Способ получения комплекса аллогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста для стимуляции регенеративного остеогенеза

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способу получения комплекса аллогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста для стимуляции регенеративного остеогенеза, отличающемуся тем, что включает в себя забор цельной крови, центрифугирование крови при ускорении 350-750 g в течение 4-5 мин при температуре 18-23°С, отбор среднего слоя плазмы, повторное центрифугирование крови при ускорении 150-200 g в течение 3-4 мин при температуре 18-23°С, отбор надосадочного слоя, получение тромбоцитарного концентрата, промывание его изотоничным плазме крови раствором, повторное центрифугирование его при ускорении 1000-2000 g в течение 4-5 мин при температуре 18-23°С, отбор из нижнего слоя фракции «чистого» тромбоцитарного концентрата, замораживание его «шоковой заморозкой» при постоянном перемешивании как минимум 15 мин при температуре от -30°С и ниже, затем при температуре от -80°С и ниже как минимум в течение 60 мин, лиофилизацию и стерилизацию полученного комплекса. Технический результат заключается в повышении концентрации факторов роста без примесей. 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, позволяет изготавливать биологически активный препарат из аллокрови для ускорения процессов регенерации костной ткани организма.

Известен аналог: технология лиофилизации обогащенной тромбоцитами плазмы с сохранением жизнеспособности факторов TGF, PDGF, VEGF в описании изобретения к патенту №2506946 РФ, МПК A61K 9/19, A61K 38/18, A61L 15/44, B01J 3/00, по заявке №2012151106/15 от 28.11.2012, опубл. 20.02.2014, в бюл. №25, включающая забор цельной крови, ее центрифугирование, отбор среднего слоя плазмы таким образом, чтобы исключить попадание эритроцитов. Полученный в результате центрифугирования тромбоцитарный концентрат замораживают в холодильной камере при температуре ниже, чем минус 1°С, производят его высушивание в течение, как минимум, трех минут в диапазоне температур от 2°С до 52°С; перед применением лиофилизат подвергают стерилизации.

Недостатки: позволяет получить лиофилизированную обогащенную тромбоцитами плазму с недостаточно большой концентрацией факторов роста и примесями.

Полученную лиофилизированную обогащенную тромбоцитами плазму можно использовать только у тех пациентов, из крови которых она получена из-за наличия иммуногенных примесей, включающих антитела и антигены, а также клеточные структуры - лейкоциты, так как в процессе изготовления отсутствует стадия промывки. Наличие примесей в готовом препарате стимулирует иммунные реакции при его введении другому человеку.

При применении стандартной-медленной заморозки происходит разрушение факторов роста тромбоцитов в концентрате из-за постепенного снижения температуры и перехода вещества из жидкого состояния в твердое. Кроме того, процесс лиофилизации идет в очень большом температурном диапазоне от 2С° до 52С°. При температуре выше 38°С возможна денатурация белковых субъединиц факторов роста. Поэтому конечный продукт имеет недостаточно высокую концентрацию факторов роста. Так как стерилизация лиофилизированной обогащенной тромбоцитами плазмы происходит непосредственно перед применением, а не сразу после приготовления, то во время хранения инородные частицы, попавшие в момент приготовления, например при лиофилизации, могут ухудшить свойства полученного препарата.

Известен аналог - способ получения богатой тромбоцитами аутоплазмы в описании изобретения к патенту №2305563 РФ, МПК А61М 1/36, А61К 35/16, А61К 35/14, по заявке №2005125929/15, от 15.08.2005; опубл. 20.02.2007, в бюл. №25, заключающийся во введении в аутогенную кровь стабилизатора, ее центрифугировании, добавлении прокоагулянта, содержащего 10%-ный раствор CaCl₂ и фактора свертывания крови, отличающийся тем, что центрифугирирование проводят при комнатной температуре в течение 6-8 мин со скоростью 1000-2300 об/мин, а затем в качестве фактора свертывания крови добавляют 5000 ЕД протромбина.

Недостатки: позволяет получить богатую тромбоцитами аутоплазму (далее по тексту аутоБоТП) с примесями, с недостаточно длительным сроком хранения.

Препарат может быть использован только у пациента, из цельной крови которого он приготовлен. При применении у другого больного велика вероятность осложнений в виде иммунной реакции, так как при приготовлении БОТП используется аутогенная кровь и полученный препарат содержит белковые единицы антитела, антигены и клеточные структуры, такие как лейкоциты.

АутоБоТП находящаяся в жидком состоянии быстро, теряет свои свойства за счет денатурации белковых структур и высвобождении про- и противовоспалительных цитокинов и других иммуногенных структур, влияющих на терапевтическую эффективность и иммунную реактивность.

Известен наиболее близкий аналог - способ получения экстракта аллогенных факторов роста в описании изобретения к патенту ЕР Пат №13171495, МПК A61K 35/16; A61K 35/19; A61K 45/06; A61L 27/54; А61Р 17/02, от 11.06.2013, в котором экстракт, получен при отделении тромбоцитов от плазмы с последующей их активацией. Приготовление человеческой плазмы, состоящей из тромбоцитов и белков плазмы осуществляется следующим образом: отделение тромбоцитов от плазмы и белков плазмы, смешивание отделенных на предыдущей стадии тромбоцитов с дистиллированной водой для высвобождения факторов роста, и отделение высвобожденных факторов роста для получения экстракта аллогенных факторов роста. Затем проводится лиофилизация выделенного экстракта аллогенных факторов роста.

Недостатки: позволяет получить экстракт аллогенных факторов роста с примесями и недостаточно большой концентрацией факторов роста.

Отсутствует стадия получения тромбоцитарного концентрата (далее по тексту ТК). На стадии получения «чистых» тромбоцитов, при промывании остаются в значительных количествах и лейкоциты. А при активации тромбоцитов для высвобождения факторов роста из лейкоцитов также выходят активные вещества, которые при повторном центрифугировании остаются с факторами роста тромбоцитов, так как имеют сходный молекулярный вес. Это будет вызывать местные иммунные процессы в поле введения препарата.

Способ предусматривает стадию, на которой происходит промывание тромбоцитов и отмывание их от плазмы с последующей активацией и дальнейшим повторным неоднократным центрифугированием и взбалтыванием, что стимулирует выброс факторов роста в плазму, которая на последующем этапе отфильтровывается, снижая количество факторов роста в препарате.

Перед лиофилизацией полученного материала, при применении стандартной медленной заморозки возможно разрушение или частичное повреждение факторов роста тромбоцитов из-за этапа кристаллизации.

Препарат может быть использован только у пациента, из цельной крови которого он приготовлен из-за содержания иммуногенных примесей в препарате, которые могут вызывать иммунную реакцию организма при применении у другого пациента.

Технический результат: повышение концентрации факторов роста без примесей, с длительным сроком хранения.

Технический результат в способе получения комплекса аллогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста для стимуляции регенеративного остеогенеза достигается за счет того, что включает в себя забор цельной крови, центрифугирование крови при ускорении 350-750 g в течение 4-5 мин., при температуре 18-23°С, отбор среднего слоя плазмы, повторное центрифугирование крови при ускорении 150-200 g в течение 3-4 мин. при температуре 18-23°С, отбор надосадочного слоя, получение тромбоцитарного концентрата, промывание его изотоничным плазме крови растворе, повторное центрифугирование его при ускорении 1000-2000 g, в течение 4-5 мин при температуре 18-23°С, отбор из нижнего слоя фракции «чистого» тромбоцитарного концентрата, замораживание его «шоковой заморозкой» при постоянном перемешивании, как минимум 15 мин., при температуре, как минимум -30°С, затем при температуре, как минимум -80°С, как минимум в течение 60 мин., лиофилизацию и стерилизацию полученного комплекса.

В заявленном изобретении высокая концентрация тромбоцитарных факторов роста достигается путем щадящего отношения к клеточным и белковым структурам. Первично «мягко» центрифугируют полученную цельную кровь при оптимальном ускорении 350-750 g в течение 4-5 мин при температуре 18-23°С, получая БоТП. В отличие от аналогов, используемые при центрифугировании параметры не зависят от марки, модели и конфигурации ротора и определяются, как ускорение силы тяжести g.

Полученный комплекс аллогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста (далее по тексту аллоЛТФР) для стимуляции регенеративного остеогенеза может применяться у любых пациентов за счет получения «чистого» препарата. «Чистота» комплекса достигается, путем приготовления ТК сразу после получения БоТП непосредственно перед промыванием. Стадия получения ТК дает возможность получить наиболее чистый от лейкоцитов препарат. Так как при центрифугировании при оптимальном ускорении 150-200 g в течении 3-4 мин при температуре 18-23°С происходит осаждение лейкоцитов, а наиболее жизнеспособные и не активированные тромбоциты остаются во взвешенном состоянии в надосадочной области. В полученном ТК отсутствуют лейкоциты, которые на дальнейших этапах приготовления могут высвобождать антигены и антитела в концентрат, тем самым снижая его иммунную резистентность.

В заявленном изобретении имеется стадия промывки ТК. Очищают тромбоцитарный концентрат предпочтительно физиологическим раствором 0,9% NaCl или любым другим индифферентным раствором, не влияющим на компоненты крови. Данная процедура позволяет отмыть тромбоциты от нежелательных частиц, таких как антигены, антитела, которые остались в плазме и могут вызывать иммунный ответ и аллергическую реакцию у пациента, в том числе и местные иммунные процессы в поле введения препарата.

В заявляемом изобретении изготовление препарата проводится из аллогенной крови, которую берут у донора, что позволяет заготавливать препарат заранее и использовать его по мере необходимости у любых пациентов.

В заявленном изобретении в отличие от аналогов, используют шоковую заморозку мелких объемов, в пробирках объемом 2-5 мл. Замораживание происходит, в течение, как минимум 15 мин, при температуре, как минимум -30°С, затем при температуре, как минимум -80°С, как минимум в течение 60 мин.

Это позволяет за минимальные сроки заморозить аллоЛТФР не повреждая их структуры, так как при более медленной заморозке, возможно повреждение факторов роста.

В заявленном изобретении предполагается более длительный срок хранения благодаря применению технологии лиофилизации, которая позволяет изготовить препарат без потери его структурной целостности и биологической активности. Лиофилизация обеспечивает получение препарата в высушенном состоянии, который в отличие от аналогов дольше хранится. При предложенном способе лиофилизации факторы роста не подвергаются денатурации и могут длительно сохраняться. Полученные аллоЛТФР при добавлении индифферентного раствора, не влияющего на компоненты крови, восстанавливают свои первоначальные свойства.

Из уровня техники не выявлены технические решения содержащие признаки, совпадающие с отличительными признаками заявляемого способа, поэтому заявляемый способ отвечает критерию изобретательского уровня.

Наличие отличительных от прототипа существенных признаков позволяет признать заявляемое техническое решение новым.

Возможность осуществления заявляемого изобретения в промышленности позволяет признать его соответствующим критерию промышленной применимости.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

В связи со способностью лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста храниться длительное время, без применения особых условий хранения, заготовку аллогенных лиофилизированных факторов роста производят заблаговременно.

Производят забор цельной крови у донора в объеме 200-500 мл с концентрацией тромбоцитов 180-320×10⁹/л. В стерильные пробирки с соблюдением правил асептики набирают кровь, предварительно добавив антикоагулянт 3,8% цитрата натрия. После заполнения пробирки кровью ее закрывают стерильной пробкой и тщательно, плавно, несколько раз переворачивают для перемешивания антикоагулянта и крови. Далее кровь подвергают центрифугированию при ускорении 350-750 g, в течение 4-5 мин. при температуре 18-23°С. В стерильных условиях производят отбор среднего слоя плазмы таким образом, чтобы исключить попадание эритроцитов. Полученную в результате центрифугирования БоТП повторно центрифугируют при ускорении 150-200 g в течение 3-4 мин. при температуре 18-23°С. В стерильных условиях производят отбор надосадочного слоя таким образом, чтобы исключить попадание лейкоцитов со дна пробирки.

Полученный в результате центрифугирования ТК промывают в изотоничном плазме крови растворе, например, физиологическим раствором 0,9% NaCl или любым другим индифферентным раствором. В ТК добавляют 200-500 мл 0,9% NaCl, затем повторно центрифугируют при ускорении 1000-2000 g в течение 4-5 мин при температуре 18-23°С. В стерильных условиях производят отбор нижнего слоя фракции.

Полученный «чистый» ТК распределяют в пробирки, предпочтительно объемом 2-5 мл, замораживают в течение, как минимум 15 мин, при температуре, как минимум -30°С, затем при температуре, как минимум -80°С, как минимум в течение 60 мин. Полученный материал лиофилизируют, стерилизуют, используя озоновую камеру. Полученные аллоЛТФР перемещают в асептических условиях в герметичный контейнер, хранят в сухом месте, без доступа солнечных лучей до момента его применения. Лиофилизация обеспечивает получение препарата в высушенном виде, с сохранением всех свойств, имеющихся перед лиофилизацией.

Пример осуществления заявляемого способа.

В связи со способностью лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста храниться длительное время без особых условий хранения, их заготовку производят заблаговременно.

Производят забор цельной крови у донора в объеме 200-500 мл с концентрацией тромбоцитов 180-320×10⁹/л. В стерильные пробирки с соблюдением правил асептики набирают кровь, предварительно добавив антикоагулянт 3,8% цитрата натрия. После заполнения пробирки кровью ее закрывают стерильной пробкой и тщательно, плавно, несколько раз переворачивают для перемешивания антикоагулянта и крови. Далее кровь подвергают центрифугированию при ускорении 350-750 g, в течение оптимального времени 4-5 мин при температуре 18-23°С. В стерильных условиях производят отбор среднего слоя плазмы таким образом, чтобы исключить попадание эритроцитов.

При ускорении 350-750 g в течение 4-5 минут обеспечивается максимальное разделение цельной крови на фракции. При взятии среднего слоя плазмы, содержание тромбоцитов в нем будет максимально, так как большая часть эритроцитов и лейкоцитов будет находится в осадке. Худшие результаты получают при центрифугировании с ускорением меньше 350 g, больше 750 g в течение меньше 4 мин, больше 5 мин, при температуре ниже 18°С, выше 23°С. Так как при ускорении менее 350 g в течение 4-5 минут слои плазмы визуально плохо определяются и при отборе среднего слоя плазмы происходит попадание большего числа эритроцитов и лейкоцитов, что в итоге влияет на «чистоту» и терапевтическую эффективность полученного препарата. При ускорении больше 750 g в течение 4-5 минут вместе с эритроцитами и лейкоцитами происходит оседание большого числа тромбоцитов, в результате чего средний слой плазмы будет обеднен тромбоцитами, что в конечном итоге повлияет на концентрацию факторов роста в препарате, тем самым снижая его эффективность при применении. При центрифугировании с ускорением 350-750 g меньше 4 мин. цельная кровь не полностью разделится на фракции, что приведет к отбору большого количества эритроцитов и лейкоцитов, тем самым снижая «чистоту» полученного препарата. При центрифугировании с ускорением 350-750 g более 5 мин оседает большое количество тромбоцитов, в результате чего снижается концентрация факторов роста в препарате, тем самым снижая его эффективность при применении. Температура от 18°С до 23°С способствует сохранению жизнеспособности тромбоцитов на всех этапах приготовления, снижение температуры ниже 18°С и превышение 23°С приводит к гибели или активации тромбоцитов, что в результате сводит к минимуму количество факторов роста в конечном препарате.

Полученную в результате центрифугирования БоТП повторно центрифугируют при ускорении 150-200 g в течение 3-4 мин при температуре 18-23°С. В стерильных условиях производят отбор надосадочного слоя таким образом, чтобы исключить попадание лейкоцитов со дна пробирки.

При ускорении 150-200 g в течение 3-4 минут происходит осаждение оставшихся на предыдущем этапе лейкоцитов, и при этом во взвешенном состоянии остается большая часть жизнеспособных, не активированных тромбоцитов. Худшие результаты получают при ускорении меньше 150 g, больше 200 g, в течение меньше 3 мин, больше 4 мин, при температуре ниже 18°С, выше 23°С. Так как при ускорении меньше 150 g на осаждение лейкоцитов потребуется большее количество времени, а с увеличением времени более 4 мин повышается выброс провоспалительных цитокинов в плазму, что в конечном итоге повлияет на иммунорезистентные свойства полученного препарата. При ускорении больше 200 g вместе с лейкоцитами происходит осаждение и тромбоцитов, поэтому в полученном концентрате будет содержаться меньшее количество тромбоцитов. При центрифугировании с ускорением 150-200 g менее 3 мин. лейкоциты не осаждаются в полном объеме и в конечном ТК будет повышенное количество лейкоцитов, тем самым увеличивается риск получения нежелательных частиц в виде антител, провоспалительных цитокинов в конечном препарате. Температура от 18°С до 23°С способствует сохранению жизнеспособности тромбоцитов на всех этапах приготовления, снижение температуры ниже 18°С и превышение 23°С приводит к гибели или активации тромбоцитов, что в результате сводит к минимуму количество факторов роста в конечном препарате. Полученный в результате центрифугирования ТК промывают Полученный в результате центрифугирования ТК промывают изотоничным плазме крови раствором, например наприм, физиологическим раствором 0,9% NaCl или любым другим индифферентным раствором, не влияющим на компоненты крови. В ТК добавляют 200-500 мл 0,9% NaCl, затем повторно центрифугируют при ускорении 1000-2000 g в течение 4-5 мин. при температуре 18-23°С. Затем в стерильных условиях производят отбор нижнего слоя.

При центрифугировании с ускорением 1000-2000 g в течении 4-5 минут выпадают в осадок необходимые для получения конечной субстанции тромбоциты, при этом более мелкие частицы, такие как антитела, про- и противовоспалительные цитокины и другие иммуногенные структуры остаются во взвешенном состоянии. Худшие результаты получают при центрифугировании с ускорением меньше 1000 g, больше 2000 g, в течение меньше 4 мин, больше 5 мин, при температуре ниже 18°С, выше 23°С. Так как при ускорении меньше 1000 g за 4-5 минут большая часть кровяных пластин не успевает осаждаться, тем самым в конечном продукте концентрация факторов роста будет низкая. А при ускорении более 2000 g за 4-5 минут происходит повреждение и частичная активация тромбоцитов с высвобождением факторов роста, что в конечном итоге приведет к их отмыванию на последующих этапах. При центрифугировании с ускорением 1000-2000 g меньше 4 минут большая часть тромбоцитов не выпадает в осадок и их концентрация в конечном продукте будет снижена. Центрифугирование с ускорением 1000-2000 g более 5 минут приведет к нарушению структуры тромбоцитов и их частичной активации, что снижает концентрацию факторов роста в полученном препарате. Температура от 18°С до 23°С способствует сохранению жизнеспособности тромбоцитов на всех этапах приготовления, снижение температуры ниже 18°С и превышение 23°С приводит к гибели или активации тромбоцитов, что в результате сводит к минимуму количество факторов роста в конечном препарате.

Полученный «чистый» ТК распределяют в пробирки, предпочтительно объемом 2-5 мл., замораживают методом «шоковой заморозки»: при постоянном перемешивании в течение, как минимум 15 мин., при температуре, как миниму -30°С. В течение, как минимум 15 мин. при температуре, как минимум -30°С при постоянном перемешивании заморозка происходит равномерно на всех участках. Худшие результаты получают при замораживании в течение менее 15 мин., при температуре выше -30°С, так как будут сохраняться микроучастки незамороженного материала, что в конечном результате способствует нарушению процесса лиофилизации и влияет на качество получаемого препарата.

Затем сразу по окончанию первого этапа снижают оптимально температуру ниже -80°С, в течение минимум 60 мин. При соблюдении данных условий происходит полное замораживание всего объема и легко возгоняется жидкий субстрат, в результате получают более качественный лиофилизат. Худшие результаты получают при температуре выше -80°С, в течение менее 60 мин, так как нарушается процесс лиофилизации из-за неравномерной кристаллизации материала.

Полученный материал лиофилизируют, стерилизуют, применяя озоновую камеру. Полученные аллоЛТФР перемещают в асептических условиях в герметичный контейнер, хранят в сухом месте, без доступа солнечных лучей до момента его применения.

В заявленном способе полученный аллоЛТФР может храниться длительное время без потери своих первоначальных свойств, т.к. лиофилизация обеспечивает получение препарата в высушенном состоянии, который в отличие от аналогов дольше хранится.

Способ апробирован в эксперименте в два этапа.

На первом этапе эксперимента осуществляли забор крови у лабораторных животных, с дальнейшим получением аллоЛТФР. Расчет необходимого объема цельной крови для приготовления ЛТФР производился с учетом что для стимуляции направленного действия в регенерации достаточно содержание PDGF 5-20 нг\мл. Объема 0,5 мл цельной крови, используемой для приготовления ЛТФР достаточно, для положительного влияния на репаративный остеогенез.

Итого в эксперименте использовалось 30 мл цельной крови, разделенной на 5 стерильных пробирок, по 6 мл соответственно каждой экспериментальной подгруппе.

Второй этап эксперимента проводили на 120 нелинейных конвекциональных крысах-самцах 5-6-месячного возраста, весом в 450-550 г, разделенных на 10 подгрупп.

1 группа - экспериментальная (60 крыс), разделенная на 5 подгрупп: 1 подгруппа - оценка остеогенеза на 5 сутки (12 крыс); 2 подгруппа - на 14 сутки (12 крыс); 3 подгруппа - на 21 стуки (12 крыс); 4 подгруппа - на 32 сутки (12 крыс), 5 подгруппа - на 44 сутки (12 крыс).

2 группа - контрольная (60 крыс) - 5 подгрупп по 12 особей животных с оценкой остеогенеза на 5, 14, 21, 32 и 44 сутки соответственно.

Производили ручную остеоклазию правой бедренной кости, формируя закрытый перелом с-н/3 бедра. АллоЛТФР из каждой пробирки разводили в 6 мл 0,9% NaCl и полученный раствор вводили в область перелома в объеме 0,25 мл на первые и вторые сутки после остеоклазии. В контрольной группе использовался раствор 0,9% NaCl в объеме 0,25 мл аналогично экспериментальной группе.

Выполнен сравнительный анализ лечения переломов костей с применением лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста, полученных из аллогенной крови и без применения данного препарата путем изучения рентгенологических снимков, гистологической картины, а также биохимического анализа.

В результате доказано - аллоЛТФР способны стимулировать репаративный остеогенез.

Одно из главных преимуществ использования аллоЛТФР - возможность длительного хранения и заготовки «про запас». Это позволит применять препарат повсеместно по мере надобности.

АллоЛТФР не просто способны нормализовать остеогенез, также как и традиционная ауто-PRP, но могут быть использованы у пациентов, ослабленных соматической патологией и тяжестью состояния, так как для приготовления препарата используется исключительно донорская кровь.

Проведенный эксперимент с применением аллоЛТФР клинически, рентгенологически и морфологически, биохимически не выявил каких-либо побочных эффектов. Можно констатировать факт отсутствия реакции со стороны иммунной системы в ответ на введение аллоЛТФР.

Проведенная статистическая обработка результатов исследований, позволяет считать эффективность использования комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов доказанной.

Примеры применения комплекса аллогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста для стимуляции регенеративного остеогенеза полученного заявляемым способом.

Пример №1, применение заявляемого изобретения в клинике, после клинических испытаний, может выглядеть следующим образом.

Больная «Р», 67 лет, травма в быту, падение со стремянки. Поступила с диагнозом: Закрытый оскольчатый перелом обеих костей правой голени в н\3 со смещением. В анамнезе закрытый компрессионный перелом L_1-2 1 ст.

Больной в травматологическом отделении проведен МОС большеберцовой кости пластиной и винтами. Малоберцовая кость фиксирована спицами. Синтез устойчив. Дренаж. Гемостаз. Швы. Рана заживала первичным натяжением, через 10 дней швы сняты. Пациентка выписана на амбулаторное лечение с рекомендациями.

Через 8 нед на Р-гр правой голени, признаки формирования псевдоартроза, повторное обращение.

За 5 недель до травмы больной «Р» у донора «М» взята кровь в количестве 300 мл. С помощью центрифугирования 400 g 5 мин при Т-18°С. Полученный материал повторно центрифугировали 170 g 3 мин при Т 18°С. Полученный материал промывали путем добавления 300 мл 0,9% NaCl. Повторное отделение тромбоцитов от других элементов промытой плазмы центрифугированием 2000 g 4 мин при Т 18°С. Далее полученный материал распределяли в пробирки по 5 мл и замораживали «шоковой заморозкой при постоянно перемешивании в течении 20 мин при температуре -30°С, затем сразу по окончанию первого этапа снизили температуру до -80°С, и замораживали в течении 60 мин. Полученный материал лиофилизировали, стерилизовали применяя озоновую камеру. Хранили в сухом прохладном месте.

В область формирующегося псевдоартроза пациентке в день повторного обращения вводят аллоЛТФР предварительно разведенный в 50 мл физ. раствора на первый и второй день. Рентген-контроль через 6 недель. Признаки формирования периосталъной мозоли.

Пример 2.

Больная «Б», 52 года, травма в ДТП. Поступила с диагнозом: Закрытый оскольчатый перелом обеих костей левого предплечья в с\3 со смещением. Больная в травматологическом отделении проведена открытая репозиция, металлостеосинтез левой локтевой и лучевой костей титановыми пластинами. Послеоперационный период без особенностей. Рана заживала первичным натяжением. Выписана на амбулаторное лечение с рекомендациями. Пациент самостоятельно снял гипсовую лонгету через 2 недели после выписки. Нагрузку на левую в\конечность не дозировал. Рекомендации лечащего врача не соблюдал. Через 6 нед на Р-гр левого предплечья, признаки замедленной консолидации, повторное обращение. За 3 недели до травмы больной «Б» у донора «О» взята кровь в количестве 350 мл. С помощью центрифугирования 450 g 4 мин при Т-20°С. Полученный материал повторно центрифугировали 180 g 3 мин при Т 20°С. Полученный материал промывали путем добавления 350 мл 0,9% NaCl. Повторное отделение тромбоцитов от других элементов промытой плазмы центрифугированием 1500 g 4 мин при Т 20°С. Далее полученный материал распределяли в пробирки по 5 мл и замораживали «шоковой заморозкой при постоянно перемешивании в течении 15 мин при температуре -35°С, затем сразу по окончанию первого этапа снизили температуру до -90°С, и замораживали в течении 60 мин. Полученный материал лиофилизировали, стерилизовали, применяя озоновую камеру. Хранили в сухом прохладном месте.

В область замедленной консолидации пациентке в день повторного обращения вводят аллоЛТФР предварительно разведенный в 50 мл физ. раствора на первый и второй день. Рентген-контроль через 5 недель. Признаки формирования периостальной мозоли.

Пример 3.

Больной «П», 57 лет, травма на производстве. Поступил с диагнозом: Закрытый перелом 2, 3, 4, 5 пястных костей правой кисти со смещением. Сахарный диабет тип 2 в анамнезе около 15 лет. Больному в травматологическом отделении проведена открытая репозиция, металлостеосинтез 2, 3, 4, 5 пястных костей правой кисти спицами. Послеоперационный период протекал на фоне плохо заживающей послеоперационной раны. Швы сняты на 14 дней. Выписан на амбулаторное лечение с рекомендациями. Через 4 нед на Р-гр правой кисти, признаки замедленной консолидации, повторное обращение. За 1 неделю до травмы пациента «П» у донора «С» взята кровь в количестве 300 мл. С помощью центрифугирования 500 g 4 мин при Т-22°С. Полученный материал повторно центрифугировали 200 g 3 мин при Т 22°С. Полученный материал промывали путем добавления 300 мл 0,9% NaCl. Повторное отделение тромбоцитов от других элементов промытой плазмы центрифугированием 1500 g 4 мин при Т 22°С. Далее полученный материал распределяли в пробирки по 3 мл и замораживали «шоковой заморозкой при постоянно перемешивании в течении 15 мин при температуре -40°С, затем сразу по окончанию первого этапа снизили температуру до -90°С, и замораживали в течении 60 мин. Полученный материал лиофилизировали, стерилизовали применяя озоновую камеру. Хранили сухом прохладном месте. В область замедленной консолидации пациенту в день повторного обращения вводят аллоЛТФР предварительно разведенный в 20 мл физ. раствора на первый и второй день. Рентген-контроль через 3 недели. Признаки формирования периостальной мозоли.

Использование заявляемого способа обеспечит получение комплекса аллогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста для стимуляции регенеративного остеогенеза с высокой концентрацией факторов роста без примесей, высоким сроком хранения.

Способ получения комплекса аллогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста для стимуляции регенеративного остеогенеза, отличающийся тем, что включает в себя забор цельной крови, центрифугирование крови при ускорении 350-750 g в течение 4-5 мин при температуре 18-23°С, отбор среднего слоя плазмы, повторное центрифугирование крови при ускорении 150-200 g в течение 3-4 мин при температуре 18-23°С, отбор надосадочного слоя, получение тромбоцитарного концентрата, промывание его изотоничным плазме крови раствором, повторное центрифугирование его при ускорении 1000-2000 g в течение 4-5 мин при температуре 18-23°С, отбор из нижнего слоя фракции «чистого» тромбоцитарного концентрата, замораживание его «шоковой заморозкой» при постоянном перемешивании как минимум 15 мин при температуре от -30°С и ниже, затем при температуре от -80°С и ниже как минимум в течение 60 мин, лиофилизацию и стерилизацию полученного комплекса.