденовирус 1-го типа (CAV1), который вызывает инфекционный гепатит, и вирус собачьего гриппа (CIV), который является высоко контагиозным и может вызвать тяжелые заболевания дыхательных путей. Известно, что CIV способен вызывать 100% инфицирование с заболеваемостью 80%, и в случае тяжелых инфекций смертность доходит до 5-8% [Crawford et al., Science, 310 (5747):. 482-485 (2005); US 7959929 B2]. Кроме того, существует целый ряд кошачьих вирусов, поражающих кошек, в число которых входит калицивирус кошек (FCV), вирус лейкоза кошек (FeLV), вирус панлейкопении кошек (FPLV), коронавирус кошек (FCoV) и вирус ринотрахеита кошек (FVR).

Также существует значительное число вирусов, которые могут инфицировать крупный рогатый скот. Такие вирусы включают вирусы бычьей вирусной диареи типа 1 и типа 2 (BVDV1 и BVDV2), вирус инфекционного бычьего ринотрахеита (IBR), вирус парагриппа типа 3 (PI3), бычий респираторно-синцитиальный вирус (BRSV) и бычий респираторный коронавирус (BRCV). Дополнительно, существует целый ряд бактерий, которые также могут инфицировать крупный рогатый скот, в том числе Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni и Mycoplasma bovis.

Кроме того, существует значительное число вирусов, которые могут инфицировать домашнюю птицу. Такие вирусы включают вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус инфекционного бурсита (IBDV), вирус болезни Ньюкасла (NDV), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV), вирус болезни Марека (MDV), вирус герпеса индеек (HVT), который также известен как MDV3, и метапневмовирусы птиц (AMPV). Дополнительно, существует целый ряд бактерий, которые также могут инфицировать домашнюю птицу, в том числе Pasteurella multocida, Salmonella ssp., Escherichia coli, Mycoplasma ssp., Avibacterium paragallinararum, Erysipelas ssp., Campylobacter ssp., Vibrio ssp., Clostridium perfringens и паразиты, такие как Eimeria.

Кроме того, существует целый ряд вирусов, которые могут инфицировать свиней. Такие вирусы включают вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), цирковирус свиней (PCV), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGE), вирус свиного псевдобешенства (PPRV), парвовирус свиней (PPV), вирус свиного гриппа (SIV), ротавирус свиней (PRV) и вирус эпидемической диареи свиней (PED). В дополнение, существует целый ряд бактерий, которые также могут инфицировать свиней, в том числе различные серотипы Pasteurella multocida, Salmonella ssp., различные фимбриальные типы Escherichia coli, Haemophilus parasuis, Lawsonia intracellularis, Mycoplasma ssp., Bordetella bronchiseptica, Erysipelas ssp., Campylobacter ssp., Actinobacillus pleuropneumonia., Clostridium perfringens и Clostridium difficile.

В настоящее время общепризнанным лучшим способом профилактики заболеваний, обусловленных вирусными инфекциями у животных, является вакцинация животных против этих вирусов. Только в качестве одного примера, вакцины против вируса собачьей чумы значительно уменьшили распространенность указанного заболевания у собак. Также, в значительной степени было уменьшено число случаев инфекционного гепатита собак с помощью вакцин против собачьего аденовируса-2 (CAV2). Применение живого аттенуированного CAV2 в вакцинах вместо близкородственного CAV1 устраняет угрозу интерстициального нефрита и помутнения роговицы, наблюдаемые у собак, которые были привиты живым аттенуированным CAV1 [Taguchi et al., Can Vet J. 52(9): 983-986 (2011)]. Кроме того, можно безопасно вводить поливалентные живые аттенуированные вирусные вакцины, для которых ограничено количество необходимых инъекций вакцин. Таким образом, существует ряд коммерчески доступных мультивалентных живых аттенуированных вирусных вакцин для собак, защищающих собак от чумы плотоядных, инфекционного гепатита, собачьего парвовируса и вируса собачьего парагриппа. Дополнительно, более современные поливалентные вакцины также дают дополнительную защиту от вируса собачьего гриппа. Тем не менее, по-прежнему существует большая потребность в аттенуированных живых вирусных вакцинах, таких как вирусные вакцины для собак, которые могут транспортироваться и храниться при комнатной температуре.

Приведенную в настоящем документе любую ссылку не следует толковать как признание того, что эта ссылка доступна в качестве "предшествующего уровня техники" по отношению к этой заявке.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение, имеющее своей целью преодоление недостатков существующих вакцин, относится к новым стабильным сухим композициям живых аттенуированных вакцин, например, к композициям вирусных вакцин, которые могут транспортироваться и/или храниться при комнатной температуре, а также к соответствующим иммуногенным композициям. Эти сухие композиции остаются эффективными при 27°С в течение длительных периодов времени, например, 12 месяцев, 18 месяцев или даже больше (например, от 1,5 до 3 лет).

В некоторых вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина представляет собой вакцину для птиц. В конкретных вариантах осуществления такого типа вакцин живая аттенуированная вакцина для птиц представляет собой вакцину для домашней птицы, содержащую живой аттенуированный птичий вирус. В более конкретных вариантах осуществления такого типа вакцин живой аттенуированной вакциной для домашней птицы является куриная вакцина, содержащая живой аттенуированныйй куриный вирус. В альтернативном варианте осуществления такого типа вакцин живая аттенуированная вакцина для домашней птицы представляет собой вакцину для индеек, содержащую живой аттенуированный индюшачий вирус.

В некоторых вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина представляет собой вакцину для млекопитающих. В конкретных вариантах осуществления такого типа вакцин живая аттенуированная вакцина для млекопитающих представляет собой вакцину для человека, содержащую живой аттенуированный человеческий вирус. В других таких вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина для млекопитающих представляет собой вакцину для крупного рогатого скота, содержащую живой аттенуированный бычий вирус. В других вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина для млекопитающих представляет собой вакцину для свиней, содержащую живой аттенуированный свиной вирус.

В других вариантах осуществления живой аттенуированной вакциной для млекопитающих является вакцина для животного-компаньона. В конкретных вариантах осуществления вакцины такого типа живая аттенуированная вакцина для животного-компаньона представляет собой вакцину для собак. В других вариантах осуществления вакцины такого типа живая аттенуированная вакцина для животного-компаньона представляет собой вакцину для кошек. В других вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина для животного-компаньона представляет собой вакцину для лошадей. Соответственно, в конкретных вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина для собак содержит живой аттенуированный собачий вирус. В других вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина для кошек содержит живой аттенуированный кошачий вирус. В других вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина для лошадей содержит живой аттенуированный лошадиный вирус.

В других вариантах осуществления живая аттенуированная вакцина содержит рекомбинантный вирус. В конкретных вариантах осуществления такого типа рекомбинантный вирус используют в качестве рекомбинантного вектора, который кодирует гетерологичный белок. В более конкретных вариантах осуществления такого типа гетерологичный белок представляет собой вирусный или бактериальный антиген. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения стабильных сухих композиций по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам хранения перед использованием вакцин по настоящему изобретению в виде стабильных сухих композиций при температуре 27°С в течение продолжительных периодов времени, например, в течение 12 месяцев или больше (например, от 1,5 до 3-х лет).

Настоящее изобретение также относится к способам введения животному стабильных сухих композиций по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления стабильную сухую композицию разводят перед введением для получения жидкой вакцины. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам профилактики заболевания у животного (то есть, у человека, животного-компаньона сельскохозяйственного животного) посредством введения сухой композиции (например, в виде порошка) и/или растворенной жидкой вакцины согласно изобретению. В конкретных вариантах осуществления животным-компаньоном является собака. В родственных вариантах осуществления животным-компаньоном является кошка. В других вариантах осуществления изобретения сельскохозяйственным животным является лошадь. В других вариантах осуществления настоящего изобретения сельскохозяйственным животным является корова. В других вариантах осуществления сельскохозяйственным животным является свинья. В других вариантах осуществления сельскохозяйственным животным является курица. В других вариантах осуществления сельскохозяйственным животным является индейка.

Таким образом, настоящее изобретение относится к сухим композициям вакцин, которые являются стабильными при комнатной температуре, и которые содержат живой аттенуированный вирус. В конкретных вариантах осуществления сухие композиции вакцины содержат сахарный стабилизатор. В родственных вариантах осуществления этого типа такая вакцина содержит сахарный стабилизатор в количестве от 15% до 80% (вес/вес). В конкретных вариантах осуществления сухие композиции вакцины содержат сахарный стабилизатор в количестве от 30% до 80% (вес/вес). В других конкретных вариантах осуществления эта вакцина содержит сахарный стабилизатор в количестве от 40% до 80% (вес/вес). В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит сахарный стабилизатор в количестве от 25% до 50% (вес/вес). В родственных вариантах осуществления вакцина содержит сахарный стабилизатор в количестве от 30% до 70% (вес/вес). В дополнительных конкретных вариантах осуществления вакцина содержит сахарный стабилизатор в количестве от 40% до 60% (вес/вес).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сахарный стабилизатор представляет собой невосстанавливающий олигосахарид. В конкретных вариантах осуществления такого типа невосстанавливающий олигосахарид представляет собой сахарозу. В других вариантах осуществления невосстанавливающий олигосахарид представляет собой трегалозу. В других вариантах осуществления невосстанавливающий олигосахарид представляет собой рафинозу. В других вариантах осуществления сахарный стабилизатор представляет собой сахарный спирт. В конкретном варианте осуществления такого типа сахарный спирт представляет собой сорбит. В других вариантах осуществления сахарный спирт представляет собой ксилит. В других вариантах осуществления сахарный спирт представляет собой мальтит.

В альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения сахарный стабилизатор фактически является комбинацией двух или нескольких сахарных стабилизаторов. В конкретных вариантах осуществления такого типа сахарный стабилизатор представляет собой комбинацию сахарозы и сорбита. В некоторых вариантах осуществления сахарный стабилизатор представляет собой комбинацию сахарозы и трегалозы. В других вариантах осуществления сахарный стабилизатор представляет собой комбинацию трегалозы и сорбита. В других вариантах осуществления сахарный стабилизатор представляет собой комбинацию сахарозы, трегалозы и сорбита.

Сухие композиции вакцины по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут дополнительно содержать один или несколько наполнителей-стабилизаторов. В конкретных вариантах осуществления содержание наполнителей-стабилизаторов в вакцинах составляет от 1% до 6% (вес/объем) в жидкой форме вакцины и от 2% до 25% (вес/вес) в сухой композиции. В некоторых вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой маннит. В родственных вариантах наполнитель- стабилизатор представляет собой глицин. В конкретных вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой декстран. В некоторых вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой мальтодекстрин. В конкретных вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой декстрозу. В других вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой поливинилпирролидон. В других вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой гидроксиэтилкрахмал. В других вариантах осуществления вакцины содержат комбинацию наполнителей-стабилизаторов. В некоторых вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор содержит два или несколько из следующих веществ: декстран, маннит, глицин, мальтодекстрин, поливинилпирролидон и гидроксиэтилкрахмал. В конкретных вариантах осуществления этого типа наполнитель-стабилизатор содержит маннит и глицин. В родственных вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор содержит декстран и глицин. В других вариантах осуществления этого типа наполнитель-стабилизатор содержит маннит, декстран и глицин.

В конкретных вариантах осуществления белковым стабилизатором является желатин. В других вариантах осуществления белковый стабилизатор представляет собой гидролизат суммарного казеина. В конкретных вариантах осуществления гидролизат суммарного казеина представляет собой протеолитический гидролизат суммарного казеина. В других вариантах осуществления белковый стабилизатор представляет собой комбинацию и желатина и протеолитического гидролизата суммарного казеина.

Сухие композиции вакцин по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут иметь уровень рН в диапазоне от рН 5,5 до рН 8,5. В конкретных вариантах осуществления уровень рН находится в диапазоне от 6,0 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень рН находится в диапазоне от 6,5 до 7,8. В конкретных вариантах осуществления уровень рН находится в диапазоне от 6,8 до 7,5. В других вариантах осуществления уровень рН находится в диапазоне от 6,0 до 7,6. В других вариантах осуществления уровень рН находится в диапазоне от 6,0 до 6,8. В других конкретных вариантах осуществления уровень рН находится в диапазоне от 7,0 до 7,4. В более конкретных вариантах осуществления уровень рН составляет 7,2. В других более конкретных вариантах осуществления уровень рН составляет 6,5.

Сухие композиции вакцин по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут содержать буфер. В конкретном варианте осуществления данного типа буфер содержит гистидин в количестве от 0,1% до 2% (вес/вес) (от 2,5 до 50 мМ перед сушкой). В родственном варианте осуществления буфер содержит гистидин в количестве 0,2% до 1% (вес/вес). В конкретных вариантах осуществления буфер содержит гистидин в количестве от 0,25% до 0,75% (вес/вес). В более конкретных вариантах осуществления буфер содержит гистидин в количестве 0,5% (вес/вес).

В других вариантах осуществления буфер содержит фосфат в количестве 0,1% до 2% (вес/вес) (или фосфат натрия, фосфат калия, или смесь этих двух веществ; от 2,5 до 50 мМ перед сушкой). В родственных вариантах осуществления буфер содержит фосфат в количестве от 0,2% до 1% (вес/вес). В конкретных вариантах осуществления буфер содержит фосфат в количестве от 0,25% до 0,75% (вес/вес). В более конкретных вариантах осуществления буфер содержит 0,5% фосфата (вес/вес).

В других вариантах осуществления буфер может содержать Трис в количестве от 2,5 до 50 мМ. В конкретных вариантах осуществления буфер содержит Трис от 2,5 до 50 мМ и гистидин от 2,5 до 50 мМ. В более конкретных вариантах осуществления буфер содержит Трис от 5 до 20 мМ и гистидин от 5 до 20 мМ. В дополнительных конкретных вариантах осуществления буфер содержит Трис от 7,5 до 15 мМ и гистидин от 7,5 до 15 мМ.

Сухие композиции вакцин по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут также содержать аминокислотный стабилизатор. В конкретных вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин. В других вариантах осуществления аминокислотным стабилизатором является глутаминовая кислота. В других вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор представляет собой аспарагиновую кислоту. В других вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор представляет собой лизин. В родственных вариантах осуществления сухие композиции вакцин по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, содержат два или несколько аминокислотных стабилизаторов. В конкретном варианте осуществления данного типа аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин и глутамат.

В некоторых вариантах осуществления концентрация аминокислотного стабилизатора в вакцине составляет в жидкой композиции от 0,1 до 0,4M [от 10% до 40% (вес/вес) в сухой композиции]. В конкретных вариантах осуществления концентрация аминокислотного стабилизатора в вакцине составляет от 0,25 до 0,35М в жидкой композиции. В более конкретных вариантах осуществления концентрация аминокислотного стабилизатора в вакцине составляет от 0,25 до 0,35М в жидкой композиции. В более конкретных вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор в жидкой композиции представляет собой аргинин 0,3 М.

Сухие композиции вакцин по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут также содержать белковый стабилизатор. Белковый стабилизатор может представлять собой интактный белок и/или белковый гидролизат. В конкретных вариантах осуществления белковый стабилизатор представляет собой желатин. В альтернативных вариантах осуществления белковый стабилизатор представляет собой гидролизат суммарного казеина. В некоторых вариантах осуществления гидролизатом суммарного казеина является протеолитический гидролизат суммарного казеина. В конкретных вариантах осуществления сухая композиция содержит белковый стабилизатор в количестве от 2% до 20% (вес/вес). В других конкретных вариантах осуществления белковый стабилизатор содержит от 1% до 10% (вес/вес) желатина. В других конкретных вариантах осуществления белковый стабилизатор содержит гидролизат суммарного казеина в количестве от 1% до 10% (вес/вес).

Сухие композиции вакцин по настоящему изобретению могут также содержать белковый стабилизатор, который включает и желатин и гидролизат суммарного казеина. В конкретных вариантах осуществления этого типа белковый стабилизатор содержит от 1% до 10% (вес/вес) желатина и от 1% до 10% (вес/вес) гидролизата суммарного казеина. В более конкретных вариантах осуществления белковый стабилизатор содержит от 2% до 5% (вес/вес) желатина и от 2% до 6% (вес/вес) гидролизата суммарного казеина. В других конкретных вариантах осуществления белковый стабилизатор содержит от 0,4% до 3,0% желатина (вес/вес) и от 0,5% до 3,0% (вес/вес) гидролизата суммарного казеина. В конкретных вариантах осуществления белковый стабилизатор содержит желатин в количестве 2,3% (вес/вес) и гидролизат суммарного казеина в количестве 2,8% (вес/вес). В других конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения белковый стабилизатор содержит желатин в количестве 3,3% (вес/вес) и гидролизат суммарного казеина в количестве 4,2% (вес/вес).

Любая из сухих композиций согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать соль двухвалентного катиона в количестве от 0,02% до 1% (вес/вес). В конкретных вариантах осуществления содержание двухвалентного катиона составляет от 1 мМ до 5 мМ в жидкой форме и от 0,1% до 0,5% (вес/вес) в сухой композиции. В некоторых вариантах осуществления двухвалентным катионом является магний (Mg⁺⁺). В других вариантах осуществления двухвалентным катионом является кальций (Са⁺⁺). В других вариантах осуществления двухвалентный катион представляет собой цинк (Zn⁺⁺). В других вариантах осуществления двухвалентный катион представляет собой смесь Mg⁺⁺ и/или Са⁺⁺ и/или Zn⁺⁺.

Любая из сухих композиций вакцин по настоящему изобретению, стабильных при комнатной температуре, может дополнительно содержать один или несколько осмолитов. В конкретных вариантах осуществления осмолитом является эктоин. В других конкретных вариантах осуществления осмолитом является гидроксиэктоин. В других вариантах осуществления осмолит представляет собой комбинацию эктоина и гидроксиэктоина. В конкретных вариантах осуществления процент осмолита в композиции составляет от 0,2% до 7,5% (вес/вес). В более конкретных вариантах осуществления процент осмолита в композиции составляет от 0,5% до 5% (вес/вес). В дополнительных конкретных вариантах осуществления процент осмолита в композиции составляет от 1% до 3% (вес/вес).

Сухие композиции вакцин по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут содержать живой аттенуированный вирус. В одном аспекте настоящего изобретения живым аттенуированным вирусом является собачий вирус. В родственном варианте осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой кошачий вирус. В другом варианте осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой лошадиный вирус.

В другом аспекте настоящего изобретения живой аттенуированный вирус представляет собой вирус сельскохозяйственного животного, например, вирус животного, которое содержат для получения продуктов питания. В одном таком варианте осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой птичий вирус. В конкретных вариантах осуществления этого типа птичий вирус представляет собой куриный вирус. В других вариантах осуществления этого типа птичий вирус представляет собой индюшачий вирус. В других таких вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой бычий вирус. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой свиной вирус.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой вирус чумы плотоядных (CDV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой аденовирус. В других вариантах осуществления живым аттенуированным вирусом является парвовирус. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой вирус парагриппа (CPI). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой вирус гриппа.

В другом аспекте настоящего изобретения живой аттенуированный вирус представляет собой вирус собак. В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой собачий вирус чумы плотоядных (CDV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой собачий аденовирус типа 2 (CAV2). В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой собачий парвовирус (CPV). В одном конкретном варианте осуществления данного типа парвовирус собак представляет собой собачий парвовирус 2 (CPV2). В другом конкретном варианте осуществления данного типа парвовирус собак представляет собой собачий парвовирус 2a (CPV-2a). В другом конкретном варианте этого типа парвовирус собак представляет собой собачий парвовирус 2b (CPV-2b). Еще в одном конкретном варианте этого типа парвовирус собак представляет собой собачий парвовирус 2c (CPV-2c). В конкретном варианте осуществления данного типа CPV-2с доступен в Американской коллекции типовых культур АТСС под № РТА-13492. Еще в одном варианте осуществления парвовирус собак представляет собой рекомбинантный собачий парвовирус, который был сконструирован с тем, чтобы содержать гетерогенный геном CPV-2с/CPV-2, таким образом, что участок, кодирующий капсидные белки, происходит из изолята CPV-2с, а участок, кодирующий неструктурные белки, происходит из изолята CPV-2 [см. патент US 2012/0328652 А1, содержание которого включено в данный документ путем ссылки в полном объеме, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая капсидный белок в геноме CPV-2, была заменена нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок в геноме CPV-2c, тем самым был получен гетерогенный геном CPV-2c/CPV-2]. В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой вирус парагриппа собак (CPI).

Настоящее изобретение также включает рекомбинантные вирусные векторы. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного вируса парагриппа. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного вируса парагриппа представляет собой вектор на основе рекомбинантного вируса парагриппа собак. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вирус парагриппа (например, вектор на основе рекомбинантного вируса собачьего парагриппа) кодирует и экспрессирует гетерологичный белок. В некоторых вариантах осуществления этого типа гетерологичный белок представляет собой антиген несобачьего происхождения. В более конкретных вариантах осуществления такой антиген несобачьего происхождения представляет собой вирусный антиген домашней птицы или бактериальный антиген домашней птицы. В других вариантах осуществления антиген несобачьего происхождения представляет собой вирусный антиген свиньи или бактериальный антиген свиньи. В других вариантах осуществления антиген несобачьего происхождения представляет собой бычий вирусный антиген или бычий бактериальный антиген. В других вариантах осуществления антиген несобачьего происхождения представляет собой кошачий вирусный антиген или кошачий бактериальный антиген. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантным вирусом парагриппа является рекомбинантный вирус 5 парагриппа.

В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой собачий коронавирус. В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой собачий пневмовирус. В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой вирус инфекционного гепатита собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой вирус герпеса собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой вирус бешенства. В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой собачий минут-вирус. В других вариантах осуществления живой аттенуированный собачий вирус представляет собой вирус собачьего гриппа. В альтернативных вариантах осуществления живой аттенуированный вирус является вирусом псевдобешенства.

Сухие композиции вакцин по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут содержать живой аттенуированный кошачий вирус. В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус кошачьего герпеса (FHV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус калицивироза (FCV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой кошачий пневмовирус (FPN). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой кошачий парвовирус (FPV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус лейкоза кошек (FeLV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус иммунодефицита кошек (FIV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус болезни Борна (BDV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус кошачьего гриппа. В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус панлейкопении кошек (FPLV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой кошачий коронавирус (FCoV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный кошачий вирус представляет собой вирус ринотрахеита кошек (FVR).

Дополнительно, настоящее изобретение относится к стабильным при комнатной температуре сухим композициям вакцин, которые представляют собой поливалентные вакцины. В конкретных вариантах осуществления поливалентные вакцины по настоящему изобретению содержат только живые аттенуированные вирусные вакцины. Такие поливалентные вакцины могут содержать любую комбинацию живых аттенуированных вирусов. В конкретных вариантах осуществления этого типа поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных и живой аттенуированный собачий парвовирус. В родственных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных и живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный собачий парвовирус и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный собачий парвовирус и живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированной собачий парвовирус, живой аттенуированной вирус парагриппа собак и живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2. В конкретных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный собачий парвовирус, живой аттенуированный вирус парагриппа собак, живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2 и живой аттенуированный собачий коронавирус. В родственных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный собачий парвовирус, живой аттенуированный вирус парагриппа собак, живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2 и живой аттенуированный кошачий коронавирус. В конкретных вариантах осуществления этого типа поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2, живой аттенуированный собачий парвовирус, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный вирус гриппа собак.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к стабильным при комнатной температуре сухим композициям поливалентных вакцин, которые содержат живой аттенуированный аденовирус типа 2 и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2 и живой аттенуированный собачий парвовирус. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий парвовирус и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2, живой аттенуированный собачий парвовирус и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В конкретных вариантах осуществления этого типа поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2, живой аттенуированный собачий парвовирус, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный вирус собачьего гриппа.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к стабильным при комнатной температуре сухим композициям поливалентных вакцин, которые содержат живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2 и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2 и живой аттенуированный собачий парвовирус. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий парвовирус и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2, живой аттенуированный собачий парвовирус и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В конкретных вариантах осуществления этого типа поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2, живой аттенуированный собачий парвовирус, живой аттенуированный собачий вирус парагриппа и живой аттенуированный вирус собачьего гриппа.

В любом из указанных выше вариантов осуществления живой аттенуированный собачий вирус может представлять собой рекомбинантный вирусный вектор. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного вируса парагриппа собак. В конкретных вариантах осуществления этого типа вектор на основе рекомбинантного вируса парагриппа собак кодирует и экспрессирует гетерологичный антиген. В других конкретных вариантах осуществления сухие композиции поливалентной вакцины, которые содержат собачий парвовирус (CPV), могут дополнительно содержать сорбит в количестве от 0,5% до 5% (вес/вес).

В конкретных вариантах осуществления титр живого аттенуированного вируса в сухих композициях вакцины (или каждого из вирусов в поливалентной вакцине) по настоящему изобретению, составляет от 1×10³ до 1×10¹⁰. В более конкретных вариантах осуществления титр составляет от 1×10⁴ до 1×10⁹. В дополнительных конкретных вариантах осуществления титр составляет от 5×10⁴ до 1×10⁸.

Таким образом, настоящее изобретение относится к сухим композициям вакцин, которые содержат живой аттенуированный вирус (например, вирус собак или вирус кошек или вирус лошадей или вирус свиней или вирус крупного рогатого скота или вирус домашней птицы), невосстанавливающие олигосахариды в количестве от 30% до 80% (вес/вес), аминокислотный стабилизатор в количестве от 6% до 40% (вес/вес), белковый стабилизатор от 2% до 20% (вес/вес) и буфер, имеющий рН от 6,0 до 8,0. В конкретных вариантах осуществления сухие композиции остаются эффективными в течение по меньшей мере 18 месяцев при температуре 27°С. В родственных вариантах осуществления сухие композиции дополнительно содержат наполнитель-стабилизатор в количестве от 2% до 25% (вес/вес). В конкретных вариантах осуществления этого типа соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающих олигосахаридов и/или сахарного спирта составляет от 0,025 до 0,60. В более конкретных вариантах осуществления соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающих олигосахаридов и/или сахарного спирта составляет от 0,05 до 0,40. В дополнительных конкретных вариантах осуществления соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающих олигосахаридов и/или сахарного спирта составляет от 0,075 до 0,30. В других конкретных вариантах осуществления соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающих олигосахаридов и/или сахарного спирта составляет от 0,1 до 0,25.

В конкретных вариантах осуществления невосстанавливающий олигосахарид в сухой композиции вакцины по настоящему изобретению содержит сахарозу, и/или трегалозу и/или рафинозу. В некоторых вариантах осуществления этого типа уровень рН сухой композиции составляет от 6,0 до 7,6. В конкретных вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой маннит. В родственных вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин. В некоторых вариантах осуществления этого типа аминокислотный стабилизатор дополнительно содержит глутамат.

В конкретных вариантах осуществления сухая композиция вакцины по настоящему изобретению содержит комбинацию из сахарозы в количестве от 20% до 80% (вес/вес) и трегалозу от 18% до 66% (вес/вес) в качестве невосстанавливающих олигосахаридов, маннит в количестве от 5% до 20% (вес/вес) в качестве наполнителя-стабилизатора, аминокислотный стабилизатор в количестве от 9% до 34% (вес/вес), комбинацию из желатина в количестве от 2% до 5% (вес/вес) и от 2% до 6% (вес/вес) протеолитического гидролизата суммарного казеина в качестве стабилизатора белка, и буфер с уровнем рН от 6,2 до 7,5. В конкретных вариантах осуществления этого типа соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающего олигосахарида составляет от 0,08 до 0,37.

В более конкретных вариантах осуществления невосстанавливающий олигосахарид представляет собой комбинацию из сахарозы от 45% до 60% (вес/вес) и трегалозы от 15% до 25% (вес/вес), наполнитель-материал стабилизатора представляет собой маннит в количестве от 5% до 17% (вес/вес), аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин от 10% до 25% (вес/вес); белковый стабилизатор содержит от 1,5% до 3,5% (вес/вес) желатина и от 2% до 4% (вес/вес) протеолитического гидролизата суммарного казеина, и уровень рН буфера составляет от 6,2 до 7,5. В конкретных вариантах осуществления этого типа соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающих олигосахаридов составляет от 0,1 до 0,3.

В некоторых вариантах осуществления сухая композиция вакцины для собак по настоящему изобретению содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных (CDV), собачий аденовирус типа 2 (CAV2) и вирус парагриппа собак (CPI); комбинацию сахарозы в количестве от 15% до 80% (вес/вес) и трегалозы от 15% до 80% (вес/вес) в качестве невосстанавливающего олигосахарида, при этом совокупное количество сахарозы и трегалозы составляет от 30% до 80% (вес/вес); от 2% до 25% (вес/вес) маннита в качестве наполнителя-стабилизатора, при этом соотношение общего количества наполнителя-стабилизатора и общего количества невосстанавливающих олигосахаридов составляет от 0,05 до 0,4; белковый стабилизатор представляет собой комбинацию от 1% до 10% (вес/вес) желатина и протеолитического гидролизата суммарного казеина в количестве от 1% до 10% (вес/вес); содержит от 6% до 40% (вес/вес) аргинина в качестве аминокислотного стабилизатора; и уровень рН буфера составляет от 6,2 до 7,5. В конкретных вариантах осуществления этого типа сухая композиция дополнительно содержит одно, или несколько, или все из следующих компонентов: (i) от 0,5% до 5,0% экотоина, (ii) от 5% до 15% глутамата, (iii) от 0,02% до 1% MgSO₄ и (iv) живой аттенуированной собачий парвовирус (CPV) с сорбитом в количестве от 2% до 5%. В более конкретных вариантах осуществления буфер представляет собой фосфат калия или натрия в количестве от 0,1% до 2%, с уровнем рН от 6,2 до 7,5.

В более конкретных вариантах осуществления сухая композиция вакцины для собак по настоящему изобретению содержит живые аттенуированные вирусы CDV, CAV2 и CPI; комбинацию сахарозы в количестве от 20% до 80% (вес/вес) и трегалозы от 18% до 66% (вес/вес) в качестве невосстанавливающих олигосахаридов, при этом совокупное количество сахарозы и трегалозы составляет от 45% до 79% (вес/вес); от 5% до 17% (вес/вес) маннита в качестве наполнителя-стабилизатора, при этом соотношение общего количества наполнителя-стабилизатора и общего количества невосстанавливающих олигосахаридов составляет от 0,08 до 0,37; белковый стабилизатор, представляющий собой комбинацию желатина от 2% до 5% (вес/вес) и протеолитического гидролизата суммарного казеина от 2% до 6% (вес/вес); аминокислотный стабилизатор, представляющий собой аргинин в количестве от 9% до 34% (вес/вес); и уровень рН буфера составляет от 6,5 до 7,2.

В конкретных вариантах осуществления этого типа сухая композиция дополнительно содержит один, или несколько, или все из следующих компонентов: (i) от 1% до 3% экотоина, (ii) от 7% до 12% глутамата, (iii) от 0,05% до 0,5% MgSO₄, и (iv) живой аттенуированный CPV с сорбитом в количестве от 3% до 4%. В конкретных вариантах осуществления буфер представляет собой фосфат калия или натрия в количестве от 0,2% до 1%, уровень рН от 6,5 до 7,2. В некоторых указанных типах вариантов осуществления сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при температуре 27°С в течение не менее 18 месяцев.

В альтернативном аспекте настоящее изобретение относится к сухим композициям вакцин, которые содержат живой аттенуированный парвовирус, например, собачий парвовирус (CPV), от 10% до 80% (вес/вес) сахарного спирта, от 10% до 70% (вес/вес) наполнителя-стабилизатора, от 4% до 50% (вес/вес) белкового стабилизатора и буфер с уровнем рН от 6,8 до 8,0. В конкретных вариантах осуществления этого типа сухая композиция дополнительно содержит аминокислотный стабилизатор в количестве от 10% до 50% (вес/вес). В некоторых вариантах осуществления сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при температуре 27°С в течение по меньшей мере 18 месяцев.

В более конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сухим композициям вакцин, которые содержат живой аттенуированный парвовирус, например, CPV, сахарный спирт в количестве от 23% до 49% (вес/вес), от 16% до 50% (вес/вес) наполнителя-стабилизатора, от 7% до 36% (вес/вес) белкового стабилизатора и буфер с уровнем рН от 7,0 до 7,4. В других более конкретных вариантах осуществления этого типа сухая композиция дополнительно содержит аминокислотный стабилизатор в количестве от 25% до 36% (вес/вес). В некоторых вариантах осуществления сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при температуре 27°С в течение по меньшей мере 18 месяцев.

В сухих композициях указанных моновалентных парвовирусных вакцин, например, моновалентных вакцин CPV, сахарным спиртом может быть сорбит, маннит, ксилит, мальтит и их комбинации, наполнителем-стабилизатором может быть декстран, мальтодекстрин, поливинилпирролидон, гидроксиэтилкрахмал, глицин или любая их комбинация. Белковый стабилизатор может представлять собой желатин, гидролизат суммарного казеина или комбинацию из этих двух веществ. В некоторых вариантах осуществления такого типа гидролизатом суммарного казеина является протеолитический гидролизат суммарного казеина. В конкретных вариантах осуществления сахарный спирт представляет собой сорбит, наполнитель-стабилизатор представляет собой комбинацию декстрана и глицина, и белковый стабилизатор представляет собой комбинацию желатина и протеолитического гидролизата суммарного казеина.

В более конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сухим композициям вакцин, содержащим живой аттенуированный парвовирус, например, CPV, содержащим в качестве сахарного спирта сорбит в количестве от 10% до 80% (вес/вес), комбинацию глицина от 5% до 30% (вес/вес) и от 5% до 40% (вес/вес) декстрана в качестве наполнителя-стабилизатора, комбинацию желатина а количестве от 2% до 25% (вес/вес) и от 2% до 25% (вес/вес) протеолитического гидролизата суммарного казеина в качестве белкового стабилизатора; и буфер, имеющий уровень рН от 6,5 до 7,8. В некоторых вариантах осуществления такого типа в качестве аминокислотного стабилизатора в композицию включен аргинин в количестве от 10% до 50% (вес/вес). В конкретных вариантах осуществления буфер представляет собой фосфат калия или натрия в количестве от 0,2% до 5% (вес/вес), рН от 6,5 до 7,8. В некоторых вариантах осуществления сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при температуре 27°С в течение не менее 18 месяцев.

В дополнительных конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сухим композициям вакцин, которые содержат живой аттенуированный парвовирус, например, CPV, содержат от 23% до 49% (вес/вес) сорбита в качестве сахарного спирта, комбинацию от 8% до 17% (вес/вес) глицина и от 8% до 33% (вес/вес) декстрана в качестве наполнителя-стабилизатора, комбинацию от 3% до 18% (вес/вес) желатина и от 4% до 18% (вес/вес) протеолитического гидролизата суммарного казеина в качестве белкового стабилизатора; и буфер с уровнем рН от 7,0 до 7,4. В некоторых вариантах осуществления такого типа в композицию в качестве аминокислотного стабилизатора включен аргинин в количестве от 25% до 36% (вес/вес). В конкретных вариантах осуществления буфер представляет собой фосфат калия или натрия в количестве от 0,5% до 2% (вес/вес), уровень рН от 7,0 до 7,4. В некоторых вариантах осуществления сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при температуре 27°С в течение по меньшей мере 18 месяцев.

В конкретных вариантах осуществления парвовирус собак (CPV) представляет собой собачий парвовирус 2 (CPV-2). В другом конкретном варианте осуществления данного типа парвовирус собак представляет собой собачий парвовирус 2a (CPV-2a). В другом конкретном варианте осуществления такого типа парвовирус собак представляет собой собачий парвовирус 2b (CPV-2b). Еще в одном конкретном варианте осуществления такого типа парвовирус собак представляет собой собачий парвовирус 2С (CPV-2с). В конкретном варианте осуществления данного типа вирус CPV-2с доступен в АТСС под номером РТА-13492. Еще в одном варианте осуществления собачий парвовирус представляет собой рекомбинантный собачий парвовирус, который сконструирован, чтобы содержать гетерогенный геном CPV-2с/CPV-2, таким образом, участок, кодирующий капсидные белки, происходит из изолята CPV-2с, а участок, кодирующий неструктурные белки, происходит из изолята CPV-2 [см. патент US 2012/0328652 А1, содержание которого включено в данный документ путем ссылки в полном объеме, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая капсидный белок в геноме CPV-2, была заменена нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок в геноме CPV-2c, и таким образом был получен гетерогенный геном CPV-2c/CPV-2].

В рамках способа изготовления стабильных сухих композиций живых аттенуированных вакцин по настоящему изобретению, соответствующие композиции жидких вакцин могут быть нанесены на мембрану, и/или заморожены в виде шариков (гранул), и/или заморожены в контейнерах, например, во флаконах, и/или подвергаться распылительной сушке, и/или распылительной сушке вымораживанием, и/или доведены до состояния пены, и/или помещены в имплантат с отсроченным высвобождением.

Настоящее изобретение также относится к способам, способствующим защите животного (например, кошки или собаки) от клинического проявления заболевания, которое возникает вследствие инфекции (например, обусловлено кошачьим или собачьим вирусом), и указанный способ содержит введение животному растворенной вакцины по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют через слизистую оболочку. В других вариантах осуществления введение осуществляют парентерально. В других вариантах осуществления введение осуществляют внутрикожно. В других вариантах осуществления введение осуществляют чрескожно. В более конкретных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят животному подкожно. В других конкретных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят животному внутримышечно. Настоящее изобретение также включает применение вакцин для примирования и/или бустер-вакцин.

В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество живого аттенуированного вируса представляет собой терапевтически эффективное количество живого аттенуированного собачьего вируса. В конкретных вариантах осуществления такого типа терапевтически эффективное количество живого аттенуированного собачьего вируса включает терапевтически эффективные количества живого аттенуированного собачьего вируса чумы плотоядных и/или живого аттенуированного собачьего аденовируса типа 2, и/или живого аттенуированного собачьего парвовируса, и/или живого аттенуированного вируса собачьего парагриппа.

В конкретных вариантах осуществления животным по изобретению является собака, и способ содержит введение собаке растворенной вакцины по настоящему изобретению, которая стабильна при комнатной температуре и содержит живой аттенуированный вирус. В конкретных вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2 и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В некоторых вариантах осуществления этого типа стабильная при комнатной температуре вакцина содержит живой аттенуированный собачий вирус чумы плотоядных, живой аттенуированный собачий аденовирус типа 2, живой аттенуированной собачий вирус парагриппа, а также живой аттенуированный вирус собачьего гриппа или живой аттенуированный собачий парвовирус, или, в качестве альтернативы, комбинацию живого аттенуированного собачьего вируса гриппа и живого аттенуированного собачьего парвовируса.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к растворенной вакцине, сделанной из любой одной или нескольких сухих композиций, представленных в изобретении, и фармацевтически приемлемого носителя. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к поливалентной вакцине, приготовленной из комбинации сухой композиции трехвалентной вакцины CDV, CAV2 и CPI с отдельной сухой композицией моновалентной вакцины CPV и фармацевтически приемлемого носителя.

Также изобретение относится к способам изготовления и/или хранения при комнатной температуре (например, от 22 до 27°C) любой и всех сухих композиций вакцин по настоящему изобретению, стабильных при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления способ содержит получение вакцинной композиции путем объединения терапевтически эффективного количества живых аттенуированных кошачьих или собачьих вирусов и невосстанавливающего олигосахарида в количестве от 8% до 30% (вес/объем), аминокислотного стабилизатора от 0,1М до 0,5М, белкового стабилизатора от 0,9% до 10% (вес/объем) и буфера с уровнем рН от 6,0 до 8,0. Обычно после смешивания, хотя не всегда, вакцинную композицию замораживают, а затем высушивают в вакууме для получения сухой композиции вакцины, стабильной при комнатной температуре. Чтобы ускорить удаление влаги, можно повышать температуру внутри сублимационной сушилки в ходе этого этапа. Предпочтительно сухая композиция вакцины сохраняет эффективность в течение, по меньшей мере 18 месяцев при хранении при температуре 27°С.

В конкретных вариантах осуществления этого типа композиция вакцины дополнительно содержит наполнитель-стабилизатор в количестве от 1% до 6% (вес/объем). В более конкретном варианте осуществления данного типа соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающих олигосахаридов составляет от 0,05 до 0,40. В некоторых вариантах осуществления в композицию также включен сорбит в количестве от 0,5% до 5% (вес/объем). В конкретных вариантах осуществления наполнитель-стабилизатор представляет собой маннит. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин. В других вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор представляет собой глутамат. В других вариантах осуществления аминокислотный стабилизатор представляет собой комбинацию аргинина и глутамата.

Способы изготовления любых и всех сухих вакцинных композиций по настоящему изобретению, стабильных при комнатной температуре, могут включать, перед сушкой, нанесение жидкой вакцинной композиции на мембрану, и/или замораживание в гранулы, и/или замораживание во флаконах, и/или распылительную сушку, и/или распылительную сушку вымораживанием и/или доведение до состояния пены.

В конкретных вариантах осуществления способов изготовления стабильной при комнатной температуре вакцины такой способ содержит комбинирование терапевтически эффективного количества живого аттенуированного вируса и невосстанавливающего олигосахарида, который представляет собой комбинацию сахарозы от 5% до 18% (вес/объем) и трегалозы от 5% до 18% (вес/объем), наполнителя-стабилизатора от 2% до 4% (вес/объем), аминокислотного стабилизатора от 0,1М до 0,3М и белкового стабилизатора от 1,5% до 6% (вес/объем). В более конкретных вариантах осуществления соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающего олигосахарида составляет от 0,08 до 0,37. В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой живой аттенуированный собачий вирус. В родственных вариантах осуществления живой аттенуированный вирус представляет собой живой аттенуированный кошачий вирус.

Упомянутые и другие аспекты настоящего изобретения будут более понятны из последующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к безопасным и эффективным живым аттенуированным вирусным вакцинам и/или к иммуногенным композициям, которые могут храниться в виде сухих композиций при комнатной температуре и при этом сохранять безопасность и эффективность в течение 12, или 18 или даже 24 месяцев или больше. Таким образом, одним из основных преимуществ сухих композиций вакцин по настоящему изобретению, стабильных при комнатной температуре, является отсутствие необходимости их хранения или в холодильнике или в морозильной камере. Это значительно уменьшает стоимость хранения, особенно в удаленных районах, и, кроме того, устраняет необходимость оценивать вакцину на безопасность и эффективность в случае, если при хранении нарушалась работа холодильника или морозильной камеры.

Кроме того, удивительно, но стабильные при комнатной температуре композиции живых вирусных вакцин по настоящему изобретению могут включать живые аттенуированные вирусы любого типа. Таким образом, стабильные при комнатной температуре композиции живых вирусных вакцин по настоящему изобретению могут включать как оболочечные, так и не оболочечные вирусы. Дополнительно, стабильные при комнатной температуре сухие композиции живых вирусных вакцин по настоящему изобретению могут включать живые аттенуированные вирусы с геномами в виде одноцепочечной РНК, геномами в виде одноцепочечной ДНК или с геномами в виде двухцепочечной ДНК. В одном из аспектов настоящего изобретения живые вирусные вакцины по настоящему изобретению включают живые аттенуированные вирусы собак и/или кошек. Настоящее изобретение дополнительно относится к стабильным при комнатной температуре вакцинам, которые представляют собой поливалентные вакцины. Кроме того, стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать убитый вирус и/или убитую бактерию (например, бактерин), и/или субфракцию бактерина и/или субъединицу вируса или бактерии (например, белковый антиген).

Дополнительно, живые вирусные композиции по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, могут содержать рекомбинантные векторы, такие как рекомбинантные вирусные векторы (в том числе рекомбинантные бакуловирусы), которые присутствуют в качестве единственного вирусного компонента, и/или с другими такими же рекомбинантными вирусными векторами, и/или с живыми аттенуированными вирусами и/или в комбинации с убитыми бактериями и/или убитыми вирусами, например, с убитыми собачьими вирусами. Такие рекомбинантные вирусные векторы могут дополнительно кодировать один или несколько гетерологичных вирусных или бактериальных антигенов. Конкретным примером такого рекомбинантного вектора является рекомбинантный вирус парагриппа, например, вирус парагриппа собак. Одним из векторов на основе рекомбинантного вируса парагриппа является рекомбинантный вирус 5 парагриппа, который недавно был описан авторами Li et al., (J. of Virology 87(10) 5985-5993 (2013); эта публикация включена в настоящее изобретение в полном объеме путем ссылки]. Такие рекомбинантные вирусные векторы, например, рекомбинантный вирус 5 парагриппа или вектор на основе рекомбинантного вирус парагриппа собак, могут кодировать гетерологичный антиген из собачьего вируса, и/или из кошачьего вируса, и/или из лошадиного вируса, и/или из человеческого вируса, и/или из обезьяньего вируса, и/или из коровьего вируса, и/или из овечьего вируса, и/или из свиного вируса и/или из вируса домашней птицы (например, куриного вируса). В конкретных вариантах осуществления стабильные при комнатной температуре сухие композиции вакцины по настоящему изобретению содержат рекомбинантный вирус парагриппа (например, рекомбинантный вирус 5 парагриппа или рекомбинантный вирус парагриппа собак), который кодирует один или несколько антигенов из одного или нескольких куриных вирусов и/или бактерий, которые инфицируют кур.

В альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения стабильные при комнатной температуре сухие композиции вакцины по настоящему изобретению могут содержать живые аттенуированные вирусы крупного рогатого скота и/или бактерии, которые заражают крупный рогатый скот. В конкретных вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре вакцина содержит живой аттенуированный BVDV1, живой аттенуированный BVDV2 и живой аттенуированный вирус IBR. В других вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре вакцина содержит живой аттенуированный BVDV1, живой аттенуированный BVDV2, живой аттенуированный вирус PI3 и живой аттенуированный вирус BRSV. В других вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре вакцина содержит живой аттенуированный BVDV1, живой аттенуированный BVDV2, живой аттенуированный вирус PI3, живой аттенуированный вирус IBR и живой аттенуированный BRSV. В других вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре вакцина содержит живой аттенуированный BVDV1, живой аттенуированный BVDV2, живой аттенуированный вирус PI3, живой аттенуированный вирус IBR, живой аттенуированный BRSV и живой аттенуированный вирус BRCV. Любую из стабильных при комнатной температуре вакцин по настоящему изобретению также можно объединять перед введением с одним или несколькими аттенуированными или убитыми бактериальными антигенами, такими как Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni и Mycoplasma bovis. Один из таких вариантов осуществления представляет собой стабильную при комнатной температуре вакцину, содержащую живой аттенуированный BVDV1, живой аттенуированный BVDV2, живой аттенуированный вирус PI3, живой аттенуированный вирус IBR и живой аттенуированный вирус BRSV (плюс или минус живой аттенуированной BRCV) с живой аттенуированной Pasteurella multocida, живой аттенуированной Mannheimia haemolytica и живой аттенуированной Histophilus somni. В конкретных вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагаются способы, содержащие введение стабильной при комнатной температуре коровьей вакцины по настоящему изобретению, которая содержит живой аттенуированный коровий вирус.

Стабильные при комнатной температуре сухие композиции вакцин по настоящему изобретению могут содержать, в качестве альтернативы, живые аттенуированные вирусы и/или бактерии домашней птицы, которые инфицируют домашних птиц. В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный вирус домашней птицы представляет собой вирус инфекционного бронхита (IBV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус домашней птицы представляет собой вирус инфекционного бурсита (IBDV). В дополнительных вариантах осуществления живой аттенуированный вирус домашней птицы представляет собой вирус болезни Ньюкасла (NDV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус домашней птицы представляет собой вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус домашней птицы представляет собой птичий метапневмовирус (AMPV). В других вариантах осуществления изобретения живой аттенуированный вирус домашней птицы представляет собой вирус болезни Марека (MDV). В других вариантах осуществления живой вирус домашней птицы представляет собой вирус индюшачьего герпеса (HVT). [HVT не является патогенным для кур.]

Живые вирусы домашней птицы также могут быть рекомбинантными векторами. Это особенно верно для вирусов HVT и двух других вирусов MDV, т.е. для MDV1 и MDV2. В настоящее время коммерчески доступны векторы на основе рекомбинантного HVT, которые кодируют антигены из вируса болезни Ньюкасла или вируса инфекционного ларинготрахеита. В последнее время были описаны два уникальных вектора рекомбинантного HVT, которые кодируют антигены из обоих вирусов NDV и ILTV или из обоих вирусов NDV и IBDV [см. патенты US 2013/0101619 А1 и WO2013057235 А1, соответственно; содержание этих двух патентов включено в настоящее изобретение в полном объеме путем ссылки]. Стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению могут содержать любой из этих рекомбинантных вирусных векторов, предназначенных для домашней птицы, либо по отдельности, либо в любой комбинации, как описано в настоящем изобретении. Кроме того, любая из вакцин по настоящему изобретению, стабильных при комнатной температуре, содержащая одну или несколько живых вирусных птичьих вакцин, может дополнительно содержать убитый вирус, и/или убитые бактерии, и/или субфракцию бактерина, или даже паразит, например, живой Eimeria, который является или аттенуированным или не аттенуированным. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, содержащим введение домашней птице, например, курице, стабильную при комнатной температуре вакцину по настоящему изобретению, которая содержит живой аттенуированный вирус домашней птицы.

Еще в одном аспекте стабильная при комнатной температуре сухая композиция вакцины по настоящему изобретению может содержать живой аттенуированный свиной вирус. В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный свиной вирус представляет собой вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGE). В других вариантах осуществления живой аттенуированный свиной вирус представляет собой вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS). В других вариантах осуществления живой аттенуированный свиной вирус представляет собой вирус эпидемической диареи свиней (PED). В других вариантах осуществления живой аттенуированный свиной вирус представляет собой вирус свиного гриппа (SIV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный свиной вирус представляет собой ротавирус свиней (PRV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный свиной вирус представляет собой парвовирус свиней (PPV). В других вариантах осуществления изобретения живой аттенуированный свиной вирус представляет собой вирус свиного псевдобешенства (PPRV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный свиной вирус является цирковирусом свиней (PCV).

Поливалентные вакцины по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию свиных вирусов. В некоторых вариантах осуществления поливалентные вакцины по настоящему изобретению содержат и убитые свиные вирусы и живые аттенуированные свиные вирусы. В конкретном варианте осуществления данного типа поливалентная вакцина содержит убитый вирус свиного гриппа SIV, субъединицу свиного цирковируса или убитый цирковирус свиней (PCV) [который включает бакуловирус-экспрессируемые антигены PCV, см. патент US 8008001, содержание которого включено в настоящее изобретение путем ссылки], вместе с живым аттенуированным вирусом трансмиссивного гастроэнтерита (TGE) и живым аттенуированным свиным парвовирусом (PPV). В родственном варианте осуществления поливалентная вакцина содержит антиген убитого свиного цирковируса (PCV), несколько серотипов убитого вируса свиного гриппа (SIV) и комбинацию убитого и живого аттенуированного вируса трансмиссивного гастроэнтерита (TGE), а также живой аттенуированный свиной ротавирус (PRV). В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, содержащим введение свинье стабильной при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению, которая содержит живой аттенуированный свиной вирус. В родственных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит антиген живого аттенуированного и/или инактивированного свиного цирковируса (PCV) и/или его субъединицу, антиген живого аттенуированного и/или инактивированного свиного вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) и/или его субъединицу, и/или антиген живого аттенуированного и/или инактивированного вирус эпидемической диареи свиней (PED) или его субъединицу.

Стабильные при комнатной температуре живые аттенуированные свиные вирусные вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать убитые вирусы и/или убитые бактерии (например, бактерин) и/или субфракцию бактерина. В конкретном варианте осуществления такого типа поливалентная вакцина содержит инактивированный анатоксин Clostridium perfringens, фимбриальный антиген, извлеченный из бактерий E.coli любого из следующих серотипов: K99, K88, 987P или F41, в комбинации с живым аттенуированным вирусом трансмиссивного гастроэнтерита (TGE) и живым аттенуированным свиным парвовирусом (PPV). В родственном варианте осуществления мультивалентная свиная вакцина содержит антиген убитого свиного цирковируса (PCV) или его субъединицу, убитую Mycoplasma hyopneumonia (М. hyo), инактивированный или живой аттенуированный бактерин Lawsonia intracellularis, вместе с живым аттенуированным и/или инактивированным вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) и/или с живым аттенуированным или инактивированным вирусом эпидемической диареи свиней (PED).

Сухие композиции вакцины по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, включают по меньшей мере один сахарный стабилизатор, по меньшей мере один белковый стабилизатор и по меньшей мере один буфер для поддержания рН жидкой формы вакцины на уровне от 5,5 до 8,5. Также можно добавлять по меньшей мере один наполнитель-стабилизатор. Соответственно, стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению хранятся в виде сухих композиций. Такие сухие композиции могут быть получены способами, включающими сублимационную сушку в шариках, например, в сферических гранулах, называемых лиосферами и/или сфереонами, которые получают способом, описанным ранее [см., например, патенты WO 2010/125084, US 2012/0049412 A1 и US 2014/0017318; содержание всех из указанных документов включено в настоящее изобретение путем ссылки в полном объеме], или получены в виде лиофилизированной массы "лепешки", например, во флаконах, или высушены на твердой матрице, например, на мембране или фильтре, или в качестве альтернативы, высушены в виде порошка, или путем распылительной сушки, или путем распылительной сушки с замораживанием, или доведены до состояния пены.

Активные иммуногенные фракции моновалентных или поливалентных вакцин могут содержать один или несколько вирусов и/или бактерий. Соответственно, стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению могут подвергаться сублимационной сушке (или уменьшению объема жидкости другим способом) для хранения, а затем возвращаться в жидкое состояние в жидком носителе, например, с помощью фармацевтически приемлемого носителя, такого как вода со степенью качества для вакцин, или другого разбавителя, перед введением или во время введения. В конкретных вариантах осуществления растворитель содержит один или несколько других вирусных и/или бактериальных антигенов. В качестве альтернативы, стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению могут быть введены в виде твердого вещества, например, когда твердое вещество представляет собой порошок, а устройство для инъекций представляет собой безыгольный инжектор для порошков, например, PowderJect®.

В настоящем описании используемые термины в единственном числе служит для удобства и никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения. Таким образом, например, упомянутый "сахарный стабилизатор" включает ссылку на один или несколько таких сахарных стабилизаторов, если не указано иное. Использование терминов во множественном числе также не предназначено для ограничения объема изобретения, если не указано иное.

Аналогичным образом, химическое соединение, которое может упоминаться как кислота или ее соответствующее основание, в любом случае упоминания в настоящем документе, предназначено для обозначения любой формы соединения, если не указано иное. Таким образом, при использовании термина "глутаминовая кислота" в него включен глутамат, и наоборот.

Используемый в описании термин "вакцина" относится к композиции, подходящей для применения у животных (в том числе людей, в некоторых вариантах осуществления), которая при введении животному вызывает иммунный ответ, достаточно сильный для того, чтобы минимально способствовать защите от клинического проявления заболевания, возникающего в результате инфицирования микроорганизмом дикого типа, то есть, достаточно сильный ответ, способствующий предотвращению клинического проявления заболевания, и/или предотвращающий, уменьшающий интенсивность симптомов или излечивающий это заболевание. Если специально не указано иное, в термин "вакцина", используемый в изобретении, включены поливалентные вакцины.

Используемая в изобретении "эффективная" вакцина сохраняет достаточное количество титра данного антигена, чтобы соответствовать нормативным требованиям в отношении данного антигена, действующим в стране или на территории, где применяется эта вакцина, например, применение вакцины для животных в Соединенных Штатах Америки регулируется Департаментом сельского хозяйства США (USDA).

Используемый в описании термин "поливалентная вакцина" относится к вакцине, которая содержит два или несколько разных антигенов. В конкретном варианте осуществления данного типа поливалентная вакцина стимулирует иммунную систему реципиента в отношении двух или нескольких разных патогенов.

Используемая в изобретении "стабильная при комнатной температуре" сухая композиция вакцины представляет собой сухую композицию вакцины (в том числе поливалентной вакцины), которая сохраняет эффективность в течение, по меньшей мере одного года при хранении при температуре 27°С. В конкретных вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при хранении при температуре 27°С в течение не менее 1,5 года. В более конкретных вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при хранении при температуре 27°С в течение по меньшей мере 2-х лет. В других конкретных вариантах осуществления стабильная при комнатной температуре сухая композиция вакцины сохраняет эффективность при хранении при температуре 27°С в течение по меньшей мере от 2,5 до 3-х лет.

Используемую в изобретении "сухую композицию" вакцины получают путем удаления жидкости из вакцины, рецептура которой подразумевает форму раствора. Удаление жидкости можно осуществлять посредством, например, выпаривания, например, путем нанесения жидкой вакцины на твердый субстрат и испарения жидкости, и/или путем сублимации, например, путем лиофилизации (сушки с замораживанием). Вакцины по настоящему изобретению хранятся в виде сухих композиций с содержанием остаточной влажности (RMC), обычно составляющей от 0,5% до 10,0% (вес/вес). Перед введением можно восстанавливать жидкое состояние сухих композиций растворением в фармацевтически приемлемом носителе. В конкретных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению хранятся в виде сухих композиций, имеющих остаточное содержание влаги от 0,5% до 5% (вес/вес). В более конкретных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению хранятся в виде сухих композиций, имеющих содержание остаточной влаги от 0,5% до 3% (вес/вес).

Поскольку вакцины по настоящему изобретению хранятся в виде сухих композиций, термин "вакцина" по настоящему изобретению также относится к композициям, содержащим один или несколько антигенов, которые хранятся в виде сухих композиций. Как указано выше, за некоторое время перед введением эти сухие композиции можно объединять с фармацевтически приемлемым носителем. Антигены из поливалентной вакцины могут храниться в той же сухой композиции, или в отдельных сухих композициях. Соответственно, в некоторых поливалентных вакцинах разные вакцинные антигены хранят по отдельности в виде самостоятельных сухих композиций, а затем перед введением их объединяют с фармацевтически приемлемым носителем для получения поливалентной вакцины. В качестве альтернативы, множество вакцинных антигенов можно объединять и хранить в виде единой сухой композиции, а затем перед введением их можно смешивать с фармацевтически приемлемым носителем и одним или несколькими другими вакцинными антигенами, которые хранились в одной или нескольких отдельных сухих композициях.

Используемый в данном документе термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или веществу-носителю, вместе с которым осуществляют введение этого соединения.

Согласно настоящему изобретению, термин "фармацевтически приемлемый", используемый в качестве определения, означает, что модифицированное таким образом вещество подходит для использования в качестве фармацевтического продукта. Когда этот термин используется, например, для описания вспомогательного вещества в фармацевтической вакцине, он характеризует вспомогательное вещество, например, фармацевтически приемлемый носитель, как совместимое с другими ингредиентами композиции и не оказывающее на предполагаемого реципиента неблагоприятного вредного действия. Фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и/или масла, включающие масла из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. В качестве носителей можно использовать воду или водный раствор, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности, для инъекционных растворов. В конкретных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель является адъювантом и/или содержит адъювант. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель может дополнительно содержать один или несколько вакцинных антигенов, которые перед введением можно объединять с сухой композицией вакцины по настоящему изобретению.

Используемый в настоящем описании "адъювант" представляет собой вещество, которое может способствовать каскаду иммунологических событий или усиливать его, что в конечном итоге приводит к улучшению иммунного ответа, т.е. интегрированного ответа организма на антиген. Адъювант в общем не является необходимым для возникновения иммунного ответа, но способствует или усиливает эту реакцию.

Используемые в настоящем изобретении понятия "защита", "защищать", "обеспечение защиты", "обеспечивать защиту" и "способствовать защите" не подразумевают полную защиту от каких-либо признаков инфекции. Например, "способствовать защите" может означать, что защита является достаточной для того, чтобы после заражения симптомы основной инфекции были, по меньшей мере, уменьшены, и/или, чтобы одна или несколько из основных клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих эти симптомы, были уменьшены и/или устранены. Следует понимать, что понятие "уменьшение", используемое в данном контексте, означает сравнение с состоянием инфекции, в том числе с состоянием инфекции на молекулярном уровне, а не только с физиологическим состоянием инфекции.

Используемый в настоящем изобретении термин "терапевтически эффективное количество" означает количество данного антигена, например, живого аттенуированного вируса, которое является достаточным для обеспечения защиты и/или облегчения защиты от патогена, для защиты против которого вводится этот антиген, в случае, если предусмотрено его однократное введение и/или, если он предназначен для первичного введения с последующим применением одного или нескольких бустерных введений.

Используемый в настоящем изобретении термин "системное введение" означает введение в кровеносную систему организма (содержащую сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), которое тем самым оказывает воздействие на организм в целом, а не в конкретной локализации, например, в желудочно-кишечном тракте (например, путем перорального или ректального введения) и в дыхательной системе (например, путем интраназального введения). Системное введение может быть осуществлено, например, путем введения в мышечную ткань (внутримышечно), в кожу (внутрикожное, чрескожное или накожное введение), под кожу (подкожное), под слизистую оболочку (подслизистое), в вены (внутривенное введение) и т.д.. "Парентеральное введение" включает подкожные инъекции, подслизистые инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и инфузии.

Используемые в изобретении понятия "домашний скот" и "сельскохозяйственное животное" включают крупный рогатый скот, свиней и домашнюю птицу. Используемые в настоящем изобретении понятия "коровий/бычий" и "крупный рогатый скот" используются как синонимы, если не указано иное. Аналогично, понятия "свинья", "кабан" и "поросенок" используются как синонимы, если не указано иное. Используемые в данном изобретении термины "птицы/птичий" и "пернатые" используются взаимозаменяемо, и оба термина включают домашнюю птицу. Используемое в изобретении понятие "домашняя птица" может включать кур, индеек, уток, гусей, перепелов и фазанов.

Используемое в настоящем изобретении понятие "животное-компаньон" включает собак, кошек и лошадей.

Используемое в настоящем изобретении понятие "кошка" относится к любому члену семейства кошачьих. Члены этого семейства включают диких, содержащихся в зоопарке и домашних представителей этого семейства, таких как любые представители подсемейства Felinae, например, кошки, львы, тигры, пумы, ягуары, леопарды, снежные барсы, пантеры, североамериканские горные львы, гепарды, рыси, рыжие рыси, каракалы или любые их помеси. Кошки также включают домашних кошек, породистых и/или беспородных кошек-компаньонов, кошек шоу-класса, лабораторных кошек, клонированных кошек и диких или бездомных кошек.

Используемое в настоящем изобретении понятие "собака" включает всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris, если не указано иное.

Впервые собачий парвовирус "CPV" был выделен в 1978 году и получил название CPV-2 для его отличия от собачьего парвовируса минут-вируса (CMV или CPV-1). Примерно через год после первоначального выделения CPV-2 был идентифицирован генетический вариант CPV-2а. В середине 1980-х годов был идентифицирован второй генетический вариант, CPV-2b. Вирусы CPV-2a и CPV-2b вскоре полностью вытеснили CPV-2. В настоящее время в Соединенных Штатах Америки CPV-2a больше не обнаруживается [Parrish and Kawaoka, Annu Rev. Microbiol, 59: 553-586. (2005)]. Четвертый CPV-вариант в этом семействе, CPV-2с, был впервые описан в 2000 году [см, патенты US 8227593, US 8258274; Hong et al., J. Vet. Diagn. Invest. (5):535-9 (2007)]. В предварительных патентных заявках US 61/739067, поданной 19 декабря 2012 года, и 61/778751, поданной 16 марта 2013 года, содержание обоих из которых включено в настоящее изобретение путем ссылки в полном объеме, описан специфичный аттенуированный изолят CPV-2c (№ доступа в АТСС - РТА-13492), который был депонирован 24 января 2013 года в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209, США, на условиях, удовлетворяющих требованиям Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Дополнительно, был сконструирован рекомбинантный собачий парвовирус, который содержит гетерогенный геном CPV-2с/CPV-2, в котором участок, кодирующий капсидные белки, происходит из изолята CPV-2с, и участок, кодирующий неструктурные белки, просходит из изолята CPV-2 [WO2011107534 (A1); US 20120328652; WO2012007589 (А1), содержание которых включено в настоящее изобретение в полном объеме путем ссылки, и в указанном парвовирусе нуклеотидная последовательность, кодирующая капсидный белок в геноме CPV-2, была заменена нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок CPV-2c, таким образом был получен гетерогенный геном CPV-2с/CPV-2]. Используемая вакцина по данному изобретению, которая содержит "собачий парвовирус", может содержать один или несколько из этих типов/вариантов/изолятов CPV, в том числе недавно сконструированный рекомбинантный собачий парвовирус, который содержит гетерогенный геном CPV-2с/CPV-2.

Используемый в описании "невосстанавливающий олигосахарид" представляет собой углевод, состоящий из моносахаридных остатков в количестве от двух до десяти, соединенных посредством гликозидных связей, и которые в основной водной среде не образуют каких-либо соединений, содержащих альдегидную группу. Примеры невосстанавливающих олигосахаридов по настоящему изобретению включают сахарозу, трегалозу и рафинозу.

Используемый в описании термин "сахарный стабилизатор" представляет собой невосстанавливающий олигосахарид (например, см. выше), или "сахарный спирт"/полиол (например, сорбит, маннит, арабитол, инозит, мальтит).

Используемый в описании "наполнитель-стабилизатор" представляет собой соединение, которое способствует стабилизации вакцины при повышенных температурах, т.е., при 25°-30°С или выше. Примерами таких наполнителей-стабилизаторов являются маннит, глицин, декстран, мальтодекстрин, поливинилпирролидон, гидроксиэтилкрахмал, полиэтиленгликоль (ПЭГ, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 400 дальтон до 20 килодальтон), или любую их комбинацию. В конкретных вариантах осуществления "наполнитель-стабилизатор" представляет собой маннит.

Используемые в настоящем изобретении, если не указано иное, показатели количества в вакцине твердых добавок в процентах (%), например, количества невосстанавливающего олигосахарида или белкового стабилизатора, могут быть приведены или как отношение вес/вес и/или как отношение вес/объем, означающее 1% раствор, состоящий из 1 г твердого вещества в 100 мл объема вакцины.

Используемые в настоящем изобретении, если не указано иное, процентные показатели количества (%) жидкой добавки, например, этанола, в вакцине, приведены как 1% раствор, состоящий из 1 мл жидкой добавки на 100 мл объема вакцины (объем/объем).

Согласно настоящему изобретению, соотношение двух реагентов в данной композиции, например, соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающего олигосахарида и/или сахарного спирта, основано на реагентах, имеющих одинаковые единицы измерения, например, вес/вес.

Используемый в настоящем изобретении "аминокислотный стабилизатор" представляет собой заряженную аминокислоту, то есть, аргинин, лизин, глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту.

Используемый в настоящем изобретении "белковый стабилизатор" может быть интактным белком и/или белковым гидролизатом. В конкретных вариантах осуществления "белковый стабилизатор" по настоящему изобретению представляет собой или гидролизованный казеин или коллаген/коллагеновое производное, такое как желатин. Гидролизат суммарного казеина, который можно использовать в стабильных при комнатной температуре вакцинах по настоящему изобретению, может быть получен с помощью ряда способов, включающих, например, получение кислотного гидролизата или ферментативного гидролизата. Такие гидролизаты содержат все аминокислоты, исходно присутствующие в казеине, в виде смешанных аминокислот и пептидов. Один панкреатический гидролизат суммарного казеина, который можно использовать в стабильных при комнатной температуре вакцинах по настоящему изобретению, присутствует на рынке под торговым названием Казеин гидролизат ферментативный® от компании MP Biomedicals. Сопоставимые продукты присутствуют на рынке под торговыми названиями NZ-AMINE®, NZ AMINE® A, NZ-AMINE® AS, NZ-AMINE® B и Триптон от компании Sigma-Aldrich.

Поскольку стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению в идеале имеют уровень рН в диапазоне от рН 5,5 до рН 8,5, такие вакцины по настоящему изобретению, стабильные при комнатной температуре, содержат буферный агент, т.е. буфер. Буферы для использования в вакцинах по настоящему изобретению, стабильных при комнатной температуре, включают без ограничения: гистидин, фосфат калия и/или натрия, пирофосфат натрия или калия, имидазол, Трис, Трис-гистидин, БИС-Трис и хорошие буферы: БИС-Трис-пропан (BPT), PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, трицин, глицилглицин и HEPES. Буферы могут быть доведены до желаемого значения pH с помощью любого подходящего противоиона.

Согласно изобретению, при условии поддержания уровня рН буфера в сухой композиции вакцины по настоящему изобретению, это значение рН представляет собой рН содержащей буфер вакцинной композиции перед удалением по существу всей жидкости из вакцины (т.е. перед сушкой) для получения сухой композиции. Согласно изобретению, и если не указано иное, заданное значение уровня рН представляет собой значение рН, определенное/измеренное при 25°С.

Поливалентные вакцины: Настоящее изобретение относится к стабильным при комнатной температуре поливалентным вакцинам, содержащим вирусы сельскохозяйственных животных или животных-компаньонов, как подробно описано в настоящем документе. Примеры стабильных при комнатной температуре поливалентных вакцин для собак, согласно настоящему изобретению, включают без какого-либо ограничения следующее: два или несколько из нижеуказанных живых аттенуированных вирусов или рекомбинантных векторов: собачий вирус чумы плотоядных, собачий аденовирус типа 2, парвовирус собак, вирус собачьего парагриппа, вирус собачьего гриппа, собачьи пневмовирусы, собачий коронавирус, собачий вирус герпеса, вирус инфекционного гепатита собак, собачий минут-вирус, вирус бешенства, вирус псевдобешенства, рекомбинантный вирусный вектор, например, рекомбинантный собачий или кошачий вирусный вектор, который кодирует и экспрессирует гетерологичный антиген из собачьего патогена и/или из кошачьего патогена.

Дополнительно, стабильные при комнатной температуре собачьи вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать и/или впоследствии перед введением комбинироваться с одним или несколькими аттенуированными или убитыми антигенами, такими как Bordetella bronchiseptica, видами Mycoplasma, Ehrlichia canis, видами Anaplasma, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira interrogans, Leptospira autmnalis или Leptospira Bratislava; или с убитым вирусом собачьего гриппа, или с убитым собачьим коронавирусом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к стабильным при комнатной температуре поливалентным вакцинам, содержащим рекомбинантные вирусные векторы, такие как вектор на основе рекомбинантного вируса собачьего парагриппа, который кодирует гетерологичный антиген, полученный из человеческого патогена, и/или обезьяньего патогена, и/или коровьего патогена, и/или овечьего патогена, и/или свиного патогена, и/или из патогена домашней птицы (например, куриного вируса).

Также стабильная при комнатной температуре поливалентная кошачья вакцина по настоящему изобретению может содержать два или несколько из следующих живых аттенуированных вирусов семейства кошачьих: кошачий герпесвирус, вирус калицивироза кошек, кошачий пневмовирус, кошачий парвовирус, вирус лейкоза кошек, вирус инфекционного перитонита кошек, вирус иммунодефицита кошек, вирус болезни Борна, вирус кошачьего гриппа и вирус птичьего гриппа. Такие стабильные при комнатной температуре вакцины могут дополнительно содержать и/или перед введением комбинироваться с аттенуированными или убитыми Chlamydophila felis и/или Bartonella spp. (например, B. henselae).

Стабильные при комнатной температуре вакцины и поливалентные вакцины по настоящему изобретению хранятся в виде сухих композиций, и, следовательно, отдельные антигены могут быть упакованы и храниться или по отдельности, или в любой комбинации, перед смешиванием с фармацевтически приемлемым носителем и введением их животному-реципиенту. В одном из таких примеров поливалентная вакцина, содержащая антиген собачьего вируса чумы плотоядных, вирус собачьего парагриппа и антиген собачьего аденовируса типа 2, хранится в виде единой сухой композиции, и антиген собачьего парвовируса хранится во второй сухой композиции. Перед введением реципиенту-собаке эти две сухие композиции объединяют с носителем для получения поливалентной вакцины против собачьего вируса чумы плотоядных, вируса собачьего парагриппа, собачьего аденовируса типа 2 и собачьего парвовируса.

Введение вакцины: После смешивания с носителем стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению могут быть введены любым обычным способом, например, путем системного введения, или путем парентерального введения, например, без ограничения, путем подкожного или внутримышечного введения. После смешивания с носителем стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению также могут быть введены путем введения через слизистую оболочку, например, путем интраназального, перорального, внутритрахиального, ректального и/или внутриглазного введения. Альтернативно, вакцины можно вводить с помощью кожного пластыря, скарификации или местного введения. Предполагается, что стабильные при комнатной температуре вакцины по настоящему изобретению можно также вводить реципиенту с питьевой водой и/или пищей. Дополнительно, такие вакцины можно вводить в виде лакомства или игрушки.

Вакцины (включая поливалентные вакцины) по настоящему изобретению также можно вводить в качестве части комбинированного лечения, то есть лечения, которое включает, в дополнение к самой вакцине, введение одного или нескольких дополнительных активных веществ, лекарственных средств и т.д. В этом аспекте следует понимать, что количество вакцины, которое представляет собой "терапевтически эффективное" количество, может быть больше или меньше, чем количество вакцины, которое является "терапевтически эффективным количеством" в случае введения этой вакцины как единственного средства. Другие виды лечения могут включать известные в данной области препараты, такие как, например, анальгетики, жаропонижающие препараты, отхаркивающие средства, противовоспалительные препараты, антигистаминные препараты и/или введение жидкостей.

Уровень иммуногенности может быть определен экспериментально с помощью тестов титрования провокационной дозы, в общем известных в данной области. Такие способы обычно включают вакцинацию нескольких животных разными дозами вакцины, с последующим заражением этих животных вирулентным вирусом для определения минимальной защитной дозы.

Факторы, влияющие на предпочтительный режим дозирования, могут включать, например, вид или породу животного (например, среди собак или кошек), возраст, вес, пол, рацион питания, активность, размер легких и состояние животного; путь введения; профили эффективности, безопасности и длительности иммунитета конкретной используемой вакцины; использование системы доставки; введение вакцины в составе лекарственного средства и/или в виде комбинированной вакцины. Таким образом, фактически применяемая дозировка может варьироваться для конкретных животных, и, следовательно, может отклоняться от указанных выше типичных дозировок. Определение такого подбора дозы обычно входит в квалификацию специалистов в области разработки вакцин с использованием общепринятых способов.

Аналогичным образом, объем, с которым можно вводить такую дозу, обычно находится в диапазоне от 0,1 мл (типичный объем для внутрикожного или чрескожного применения) до 5,0 мл. Обычный диапазон значений для вводимого объема составляет от 0,2 до 2,0 мл, и от 1,0 до 2,0 мл для внутримышечного или подкожного введения.

Предполагается, что вакцину можно вводить реципиенту вакцины однократно или в качестве альтернативы, за два или несколько раз в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят по меньшей мере за два раза. В некоторых таких вариантах осуществления, например, вакцину вводят дважды, при этом вторую дозу (например, бустер) вводят по меньшей мере через 2 недели после первой дозы. В конкретных вариантах осуществления вакцина вводится дважды, причем вторая доза вводится не позднее 8 недель после первой дозы. В других вариантах осуществления вторая доза вводится в срок от 1 недели до 2-х лет после первой дозы, от 1,5 недель до 8 недель после первой дозы, или от 2 до 4 недель после введения первой дозы. В других вариантах осуществления вторая доза вводится через 3 недели после первой дозы.

В приведенных выше вариантах осуществления первая и последующие дозы могут варьировать, например, по количеству и/или по форме. Вместе с тем, часто дозы являются одинаковыми по количеству и форме. В случае введения однократной дозы, количество вакцины в этой единственной дозе обычно составляет терапевтически эффективное количество вакцины. В случае введения более чем одной дозы совокупное количество вакцины в этих дозах может представлять собой терапевтически эффективное количество. Дополнительно, можно первоначально вводить вакцину и затем вводить бустер-вакцину. Последующие введения вакцины также можно проводить на ежегодной основе (1 раз в год) или полугодовой основе (2 раза в год), независимо от факта введения бустера.

Настоящее изобретение может быть лучше понято со ссылкой на следующие не ограничивающие примеры, которые представлены в качестве иллюстрации настоящего изобретения. Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретения. Вместе с тем, никоим образом не следует толковать их в качестве ограничения широкого объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Материалы: Сахароза и сорбит с минимальной оценкой степени чистоты по стандарту ACS (Американского химического общества) были приобретены в компании Fisher Scientific. L-аргинин гидрохлорид, L-метионин, L-гистидин, маннит, сульфат магния, эктоин, гидроксиэктоин, глицин и хлорид натрия, имеющие качество молекулярного уровня с чистотой более 98%, были приобретены в компании Sigma. Декстран со средней молекулярной массой 70000 Да и чистотой > 95% был приобретен в компании Sigma. Растворы молекулярно-биологического качества 1,0M Трис (рН 8,0) и ЭДТА (рН 8,0) приобретены в компании Sigma. Раствор 20% желатин Bloom 250 и раствор NZ-амин AS были изготовлены лучшими доступными коммерческими поставщиками.

Подготовка стокового раствора: были приготовлены и стерилизованы путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм следующие растворы: 80% сахароза, 70% сорбит, 1,0М L-аргинин (рН 7,2), 5% L-метионин и 5 мМ сульфат декстрана. Не расфасованные антигены CDV, CAV2, CPV и CPI, имеющие титры от 6,5 до 9,5, были заморожены при температуре -80°C и разморожены непосредственно перед смешиванием.

Смешивание вакцины, наполнение и сушка : Вирусные антигены и стабилизаторы смешивали до конечной концентрации каждого компонента, как указано в таблице композиций. Для доведения раствора до конечного объема использовалась деионизированная вода. Все компоненты в вакцинных смесях тщательно перемешивались путем взбалтывания в течение по меньшей мере 10 минут на плоской мешалке. Для получения вакцин, высушенных во флаконах, смесь разливали в 2,2 куб.см стеклянные флаконы по 0,5 мл на флакон, затем высушивали замораживанием в лиофилизаторе с использованием цикла сушки по схеме, приведенной в таблице 4. Для получения вакцин, высушенных в гранулах (например, лиосферы/сфереоны), смесь наносили по каплям на сверххолодные пресс-формы из нержавеющей стали по 100 мкл на каплю, для получения замороженных сферических гранул. Замороженные гранулы перемещали в лоток и высушивали замораживанием в лиофилизаторе с использованием оптимизированного цикла сушки, описанного в таблице 5. Для получения вакцин, высушенных на мембранах, вакцинную смесь распределяли на мембране, после чего мембрану высушивали в вакуумной камере, отрегулированной от 100 до 1000 мТорр в течение приблизительно 16 часов при 25°C.

Испытание на стабильность в ускоренном температурном режиме и в режиме реального времени :

Испытание на стабильность в ускоренном режиме при 45°C и 37°C используется для скрининга различных композиций. Проводится мониторинг лидирующих композиций в долгосрочном испытании в реальном времени на стабильность при 27°C, если это желательно. В назначенный момент времени забирали 3 пробы из каждой композиции и измеряли титр каждого антигена с помощью анализа титрования в клеточной культуре; результаты выражены в виде средней инфицирующей дозы тканевой культуры (TCID₅₀) и/или в виде 50% инфицирующей дозы для флюоресцирующих антител (FAID₅₀).

Способы анализа:

Активность CPI: Вирусные образцы в разведении инокулировали на клетки почки собаки (DK). Через 4-6 дней монослои фиксировали и окрашивали флуоресцеин-конъюгированной сывороткой против CPI, затем рассчитывали титр вируса способом Спирмана-Карбера (Spearman-Karber Method [Cunningham, C.H. A Laboratory Guide in Virology, 7^th edition, Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN. (1973); Kaplan, M.M. and Koprowski, H., Laboratory Techniques in Rabies, World Health Organization, Switzerland, (1973)].

Активность CDV: Вирусные образцы в разведении инокулировали на клетки Vero. Через 5-7 дней обследовали монослои на наличие цитопатического эффекта и рассчитывали титр вируса по способу Спирмана-Карбера, как указано выше.

Активность CAV2: Вирусные образцы в разведении инокулировали на клетки DK. Через 7 дней монослои обследовали на наличие цитопатического эффекта и рассчитывали титр вируса по способу Спирмана-Карбера, как указано выше.

Активность CPV: Вирусные образцы в разведении инокулировали на клетки DK. Через 3 дня монослои окрашивали флуоресцеин-конъюгированной сывороткой против CPV и рассчитывали титр вируса по способу Спирмена-Карбера, как указано выше.

Анализ на влажность и температуру сухой вакцины: Содержание влаги в вакцине, высушенной замораживанием во флаконах или в гранулах, определяли с помощью общепринятого гравиметрического способа или способа Карла-Фишера в вакуумном сушильном шкафу. [Было установлено, что содержание остаточной влаги (RMC) в лиофилизированных образцах варьируется в диапазоне от 0,5% до 3% (вес/вес).] Значения температуры стеклования лиофилизированных гранул или лепешек во флаконах определяли с помощью устройства для дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Если не указано иное, то значение RMC в высушенных замораживанием композициях представлено в процентном виде (вес/вес).

Пример 1

ПОЛУЧЕНИЕ Стабилизаторов

Конечная целевая концентрация (вес/вес) каждого компонента в конечной сухой вакцине из каждой композиции приведена в таблицах 1а и 2а. Конечная концентрация каждого компонента в вакцинной смеси из каждой композиции приведена в таблицах 1b и 2b. Объем каждой дозы вакцины в сухой вакцине в виде гранул (например, в виде лиосфер/сфереонов) в пластиковом лотке, составляет 100 мкл или 250 мкл. Объем дозы в вакцине, высушенной в виде лепешки в стеклянном флаконе, составляет 250 мкл, или 500 мкл, или 1000 мкл. Для стабилизаторов в сухих вакцинах, описанных в таблице 1а и 2а, все единицы концентрации представляют собой отношение веса к весу (вес/вес), за исключением общего веса дозы вакцины, указанного в мг. В отношении стабилизаторов в вакцинных смесях, описанных в таблице 1b и 2b: концентрация сахара и белка указана в процентах веса по отношению к объему (вес/объем), концентрация аминокислот, катионов и буферов обозначена в молях (М) или миллимолях (мМ), концентрация эктоина и гидроксиэктоина представляет собой отношение веса к объему (вес/объем). Все значения концентрации, приведенные в таблицах 1b и 2b, являются конечными концентрациями в вакцинной смеси с вирусными антигенами. L-аргинин в композициях SP33 и SP34 представляет собой соль фосфата или ацетата, соответственно. Все остальные композиции L-аргинина являются хлоридами. Значение рН представляет собой конечное значение рН вакцинной смеси с вирусными антигенами. Конечная концентрация всех буферов в композиции составляет 10 мМ. KPO₄ представляет собой калий-фосфатный буфер, содержащий одноосновный и двухосновный фосфат калия с конечным уровнем рН 7,2. Стабилизаторы, перечисленные в таблицах 1b и 2b, тщательно смешивают с соответствующим количеством воды, а затем добавляют вирусные антигены и тщательно перемешивают перед распределением вакцинной смеси, заморозкой и лиофилизацией в виде гранул или во флаконах.

ПРИМЕР 2

ИССЛЕДОВАНИЯ КОРРЕЛЯЦИИ стабильностИ ПРИ 27 °C СО СТАБИЛЬНОСТЬЮ ПРИ 37°C И 45°C

Испытания на стабильность в ускоренном режиме при повышенной температуре используются для скрининга различных стабилизаторов. В этих исследованиях применяются повышенные температуры 45°C и 37°C для испытаний на стабильность в ускоренном режиме. Долгосрочные испытания на стабильность в режиме реального времени проводят при температуре 27°C. Для изучения возможности использования испытаний на стабильность в ускоренном режиме при 45°C и 37°C для скрининга различных стабилизаторов или композиций проводили сравнение профилей стабильности по меньшей мере трех композиций для каждого вируса при 45°C, 37°C и 27°C (таблица 3). Относительная стабильность вируса в различных композициях оценивается по титру вируса в каждой точке времени, а также по общей тенденции снижения титра. Аналогичное ранжирование используется для тех же композиций при разных значениях температуры. Из таблицы 3 следует, что существует тесная корреляция между испытаниями на стабильность в ускоренном режиме и в реальном времени среди всех 3-х температурных значений. Относительная характеристика стабильности при 45°C, 37°C и 27°C всегда согласуется для всех четырех вирусов в разных композициях. Для большинства композиций выявлено согласуемое ранжирование среди всех трех температурных значений. Таким образом, полученные данные указывают на то, что режим 45°C и 37°C может быть надежным способом скрининга композиции в ускоренном режиме, в частности, для выделения лучших и худших композиций в группе. Для некоторых композиций с очень сходными профилями стабильности при повышенных температурах 45°C и 37°C затруднительно предсказать, какая из композиций будет показывать более высокую стабильность при 27°C (в реальном времени). Для скрининга композиций на DHPPi (CDV, CAV2, CPV и CPI) используется испытание на стабильность в ускоренном режиме при 45°C и 37°C с целью скрининга различных стабилизаторов и наполнителей и определения наилучших композиций. Затем такие лидирующие композиции можно при желании подвергать долгосрочному испытанию на стабильность в режиме реального времени при 27°C для подтверждения.

Пример 3

СПОСОБ СУШКИ ДЛЯ ВИРУСА В РАЗЛИЧНЫХ КОМПОЗИЦИЯХ

После тщательного смешивания стабилизаторов и вирусных антигенов проводят измерение температуры стеклования (Tg) большинства вакцинных смесей с помощью дифференциального сканирующего калориметра (Perkin Elmer). Во всех композициях, указанных в таблицах 1 и 2, выявлены значения Tg, намного превышающие -40°C. Исходя из этих результатов, применяли цикл сушки согласно таблицам 4 и 5 для сушки замороженной гранулированной вакцины и жидкой вакцины во флаконах, соответственно.

Для приготовления вакцины в виде сухих гранул вначале делали замороженные гранулы вакцины по 100 мкл на гранулу путем капельного распределения вакцинной смеси в лунки в предварительно охлажденных планшетах из нержавеющей стали (при температуре от -110°C до -130°C). Замороженные гранулы собирали в лотки и хранили при -80°C до высушивания на лиофилизаторе. Непосредственно перед сушкой замораживанием гранул вакцины полку в лиофилизаторе предварительно охлаждали до -20°C и быстро помещали лотки с гранулами вакцин на полку. Проводили сушку замораживанием в режиме сушильного цикла, указанного в таблице 4, и после этого сбрасывали вакуум с помощью сухого аргона или сухого газообразного азота. Высушенные лотки с гранулами запечатывали в саше из фольги с сухим аргоном или азотом.

Для приготовления вакцины в виде лиофилизированной массы во флаконе вакцинную смесь распределяли в стеклянные флаконы объемом 2,2 см³ по 250 мкл на флакон. Затем заполненный флакон закупоривали и переносили в лиофилизатор на предварительно охлажденную до 4°C полку. Для сушки замораживанием вакцины во флаконах применяли цикл сушки согласно таблице 5. После лиофилизации сбрасывали вакуум и флаконы заполняли сухим аргоном или азотом. Затем флаконы плотно закрывали резиновой пробкой, после чего дополнительно укупоривали с помощью обжимных щипцов.

Пример 4

ПОКАЗАТЕЛИ СТАБИЛЬНОСТИ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ВИРУСОВ CDV, CAV2, CPI И CPV

Для вирусов, высушенных в гранулах: лиофилизированные гранулы с антигенами упаковывали в контейнеры в перчаточном боксе с сухим азотом [<1,0% относительной влажности (ОВ)] и затем проводили испытания на стабильность при различных температурах. Для образцов, высушенных в виде лепешек во флаконах: запечатанный флакон помещали в контейнер для хранения, а затем проводили испытания на стабильность в инкубаторах при разных температурах. В разные точки времени образцы извлекали из инкубатора и титровали каждую вакцину на эффективность, используя титрометрические анализы на основе клеточной культуры.

Для анализа эффективности в каждой точке времени отбирали по меньшей мере три флакона с одинаковой композицией и разводили ее до жидкого состояния фосфатно-буферным раствором (ФБР) в количестве 1 мл на флакон. Активность вирусов определяли по методике TCID₅₀ на основе клеточной культуры и/или по методике FAID₅₀. Скрининг композиций проводили поэтапно в различных исследованиях. В каждое исследование была включена по меньшей мере одна исходная композиция для сравнения с результатами других исследований. В рамках каждого исследования разные композиции получали оценку в виде одного или нескольких "+", а затем составлялся их рейтинг на основе данных относительной стабильности в нескольких точках времени. Чем больше число "+", тем выше относительная стабильность конкретного вируса, проанализированного в образце.

В большинстве композиций SPxx была выявлена приемлемая физическая стабильность гранул (например, лиосфер/сфереонов) без изменений внешнего вида гранул или лиофилизированных лепешек при длительном хранении, таким образом, оценку их физической стабильности не определяли. В композициях SPCPVxx физическая стабильность варьировалась в зависимости от компонентов в композиции. Ранжирование физической стабильности сухой вакцины проводили по показателю Tg и путем визуального осмотра физического внешнего вида.

В таблице 6 показана стабильность четырех вирусов при температуре 27°C в разных композициях и их прогнозируемый срок годности при хранении при 27°C. В ходе этих испытаний исходный титр целевого антигена [log10 (TCID₅₀)] для вирусов CDV, CPI, CAV2 и CPV составлял 7,0, 7,0, 4,0 и 5,0, соответственно. По истечении срока годности для каждого антигена был определен минимальный титр, составляющий 4,7, 5,0, 3,3 и 4,5 для CDV, CPI, CAV2 и CPV, соответственно. Предполагаемый срок хранения вируса DHPPi в различных композициях рассчитывается в ходе испытания на стабильность, исходя из тенденции изменения титра в разные точки времени. Предполагаемый срок хранения вируса CPI основан на минимальном титре по истечении срока годности, который составляет 5,0, и исходный титр антигена для CPI выше 0,5 log. В других исследованиях в ряде лидирующих композиций была выявлена повышенная стабильность при 45°C и 37°C, по сравнению с композициями, перечисленными в таблице 6. Эти лидирующие композиции могут подвергаться повторным испытаниям на долгосрочную стабильность в реальном времени при 27°C. Данные, приведенные в таблице 6, показывают, что при использовании современных спецификаций для производства вакцин можно обеспечить минимальный срок хранения композиции SP10 при температуре 27°C, составляющий для вирусов CDV, CAV2 и CPI 18 месяцев или более длительный срок (при исходном титре антигена CPI выше 0,5 log).

В таблице 7 представлены несколько лидирующих композиций, определенных с помощью испытаний на стабильность в ускоренном режиме при 45°C. В этих композициях вирусы CDV, CAV2, CPI и CPV смешивали, после чего подвергали сушке замораживанием в гранулы. Гранулы герметично упаковывали во флаконы с сухим азотом, а затем подвергали испытанию на стабильность при 45°C. Аналогичным образом, оценку стабильности определяли на основании титра в каждой точке времени и скорости изменения титра с течением времени. Как показано в таблице 7, в композициях SP43 и SP44 выявлена значительно более высокая стабильность для вирусов CDV и CPI, чем в композиции SP10. Выявлено улучшение выше 0,5 log в точках времени 1, 2 и 4 недели для обоих вирусов CDV и CPI в композиции SP44 по сравнению с SP10. Дополнительно, в композиции SP44 также выявлена значительно более высокая стабильность вируса CAV2, чем в SP10. Улучшенные показатели стабильности у композиции SP44 по сравнению с SP10 могут быть экстраполированы для получения стабильной вакцины CDV, CAV2 и CPI (вакцина DHPi), которая имеет срок годности 24 месяцев или дольше при температуре 27°C, если данные, полученные для композиции SP44 в испытаниях при 45°C в ускоренном режиме, сравнивать с данными, полученным при 27°C для композиции SP10.

Влияние стабилизаторов или наполнителей на стабильность вирусов были тщательно оценены в ходе скрининга композиций для вирусов CDV, CPI, CAV2 и CPV. Несколько скрининговых примеров приведены в таблицах 8-13.

Влияние буфера и уровня рН на стабильность вирусов показано в таблице 8. В исследовании, описанном в таблице 8, вакцины были лиофилизированы в виде лепешек во флаконах. Все четыре вируса были смешаны в композициях, согласно таблице, помещены в стеклянные флаконы, а затем высушены замораживанием в лиофилизаторе, как описано в способах с использованием цикла сушки, показанном в таблице 5. За исключением использования разных буферов [калий-фосфатный буфер (KPO₄), гистидин, бис-трис пропановый буфер (BTP) и MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота)] и указанного уровня рН, все композиции в данном исследовании содержали 4% маннита, 5% сахарозы, 0,8% желатина, 1,0% NZ-амина и 2 мМ MgSO₄. Все композиции в данном исследовании также содержали 10 мМ буфера с конечным уровнем рН, указанным в этой таблице. Данные по стабильности при 45°C и 37°C для каждого вируса использовали для ранжирования композиций.

Из представленных в таблице 8 данных видно, что вирусы CDV, CPI и CAV2 обладают более высокой стабильностью при более низком значении рН (6,5), чем при нейтральном или высоком рН, тогда как CPV обладает более высокой стабильностью при уровне рН от нейтрального до более высокого (7,6). Вирусы CDV и CPI более стабильны в KPO₄ или гистидине, чем в двух других протестированных буферах, тогда как стабильность CAV2 и CPV, по-видимому, меньше зависит от используемого буфера.

Было исследовано влияние концентрации и комбинации сахаров на стабильность вирусов, что показано в таблицах 9A и 9B. Концентрации сахаров приведены в таблице 9а, показатели стабильности вирусов в этих композициях при 45°C и 37°C приведены в таблице 9b. В этом исследовании все композиции имеют один и тот исходный титр вирусного антигена, и вирусы в этих композициях были лиофилизированы в гранулах. Оценку относительной стабильности определяли на основании данных о стабильности и при 45°C и при 37°C и в разные точки времени для каждого вируса в разных композициях. По данным из таблиц 9а и 9b видно, что стабильность CDV, CPI и CAV2 в значительной степени зависит от концентрации сахара, при этом более высокая стабильность вирусов наблюдается при более высокой концентрации сахара в диапазоне от 4 до 30%. Эти данные также показывают более хорошие результаты для комбинации сахарозы и трегалозы (Suc + TrH), чем использование единственной сахарозы или единственной трегалозы.

Также исследовали влияние концентрации L-аргинина на стабильность вирусов (таблица 10). Композиции SP02B, SP26 и SP27 отличаются только концентрацией L-аргинина гидрохлорида. [Для некоторых точек данных данные недоступны из-за недостоверности анализа (н/д)]. Исходя из данных, полученных при 45°C и 37°C, стабильность CDV, CPI и CAV2, по-видимому, зависит от концентрации аргинина, при этом более высокие концентрации аргинина соответствуют более высокой стабильности (таблица 10).

Дополнительно было исследовано влияние различных солей аргинина или концентрации аргинина в комбинации с глутаминовой кислотой (таблицы 11А и 11В). В таблице 11а показаны концентрация и соль аргинина и концентрация глутаминовой кислоты в каждой композиции и соответствующее значение начала Тg в сухой вакцине. Все композиции являются одинаковыми, за исключением указанных выше различий по аргинину и глутаминовой кислоте. L-аргинин доводили до уровня рН 7,2 с помощью различных кислот с образованием различных солей аргинина. Начало Tg представляет собой температуру начала стеклования лиофилизированных гранул вакцины в композиции. Наступление Tg определяется с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии и представляет собой среднее значение по меньшей мере из 3 повторных измерений. Данные о стабильности при 45°C и 37°C композиций, перечисленных в таблице 11а, представлены в таблице 11b. Также составлен рейтинг относительной стабильности, представленный в таблице 11b. Как показано в таблице 11а и 11b, разные соли L-аргинина могут иметь разные эффекты в отношении стабильности. Аргинин фосфат в композиции SP33 обеспечивает гораздо более высокое значение Tg, но при этом выявлено снижение стабильности всех 3-х вирусов по сравнению с другими солями аргинина. Комбинация 0,15М аргинина хлорида с 0,15М натриевой соли одноосновной глутаминовой кислоты в композиции SP35 показала некоторое улучшение стабильности всех трех вирусов по сравнению со стабильностью SP10.

Эктоин и гидроксиэктоин являются природными соединениями, которые были обнаружены в галофильных микроорганизмах. Оба этих соединения являются совместимыми растворами, которые служат в качестве защитных веществ благодаря своему осмолитическому действию, и таким образом способствуют выживанию организма при экстремальном осмотическом стрессе, придавая устойчивость к солям и температурному стрессу. Было показано, что эктоин и гидроксиэктоин являются эффективными стабилизаторами белков, а также многих других биологических веществ. В этой связи, был исследован их стабилизирующий эффект на стабильность CDV, CPI и CAV2. Композиции SP39 и SP40 были идентичными, за исключением композиции SP10, и дополнительно они содержали или эктоин или гидроксиэктоин, соответственно (таблица 13). Для оценки их стабилизирующего эффекта использовали данные о стабильности при трех значениях температуры хранения. Вакцинная смесь, содержащая 3 указанные вирусные фракции, подвергалась сушке замораживанием в гранулы с использованием упомянутого цикла сушки.

Рейтинг стабильности основан на данных о стабильности при 3-х значениях температур (45°C, 37°C и 27°C). Из данных о стабильности и оценок стабильности из таблицы 13 следует, что и эктоин и гидроксиэктоин могут повышать стабильность CDV и CPI при температуре 37°C и 27°C, при этом стабилизирующие эффекты при 45°C выражены не столь значительно. Стабилизирующее действие эктоина и гидроксиэктоина на CAV2 определить затруднительно из-за его низкой кривой деградации.

Пример 5

РЕЗУЛЬТАТЫ СТАБИЛЬНОСТИ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО CPV

Сабильность моновалентного CPV в различных композициях также была проанализирована. Несмотря на возможность включения CPV вместе с тремя другими собачьими вирусами в жизнеспособную при комнатной температуре стабильную композицию, например, в композиции SPCPV-02 и SPCPV-03, для которых можно гарантировать срок годности для CPV примерно 18 месяцев при хранении при температуре 27°C, вирус CPV из четырех исследованных разных собачьих вирусов имеет наибольшие отличия, связанные с его оптимальной стабильностью при комнатной температуре.

Таким образом, CPV отличается от CDV, CPI или CAV2 по предпочтениям в отношении сахаров, например, по причине более высокой стабильности в присутствии сахарного спирта, такого как сорбит, чем в присутствии восстанавливающего сахара. Тем не менее, даже в присутствии сорбита, физическая стабильность и лиофилизированных гранул и лепешек иногда может перейти в уменьшение размеров или разрушение сухих гранул во время хранения. Таким образом, в ходе скрининга композиций проводили мониторинг и функциональной стабильности и физической стабильности сухих композиций CPV. Отмечено, что скрининг моновалентных вакцинных композиций CPV смог стать моделью исследования для получения вакцинного продукта с балансом стабильности вирусной эффективности и физической стабильности сухого продукта.

В таблице 14 представлены данные о стабильности CPV при 45°C, 37°C и 27°C в пяти разных композициях. Моновалентный CPV подмешивали в эти композиции, а затем лиофилизировали в виде гранул размером 100 мкл. Все композиции в данном исследовании содержали 10 мМ KPO₄ при рН 7,2 в качестве буфера и 2% декстрана 70k и 2% глицина в качестве наполнителей-стабилизаторов. Концентрация сорбита (вес/объем) каждой композиции показана в таблице 14. Все композиции также содержали стабилизирующие белки "GN" (желатин и NZ-амин). Состав 1 x GN: 0,8% желатина и 1,0% NZ-амина, состав 2,5 x GN: 2,5% желатина и 2,5% NZ-амина. Рейтинг стабильности эффективности основан на изменении титра вируса при 45°C, 37°C и 27°C. Рейтинг физической стабильности основан на показателях температуры стеклования (Tg) и внешнего вида физического структуры лиофилизированных гранул после сушки замораживанием и в ходе испытания на стабильность. Более высокие значения Tg и более сильная тенденция к сохранению физической структуры гранул дают более высокую оценку физической стабильности.

Данные по стабильности, приведенные в таблице 14, показывают, что более высокая концентрация сорбита положительным образом влияет на стабильность эффективности CPV, но снижает физическую стабильность вакцины; при этом более высокая концентрация белка благоприятно сказывается на физической стабильности. Дополнительно, включение L-аргинина не оказывает негативного эффекта на стабильность CPV.

Влияние разных концентраций декстрана и сорбита дополнительно оценивали в исследовании, результаты которого приведены в таблице 15. Все из указанных в таблице 15 композиций содержат 2% глицина, 2,5% желатина, 2,5% NZ-амина и 10 мМ буфера KPO₄ при рН 7,2. Дополнительно, все композиции содержат сорбит и декстран 70k. Моновалентный CPV подмешивают в эти композиции, а затем подвергают сушке замораживанием в гранулы размером 100 мкл. Рейтинг стабильности эффективности и физической стабильности этих композиций построен так же, как и в исследовании согласно таблице 15. Данные, приведенные в таблице 15, указывают, что более высокие концентрации декстрана 70k способствуют физической стабильности лиофилизированных гранул CPV, но негативно влияют на стабильность эффективности, снижая ее на 6%. В то же время, более высокая концентрация сорбита является полезным фактором для стабильности эффективности, но для сохранения структуры требуются средние значения концентрации декстрана 70k. Приведенные в этом исследовании данные свидетельствуют о том, что оптимальная комбинация сорбита и декстрана 70К необходима для оптимальной лиофилизированной CPV-вакцины, обладающей и высокой эффективностью и высокой физической стабильностью.

Пример 6

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМОВ СУШКИ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ВИРУСА

Для изучения вопроса о том, имеют ли полученные в разных режимах сушки вакцины разные профили стабильности, вирусы в одной и той же композиции подвергали лиофилизации или в виде лепешек во флаконе или в виде гранул в лотке, а затем сравнивали их стабильность. В таблице 16 показаны результаты испытания на стабильность вирусов CDV, CAV2 и CPI в гранулах в композиции SP02B и в лепешках в композиции FDIV-03. (Фактически, SP02B и FDIV-03 являются одной и той же композицией). Как видно из таблицы 16, стабильность CDV, CPI и CAV2 во флаконе была эквивалентна (или немного выше), чем стабильность в гранулах. Данные, приведенные в этом исследовании, свидетельствуют о том, что оптимальные композиции, установленные для гранул, также могут быть использованы для вирусных вакцин, полученных сушкой в виде лепешек во флаконах.

Таблица 1а Стабилизаторы и вспомогательные вещества (вес/вес) в сухих вакцинных продуктах, содержащих CDV, CAV2, CPV и CPI
Название композиции	Сахар (вес/вес)	Белок (вес/вес)	Аминокислота (вес/вес)	MgSO4 (вес/ вес)	Прочие стаби-лизаторы (вес/вес)	Буфер (вес/ вес)	pH	Вес дозы (мг) сухой вакцины
Сахароза	Трегалоза	Сорбит	Маннит	Желатин	NZ-амин	L-Arg	L-Glu	Гранулы 100 мкл	Гранулы 250 мкл
SP01	64,2%				13,5%	16,9%					2,5%	7,2	5,6	14,0
SP06			47,8%		23,9%	23,9%					1,4%	7,2	10,0	25,0
SP02B	65,4%				3,1%	3,8%	24,2%				0,6%	7,2	25,2	63,1
SP10	51,6%	20,5%			2,4%	3,0%	19,1%				0,5%	7,2	32,0	80,1
SP11	39,4%	26,0%			3,1%	3,8%	24,2%				0,6%	7,2	25,2	63,1
SP12	26,0%	39,4%			3,1%	3,8%	24,2%				0,6%	7,2	25,2	63,1
SP13	20,5%	51,6%			2,4%	3,0%	19,1%				0,5%	7,2	32,0	80,1
SP14		65,4%			3,1%	3,8%	24,2%				0,6%	7,2	25,2	63,1
SP15	53,9%				4,2%	5,2%	33,0%				0,8%	7,2	18,4	46,1
SP16	26,9%	26,9%			4,2%	5,2%	33,0%				0,8%	7,2	18,4	46,1
SP17		53,9%			4,2%	5,2%	33,0%				0,8%	7,2	18,4	46,1
SP26	71,4%				3,3%	4,2%	17,6%				0,6%	7,2	23,1	57,8
SP27	78,5%				3,7%	4,6%	9,7%				0,7%	7,2	21,0	52,5
SP33	48,8%	19,4%			2,3%	2,9%	23,3%				0,4%	7,2	33,9	84,7
SP34	50,6%	20,1%			2,4%	3,0%	20,6%				0,4%	7,2	32,7	81,7
SP35	52,6%	20,9%			2,5%	3,1%	9,7%	7,8%			0,5%	7,2	31,4	78,5
SP36	47,0%	18,7%			2,2%	2,7%	14,5%	11,6%			0,4%	7,2	35,2	88,0
SP39	50,5%	20,1%			2,4%	3,0%	18,7%			2,1%	0,4%	7,2	32,7	81,8
SP40	50,4%	20,0%			2,4%	2,9%	18,6%			2,3%	0,4%	7,2	32,8	82,0
SP43	51,6%	20,5%			2,4%	3,0%	19,1%				0,5%	6,5	32,0	80,1
SP44	48,5%	19,3%		5,7%	2,3%	2,8%	17,9%		0,1%		0,5%	6,5	34,0	85,1
FDIV-03	65,4%				3,1%	3,8%	24,2%				0,6%	7,2	25,2	63,1
FDIV-11	42,8%		3,1%	16,6%	3,3%	4,2%	26,3%		0,1%		0,6%	7,2	23,2	58,0
- В лиофилизированной вакцине вводимый антиген составляет около 1% (вес/вес) и остаточная влажность (RMC) составляет около 2% (вес/вес). - Вес дозы сухой вакцины представляет собой вес одной дозы количества вакцины при сушке из вакцинной смеси объемом или 100 мкл или 250 мкл с использованием соответствующих рецептур из Таблицы 1b, см. ниже. - L-аргинин (L-Arg) в SP33 представляет собой аргинин фосфат, и L-аргинин в SP34 представляет собой аргинин ацетат. - В обеих композициях SP35 и SP36 L-аргинин представляет собой аргинин хлорид, и L-глутамин (L-Glu) представляет собой натриевую соль глутаминовой кислоты. - SP39 содержит эктоин и SP40 содержит гидроксиэктоин в качестве других стабилизаторов (прочие стабилизаторы). - SP43 и SP44 содержат гистидин в качестве буфера в вакцинной смеси, все другие композиции содержат в качестве буфера фосфат калия (KPO4).

Таблица 1b Рецептурная смесь для лиофилизированных вирусов CDV, CPI, CAV2 и CPV
Название композиции	Сахар (вес/объем)	Белок (вес/объем)	Аминокислота (М)	MgSO4 (мМ)	Прочие стабилизаторы (вес/объем)	Буфер (10 мМ)	pH
Сахароза	Трегалоза	Сорбит	Маннит	Желатин	NZ-амин	L-Arg	L-Glu
SP01	3,8%				0,8%	1,0%					KPO4	7,2
SP06			5%		2,5%	2,5%					KPO4	7,2
SP02B	17,1%				0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP10	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP11	10,3%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP12	6,8%	10,3%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP13	6,8%	17,1%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP14		17,1%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP15	10,3%				0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP16	5,2%	5,2%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP17		10,3%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
SP26	17,1%				0,8%	1,0%	0,2M				KPO4	7,2
SP27	17,1%				0,8%	1,0%	0,1M				KPO4	7,2
SP33	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M Arg3PO4				KPO4	7,2
SP34	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M ArgAc				KPO4	7,2
SP35	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,15M	0,15M			KPO4	7,2
SP36	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,25M	0,25M			KPO4	7,2
SP39	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M			0,71% эктоин	KPO4	7,2
SP40	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M			0,79% гидроксиэктоин	KPO4	7,2
SP43	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M				гистидин	6,5
SP44	17,1%			2%	0,8%	1,0%	0,3M		2 мМ		гистидин	6,5
FDIV-03	17,1%	6,8%			0,8%	1,0%	0,3M				KPO4	7,2
FDIV-11	10,3%		0,75%	4%	0,8%	1,0%	0,3M		2 мМ		KPO4	7,2
- Единицы измерения для конечного количества каждого стабилизатора в вакцине указаны сверху в каждой категории. Вес/объем обозначает вес на единицу объема. - KPO4 представляет собой калий-фосфатный буфер. Значение рН обозначает конечное значение уровня рН вакцинной смеси после введения антигенов/вирусов. - В отношении L-аргинина: композиции SP33 и SP34 содержат фосфат и соль уксусной кислоты L-аргинина, соответственно. Во всех остальных случаях указанный в таблице L-аргинин представляет собой соль хлорида.

Таблица 2а Стабилизаторы и вспомогательные вещества (вес/вес) в лиофилизированных вакцинных продуктах, содержащих CPV
Название композиции	Сахар (вес/вес)	Наполнитель (вес/вес)	Белок (вес/вес)	L-Arg (вес/вес)	KPO4 (вес/вес)	Вес дозы (мг) сухой вакцины
Сахароза	Трегалоза	Сорбит	Глицин	Декстран	Желатин	NZ-амин	гранулы 100 мкл	гранулы 250 мкл
SPCPV-02			28,1%	11,2%	11,2%	4,5%	5,6%	35,5%	0,8%	17,1	42,8
SPCPV-06	28,1%			11,2%	11,2%	4,5%	5,6%	35,5%	0,8%	17,1	42,8
SPCPV-10		65,0%		16,2%		6,5%	8,1%		1,2%	11,8	29,5
SPCPV-13			38,3%	9,6%	9,6%	3,8%	4,8%	30,3%	0,7%	20,1	50,3
SPCPV-14			48,0%	8,0%	8,0%	3,2%	4,0%	25,3%	0,6%	24,1	60,3
SPCPV-15			23,7%	9,5%	9,5%	11,9%	11,9%	30,0%	0,7%	20,3	50,8
SPCPV-17			34,3%	13,7%	13,7%	17,2%	17,2%		1,0%	14,0	35,0
SPCPV-23			30,1%	12,0%	24,0%	15,0%	15,0%		0,9%	16,0	40,0
SPCPV-24			26,7%	10,7%	32,1%	13,4%	13,4%		0,8%	18,0	45,0
SPCPV-26			40,6%	10,1%	20,3%	12,7%	12,7%		0,8%	19,0	47,5
- В лиофилизированной вакцине вводимый антиген составляет около 1% (вес/вес) и RMC составляет около 2% (вес/вес). - Вес дозы сухой вакцины представляет собой вес одной дозы количества вакцины при сушке из вакцинной смеси объемом или 100 мкл или 250 мкл с использованием соответствующих рецептур из Таблицы 2b, см. ниже. - L-аргинин (L-Arg) представляет собой аргинин хлорид; Gly обозначает глицин.

Таблица 2b Рецептурная смесь для лиофилизированного CPV
Название композиции	Сахар (вес/объем)	Наполнитель (вес/объем)	Белок (вес/объем)	L-Arg (M)	KPO4 (мМ)
Сахароза	Трегалоза	Сорбит	Глицин	Декстран	Желатин	NZ-амин
SPCPV-02			5,0%	2,0%	2,0%	0,8%	1,0%	0,3M	10 мМ
SPCPV-06	5,0%			2,0%	2,0%	0,8%	1,0%	0,3M	10 мМ
SPCPV-10		8,0%		2,0%		0,8%	1,0%		10 мМ
SPCPV-13			8,0%	2,0%	2,0%	0,8%	1,0%	0,3M	10 мМ
SPCPV-14			12,0%	2,0%	2,0%	0,8%	1,0%	0,3M	10 мМ
SPCPV-15			5,0%	2,0%	2,0%	2,5%	2,5%	0,3M	10 мМ
SPCPV-17			5,0%	2,0%	2,0%	2,5%	2,5%		10 мМ
SPCPV-23			5,0%	2,0%	4,0%	2,5%	2,5%		10 мМ
SPCPV-24			5,0%	2,0%	6,0%	2,5%	2,5%		10 мМ
SPCPV-26			8,0%	2,0%	4,0%	2,5%	2,5%		10 мМ
- Единицы измерения для конечного количества каждого стабилизатора в вакцине указаны сверху для каждой категории. Вес/объем обозначает вес на единицу объема. - KPO4 представляет собой калий-фосфатный буфер. - рН представляет собой конечное значение рН вакцинной смеси после введения антигенов/вирусов.

Таблица 3 Корреляция результатов тестирования стабильности в ускоренном режиме (45°C и 37°C) и режиме реального времени (27°C) при скрининге композиций
Вирус	Композиция	Титр вируса во время исследования стабильности при разных температурах. Оценка композиций
		Д 0	45°C	37°C	27°C
Нед 1	Нед 2	Нед 4	Оценка	Нед 4	Нед 6	Нед 12	Оценка	Мес 6	Мес 12	Мес 18	Оценка
	SP06	7,50	4,58	4,25	2,58	+	3,50	1,58	1,50	+	5,33	3,88	3,67	+
CDV	SP02B	7,00	н/д	5,25	5,00	++	4,67	4,83	4,00	++	5,33	4,50	4,75	++
CDV	SP10	6,83	н/д	5,58	5,08	+++	5,33	5,17	5,25	+++	5,42	5,50	5,33	+++
		Д 0	Нед 1	Нед 2	Нед 4		Нед 4	Нед 6	Нед 12		Мес 6	Мес 12	Мес 18
CPI	SP01	6,83	5,17	4,50	4,58	++	4,33	3,58	2,50	++	5,08	4,67	3,92	++
CPI	SP06	6,67	4,58	4,17	2,50	+	3,33	2,58	1,50	+	5,33	4,33	3,67	+
CPI	SP02B	6,83	5,33	4,67	4,83	+++	4,58	4,25	3,75	+++	5,08	4,92	4,92	+++
		Д 0	Нед 2	Нед 4	Нед 8		Нед 4	Нед 6	Нед 12		Мес 6	Мес 12	Мес 18
CAV2	SP01	4,00	1,58	2,33	н/д	+	1,50	1,50	н/д	+	1,58	1,50	1,67	+
CAV2	SP15	4,58	3,17	3,33	н/д	++	2,83	3,00	н/д	++	3,17	2,92	н/д	++
CAV2	SP02B	4,33	4,33	4,25	2,83	+++	3,33	3,25	1,50	+++	3,67	3,58	3,67	+++
CAV2	SP10	4,08	4,33	4,17	3,67	++++	3,50	3,50	3,08	++++	3,92	3,75	3,83	++++
		Д 0	Нед 2	Нед 4	Нед 8		Мес 2	Мес 4	Мес 6		Мес 6	Мес 10	Мес 12
CPV	SPCPV-02	4,83	4,83	4,33	4,67	+++	4,50	3,83	3,67	+++	4,75	4,92	4,58	+++
CPV	SPCPV-06	4,92	3,83	3,42	3,25	++	3,83	3,17	3,33	++	5,25	4,33	3,92	++
CPV	SPCPV-10	5,13	3,75	3,25	2,50	+	4,00	3,08	2,83	+	4,50	3,83	3,50	+
- н/д указывает на отсутствие данных из-за ошибок анализа или на то, что образцы не были протестированы. - "+" используется для оценки композиций, более высокая стабильность обозначена большим числом "+". - точка времени выражается в виде комбинации дня (Д), недели (нед) или месяца (мес) и продолжительности. Например, Д 0 обозначает день 0, нед 1 = неделя 1 и мес 6 = месяц 6.

Таблица 4 Циклы сублимационной сушки для вакцин (для вакцин в виде замороженных гранул)
Этап	Температура	Время	Скорость линейного изменения	Давление в камере
Загрузка	-20°C	1 час	н/п	н/п
Замораживание	от -20°C до -45°C	н/п	1°C/мин	н/п
Поддержание	-45°C	1 час	1°C/мин	н/п
Отжиг	-20°C	н/п	н/п	н/п
Поддержание	-20°C	1 час	н/п	н/п
Замораживание	от -20°C до -45°C	н/п	1°C/мин	н/п
Поддержание	-45°C	1 час	н/п	н/п
Первичная сушка	-45°C	10 минут	н/п	30 мТорр
	от -45°C до 35°C	н/п	0,5°C/мин	30 мТорр
35°C	9 часов	н/п	30 мТорр
Вторичная сушка	35°C	3 часа	н/п	255 мТорр
н/п - не применялось

Таблица 5 Цикл сушки замораживанием для вакцины во флаконе
Этап	Температура	Время	Скорость линейного изменения	Давление в камере
Загрузка	4°C	1 час	н/п	н/п
Замораживание	от 4°C до -50°C	н/п	1°C/мин	н/п
Поддержание	-50°C	2 час	1°C/мин	н/п
Отжиг	-15°C	н/п	н/п	н/п
Поддержание	-15°C	2 часа	н/п	н/п
Замораживание	от -15°C до -30°C	н/п	1°C/мин	н/п
Поддержание	-30°C	4 часа	н/п	н/п
Первичная сушка	-30°C	40 часов	н/п	50 мТорр
	от -30°C до 10°C	н/п	1°C/мин	200 мТорр
10°C	8 часов	н/п	200 мТорр
Вторичная сушка	от 10°C до 35°C	н/п	1°C/мин	200 мТорр
35°C	4	н/п	200 мТорр
н/п - не применялось

Таблица 6 Предполагаемый срок хранения CDV, CPI, CAV2 и CPV в разных композициях при 27°C
Вирус	Композиции	Титр вируса в разные точки времени при 27°C	Предполагаемый срок хранения при 27°C
Д 0	Мес 6	Мес 12	Мес 18
CDV	SP02B	7,00	5,33	4,50	4,75	~24 мес
CDV	SP10	6,83	5,42	5,50	5,33	>24 мес
		Д 0	Мес 6	Мес 12	Мес 18
CPI	SP02B	6,67	5,00	4,75	4,83	>18 мес
CPI	SP10	7,17	4,92	4,92	4,92	>18 мес
		Д 0	Мес 6	Мес 12	Мес 18
CAV	SP02B	4,33	3,67	3,58	3,67	~18 мес
CAV	SP10	4,08	3,92	3,75	3,83	>24 мес
		Д0	Мес 6	Мес 10	Мес 12
CPV	SPCPV-02	4,83	4,75	4,92	4,58	~18 мес
CPV	SPCPV-03	5,08	4,33	4,92	4,75	~18 мес

Таблица 7 Ряд лидирующих композиций, выявленных в испытании на стабильность в ускоренном режиме при 45°C
Вирус	Композиция	Титр вируса при 45°C	Оценка стабильности
Д 0	Нед 1	Нед 2	Нед 4
CDV	SP10	7,00	5,83	5,45	5,44	+++
CDV	SP43	7,11	6,11	6,00	5,89	++++
CDV	SP44	7,44	6,50	6,28	6,11	+++++
		Д 0	Нед 1	Нед 2	Нед 4
CPI	SP10	6,83	5,66	5,17	4,83	+++
CPI	SP43	6,94	5,72	5,28	5,39	++++
CPI	SP44	7,17	6,28	5,83	5,56	+++++
		Д 0	Нед 1	Нед 2	Нед 4
CAV2	SP10	4,56	4,56	4,72	4,50	+++
CAV2	SP43	4,61	4,56	4,61	4,67	+++
CAV2	SP44	4,67	5,22	5,00	4,61	++++

Таблица 8 Влияние буфера и уровня рН на стабильность вируса
Вирус	Композиция	Буфер	pH	Титр вируса в разные точки времени	Оценка стабильности вируса
				Д 0		45°C	45°C	27°C	27°C
Нед 2	Нед 4	Мес 3	Мес 6
CDV	IB3-01	KPO4	6,5	н/д	5,58	4,67	6,00	5,50	+++++
CDV	IB3-02	KPO4	7,2	6,63	4,58	3,00	5,38	5,25	+++
CDV	IB3-03	KPO4	7,6	6,88	4,00	2,00	5,00	4,63	+
CDV	IB3-04	гистидин	6,5	7,13	5,33	4,33	5,50	5,38	++++
CDV	IB3-05	гистидин	7,2	7,00	4,50	3,17	5,25	5,25	+++
CDV	IB3-06	гистидин	7,6	6,88	4,08	2,83	4,75	5,13	++
CDV	IB3-07	BTP	6,5	6,88	5,25	3,83	5,75	5,38	++++
CDV	IB3-08	MOPS	6,5	7,00	4,75	3,92	5,63	5,38	++++
CPI	IB3-01	KPO4	6,5	н/д	5,42	4,58	6,25	5,25	+++++
CPI	IB3-02	KPO4	7,2	6,50	4,50	3,42	5,38	4,75	+++
CPI	IB3-03	KPO4	7,6	6,38	3,75	2,17	4,75	4,25	+
CPI	IB3-04	гистидин	6,5	7,00	5,33	4,17	5,75	4,88	++++
CPI	IB3-05	гистидин	7,2	6,88	4,25	3,00	5,25	4,63	+++
CPI	IB3-06	гистидин	7,6	6,88	4,17	3,00	5,13	4,88	++
CPI	IB3-07	BTP	6,5	6,75	4,75	4,08	5,13	5,25	++++
CPI	IB3-08	MOPS	6,5	7,00	5,00	4,00	5,75	5,13	++++
CAV2	IB3-01	KPO4	6,5	4,80	4,50	4,50	5,25	5,38	++++
CAV2	IB3-02	KPO4	7,2	5,18	4,58	4,42	5,00	5,00	+++
CAV2	IB3-03	KPO4	7,6	4,18	4,25	4,67	5,38	5,13	+++
CAV2	IB3-04	гистидин	6,5	4,68	4,58	5,08	5,50	5,25	++++
CAV2	IB3-05	гистидин	7,2	4,80	4,58	4,50	5,25	5,13	+++
CAV2	IB3-06	гистидин	7,6	4,93	4,42	4,75	4,75	5,00	++
CAV2	IB3-07	BTP	6,5	4,55	4,83	4,75	5,13	5,75	+++++
CAV2	IB3-08	MOPS	6,5	4,55	4,75	4,67	4,75	5,63	++++
CPV	IB3-01	KPO4	6,5	4,25	2,92	3,25	4,63	н/д	++
CPV	IB3-02	KPO4	7,2	4,25	3,67	4,33	5,63	н/д	+++
CPV	IB3-03	KPO4	7,6	4,00	3,83	4,75	5,50	н/д	+++
CPV	IB3-04	гистидин	6,5	н/д	4,17	4,00	5,25	н/д	+++
CPV	IB3-05	гистидин	7,2	4,25	4,25	4,83	5,50	н/д	++++
CPV	IB3-06	гистидин	7,6	3,50	3,67	4,92	5,50	н/д	++++
CPV	IB3-07	BTP	6,5	4,88	3,58	3,83	4,88	н/д	++
CPV	IB3-08	MOPS	6,5	4,50	3,92	4,00	5,38	н/д	+++

Таблица 9а Содержание невосстанавливающих олигосахаридов и общее содержание невосстанавливающих олигосахаридов в смешанных композициях, используемых в таблице 9b
Композиции	Концентрация сахара (вес/объем)	Общее содержание сахара (вес/объем)
Сахароза	Трегалоза
SP02B	17,1%	-	17,1%
SP10	17,1%	6,8%	23,9%
SP11	10,3%	6,8%	17,1%
SP12	6,8%	10,3%	17,1%
SP13	6,8%	17,1%	23,9%
SP14	-	17,1%	17,1%
SP15	10,3%	-	10,3%
SP16	5,2%	5,2%	10,3%
SP17	-	10,3%	10,3%

Таблица 9b Влияние концентрации сахара на стабильность лиофилизированных CDV, CPI и CAV2
Вирус	Композиция	Титр вируса в разные точки времени при 45°C и 37°C	Оценка стабильности
		Д 0		45°C	45°C	45°C	37°C	37°C	37°C	37°C
Нед 2	Нед 4	Нед 8	Нед 2	Нед 4	Нед 6	Нед 12
CDV	SP02B	7,00	5,25	5,00	4,67	4,92	4,67	4,83	4,00	++
CDV	SP10	6,83	5,58	5,08	5,50	5,25	5,33	5,17	5,25	++++
CDV	SP11	6,92	5,00	5,00	н/д	5,58	5,17	4,83	н/д	+++
CDV	SP12	6,75	5,00	5,00	н/д	5,17	4,42	4,67	н/д	++
CDV	SP13	7,17	5,08	5,00	4,75	5,08	5,33	5,08	5,13	++++
CDV	SP14	6,92	4,83	4,92	5,17	5,33	4,92	4,83	4,38	++
CDV	SP15	7,00	5,17	4,92	н/д	4,92	4,88	4,67	н/д	++
CDV	SP16	6,75	5,00	4,33	н/д	4,92	4,75	4,50	н/д	+
CDV	SP17	6,83	4,33	4,75	н/д	4,92	4,33	4,08	н/д	+
CPI	SP02B	6,67	4,67	4,58	4,42	4,75	4,67	4,00	2,92	++
CPI	SP10	7,17	5,17	4,92	4,67	5,17	5,00	4,33	3,75	++++
CPI	SP11	6,67	5,17	4,78	н/д	5,00	4,75	4,42	н/д	+++
CPI	SP12	6,92	4,92	4,75	н/д	4,92	4,67	3,75	н/д	++
CPI	SP13	6,92	5,33	4,83	4,67	4,67	4,67	4,50	4,25	++++
CPI	SP14	6,67	4,92	4,83	4,33	4,75	4,58	4,33	2,50	++
CPI	SP15	7,08	5,08	4,92	н/д	4,92	4,67	4,00	н/д	++
CPI	SP16	6,83	4,92	4,58	н/д	5,00	4,67	4,00	н/д	++
CPI	SP17	6,67	4,58	4,17	н/д	4,92	4,33	3,58	н/д	+
CAV2	SP02B	4,33	4,33	4,25	2,83	3,33	3,33	3,25	1,50	++
CAV2	SP10	4,08	4,33	4,17	3,67	3,58	3,50	3,50	3,08	+++
CAV2	SP11	4,25	3,58	3,75	н/д	3,00	3,17	2,75	н/д	+
CAV2	SP12	4,58	3,92	3,83	н/д	3,33	3,67	3,17	н/д	++
CAV2	SP13	4,42	4,50	4,42	3,33	3,58	3,75	4,17	3,08	+++
CAV2	SP14	4,33	3,92	3,92	3,50	3,58	3,58	3,42	3,25	+++
CAV2	SP15	4,58	3,17	3,33	н/д	2,83	2,83	3,00	н/д	++
CAV2	SP16	4,08	3,33	3,17	н/д	2,92	2,58	2,50	н/д	+
CAV2	SP17	4,33	2,58	2,58	н/д	2,33	2,67	2,92	н/д	+
н/д: данные не доступны

Таблица 10 Влияние концентрации L-аргинина в смесях на стабильность вируса
Вирус	Композиция	Титр вируса в ходе испытаний на стабильность при 45°C и 37°C	Оценка стабильности
		45°C	45°C	45°C	45°C	37°C	37°C	37°C
Название	L-Arg	Д 0	Нед 1	Нед 2	Нед 4	Нед 8	Мес 2	Мес 4	Мес 6
CDV	SP02B	0,3M	5,75	5,50	5,83	5,58	4,83	5,25	5,42	4,83	+++
CDV	SP26	0,2M	6,58	5,58	5,83	5,33	4,33	5,17	4,75	4,83	++
CDV	SP27	0,1M	н/д	6,33	5,25	4,92	4,33	5,42	4,25	4,58	+
CPI	SP02B	0,3M	7,00	5,08	5,25	4,83	4,92	4,75	5,17	4,42	+++
CPI	SP26	0,2M	6,83	5,42	5,67	4,67	4,17	5,00	4,50	4,42	++
CPI	SP27	0,1M	6,67	5,33	4,83	4,58	4,25	4,58	4,42	4,00	+
CAV2	SP02B	0,3M	4,00	3,75	3,42	3,58	3,67	3,67	3,83	3,00	+++
CAV2	SP26	0,2M	4,33	3,42	3,25	2,92	3,67	3,25	3,50	1,67	+
CAV2	SP27	0,1M	4,33	3,33	2,83	2,50	2,67	3,33	2,92	2,42	+
н/д: данные не доступны

Таблица 11а Начало Tg в лиофилизированных гранулах с разными солями аргинина и в комбинации с глутаминовой кислотой
Композиция	Стабилизаторы	начало Tg (°C)
Аргинин	Глутаминовая кислота
SP10	0,3M ArgCl		58,7
SP33	0,3M Arg3PO4		80,9
SP34	0,3M ArgAc		36,1
SP35	0,15M ArgCl	0,15M Glu	52,9
SP36	0,25M ArgCl	0,25M Glu	27,8

Таблица 11b Влияние разных солей аргинина и глутаминовой кислоты на стабильность CDV, CAV2 и CPI
Вирус	Композиция	Титр вируса в ходе испытаний на стабильность при 45°C или 37°C
		Д 0	45°C	45°C	45°C	45°C	37°C	37°C	27°C
Нед 1	Нед 2	Нед 4	Нед 8	Мес 2	Мес 4	Мес 7	Оценка стабильности
CDV	SP10	6,92	6,00	5,50	5,50	5,33	5,50	5,08	5,67	+++
CDV	SP33	7,08	4,75	4,83	4,25	3,50	5,00	4,25	4,50	+
CDV	SP34	7,50	5,75	5,50	5,42	4,83	5,67	5,17	5,67	+++
CDV	SP35	7,25	5,67	5,33	5,42	5,25	5,58	5,17	5,42	+++
CDV	SP36	7,00	6,17	5,42	4,92	3,58	5,75	4,83	6,00	+++
CPI	SP10	6,83	5,42	5,08	5,00	4,67	5,08	5,33	5,08	+++
CPI	SP33	6,83	4,92	4,83	3,75	3,25	4,58	3,83	4,00	+
CPI	SP34	6,67	5,50	5,42	4,42	4,75	5,50	4,83	5,58	+++
CPI	SP35	6,58	5,67	5,33	5,08	4,25	5,25	4,50	5,25	++
CPI	SP36	6,58	5,83	5,83	4,58	3,83	5,25	5,08	5,33	+++
CAV2	SP10	4,25	4,25	4,42	4,25	4,00	4,00	4,42	4,33	+++
CAV2	SP33	4,00	4,33	4,33	4,00	3,08	3,58	3,92	3,83	++
CAV2	SP34	4,50	4,42	4,58	4,17	4,33	3,92	4,58	4,33	+++
CAV2	SP35	4,50	4,83	4,17	4,25	4,00	4,00	4,58	4,08	+++
CAV2	SP36	4,58	4,67	4,75	4,17	3,83	4,08	4,50	4,42	+++

Таблица 12 Влияние маннита и глицина в качестве стабилизаторов для 4-валентной вакцины
Композиция	Наполнитель-стабилизатор	Титр вируса (log10 TCID50) после хранения при 45°C
		CDV	CAV2	CPI	CPV
Д 0	Нед 2	Д 0	Нед 2	Д 0	Нед 2	Д 0	Нед 2
IB1-02	Маннит	7,75	4,50	4,83	4,67	7,25	4,17	5,83	5,17
IB1-06	Глицин	7,75	3,58	5,25	4,25	8,00	3,83	6,33	5,42
IB1-10	-	7,58	2,83	4,83	4,08	7,33	3,25	6,58	4,92
- Д 0 обозначает титр вируса после лиофилизации, нед. 2 обозначает титр вируса после хранения при 45°C в течение 2-х недель. - разница между композициями IB1-02, IB1-06 и IB1-10 заключается в наполнителе-стабилизаторе. IB1-02 содержит 4% маннита, IB1-06 содержит 2% глицина, при этом IB1-10 не содержит наполнитель-стабилизатор.

Таблица 13 Влияние эктоина и гидроксиэктоина на стабильность вируса
Вирус	Композиция	Титр вируса в ходе испытания на стабильность	Оценка стабильности
		Д 0		45°C	45°C	45°C	45°C	37°C	37°C	27°C
Нед 1	Нед 2	Нед 4	Нед 8	Мес 2	Мес 4	Мес 7
CDV	SP10	6,92	6,00	5,50	5,50	5,33	5,50	5,08	5,67	+++
CDV	SP39	7,50	5,50	5,67	5,58	5,17	5,67	5,67	5,67	+++
CDV	SP40	6,92	5,67	5,58	5,58	5,42	5,92	5,50	6,42	++++
CPI	SP10	6,83	5,42	5,08	5,00	4,67	5,08	5,33	5,08	+++
CPI	SP39	6,50	5,92	5,50	4,92	4,92	5,25	5,33	5,08	+++
CPI	SP40	6,50	5,75	5,25	5,00	5,17	5,33	5,25	5,42	++++
CAV2	SP10	4,25	4,25	4,42	4,25	4,00	4,00	4,42	4,33	+++
CAV2	SP39	4,50	5,00	4,83	4,25	3,75	4,17	4,67	4,17	+++
CAV2	SP40	3,92	4,25	4,67	4,08	3,92	4,50	4,50	4,00	+++

Таблица 14 Влияние сорбита, белка и аргинина на эффективность CPV и физическую стабильность сухой вакцины
Композиции	Наполнители	Титр вируса в разные точки времени	Оценка стабиль-ности	Оценка физической стабильности
	Сорбит	Белок	L-Arg	Перед лиоф.	Д 0	45°C	37°C	27°C
Нед 1	Нед 2	Нед 4	Мес 2	Мес 4	Мес 6	Мес 6
SPCPV-02	5%	1 x GN	0,3 M	4,80	5,08	5,33	5,00	4,33	4,36	5,17	4,42	5,17	+++	++
SPCPV-13	8%	1 x GN	0,3 M	5,30	5,17	5,25	4,83	4,25	4,75	5,58	4,75	5,58	++++	+
SPCPV-14	12%	1 x GN	0,3 M	5,05	5,08	5,25	4,92	4,33	4,42	5,58	5,00	5,58	++++	+
SPCPV-15	5%	2,5xGN	0,3 M	5,05	5,17	5,17	4,83	4,17	4,08	5,25	4,67	5,00	+++	+++
SPCPV-17	5%	2,5xGN	-	5,30	5,42	4,92	4,83	3,92	4,33	5,08	4,58	5,00	+++	+++
- титр вируса в точке перед лиофилизацией (перед лиоф.) представляет титр вируса в вакцинной смеси перед сушкой замораживанием. - 1 x GN обозначает 0,8% (вес/объем) желатина и 1,0% (вес/объем) NZ-амина. - 2,5 x GN обозначает 2,5% (вес/объем) желатина и 2,5% (вес/объем) NZ-амина.

Таблица 15 Влияние сорбита и декстрана на стабильность CPV
Композиции	Наполнители (вес/объем)	Титр вируса после хранения при 45°C	Оценка стабильности эффективности	Оценка физической стабильности
Сорбит	Декстран	Д 0	Нед 1	Нед 2	Нед 4
SP-CPV-17	5%	2%	4,83	4,39	3,95	3,83	+++	+++
SP-CPV-23	5%	4%	5,17	4,33	4,05	4,00	+++	++++
SP-CPV-24	5%	6%	4,94	4,11	3,61	3,55	+	+++++
SP-CPV-26	8%	4%	5,83	4,45	4,78	4,33	+++++	++++
- используется декстран с молекулярной массой 70k. - Оценка физической стабильности основана на физической структуре гранул после сушки вымораживанием, которую определяли в разные моменты времени во время хранения при 45°С.

Таблица 16 Эффекты различных режимов сушки на стабильность вируса
Режим лиофилизации	Композиция	Титр вируса в ходе испытания на стабильность при 45°C
		CDV	CPI	CAV2
Д 0	Нед 2	Нед 4	Д 0	Нед 2	Нед 4	Д 0	Нед 2	Нед 4
гранулы	SP02B	н/д	5,25	5,00	6,67	4,67	4,58	4,33	4,33	4,25
флакон	FDIV-03	7,25	5,00	4,92	7,13	5,42	4,92	4,63	н/д	4,25
н/д: данные титра для этой точки времени не доступны из-за недостоверности анализа.

1. Сухая композиция вакцины, которая содержит живой аттенуированный вирус, невосстанавливающие олигосахариды в количестве от 30% до 80% (вес/вес), аминокислотный стабилизатор от 5% до 40% (вес/вес), белковый стабилизатор от 2% до 20% (вес/вес), наполнитель-стабилизатор в количестве от 2% до 25% (вес/вес), где аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин, где живой аттенуированный вирус представляет собой живой аттенуированный собачий вирус, выбранный из группы, состоящей из вируса чумы плотоядных, аденовируса, вируса парагриппа и любой их комбинации,

и где указанную сухую композицию получают в виде лепешки, получают на мембране или фильтре, высушивают в виде порошка путем сублимационной сушки в шариках, путем распылительной сушки или путем распылительной сушки с замораживанием.

2. Сухая композиция по п.1, в которой соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающего олигосахарида составляет от 0,05 до 0,40.

3. Сухая композиция по п.1 или 2, в которой живой аттенуированный вирус представляет собой живой аттенуированный собачий вирус, выбранный из группы, состоящей из собачьего вируса чумы плотоядных (CDV), собачьего аденовируса типа 2 (CAV2), вируса парагриппа собак (CPI), вектора на основе рекомбинантного вируса парагриппа собак (rCPI), который кодирует и экспрессирует гетерологичный антиген, и любую их комбинацию.

4. Сухая композиция по п.3, дополнительно содержащая парвовирус собак (CPV) и от 2% до 5% (вес/вес) сорбита.

5. Сухая композиция по п.1 или 2, дополнительно содержащая парвовирус (CPV) и от 2% до 5% (вес/вес) сорбита.

6. Сухая композиция по п.1 или 2, в которой невосстанавливающий олигосахарид выбран из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, рафинозы и любой их комбинации.

7. Сухая композиция по п.2, отличающаяся тем, что наполнитель-стабилизатор представляет собой маннит.

8. Сухая композиция по п.1 или 2, дополнительно содержащая второй аминокислотный стабилизатор.

9. Сухая композиция по п.8, отличающаяся тем, что второй аминокислотный стабилизатор представляет собой глутамат.

10. Сухая композиция по п.1 или 2, которая дополнительно содержит соль двухвалентного катиона в количестве от 0,02% до 1% (вес/вес), выбранного из группы, состоящей из Мg⁺⁺, Са⁺⁺ и Zn⁺⁺.

11. Сухая композиция по п.1 или 2, в которой белковый стабилизатор выбран из группы, состоящей из желатина, протеолитического гидролизата суммарного казеина и их комбинации.

12. Сухая композиция по п.1 или 2, в которой невосстанавливающий олигосахарид представляет собой комбинацию сахарозы в количестве от 20% до 80% (вес/вес) и трегалозы от 18% до 66% (вес/вес); наполнитель-стабилизатор представляет собой маннит от 5% до 17% (вес/вес); общее количество аминокислотного стабилизатора составляет от 9% до 34% (вес/вес); при этом белковый стабилизатор содержит от 2% до 5% (вес/вес) желатина и от 2% до 6% (вес/вес) протеолитического гидролизата суммарного казеина.

13. Сухая композиция по п.1, отличающаяся тем, что невосстанавливающий олигосахарид представляет собой комбинацию сахарозы от 45% до 60% (вес/вес) и трегалозы от 15% до 25% (вес/вес); наполнитель-стабилизатор представляет собой маннит в количестве от 5% до 17% (вес/вес); аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин от 10% до 25% (вес/вес); и в которой белковый стабилизатор содержит от 1,5% до 3,5% (вес/вес) желатина и от 2% до 4% (вес/вес) протеолитического гидролизата суммарного казеина.

14. Способ получения стабильной при комнатной температуре сухой композиции вакцины по любому из пп. 1-13, который содержит:

а) приготовление вакцинной композиции путем объединения терапевтически эффективного количества живого аттенуированного собачьего вируса и от 8% до 30% (вес/объем) невосстанавливающего олигосахарида, от 1% до 6% (вес/объем) наполнителя-стабилизатора, от 0,1 М до 0,5 М аминокислотного стабилизатора, от 0,9% до 10% (вес/объем) белкового стабилизатора и буфера с уровнем рН от 6,0 до 8,0; при этом соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающего олигосахарида составляет от 0,05 до 0,40; где аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин; и

б) сушку вакцинной композиции из этапа а) под вакуумом, для получения стабильной при комнатной температуре сухой композиции.

15. Способ получения сухой композиции по п.14, в котором указанное получение содержит комбинирование терапевтически эффективного количества живого аттенуированного собачьего вируса и невосстанавливающего олигосахарида, который представляет собой комбинацию от 5% до 18% (вес/объем) сахарозы и от 5% до 18% (вес/объем) трегалозы, и наполнителя-стабилизатора в количестве от 2% до 4% (вес/объем), аминокислотного стабилизатора от 0,1М до 0,3М, белкового стабилизатора от 1,5% до 6% (вес/объем); и в котором соотношение наполнителя-стабилизатора и невосстанавливающего олигосахарида составляет от 0,08 до 0,37.

16. Способ получения сухой композиции по п.14 или 15, который дополнительно содержит включение осмолита, выбранного из группы, состоящей из эктоина, гидроксиэктоина или их комбинации.

17. Способ получения сухой композиции по п.14 или 15, где живой аттенуированный собачий вирус выбран из группы, состоящей из собачьего вируса чумы плотоядных, собачьего аденовируса типа 2, вируса парагриппа собак и любой их комбинации.

18. Способ получения сухой композиции по п.14 или15, дополнительно содержащей собачий парвовирус и от 0,5% до 5% (вес/объем) сорбита.

19. Способ получения сухой композиции по п.14 или 15, отличающийся тем, что наполнитель-стабилизатор представляет собой маннит.

20. Способ получения сухой композиции по п.14 или 15, в котором аминокислотный стабилизатор представляет собой аргинин или комбинацию аргинина и глутаминовой кислоты.

21. Способ получения сухой композиции по п.14 или15, где композицию вакцины перед сушкой обрабатывают способом, выбранным из группы, состоящей из нанесения этой композиции на мембрану, замораживания в гранулах, замораживания во флаконах, распылительной сушки, распылительной сушки замораживанием и доведения до состояния пены.

22. Сухая композиция по п.1, которая дополнительно содержит осмолит, выбранный из группы, состоящей из эктоина, гидроксиэктоина или их комбинации.