Пирролобензодиазепиновые конъюгаты

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, в частности к пирролобензодиазепиновым конъюгатам антитело-лекарственное соединение и их применению. Предложен конъюгат формулы I:

,

где L представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент к опухолеассоциированному антигену, D^L представляет собой звено формулы II:

,

где либо R¹⁰ и R¹¹ образуют двойную азот-углеродную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны, либо R¹¹ представляет собой ОН и R¹⁰ представляет собой:

,

р=1–20. Указанные конъюгаты можно использовать для лечения пролиферативного заболевания. Конъюгаты хорошо переносятся в исследованиях токсичности у различных видов животных, что обеспечивает высокий терапевтический индекс таких конъюгатов. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 8 пр.

 

Уровень техники

Некоторые пирролобензодиазепины (PBD) обладают способностью распознавать и связываться с определенными последовательностями ДНК; предпочтительной последовательностью является PuGPu. Первый PBD противоопухолевый антибиотик, антрамицин, открыт в 1965 году (Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). С тех пор описано множество природных PBD и разработано более 10 синтетических способов получения различных аналогов (Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994)). Члены семейства включают аббеймицин (Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), чикамицин (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (японский патент 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), мазетрамицин (Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), неотрамицины А и В (Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), поротрамицин (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), протракарцин (Shimizu, et al., J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), сибаномицин (DC-102)(Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), сибиромицин (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) и томамицин (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). PBD имеют общую структуру:

Они отличаются по количеству, типу и положению заместителей в ароматических кольцах А и пиррольных кольцах С, а также по степени насыщенности кольца С. В кольце В находится имин (N=C), карбиноламин (NH-CH(OH)) или метиловый эфир карбиноламина (NH-CH(OMe)) в положениях N10-C11, которые представляют собой электрофильный центр, отвечающий за алкилирование ДНК. Все известные природные продукты имеют (S)-конфигурацию в хиральном положении С11а, что обеспечивает их провостороннее скручивание, если смотреть с кольца С на кольцо А. Это придает им соответствующую трехмерную форму для изоспиральности с малой бороздкой В-формы ДНК, что приводит к точному совпадению у сайта связывания (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Нью-Йорк, cc. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Их способность образовывать аддукт в малой бороздке обеспечивает возможность влиять на процессирование ДНК, вследствие чего их используют в качестве противоопухолевых агентов.

Ранее было описано, что биологическая активность указанных молекул может быть усилена посредством соединения двух звеньев PBD друг с другом через их С8/С-гидроксильные функциональные группы посредством гибкого алкиленового линкера (Bose, D.S., et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 4939-4941 (1992); Thurston, D.E., et al., J. Org. Chem., 61, 8141-8147 (1996)). Димеры PBD предположительно образуют последовательность-селективные повреждения ДНК, такие как палиндромная 5'-Pu-GATC-Py-3' межнитевая поперечная сшивка (Smellie, М., et al., Biochemistry, 42, 8232-8239 (2003); Martin, С, et al., Biochemistry, 44, 4135-4147), которые предположительно несут главную ответственность за их биологическую активность.

Одним из примеров димера PBD является SG2000 (SJG-136):

(Gregson, S., et al., J. Med. Chem., 44, 737-748 (2001); Alley, M.C., et al., Cancer Research, 64, 6700-6706 (2004); Hartley, J.A., et al., Cancer Research, 64, 6693-6699 (2004)), который исследовали в клинических испытаниях в качестве отдельного агента, например, NCT02034227, изучая его применение при лечении острого миелоидного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза (см.: https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02034227).

Димерные PBD соединения, содержащие С2 арильные заместители, такие как SG2202 (ZC-207), описаны в WO 2005/085251:

и в WO 2006/111759 описаны бисульфиты таких PBD соединений, например, SG2285 (ZC-423):

Было показано, что данные соединения являются весьма подходящими цитотоксическими агентами (Howard, P.W., et al., Bioorg. Med. Chem. (2009), doi: 10.1016/j.bmcl. 2009.09.012).

В исследовании воздействия, представленном на рассмотрение в рамках Программы оценки научных достижений 2014 года (2014 Research Excellence Framework (REF)) в Великобритании Университетским колледжем Лондона (University College London) (доступно по ссылке

http://impact.ref.ac.uk/casestudies2/refservice.svc/GetCaseStudyPDF/35393), указано, что: «Разработано следующее поколение димеров PBD, включая SG2057 и SG2202, которые являются более эффективными, чем SG2000. Они демонстрируют пикомолярную/суб-пикомолярную активность против ряда человеческих опухолевых клеточных линий и демонстрируют терапевтическую активность в моделях ксенотрансплантата человеческих опухолей», ссылка на:

Hartley JA, et al., DNA interstrand cross-linking and in vivo antitumor activity of the extended пирроло[2,1-c][1,4]benzodiazepine dimer SG2057. Invest New Drugs. 2012 Jun; 30(3):950-8. http://dx.doi.org/10.1007/s10637-011-9647-z (здесь и далее "Hartley et al (2012)") и:

«Возможность получать такие цитотоксические молекулы, которые демонстрируют превосходную эффективность, позволяет предположить возможную роль в стратегиях, рассчитанных на направленное воздействие и высвобождение сильных цитотоксических агентов непосредственно в очаге опухоли. Такой пример действует как «активная группа» конъюгата антитела-лекарственное соединение (ADC). Полностью синтетические димеры PBD идеально подходят на роль активной группы в подходе с ADC».

В резюме документа Hartley et al (2012) указано, что «SG2057, таким образом, является весьма активным противоопухолевым агентом с более высокой in vitro активностью и превосходной in vivo активностью по сравнению с SG2000, что обосновывает дальнейшие разработки».

SG2057 имеет структуру:

Конъюгаты антитело-лекарственное соединение с применением SG2057 в качестве активной группы были впервые описаны в WO 2011/130598. Например, пункт 54 формулы указанной заявки содержит формулу:

где n равен от 1 до 24, более предпочтительно от 4 до 8. Приведены примеры следующих лекарственных соединений-линкеров: n=4, 15с; n=8, 15d; n=24, 15е.

Пункт 54 формулы указанной заявки также содержит формулу:

где n равен от 1 до 24, более предпочтительно от 4 до 8. Приведены примеры следующих лекарственных соединений-линкеров: n=8, 58; n=24, 61.

В WO 2011/130598 также описаны конъюгаты антитело-лекарственное соединение, содержащие указанные лекарственные соединения-линкеры, например, пример 110 (antiSteap 1-15d), пример 114 (тастузумаб-15d) и пример 115 (тастузумаб-58).

В WO 2013/055987 описаны линкеры-лекарственные соединения 14 и 22:

и их применение в конъюгатах антитело-лекарственное соединение. Позже активную группу:

использовали в лекарственных соединениях-линкерах и конъюгатах антитело-лекарственное соединение. В WO 2014/057074 описаны:

В WO 2015/052322 описаны:

Сущность изобретения

Авторами данного изобретения неожиданно обнаружено, что несмотря на то, что SG2000 по меньшей мере в 10 раз менее цитотоксичен, чем SG2057 (см. Hartley et al 2012), определенные конъюгаты антитело-лекарственное соединение демонстрируют по меньшей мере сравнимую активность. Было показано, что указанные конъюгаты неожиданно хорошо переносятся в исследованиях токсичности у различных видов животных. Это обеспечивает высокий терапевтический индекс таких конъюгатов и, следовательно, делает их перспективными клиническими кандидатами.

В первом аспекте данного изобретения предложены конъюгаты формулы I:

где L представляет собой звено, представляющее собой лиганд (т.е. нацеливающий агент), D^L представляет собой звено, представляющее собой лекарственное соединение-линкер формулы II:

где либо:

(a) R¹⁰ и R¹¹ образуют двойную азот-углеродную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны; либо

(b) R¹¹ представляет собой ОН, и R¹⁰ представляет собой:

р представляет собой целое число от 1 до 20.

Звено, представляющее собой лиганд, более подробно описанное ниже, представляет собой нацеливающий агент, который связывается с фрагментом-мишенью. Например, звено, представляющее собой лиганд может специфически связываться с клеточным компонентом (клеточно-связывающий агент) или с другими молекулами-мишенями, представляющими интерес.Звено, представляющее собой лиганд может представлять собой, например, белок, полипептид или пептид, такой как антитело, антиген-связывающий фрагмент антитела или другой связывающий агент, такой как гибридный белок Fc.

Во втором аспекте данного изобретения предложено соединение формулы III:

где либо:

(a) R¹⁰ и R¹¹ образуют двойную азот-углеродную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны; либо

(b) R¹¹ представляет собой ОН, и R¹⁰ представляет собой:

В третьем аспекте данного изобретения предложено применение конъюгата по первому аспекту данного изобретения в производстве лекарственного средства для лечения пролиферативного заболевания. В третьем аспекте также предложен конъюгат по первому аспекту данного изобретения для применения при лечении пролиферативного заболевания. В третьем аспекте также предложен способ лечения пролиферативного заболевания, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата по первому аспекту данного изобретения пациенту, нуждающемуся в этом.

Специалисты в данной области техники могут без труда определить, подходит или не подходит потенциальный конъюгат для лечения пролиферативного состояния для любого конкретного типа клеток. Например, анализы, которые можно удобно использовать для оценки активности, обеспечиваемой конкретным соединением, описаны ниже в примерах.

В четвертом аспекте данного изобретения предложен синтез конъюгата по первому аспекту данного изобретения, включающий конъюгирование соединения (лекарственного линкера) по второму аспекту данного изобретения со звеном лиганда.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показано изменение объема опухоли ВТ474 после лечения конъюгатом по данному изобретению;

На Фиг. 2 показано изменение объема опухоли ВТ474 после лечения другим конъюгатом по данному изобретению;

На Фиг. 3 показано изменение объема опухоли NCI-N87 после лечения конъюгатом по данному изобретению;

На Фиг. 4 показано изменение объема опухоли NCI-N87 после лечения другим конъюгатом по данному изобретению.

D^L

В первом аспекте D^L выбран из D^L-A и D^L-B:

Во втором аспекте соединение выбрано из А и В:

Звено лигаида

Звено лиганда может быть любого типа и включает белок, полипептид, пептид и непептидный агент, который специфически связывается с молекулой-мишенью. В некоторых вариантах реализации звено лиганда может быть белком, полипептидом или пептидом. В некоторых вариантах реализации звено лиганда может циклическим полипептидом. Указанные звенья лиганда могут включать антитела или фрагмент антитела, который содержит по меньшей мере один сайт, связывающий молекулу-мишень, лимфокины, гормоны, факторы роста или любую другую клеточно-связывающую молекулу или вещество, которое может специфически связываться с мишенью.

Термины «специфически связывается» и «специфическое связывание» относятся к связыванию антитела или другого белка, полипептида или пептида с определенной молекулой (например, антигеном). Обычно антитело или другая молекула связывается с аффинностью по меньшей мере около 1×10⁷ М^-1, и связывается с определенной молекулой с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, чем ее аффинность связывания с неспецифической молекулой (например, BSA, казеин), отличной от указанной определенной молекулы или близкородственной молекулы.

Примеры звеньев лиганда включают агенты, описанные для применения в WO 2007/085930, включенном в данный документ.

В некоторых вариантах реализации звено лиганда представляет собой клеточно-связывающий агент, который связывается с внеклеточной мишенью на клетке. Такой клеточно-связывающий агент может быть белком, полипептидом, пептидом или непептидным агентом. В некоторых вариантах реализации клеточно-связывающий агент может быть белком, полипептидом или пептидом. В некоторых вариантах реализации клеточно-связывающий агент может циклическим полипептидом. Клеточно-связывающий агент также может быть антителом или антиген-связывающим фрагментом антитела. Так, в одном варианте реализации данного изобретения предложен конъюгат антитело-лекарственное соединение (ADC).

Клеточно-связывающий агент

Клеточно-связывающий агент может быть любого типа и включает пептиды и непептиды. Они могут включать антитела или фрагмент антитела, который содержит по меньшей мере один связывающий сайт, лимфокины, гормоны, миметики гормонов, витамины, факторы роста, молекулы, транспортирующие питательные вещества, или любую другую клеточно-связывающую молекулу или вещество.

Пептиды

В одном варианте реализации клеточно-связывающий агент представляет собой линейный или циклический пептид, содержащий 4-30, предпочтительно 6-20 последовательных аминокислотных остатков. В данном варианте реализации предпочтительно, что один клеточно-связывающий агент связан с одним мономером или димером пирролобензодиазепинового соединения.

В одном варианте реализации клеточно-связывающий агент содержит пептид, который связывает интегрин α_vβ₆. Указанный пептид может быть селективным в отношении α_vβ₆ по сравнению с XYS.

В одном варианте реализации клеточно-связывающий агент содержит полипептид A20FMDV-Cys. A20FMDV-Cys имеет последовательность:

NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC. Альтернативно, можно использовать вариант последовательности A20FMDV-Cys, в которой один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных остатков замещены другим аминокислотным остатком. Кроме того, указанный полипептид может иметь последовательность NAVXXXXXXXXXXXXXXXRTC.

Антитела

Термин «антитело» в данном контексте использован в самом широком смысле и включает, в частности, моноклональные антитела, поликлональные антитела, димеры, мультимеры, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют требуемую биологическую активность (Miller et al (2003) Jour, of Immunology 170:4854-4861). Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов. Антитело представляет собой белок, созданный иммунной системой, который способен распознавать и связываться со специфическим антигеном. (Janeway, С., Travers, Р., Walport, М., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5-ое изд., Garland Publishing, Нью-Йорк). Антиген мишени обычно имеет множество связывающих сайтов, также называемых эпитопами, которые распознаются определяющими комплементарность областями (CDR) различных антител. Каждое антитело, которое специфически связывается с другим эпитопом, имеет другую структуру. Так, один антиген может иметь более одного соответствующего антитела. Антитело включает полноразмерную молекулу иммуноглобулина или иммунологически активную часть полноразмерной молекулы иммуноглобулина, т.е. молекулу, которая содержит антиген-связывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с антигеном рассматриваемой мишени или его частью, и такие мишени включают, но не ограничиваются ими, раковые клетки или клетки, которые вырабатывают аутоиммунные антитела, связанные с аутоиммунным заболеванием. Иммуноглобулин может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса иммуноглобулиновых молекул. Иммуноглобулины могут быть получены из любых видов животных, включая человека, мышей или кроликов.

«Фрагменты антител» содержат часть полноразмерного антитела, обычно его антиген-связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и scFv; диатела; линейные антитела; фрагменты, полученные экспрессионной библиотекой Fab, анти-идиотипические (анти-Id) антитела, CDR (определяющую комплементарность область) и эпитоп-связывающие фрагменты любых вышеперечисленных, которые иммуноспецифически связываются с антигенами раковых клеток, вирусными антигенами или микробными антигенами, одноцепочечными молекулами антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Термин «моноклональное антитело» в данном контексте относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела, образующие указанную популяцию, идентичны, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо их специфичности, моноклональные антитела имеют то преимущество, что их можно синтезировать без примеси других антител. Модификатор «моноклональное» указывает на характер антитела как полученный из по существу однородной популяции антител, и его не следует толковать как требующий получения указанного антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подходящие для применения по данному изобретению, можно получать гибридомным способом, впервые описанным авторами Kohler et al (1975) Nature 256:495, или можно получать способами рекомбинантных ДНК (см. US 4816567). Моноклональные антитела можно также выделять из библиотек фаговых антител с применением технологий, описанных в публикации Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, или из трансгенных мышей, несущих полностью человеческую иммуноглобулиновую систему (Lonberg (2008) Curr. Opinion 20(4):450-459).

Моноклональные антитела в данном контексте включают, в частности, «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенных видов животных, или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, а остальная часть цепи(-ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов животных, или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют требуемую биологическую активность (US 4816567; и Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Химерные антитела включают «приматизированные» антитела, содержащие антиген-связывающие последовательности вариабельного домена, полученные из примата, не являющегося человеком (например, мартышковых или человекообразных обезьян), и последовательности константной области человека.

«Интактное антитело» в данном контексте представляет собой антитело, содержащее домены VL и VH, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, СН2 и СН3. Константные домены могут представлять собой константные домены нативной последовательности (например, константные домены человеческой нативной последовательности) или варианты их аминокислотной последовательности. Интактное антитело может иметь одну или более «эффекторных функций», которые относятся к биологической активности, связанной с областью Fc (областью Fc нативной последовательности или областью Fc варианта аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; и угнетающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности, таких как рецептор В-клеток и BCR.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, интактные антитела можно разделить на различные «классы». Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на «подклассы» (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам антител, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов являются общеизвестными.

Гуманизация

Технологии снижения in vivo иммуногенности нечеловеческого антитела или фрагмента антитела включают технологии, называемые «гуманизацией».

«Гуманизированное антитело» относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере часть модифицированной вариабельной области человеческого антитела, в которой часть указанной вариабельной области, предпочтительно часть, которая значительно меньше интактного человеческого вариабельного домена, замещена соответствующей последовательностью из нечеловеческих видов, и при этом указанная модифицированная вариабельная область связана с по меньшей мере другой частью другого белка, предпочтительно с константной областью человеческого антитела. Выражение «гуманизированные антитела» включает человеческие антитела, в которых один или более аминокислотных остатков определяющей комплементарность области («CDR») и/или один или более аминокислотных остатков каркасной области («FW» или «FR») замещены аминокислотными остатками из аналогичных сайтов антител грызунов или других нечеловеческих антител. Выражение «гуманизированное антитело» также включает вариант аминокислотной последовательности иммуноглобулина или его фрагмент, который содержит FR, содержащую по существу аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и CDR, имеющую по существу аминокислотную последовательность нечеловеческого иммуноглобулина.

«Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Или, с другой стороны, гуманизированное антитело представляет собой человеческое антитело, которое также содержит выбранные последовательности из нечеловеческих (например, мышиных) антител вместо человеческих последовательностей. Гуманизированное антитело может содержать консервативные аминокислотные замещения или неприродные остатки из тех же или других видов, которые существенно не отличаются по своей связывающей и/или биологической активности. Такие антитела являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческих иммуноглобулинов.

Существует множество технологий гуманизации, включая «прививание CDR», «направленный выбор», «деиммунизацию», «изменение поверхности» (также известное как «рекомбинация поверхностных остатков»), «композиционные антитела», «оптимизацию состава человеческой цепочки» и перестановку в каркасе.

Прививание CDR

В данной технологии гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (принимающее антитело), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) принимающего антитела заменены на остатки из CDR нечеловеческих видов (донорное антитело), таких как мыши, крысы, верблюды, быки, козы или кролики, имеющие требуемые свойства (по факту, нечеловеческие CDR «прививают» на человеческий каркас). В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют на соответствующие нечеловеческие остатки (это может происходить, например, если определенный остаток FR имеет значительное влияние на связывание антигена).

Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются ни в принимающем антителе, ни в импортированной CDR или каркасных последовательностях. Указанные модификации осуществляют для дополнительного улучшения и максимизации характеристик антитела. Таким образом, в общем, гуманизированное антитело содержит все из по меньшей мере одного и в одном аспекте двух вариабельных доменов, в которых все или все гипервариабельные петли соответствуют аналогичным структурам нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все области FR являются областями последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина или человеческого иммуноглобулина.

Направленный выбор

Указанный способ состоит из комбинирования домена V_H или V_L данного нечеловеческого антитела, специфичного в отношении определенного эпитопа, с библиотекой человеческого V_H или V_L, и специфические человеческие V домены выбирают по отношению к рассматриваемому антигену. Такой выбранный VH затем комбинируют с библиотекой VL с получением полной человеческой комбинации VH×VL. Указанный способ описан в публикации Nature Biotechnology (N.Y.) 12, (1994) 899-903.

Композиционные антитела

В указанном способе два или более сегментов аминокислотных последовательностей из человеческого антитела комбинируют с готовой молекулой антитела. Их конструируют посредством комбинирования множества сегментов человеческой последовательности VH и VL в комбинациях, которые ограничивают или исключают эпитопы Т-клеток человека в V областях готового композиционного антитела. При необходимости эпитопы Т-клеток ограничивают или устраняют посредством замены сегментов V области, способствующих или кодирующих эпитоп Т-клетки, на альтернативные сегменты, которые устраняют эпитопы Т-клеток. Указанный способ описан в US 2008/0206239 A1.

Указанный способ включает удаление эпитопов Т-клетки человека (или других вторичных видов) из V областей терапевтического антитела (или другой молекулы). Последовательность V-области терапевтических антител анализируют на наличие мотивов, связывающих МНС II класса, например, сравнивая с базами данных МНС-связывающих мотивов (таких как база данных указанных «мотивов», размещенная на сайте www.wehi.edu.au). Альтернативно, мотивы, связывающие МНС II класса, можно идентифицировать с помощью методов вычислительного протягивания, описанных в публикации Altuvia et al. (J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)); в указанных способах последовательные перекрывающиеся пептиды из последовательностей V-области проверяют на энергию их связывания с белками МНС II класса. Затем полученные данные можно объединять с информацией о других особенностях последовательности, которые относятся к успешно открытым пептидам, таких как амфипатичность, мотивы Ротбарда и сайты расщепления для катепсина В и других процессирующих ферментов.

После идентификации возможных эпитопов Т-клеток вторичных видов (например, человека), их исключают посредством изменения одной или более аминокислот.Модифицированные аминокислоты обычно находятся в самом эпитопе Т-клетки, но также могут быть расположены вблизи эпитопа с точки зрения первичной или вторичной структуры белка (и, следовательно, могут не быть расположены рядом в первичной структуре). Наиболее типично, такое изменение осуществляют посредством замены, но в некоторых случаях может быть более подходящим добавление или удаление аминокислоты.

Все изменения можно осуществлять технологией рекомбинантных ДНК, так что готовую молекулу можно получать экспрессией из рекомбинантного хозяина с применением хорошо известных способов, таких как сайт-направленный мутагенез. Однако возможно также применение белковой химии или любых других способов молекулярного изменения.

Изменение поверхности

Указанный способ включает:

(a) определение конформационной структуры вариабельной области нечеловеческого (например, грызунов) антитела (или его фрагмента) посредством создания трехмерной модели вариабельной области нечеловеческого антитела;

(b) создание выравнивания последовательностей с применением распределений относительной доступности на основании рентгеновских кристаллографических структур достаточного количества тяжелых и легких цепей вариабельной области нечеловеческого и человеческого антитела с получением набора каркасных положений тяжелой и легкой цепи, в которых положения выравнивания идентичны на 98% относительно достаточного количества тяжелых и легких цепей нечеловеческого антитела;

(c) определение нечеловеческого антитела, подлежащего гуманизации, для чего поверхность набора тяжелой и легкой цепи подвергают действию аминокислотных остатков с использованием набора каркасных положений, полученного на стадии (b);

(d) идентификацию по аминокислотным остаткам человеческого антитела поверхности набора тяжелой и легкой цепи, подверженной действию аминокислотных остатков, которые наиболее близко идентичны указанной поверхности набора, подверженной действию аминокислотных остатков, определенной на стадии (с), причем тяжелая и легкая цепь из человеческого антитела являются или не являются естественным образом спаренными;

(e) замещение в аминокислотной последовательности нечеловеческого антитела, подлежащего гуманизации, поверхности набора тяжелой и легкой цепи, подверженной действию аминокислотных остатков, определенной на стадии (с), на поверхность набора тяжелой и легкой цепи, подверженную действию аминокислотных остатков, определенную на стадии (d);

(f) построение трехмерной модели вариабельной области нечеловеческого антитела, полученной в результате замещения, описанного на стадии (е);

(g) идентификацию, посредством сравнения трехмерных моделей, построенных на стадиях (а) и (f), любых аминокислотных остатков из наборов, идентифицированных на стадиях (с) или (d), которые находятся в пределах 5 ангстрем от любого атома любого остатка областей, определяющих комплементарность, данного нечеловеческого антитела, подлежащего гуманизации; и

(h) замену любых остатков, идентифицированных на стадии (g), из человеческого на исходный нечеловеческий аминокислотный остаток с получением гуманизирующего набора поверхности нечеловеческого антитела, подверженного действию аминокислотных остатков; при условии, что стадию (а) не обязательно следует проводить первой, но ее следует проводить до стадии (g).

В указанном способе сравнивают нечеловеческую последовательность с функциональным репертуаром генов зародышевой линии человека. Выбирают те человеческие гены, которые кодируют канонические структуры, идентичные или близкородственные к нечеловеческим последовательностям. Выбранные человеческие гены с наивысшей гомологией в CDR выбирают в качестве доноров FR. Наконец, нечеловеческие CDR прививают на указанные человеческие FR. Указанный способ описан в патенте WO 2005/079479 А2.

Оптимизация состава человеческой цепочки

В указанном способе сравнивают нечеловеческую (например, мышиную) последовательность с репертуаром генов зародышевой линии человека и оценивают различия как содержание человеческой цепочки (HSC), которое количественно определяет последовательность на уровне потенциальных эпитопов МНС/Т-клетки. Затем гуманизируют целевую последовательность, максимизируя ее HSC, вместо использования измерения общей идентичности для создания многочисленных различных гуманизированных вариантов (описано в публикации Molecular Immunology, 44, (2007) 1986-1998).

Перетановка в каркасе

CDR нечеловеческого антитела гибридизуют внутри рамки с пулами кДНК, включающими все известные каркасы тяжелой и легкой цепи гена зародышевой линии человека. Затем гуманизированные антитела отбирают, например, посредством пэннинга фаг-дисплейной библиотеки антител. Указанный способ описан в публикации Methods 36, 43-60 (2005).

Примеры клеточно-связывающих агентов включают агенты, описанные для применения в WO 2007/085930, включенном в данный документ.

Опухолеассоциированные антигены и когнатные антитела для применения в вариантах реализации данного изобретения перечислены ниже.

ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫЕ АНТИГЕНЫ И КОГНАТНЫЕ АНТИТЕЛА

(1) BMPR1B (рецептор костного морфогенетичекого белка типа IB)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001203

Genbank, версия номер NM_001203.2 GI:169790809

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:06 после полудня (пп)

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001194

Genbank, версия номер NP_001194.1 GI:4502431

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:06 пп

Перекрестные ссылки

ten Dijke, P., et al Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997));

WO 2004/063362 (п. 2); WO 2003/042661 (п. 12); US 2003/134790-A1 (страница 38-39);

WO 2002/102235 (п. 13; страница 296); WO 2003/055443 (страница 91-92);

WO 2002/99122 (Пример 2; страница 528-530); WO 2003/029421 (п. 6); WO 2003/024392 (п. 2; Фиг. 112);

WO 2002/98358 (п. 1; страница 183); WO 2002/54940 (страница 100-101);

WO 2002/59377(страница 349-350); WO 2002/30268 (п. 27; страница 376); 15 WO 2001/48204 (Пример; Фиг. 4); NP_001194, рецептор костного морфогенетического белка, тип IB /pid=NP_001194.1.; MIM:603248; AY 065994

(2) Е16 (LAT1, SLC7A5)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_003486

Genbank, версия номер NM_003486.5 GI:71979931

Genbank, дата обновления записи: 27 июня, 2012, 12:06 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_003477

Genbank, версия номер NP_003477.4 GI:71979932

Genbank, дата обновления записи: 27 июня, 2012, 12:06 пп

Перекрестные ссылки

Biochem. Biophys. Res. Соттип. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et 20 al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273); WO 2004/048938 (Пример 2); WO 2004/032842 (Пример IV); WO 2003/042661 (п. 12); WO 2003/016475 (п. 1);

WO 2002/78524 (Пример 2); WO 2002/99074 (п. 19; страница 127-129); WO 2002/86443 (п. 27; страницы 222, 393); WO 2003/003906 (п. 10; страница 293); WO 2002/64798 (п. 33; страница 93-95); WO 2000/14228 (п. 5; страница 133-136); US 2003/224454 (Фиг. 3); 25 WO 2003/025138 (п. 12; страница 150); NP_003477 семейство носителей растворенных веществ 7 (катионный аминокислотный транспортер, у+система), член 5 /pid=NP_003477.3 - Homo sapiens; MIM:600182;; NM_015923.

(3) STEAP1 (шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_012449

Genbank, версия номер NM_012449.2 GI:22027487

Genbank, дата обновления записи: 9 сентября, 2012, 02:57 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_036581

Genbank, версия номер NP_036581.1 GI:9558759

Genbank, дата обновления записи: 9 сентября, 2012, 02:57 пп

Перекрестные ссылки

Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528); WO 2004/065577 (п. 6); WO 2004/027049 (Фиг. 1L); EP 1394274 (Пример 11); WO 2004/016225 (п. 2); WO 2003/042661 (п. 12); US 2003/157089 (Пример 5); US 2003/185830 (Пример 5); US 2003/064397 (Фиг. 2); WO 2002/89747 (Пример 5; страница 618-619); WO 2003/022995 (Пример 9; Фиг. 13А, 35, Пример 53; страница 173, Пример 2; Фиг. 2А); шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы; MIM:604415.

(4) 0772Р (СА125, MUC16)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF361486

Genbank, версия номер AF361486.3 GI:34501466

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 07:56 до полудня (дп)

Полипептид

Genbank, номер доступа AAK74120

Genbank, версия номер AAK74120.3 GI:34501467

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 07:56 дп

Перекрестные ссылки

J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); WO 2004/045553 (п. 14); WO 2002/92836 (п. 6; Фиг. 12); WO 2002/83866 (п. 15; страница 116-121); US 2003/124140 (Пример 16); GI:34501467;

(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, фактор стимуляции мегакариоцитов, мезотелин)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_005823

Genbank, версия номер NM_005823.5 GI:293651528

Genbank, дата обновления записи: 2 сентября, 2012, 01:47 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_005814

Genbank, версия номер NP_005814.2 GI:53988378

Genbank, дата обновления записи: 2 сентября, 2012, 01:47 пп

Перекрестные ссылки

Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); WO 2003/101283 (п. 14); (WO 2002/102235 (п. 13; страница 287-288); WO 2002/101075 (п. 4; страница 308-309); WO 2002/71928 (страница 320-321); WO 94/10312 (страница 52-57); IM:601051.

(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, семейство носителей растворенных веществ 34 (фосфат натрия), член 2, тип II, натрий-зависимый фосфатный транспортер 3b)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_006424

Genbank, версия номер NM_006424.2 GI:110611905

Genbank, дата обновления записи: 22 июля, 2012, 03:39 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_006415

Genbank, версия номер NP_006415.2 GI:110611906

Genbank, дата обновления записи: 22 июля, 2012, 03:39 пп

Перекрестные ссылки

J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); WO 2004/022778 (п. 2); EP 1394274 (Пример 11); WO 2002/102235 (п. 13; страница 326); EP 0875569 (п. 1; страница 17-19); WO 2001/57188 (п. 20; страница 329); WO 2004/032842 (Пример IV); WO 2001/75177 (п. 24; страница 139-140); MIM:604217.

(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, Hlog семафорина 5b, домен sema 25, из семи тромбоспондиновых повторов (типа 1 и подобных типу 1), трансмембранный домен (ТМ) и короткий цитоплазматический домен, (семафорин) 5В)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа АВ040878

Genbank, версия номер АВ040878.1 GI:7959148

Genbank, дата обновления записи: 2 августа, 2006, 05:40 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ВАА95969

Genbank, версия номер ВАА95969.1 GI:7959149

Genbank, дата обновления записи: 2 августа, 2006, 05:40 пп

Перекрестные ссылки

Nagase Т., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150); WO 2004/000997 (п. 1); WO 2003/003984 (п. 1); WO 2002/06339 (п. 1; страница 50); WO 2001/88133 (п. 1; страница 41-43, 48-58); WO 2003/054152 (п. 20); WO 2003/101400 (п. 11); образец: 30 Q9P283; Genew; HGNC:10737

(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, кДНК RIKEN 2700050C12, кДНК RIKEN, ген 2700050C12)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AY358628

Genbank, версия номер AY358628.1 GI:37182377

Genbank, дата обновления записи: 1 декабря, 2009, 04:15 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAQ88991

Genbank, версия номер AAQ88991.1 GI:37182378

Genbank, дата обновления записи: 1 декабря, 2009, 04:15 дп

Перекрестные ссылки

Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; US 2003/129192 (п. 2); US 2004/044180 (п. 12); US 2004/044179 (п. 11); US 2003/096961 (п. 11); US 2003/232056 (Пример 5); WO 2003/105758 16 (п. 12); US 2003/206918 (Пример 5); ЕР 1347046 (п. 1); WO 2003/025148 (п. 20); GI:37182378.

(9) ETBR (рецептор эндотелина типа В)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AY275463

Genbank, версия номер AY275463.1 GI.30526094

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 02:26 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААР32295

Genbank, версия номер ААР32295.1 GI:30526095

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 02:26 дп

Перекрестные ссылки

Nakamuta М., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler В., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M, et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie Т., et al., Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12,445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., etalMol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206; WO 2004/045516 (п. 1); WO 2004/048938 (Пример 2); WO 2004/040000 (п. 151); WO 2003/087768 (п. 1); 20 WO 2003/016475 (п. 1); WO 2003/016475 (п. 1); WO 2002/61087 (Фиг. 1); WO 2003/016494 (Фиг. 6); WO 2003/025138 (п. 12; страница 144); WO 2001/98351 (п. 1; страница 124-125); ЕР 0522868 (п. 8; Фиг. 2); WO 2001/77172 (п. 1; страница 297-299); US 2003/109676; US 6518404 (Фиг. 3); US 5773223 (п. 1а; кол. 31-34); WO 2004/001004.

(10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_017763

Genbank, версия номер NM_017763.4 GI:167830482

Genbank, дата обновления записи: 22 июля, 2012, 12:34 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_060233

Genbank, версия номер NP_060233.3 GI:56711322

Genbank, дата обновления записи: 22 июля, 2012, 12:34 дп

Перекрестные ссылки

WO 2003/104275 (п. 1); WO 2004/046342 (Пример 2); WO 2003/042661 (п. 12); WO 2003/083074 (п. 14; страница 61); WO 2003/018621 (п. 1); WO 2003/024392 (п. 2; Фиг. 93); WO 2001/66689 (Пример 6); LocusID:54894.

(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ассоциированный с раком предстательной железы ген 1, ассоциированный с раком предстательной железы белок 1, шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы 2, шестой трансмембранный белок предстательной железы)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF455138

Genbank, версия номер AF455138.1 GI:22655487

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 01:54 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAN04080

Genbank, версия номер AAN04080.1 GI:22655488

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 01:54 дп

Прекрестные ссылки

Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)); WO 003/087306; US 2003/064397 (п. 1; Фиг. 1); WO 2002/72596 (п. 13; страница 54-55); WO 2001/72962 (п. 1; Фиг. 4В); WO 2003/104270 (п. 11); WO 2003/104270 (п. 16); US 2004/005598 (п. 22); WO 2003/042661 (п. 12); US 2003/060612 (п. 12; Фиг. 10); WO 2002/26822 (п. 23; Фиг. 2); WO 2002/16429 (п. 12; Фиг. 10); GI:22655488.

(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, катионный канал тразиторного рвцепторного потенциала 5, подсемейство М, член 4)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_017636

Genbank, версия номер NM_017636.3 GI:304766649

Genbank, дата обновления записи: 29 июня, 2012, 11:27 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_060106

Genbank, версия номер NP_060106.2 GI:21314671

Genbank, дата обновления записи: 29 июня, 2012, 11:27 дп

Перекрестные ссылки

Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); US 2003/143557 (п. 4); WO 2000/40614 (п. 14; страница 100-103); WO 2002/10382 (п. 1; Фиг. 9A); WO 2003/042661 (п. 12); WO 2002/30268 (п. 27; страница 391); US 2003/219806 (п. 4); WO 2001/62794 (п. 14; Фиг. 1A-D); MIM:606936.

(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, фактор роста, полученный из тератокарциномы)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_003212

Genbank, версия номер NM_003212.3 GI:292494881

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:57 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_003203

Genbank, версия номер NP_003203.1 GI:4507425

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:57 пп

Перекрестные ссылки

Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); US 2003/224411 (п. 1); WO 2003/083041 (Пример 1); WO 2003/034984 (п. 12); WO 2002/88170 (п. 2; страница 52-53); WO 2003/024392 (п. 2; Фиг. 58); WO 2002/16413 (п. 1; страница 94-95, 105); WO 2002/22808 (п. 2; Фиг. 1); US 5854399 (Пример 2; кол. 17-18); US 5792616 (Фиг. 2); MIM:187395.

(14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (C3d/рецептор вируса Эпштейна-Барра) или Hs. 73792)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа М26004

Genbank, версия номер М26004.1 GI:181939

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА35786

Genbank, версия номер ААА35786.1 GI:181940

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Перекрестные ссылки

Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; WO 2004/045520 (Пример 4); US 2004/005538 (Пример 1); WO 2003/062401 (п. 9); WO 2004/045520 (Пример 4); WO 91/02536 (Фиг. 9.1-9.9); WO 2004/020595 (п. 1); образец: Р20023; Q13866; Q14212; EMBL; М26004; ААА35786.1.

(15) CD79b (CD79B, CD79B, IGb (иммуноглобулин-ассоциированный, бета), B29)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_000626

Genbank, версия номер NM_000626.2 GI:90193589

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 01:53 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_000617

Genbank, версия номер NP_000617.1 GI:11038674

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 01:53 дп

Перекрестные ссылки

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); WO 2004/016225 (п. 2, Фиг. 140); WO 2003/087768, US 2004/101874 (п. 1,страница 102); WO 2003/062401 (п. 9); WO 2002/78524 (Пример 2); US 2002/150573 (п. 35 5, страница 15); US 5644033; WO 2003/048202 (п. 1, страницы 306 и 309); WO 99/58658, US 6534482 (п. 13, Фиг. 17А/В); WO 2000/55351 (п. 11, страницы 1145-1146); MIM:147245

(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (домен SH2, содержащий якорный белок фосфатазы 5 1a), SPAP1B, SPAP1C)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_030764

Genbank, версия номер NM_030764.3 GI:227430280

Genbank, дата обновления записи: 30 июня, 2012, 12:30 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_110391

Genbank, версия номер NP_110391.2 GI:19923629

Genbank, дата обновления записи: 30 июня, 2012, 12:30 дп

Перекрестные ссылки

AY358130); Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO 2004/016225 (п. 2); WO 2003/077836; WO 2001/38490 (п. 5; Фиг. 18D-1-18D-2); WO 2003/097803 (п. 12); 10 WO 2003/089624 (п. 25); MIM:606509.

(17) HER2 (ErbB2)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа M11730

Genbank, версия номер M11730.1 GI:183986

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА75493

Genbank, версия номер ААА75493.1 GI:306840

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Перекрестные ссылки

Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto Т., et al Nature319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429; WO 2004/048938 (Пример 2); WO 2004/027049 (Фиг. 1I); WO 2004/009622; WO 2003/081210; WO 2003/089904 (п. 9); WO 2003/016475 (п. 1); US 2003/118592; WO 2003/008537 (п. 1); WO 2003/055439 (п. 29; Фиг. 1А-В); WO 2003/025228 (п. 37; Фиг. 5С); 20 WO 2002/22636 (Пример 13; страница 95-107); WO 2002/12341 (п. 68; Фиг. 7); WO 2002/13847 (страница 71-74); WO 2002/14503 (страница 114-117); WO 2001/53463 (п. 2; страница 41-46); WO 2001/41787 (страница 15); WO 2000/44899 (п. 52; Фиг. 7); WO 2000/20579 (п. 3; Фиг. 2); US 5869445 (п. 3; кол. 31-38); WO 9630514 (п. 2; страница 56-61); ЕР 1439393 (п. 7); WO 2004/043361 (п. 7); WO 2004/022709; WO 2001/00244 25 (Пример 3; Фиг. 4); образец: Р04626; EMBL; M11767; ААА35808.1. EMBL; M11761; ААА35808.1

АНТИТЕЛА

Abbott: US 20110177095

Например, антитело, содержащее CDR, которые имеют, в целом, по меньшей мере 80% идентичность последовательностей с CDR, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 (CDR-H1), SEQ ID NO: 4 (CDR-H2), SEQ ID NO: 5 (CDR-H3), SEQ ID NO: 104 и/или SEQ ID NO: 6 (CDR-L1), SEQ ID NO: 7 (CDR-L2) и SEQ ID NO: 8 (CDR-L3), причем указанное анти-HER2 антитело или анти-HER2 связывающий фрагмент имеет сниженную иммуногенность по сравнению с антителом, имеющим VH с последовательностью SEQ ID NO: 1 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 2.

Biogen: US 20100119511

Например, номера доступа АТСС: РТА-10355, РТА-10356, РТА-10357, РТА-10358 Например, молекула очищенного антитела, которая связывается с HER2, содержащая все шесть CDR из антитела, выбранного из группы, состоящей из BIIB71F10 (SEQ ID NO: 11, 13), BIIB69A09 (SEQ ID NO: 15, 17); BIIB67F10 (SEQ ID NO: 19, 21); BIIB67F11 (SEQ ID NO: 23, 25), BIIB66A12 (SEQ ID NO: 27, 29), BIIB66C01 (SEQ ID NO: 31, 33), BIIB65C10 (SEQ ID NO: 35, 37), BIIB65H09 (SEQ ID NO: 39, 41) и BIIB65B03 (SEQ ID NO: 43, 45), или CDR, которые идентичны или которые имеют не более двух изменений относительно указанных CDR.

Герцептин (Genentech) - US 6054297; номер доступа АТСС CRL-10463 (Genentech)

Пертузумаб (Genentech)

US 20110117097

например, см. SEQ ID NO 15 и 16, SEQ ID NO 17 и 18, SEQ ID NO 23 и 24 и номера доступа АТСС НВ-12215, НВ-12216, CRL 10463, НВ-12697.

US 20090285837

US 20090202546

например, номера доступа АТСС: НВ-12215, НВ-12216, CRL 10463, НВ-12698. US

20060088523

- например, номера доступа АТСС: НВ-12215, НВ-12216

- например, антитело, содержащее аминокислотные последовательности вариабельной легкой и вариабельной тяжелой цепи в SEQ ID NO 3 и 4, соответственно.

- например, антитело, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO 15 и 23, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO 16 и 24

US 20060018899

- например, номера доступа АТСС: (7С2) НВ-12215, (7F3) НВ-12216, (4D5) CRL-10463, (2С4) НВ-12697.

- например, антитело, содержащее аминокислотную последовательность в SEQ ID NO 23, или ее дезамидированный и/или окисленный вариант.

US 2011/0159014

- например, антитело, имеющее вариабельный домен легкой цепи, содержащий гипервариабельные области SEQ ID NO: 1".

- например, антитело, имеющее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий гипервариабельные области SEQ ID NO: 2.

US 20090187007

Гликотоп: антитело TrasGEX http://www.glycotope.com/pipeline

Например, см. International Joint Cancer Institute and Changhai Hospital Cancer Cent:

HMTI-Fc Ab - Gao J., et al BMB Rep.2009 Oct 31;42(10):636-41.

Symphogen: US 20110217305

Union Stem Cell & Gene Engineering, China - Liu HQ., et al Xi Bao Yu Fen Zi Mian YiXue Za Zhi. 2010 May;26(5):456-8.

(18) NCA (CEACAM6)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа M18728

Genbank, версия номер M18728.1 GI:189084

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:48 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА59907

Genbank, версия номер ААА59907.1 GI:189085

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:48 дп

Barnett Т., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002; WO 2004/063709; EP 1439393 (п. 7); WO 2004/044178 (Пример 4); WO 2004/031238; WO 2003/042661 (п. 12); WO 2002/78524 (Пример 2); WO 2002/86443 (п. 27; страница 427); WO 2002/60317 (п. 2); образец: Р40199; Q14920; EMBL; М29541; ААА59915.1. EMBL; М18728.

(19) MDP (DPEP1)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа ВС017023

Genbank, версия номер ВС017023.1 GI:6877538

Genbank, дата обновления записи: 6 марта, 2012, 01:00 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААН17023

Genbank, версия номер ААН17023.1 GI:16877539

Genbank, дата обновления записи: 6 марта, 2012, 01:00 пп

Перекрестные ссылки

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002)); WO 2003/016475 (п. 1); WO 2002/64798 (п. 33; страница 85- 87); JP 05003790 (Фиг. 6-8); WO 99/46284 (Фиг. 9); MIM:179780.

(20) IL20R-alpha (IL20Ra, ZCYTOR7)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF184971

Genbank, версия номер AF184971.1 GI:6013324

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 10:00 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAF01320

Genbank, версия номер AAF01320.1 GI:6013325

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 10:00 пп

Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) 10 Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP 1394274 (Пример 11); US 2004/005320 (Пример 5); WO 2003/029262 (страница 74-75); WO 2003/002717 (п. 2; страница 63); WO 2002/22153 (страница 45-47); US 2002/042366 (страница 20-21); WO 2001/46261 (страница 57-59); WO 2001/46232 (страница 63-65); WO 98/37193 (п. 1; страница 55-59); образец: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.

(21) Brevican (BCAN, ВЕНАВ)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF229053

Genbank, версия номер AF229053.1 GI:10798902

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 12:58 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAG23135

Genbank, версия номер AAG23135.1 GI:10798903

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 12:58 дп

Перекрестные ссылки

Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US 2003/186372 (п. 11); US 2003/186373 (п. 11); US 2003/119131 (п. 1; Фиг. 52); US 2003/119122 (п. 1; Фиг. 52); US 2003/119126 (п. 1); US 2003/119121 (п. 1;Фиг. 52); US 2003/119129 (п. 1); US 2003/119130 (п. 1); US 2003/119128 (п. 1;Фиг. 52); US 2003/119125 (п. 1); WO 2003/016475 (п. 1); WO 2002/02634 (п. 1)

(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, ЕРНТ3, Tyro5)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_004442

Genbank, версия номер NM_004442.6 GI:111118979

Genbank, дата обновления записи: 8 сентября, 2012, 04:43 пп

Перекрестные ссылки

Genbank, номер доступа NP_004433

Genbank, версия номер NP_004433.2 GI:21396504

Genbank, дата обновления записи: 8 сентября, 2012, 04:43 пп

Перекрестные ссылки

Chan, J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); WO 2003042661 (п. 12); WO 200053216 (п. 1; страница 41); WO 2004065576 (п. 1); WO 2004020583 (п. 9); WO 2003004529 (страница 128-132); WO 200053216 (п. 1; страница 42); MIM:600997.

(23) ASLG659 (B7h)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа АХ092328

Genbank, версия номер АХ092328.1 GI:13444478

Genbank, дата обновления записи: 26 января, 2011, 07:37 дп

Перекрестные ссылки

US 2004/0101899 (п. 2); WO 2003104399 (п. 11); WO 2004000221 (Фиг. 3); US 2003/165504 (п. 1); US 2003/124140 (Пример 2); US 2003/065143 (Фиг. 60); WO 2002/102235 (п. 13; страница 299); US 2003/091580 (Пример 2); WO 2002/10187 (п. 6; Фиг. 10); WO 2001/94641 (п. 12; Фиг. 7b); WO 2002/02624 (п. 13; Фиг. 1А-1В); US 2002/034749 (п. 54; страница 45-46); WO 2002/06317 (Пример 2; страница 320-321, п. 34; страница 321-322); WO 2002/71928 (страница 468-469); WO 2002/02587 (Пример 1; Фиг. 1); WO 2001/40269 (Пример 3; страницы 190-192); WO 2000/36107 (Пример 2; страница 205-207); WO 2004/053079 (п. 12); WO 2003/004989 (п. 1); WO 2002/71928 (страница 233-234, 452-453); WO 01/16318.

(24) PSCA (предшественник антигена стволовых клеток предстательной железы)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AJ297436

Genbank, версия номер AJ297436.1 GI:9367211

Genbank, дата обновления записи: 1 февраля, 2011, 11:25 дп

Genbank, номер доступа CAB97347

Genbank, версия номер CAB97347.1 GI:9367212

Genbank, дата обновления записи: 1 февраля, 2011, 11:25 дп

Перекрестные ссылки

Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; WO 2004/022709; EP 1394274 (Пример 11); US 2004/018553 (п. 17); WO 2003/008537 (п. 1); WO 2002/81646 (п. 1; страница 164); WO 2003/003906 (п. 10; страница 288); WO 2001/40309 (Пример 1; Фиг. 17); US 2001/055751 (Пример 1; Фиг. 1b); WO 2000/32752 (п. 18; Фиг. 1); WO 98/51805 (п. 17 страница 97); WO 98/51824 (п. 10; страница 94); WO 98/40403 (п. 2; Фиг. 1В); образец: O43653; EMBL; AF043498; ААС39607.1

(25) GEDA

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AY260763

Genbank, версия номер AY260763.1 GI:30102448

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 02:24 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААР14954

Genbank, версия номер ААР14954.1 GI:30102449

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 02:24 дп

Перекрестные ссылки

АР 14954 lipoma HMGIC fusion-partnerlike protein /pid=AAP14954.1 - Homo sapiens (человек); WO 2003/054152 (п. 20); WO 2003/000842 (п. 1); WO 2003/023013 (Пример 3, п. 20); US 2003/194704 (п. 45); GI:30102449;

(26) BAFF-R (рецептор фактора активации В-клеток, рецептор BLyS 3, BR3)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF116456

Genbank, версия номер AF116456.1 GI:4585274

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 09:44 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAD25356

Genbank, версия номер AAD25356.1 GI:4585275

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 09:44 пп

Перекрестные ссылки

BAFF receptor /pid=NP_443177.1 - Homo sapiens: Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO 2004/058309; WO 2004/011611; WO 2003/045422 (Пример; страница 32-33); WO 2003/014294 (п. 35; Фиг. 6В); WO 2003/035846 (п. 70; страница 615-616); WO 2002/94852 (кол. 136-137); WO 2002/38766 (п. 3; страница 133); WO 2002/24909 (Пример 3; Фиг. 3); MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600

(27) CD22 (изоформа В CD22 рецептора В-клеток, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AK026467

Genbank, версия номер AK026467.1 GI:10439337

Genbank, дата обновления записи: 11 сентября, 2006, 11:24 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ВАВ15489

Genbank, версия номер ВАВ15489.1 GI:10439338

Genbank, дата обновления записи: 11 сентября, 2006, 11:24 пп

Перекрестные ссылки

Wilson et al (1991) J. Exp.Med. 173:137-146; WO 2003/072036 (п. 1; Фиг. 1); IM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1.

(27a) CD22 (молекула CD22)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа X52785

Genbank, версия номер Х52785.1 GI:29778

Genbank, дата обновления записи: 2 февраля, 2011, 10:09 дп

Genbank, номер доступа CAA36988

Genbank, версия номер CAA36988.1 GI:29779

Genbank, дата обновления записи: 2 февраля, 2011, 10:09 дп

Перекрестные ссылки

Stamenkovic I. et al., Nature 345 (6270), 74-77 (1990)??

Прочая информация

Официальный символ: CD22

Другие названия: SIGLEC-2, SIGLEC2

Другие обозначения: рецептор CD22 В-клеток; молекула клеточной адгезии В-лимфоцитов; BL-CAM; антиген CD22; антиген Leu-14 поверхности Т-клеток; Ig-подобный лектин 2 связывания сиаловой кислоты; Ig-подобный лектин 2, связывающий сиаловую кислоту

АНТИТЕЛА

G5/44 (инотузумаб): DiJoseph JF., et al Cancer Immunol Immunother. 2005 Jan;54(1):11-24.

Эпратузумаб - Goldenberg DM., et al Expert Rev Anticancer Ther. 6(10):1341-53, 2006.

(28) CD79a (CD79A, CD79 альфа), иммуноглобулин-ассоциированный альфа, специфичный к В-клеткам белок, который ковалентно взаимодействует с Ig бета (CD79B) и образует комплекс на поверхности с 35 молекулами Ig М, передает сигнал, участвующий в дифференцировке В-клеток), pI: 4,84, ММ: 25028 ТМ: 2 [Р] Хромосома гена: 19q13.2).

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001783

Genbank, версия номер NM_001783.3 GI:90193587

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 01:48 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001774

Genbank, версия номер NP_001774.1 GI:4502685

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 01:48 пп

Перекрестные ссылки

WO 2003/088808, US 2003/0228319; WO 2003/062401 (п. 9); US 2002/150573 (п. 4, страницы 13-14); WO 99/58658 (п. 13, Фиг. 16); WO 92/07574 (Фиг. 1); US 5644033; На et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; et al (1992) Eur. J. Immunol.. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. 5 Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2)633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464

(29) CXCR5 (рецептор 1 лимфомы Беркитта, рецептор, связанный с белком г, который активируется хемокином CXCL13, участвует в миграции лимфоцитов и гуморальной защите, играет 10 роль в инфекции ВИЧ-2 и возможно развитии СПИДа, лимфомы, миеломы и лейкоза); 372 aa, pI: 8,54 ММ: 41959 ТМ: 7 [Р] Хромосома гена: 11q23.3,

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001716

Genbank, версия номер NM_001716.4 GI:342307092

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:49 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001707

Genbank, версия номер NP_001707.1 GI:4502415

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:49 пп

Перекрестные ссылки

WO 2004/040000; WO 2004/015426; US 2003/105292 (Пример 2); US 6555339 (Пример 2); WO 2002/61087 (Фиг. 1); WO 2001/57188 (п. 20, страница 269); WO 2001/72830 (страницы 12-13); WO 2000/22129 (Пример 1, страницы 152-153, пример 2, страницы 254-256); WO 99/28468 (п. 1, страница 38); US 5440021 (Пример 2, кол. 49-52); WO 94/28931 (страницы 56-58); WO 92/17497 (п. 7, Фиг. 5); Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779

(30) HLA-DOB (бета-субъединица молекулы II класса МНС (антиген Ia), которые связывает пептиды и 20 предоставляет их в лимфоциты CD4+Т); 273 аа, pI: 6,56, ММ: 30820.ТМ: 1 [Р]Хромосома гена: 6р21.3)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_002120

Genbank, версия номер NM_002120.3 GI:118402587

Genbank, дата обновления записи: 8 сентября, 2012,04:46 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_002111

Genbank, версия номер NP 002111.1 GI:4504403

Genbank, дата обновления записи: 8 сентября, 2012, 04:46 пп

Перекрестные ссылки

Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et о/(1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899- 16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519; WO 99/58658 (п. 13, Фиг. 15); US 6153408 (кол. 35-38); US 5976551 (кол. 168-170); US 6011146 (кол. 145-146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119

(31) P2X5 (лиганд-управляемый ионный канал пуринергического рецептора Р2Х, ионный канал, управляемый внеклеточной АТФ, может участвовать в синоптической трансмисиии и нейрогенезе, дефицит может способствовать патофизиологии идиопатической нестабильности детрузора); 422 аа), pI: 7.63, ММ: 47206 ТМ: 1 [Р] Хромосома гена: 17р13.3).

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_002561

Genbank, версия номер NM_002561.3 GI:325197202

Genbank, дата обновления записи: 27 июня, 2012, 12:41 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_002552

Genbank, версия номер NP_002552.2 GI:28416933

Genbank, дата обновления записи: 27 июня, 2012, 12:41 дп

Перекрестные ссылки

Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199; WO 2004/047749; WO 2003/072035 (п. 10); Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173; WO 2002/22660 (п. 20); WO 2003/093444 (п. 1); WO 2003/087768 (п. 1); WO 2003/029277 (страница 82)

(32) CD72 (антиген дифференцировки В-клеток CD72, Lyb-2); 359 аа, pI: 8,66, ММ: 40225, ТМ: 1 5 [Р] Хромосома гена: 9р13.3).

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001782

Genbank, версия номер NM_001782.2 GI:194018444

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 01:43 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001773

Genbank, версия номер NP_001773.1 GI:4502683

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 01:43 пп

Перекрестные ссылки

WO 2004042346 (п. 65); WO 2003/026493 (страницы 51-52, 57-58); WO 2000/75655 (страницы 105-106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903.

(33) LY64 (лимфоцитарный антиген 64 (RP105), мембранный белок I типа семейства с высоким содержанием лейцина (LRR), регулирует активацию и апоптоз В-клеток, потеря функции связана с повышенной активностью заболевания у пациентов с системной красной волчанкой); 661 аа, pI: 6,20, ММ: 74147 ТМ: 1 [Р]Хромосома гена: 5q12).

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_005582

Genbank, версия номер NM_005582.2 GI:167555126

Genbank, дата обновления записи: 2 сентября, 2012, 01:50 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_005573

Genbank, версия номер NP_005573.2 GI:167555127

Genbank, дата обновления записи: 2 сентября, 2012, 01:50 пп

Перекрестные ссылки

US 2002/193567; WO 97/07198 (п. 11, страницы 39-42); Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; WO 2003/083047; WO 97/44452 (п. 8, страницы 57-61); WO 2000/12130 (страницы 24-26).

(34) FcRH1 (рецептор-подобный белок 1 Fc, предполагаемый рецептор к домену Fc иммуноглобулина, который содержит Ig-подобный домен типа С2 и домен ITAM, может играть роль в 20 дифференцировке В-лимфоцитов); 429 аа, pI: 5,28, ММ: 46925 ТМ: 1 [Р] Хромосома гена: Iq21-1q22)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_052938

Genbank, версия номер NM_052938.4 GI:226958543

Genbank, дата обновления записи: 2 сентября, 2012, 01:43 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_443170

Genbank, версия номер NP_443170.1 GI:16418419

Genbank, дата обновления записи: 2 сентября, 2012, 01:43 пп

Перекрестные ссылки

WO 2003/077836; WO 2001/38490 (п. 6, Фиг. 18Е-1-18-Е-2); Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; WO 2003/089624 (п. 8); EP 1347046 (п. 1); WO 2003/089624 (п. 7).

(35) IRTA2 (рецептор иммуноглобулинового суперсемейства, ассоциированный с транслокацией 2, предполагаемый иммунорецептор с возможным участием в развитии В-клеток и лимфомагенезе; разрегуляция гена вследствие транслокации происходит при некоторых В-клеточных злокачественных заболеваниях); 977 аа, pI: 6,88, ММ: 106468, ТМ: 1 [Р] Хромосома гена: 1q21)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF343662

Genbank, версия номер AF343662.1 GI:13591709

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 01:16 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAK31325

Genbank, версия номер AAK31325.1 GI:13591710

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 01:16 дп

Перекрестные ссылки

AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1; WO 2003/024392 (п. 2, Фиг. 97); Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127; WO 2003/077836; WO 2001/38490 (п. 3, Фиг. 18B-1-18B-2).

(36) TENB2 (TMEFF2, томорегулин, TPEF, HPP1, TR, предполагаемый трансмембранный 35 протеогликан, связанный с семейством EGF/герегулина факторов роста и фоллистатина); 374 аа)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF179274

Genbank, версия номер AF179274.2 GI:12280939

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 01:05 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAD55776

Genbank, версия номер AAD55776.2 GI:12280940

Genbank, дата обновления записи: 11 марта, 2010, 01:05 дп

Перекрестные ссылки

Доступ NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, эталонная последовательность NCBI: NP_057276; NCBI Ген: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO 2004/074320; JP 2004113151; WO 2003/042661; WO 2003/009814; ЕР 1295944 (страницы 69-70); WO 2002/30268 (страница 329); WO 2001/90304; US 2004/249130; US 2004/022727; WO 2004/063355; US 2004/197325; US 2003/232350; US 2004/005563; US 2003/124579; Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2):178-84.

(37) PSMA - FOLH1 (Фолатгидролаза (простата-специфический мембранный антиген) 1)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа M99487

Genbank, версия номер M99487.1 GI:190663

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:48 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА60209

Genbank, версия номер ААА60209.1 GI:190664

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:48 дп

Перекрестные ссылки

Israeli R.S., et al Cancer Res. 53 (2), 227-230 (1993)

Прочая информация

Официальный символ: FOLH1

Другие названия: GIG27, FGCP, FOLH, GCP2, GCPII, NAALAD1, NAALAdase, PSM, PSMA, mGCP Другие обозначения: N-ацетилированная альфа-связанная кислотная дипептидаза 1; N-ацетилированная-альфа-связанная кислотная дипептидаза I; NAALADase I; белок гена 27, ингибирующего рост клетки; фолиполи-гамма-глутамат-карбоксипептидаза; глутаматкарбоксилаза II; глутамат-карбоксипептидаза 2; глутамат-карбоксипептидаза II; мембранная глутамат-карбоксипептидаза; вариант F простата-специфического мембранного антигена; птероилполи-гамма-глутамат-карбоксипептидаза

АНТИТЕЛА

US 7666425:

Антитела, получаемые с помощью гибридом, имеющих следующие ссылки АТСС: номер доступа АТСС НВ-12101, номер доступа АТСС НВ-12109, номер доступа АТСС НВ-12127 и номер доступа АТСС НВ-12126.

Proscan: моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 8Н12, 3Е11, 17G1 29В4, 30С1 и 20F2 (US 7811564; Moffett S., et al Hybridoma (Larchmt). 2007 Dec; 26(6):363-72).

Cytogen: моноклональные антитела 7E11-C5 (номер доступа АТСС НВ 10494) и 9Н10-А4 (номер доступа АТСС НВ11430) - US 5763202

GlycoMimetics: NUH2 - номер доступа АТСС НВ 9762 (US 7135301)

Human Genome Science: HPRAJ70 - номер доступа АТСС 97131 (US 6824993); аминокислотная последовательность, кодируемая клоном кДНК (HPRAJ70), размещенным в Американской коллекции типовых культур («АТСС») под депозитарным номером 97131

Medarex: анти-PSMA антитела, не имеющие фукозильных остатков - US 7875278

Мышиные анти-PSMA антитела включают 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4Е10-1.14, 3Е11, 4D8, 3Е6, 3С9, 2С7, 1G3, 3С4, 3С6, 4D4, 1G9, 5С8 В9, 3G6, 4С8 В9 и моноклональные антитела. Гибридомы, секретирующие 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4Е10-1.14, 3Е11, 4D8, 3Е6, 3С9, 2С7, 1G3, 3С4, 3С6, 4D4, 1G9, 5С8 В9, 3G6 или 4С8 В9, открыто внесены в депозитарий и описаны в патенте США №6159508. Соответствующие гибридомы открыто внесены в депозитарий и описаны в патенте США №6107090. Кроме того, гуманизированные антит-PSMA антитела, включая гуманизированную версию J591, более подробно описаны в публикации РСТ WO 02/098897.

В данной области техники описаны другие мышиные анти-человеческие антитела, такие как mAb 107-1А4 (Wang, S. et al. (2001) Int. J. Cancer 92:871-876) и mAb 2C9 (Kato, K. et al. (2003) Int. J. Urol. 10:439-444).

Примеры человеческих анти-PSMA моноклональных антител включают антитела 4A3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3, выделенные и структурно описанные так, как изначально описано в публикациях РСТ WO 01/09192 и WO 03/064606 и в предварительной заявке на патент США с серийным номером 60/654,125, озаглавленной "Human Monoclonal Antibodies to Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA)", поданной 18 февраля 2005 года. Аминокислотные последовательности Vh 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены в SEQ ID NO: 1-9, соответственно. Аминокислотные последовательности V_H 4A3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены в SEQ ID NO: 10-18, соответственно.

Другие человеческие анти-PSMA антитела включают антитела, описанные в публикации РСТ WO 03/034903 и в заявке на патент США №2004/0033229.

NW Biotherapeutics: Гибридомная клеточная линия, выбранная из группы, состоящей из 3F5.4G6, имеющей номер доступа АТСС НВ12060, 3D7-1.I, имеющей номер доступа АТСС НВ 12309, 4Е10-1.14, имеющей номер доступа АТСС НВ12310, 3Е11 (АТСС НВ12488), 4D8 (АТСС НВ12487), 3Е6 (АТСС НВ12486), 3С9 (АТСС НВ12484), 2С7 (АТСС НВ12490), 1G3 (АТСС НВ12489), 3С4 (АТСС НВ12494), 3С6 (АТСС НВ12491), 4D4 (АТСС НВ12493), 1G9 (АТСС НВ12495), 5С8 В9 (АТСС НВ12492) и 3G6 (АТСС НВ12485)-см. US 6150508

PSMA Development Company / Progenies / цитоген - Seattle Genetics: mAb 3.9, вырабатываемое гибридомой, внесенной в депозитарий под номером доступа АТСС РТА-3258, или mAb 10.3, вырабатываемое гибридомой, внесенной в депозитарий под номером доступа АТСС РТА-3347 - US 7850971

PSMA Development Company - композиции PSMA антител (US 20080286284, таблица 1)

Указанная заявка представляет собой выделенную заявку из заявки на патент США с серийным номером 10/395894, поданной 21 марта 2003 года (US 7850971)

University Hospital Freiburg, Германия - mAbs 3/A12, 3/E7 и 3/F11 (Wolf P., et al Prostate. 2010 Apr 1;70(5):562-9).

(38) SST (рецептор соматостатина; следует учитывать, что существует 5 подтипов)

(38.1) SSTR2 (рецептор соматостатина 2)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001050

Genbank, версия номер NM_001050.2 GI:44890054

Genbank, дата обновления записи: 19 августа, 2012, 01:37 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001041

Genbank, версия номер NP_001041.1 GI:4557859

Genbank, дата обновления записи: 19 августа, 2012, 01:37 пп

Перекрестные ссылки

Yamada Y., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1), 251-255 (1992); Susini C., et al Ann Oncol. 2006 Dec;17(12):1733-42

Прочая информация

Официальный символ: SSTR2

Другие обозначения: SRIF-1; SS2R; рецептор соматостатина 2 типа

(38.2) SSTR5 (рецептор соматостатина 5)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа D16827

Genbank, версия номер D16827.1 GI:487683

Genbank, дата обновления записи: 1 августа, 2006, 12:45 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ВАА04107

Genbank, версия номер ВАА04107.1 GI:487684

Genbank, дата обновления записи: 1 августа, 2006, 12:45 пп

Перекрестные ссылки

Yamada,Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 195 (2), 844-852 (1993)

Прочая информация

Официальный символ: SSTR5

Другие названия: SS-5-R

Другие обозначения: рецептор соматостатина 5 подтипа; рецептор соматостатина 5 типа

(38.3) SSTR1

(38.4) SSTR3

(38.5) SSTR4

AvB6-Обе субъединицы (39+40)

(39) ITGA V (интегрин, альфа V)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа М14648 J02826 M18365

Genbank, версия номер М14648.1 GI:340306

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:56 дп

Genbank, номер доступа AAA36808

Genbank, версия номер AAA36808.1 GI:340307

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:56 дп

Перекрестные ссылки

Suzuki S., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (22), 8614-8618 (1986)

Прочая информация

Официальный символ: ITGAV

Другие названия: CD51, MSK8, VNRA, VTNR

Другие обозначения: антиген, определяемый моноклональным антителом L230; интегрин альфа-V; интегрин альфаУ-бета3; интегрин, альфа V (рецептор витронектина, альфа-полипептид, антиген CD51); альфа-субъединица рецептора витронектина

(40) ITGB6 (интегрин, бета 6)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_000888

Genbank, версия номер NM 000888.3 GI:9966771

Genbank, дата обновления записи: 27 июня, 2012, 12:46 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_000879

Genbank, версия номер NP_000879.2 GI:9625002

Genbank, дата обновления записи: 27 июня, 2012, 12:46 дп

Перекрестные ссылки

Sheppard D.J., et al Biol. Chem. 265 (20), 11502-11507 (1990)

Прочая информация

Официальный символ: ITGB6

Другие обозначения: интегрин бета-6

АНТИТЕЛА

Биоген: US 7943742 - гибридомные клоны 6.3G9 и 6.8G6 внесены в депозитарий АТСС с номерами доступа АТСС РТА-3649 и -3645, соответственно.

Биоген: US 7465449 - в некоторых вариантах реализации указанное антитело содержит такие же полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепи, как антитело, вырабатываемое гибридомой 6.1А8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2В1, 6.2В10, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1G10, 7.7G5 или 7.1С5.

Центокор (J&J): US 7550142; US 7163681

Например, в US 7550142 - антитело, имеющее вариабельные области человеческой тяжелой цепи и человеческой легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.

Seattle Genetics: 15H3 (Ryan MC., et al Cancer Res April 15, 2012; 72(8 Supplement): 4630)

(41) CEACAM5 (молекула клеточной адгезии 5, связанная с карциноэмбриональным антигеном)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа M17303

Genbank, версия номер M17303.1 GI:178676

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААВ59513

Genbank, версия номер ААВ59513.1 GI:178677

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Перекрестные ссылки

Beauchemin N., et al Mol. Cell. Biol. 7 (9), 3221-3230 (1987)

Прочая информация

Официальный символ: СЕАСАМ5

Другие названия: CD66e, CEA

Другие обозначения: антиген мекония 100

АНТИТЕЛА

AstraZeneca-MedImmune: US 20100330103; US 20080057063; US 20020142359

- например, антитело, имеющее области, определяющие комплементарность (CDR), со следующими последовательностями: тяжелая цепь; CDR1 - DNYMH, CDR2 - WIDPENGDTE YAPKFRG, CDR3 - LIYAGYLAMD Y; и легкая цепь CDR1 - SASSSVTYMH, CDR2 - STSNLAS, CDR3 - QQRSTYPLT.

- гибридома 806.077, внесенная в депозитарий Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС) под депозитарным номером 96022936.

Research Corporation Technologies, Inc.: US 5047507

Bayer Corporation: US 6013772

BioAlliance: US 7982017; US 7674605

US 7674605

- антитело, содержащее последовательность вариабельной области тяжелой цепи из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и последовательность вариабельной области легкой цепи из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

- антитело, содержащее последовательность вариабельной области тяжелой цепи из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и последовательность вариабельной области легкой цепи из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

Celltech Therapeutics Limited: US 5877293

The Dow Chemical Company: US 5472693; US 6417337; US 6333405

US 5472693 - например, АТСС № CRL-11215

US 6417337-например, АТСС CRL-12208

US 6333405 - например, АТСС CRL-12208

Immunomedics, Inc: US 7534431; US 7230084; US 7300644; US 6730300;

US 20110189085

- антитело, имеющее CDR вариабельной области легкой цепи, которые содержат: CDR1 содержит KASQDVGTSVA (SEQ ID NO: 20); CDR2 содержит WTSTRHT (SEQ ID NO: 21); и CDR3 содержит QQYSLYRS (SEQ ID NO: 22);

и CDR вариабельной области тяжелой цепи указанного анти-СЕА антитела, которые содержат: CDR1 содержит TYWMS (SEQ ID NO: 23); CDR2 содержит EIHPDSSTINYAPSLKD (SEQ ID NO: 24); и CDR3 содержит LYFGFPWFAY (SEQ ID NO: 25). US 20100221175; US 20090092598; US 20070202044; US 20110064653; US 20090185974; US 20080069775.

(42) MET (прото-онкоген met; рецептор фактора роста гепатоцитов)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа М35073

Genbank, версия номер М35073.1 GI:187553

Genbank, дата обновления записи: 6 марта, 2012, 11:12 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА59589

Genbank, версия номер ААА59589.1 GI:553531

Genbank, дата обновления записи: 6 марта, 2012, 11:12 дп

Перекрестные ссылки

Dean М., et al Nature 318 (6044), 385-388 (1985)

Прочая информация

Официальный символ: МЕТ

Другие названия: AUTS9, HGFR, RCCP2, c-Met

Другие обозначения: рецептор HGF; рецептор HGF/SF; рецептор SF; рецептор фактора роста гепатоцитов; прото-онкогенная тирозинкиназа met; прото-онкогенная c-Met; рецептор рассеивающего фактора; тирозин-протеинкиназа Met

АНТИТЕЛА

Abgenix/Pfizer: US 20100040629

например, антитело, вырабатываемое гибридомой 13.3.2, имеющей номер доступа Американской коллекции типовых культур (АТСС) РТА-5026; антитело, вырабатываемое гибридомой 9.1.2, имеющей номер доступа АТСС РТА-5027; антитело, вырабатываемое гибридомой 8.70.2, имеющей номер доступа АТСС РТА-5028; или антитело, вырабатываемое гибридомой 6.90.3, имеющей номер доступа АТСС РТА-5029.

Amgen/Pfizer: US 20050054019

например, антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, где Х2 представляет собой глутамат, и Х4 представляет собой серии, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4, где Х8 представляет собой аланин, без сигнальных последовательностей; антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8, без сигнальных последовательностей; антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12, без сигнальных последовательностей; или антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16, без сигнальных последовательностей.

Agouron Pharmaceuticals (в настоящее время Pfizer): US20060035907

Eli Lilly: US 20100129369

Genentech: US 5686292; US 20100028337; US 20100016241; US 20070129301; US 20070098707; US 20070092520, US 20060270594; US 20060134104; US 20060035278; US 20050233960; US 20050037431

US 5686292 - например, АТСС HB-11894 и АТСС НВ-11895

US 20100016241 - например, АТСС НВ-11894 (гибридома 1A3.3.13) или НВ-11895 (гибридома 5D5.11.6)

National Defense Medical Center, Тайвань: Lu RM., et al Biomaterials. 2011 Apr; 32(12):3265-74.

Novartis: US20090175860

- например, антитело, содержащее последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи 4687, где последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи 4687 представляют собой остатки 26-35, 50-65 и 98-102, соответственно, от SEQ ID NO: 58; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 5097, где последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 5097 представляют собой остатки 24-39, 55-61 и 94-100 от SEQ ID NO: 37.

Pharmacia Corporation: US 20040166544

Pierre Fabre: US 20110239316, US 20110097262, US 20100115639

Sumsung: US 20110129481 - например, моноклональное антитело, вырабатываемое гибридомной клеткой, имеющей номер доступа KCLRF-BP-00219 или номер доступа KCLRF-BP-00223.

Samsung: US 20110104176 - например, антитело, вырабатываемое гибридомной клеткой, имеющей номер доступа: KCLRF-BP-00220.

University of Turin Medical School: DN-30 Pacchiana G., et al J Biol Chem. 2010 Nov 12; 285(46):36149-57

Van Andel Research Institute: Jiao Y., et al Mol Biotechnol. 2005 Sep; 31(1):41-54.

(43) MUC1 (муцин 1, связанный с клеточной поверхностью)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа J05581

Genbank, версия номер J05581.1 GI:188869

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:48 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА59876

Genbank, версия номер ААА59876.1 GI:188870

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:48 дп

Перекрестные ссылки

Gendler S.J., et al J. Biol. Chem. 265 (25), 15286-15293 (1990)

Прочая информация

Официальный символ: MUC1

Другие названия: RP11-263К19.2, CD227, EMA, H23AG, KL-6, МАМ6, MUC-1, MUC-1/SEC, MUC-1/X, MUC1/ZD, РЕМ, РЕМТ, PUM

Другие обозначения: антиген DF3; антиген Н23; антиген DF3, связанный с карциномой молочной железы; муцин, связанный с карциномой; эписиалин; Krebs von den Lungen-6; муцин 1, трансмембранный; муцин-1; арахис-реактивный муцин мочевого пузыря; полиморфный эпителиальный муцин; опухолеассоциированный эпителиальный муцин; опухолеассоциированный эпителиальный мембранный антиген; опухолеассоциированный муцин

АНТИТЕЛА

AltaRex - Quest Pharma Tech: US 6716966 - например, антитело Alt-1, вырабатываемое гибридомой с номером АТСС РТА-975.

AltaRex - Quest Pharma Tech: US 7147850

CRT: 5E5 - S0rensen AL., et al Glycobiology, том 16, номер 2, cc. 96-107, 2006; HMFG2 -Burchell J., et al Cancer Res., 47, 5476-5482 (1987); см. WO 2015/159076

Гликотоп GT-MAB: GT-MAB 2.5-GEX (вебсайт: http://www.glycotope.com/pipeline/pankomab-gex)

Immunogen: US 7202346

- например, антитело MJ-170: гибридомная клеточная линия MJ-170, номер доступа АТСС РТА-5286, моноклональное антитело MJ-171: гибридомная клеточная линия MJ-171, номер доступа АТСС РТА-5287, моноклональное антитело MJ-172: гибридомная клеточная линия MJ-172, номер доступа АТСС РТА-5288; или моноклональное антитело MJ-173: гибридомная клеточная линия MJ-173, номер доступа АТСС РТА-5302

Immunomedics: US 6653104

Ramot Tel Aviv Uni: US 7897351

Regents Uni. CA: US 7183388; US 20040005647; US 20030077676.

Roche GlycArt: US 8021856

Российский онкологический научный центр: Imuteran- Ivanov PK., et al Biotechnol J. 2007 Jul; 2(7):863-70

Technische Univ Braunschweig: (IIB6, HT186-B7, HT186-D11, HT186-G2, HT200-3A-C1, HT220-M-D1, HT220-M-G8) - Thie H., et al PLoS One. 2011 Jan 14; 6(1):e15921

(44) CA9 (карбонангидраза IX)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа. X66839

Genbank, версия номер Х66839.1 GI:1000701

Genbank, дата обновления записи: 2 февраля, 2011, 10:15 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа САА47315

Genbank, версия номер САА47315.1 GI:1000702

Genbank, дата обновления записи: 2 февраля, 2011, 10:15 дп

Перекрестные ссылки

Pastorek J., et al Oncogene 9 (10), 2877-2888 (1994)

Прочая информация

Официальный символ: СА9

Другие названия: CAIX, MN

Другие обозначения: CA-IX; P54/58N; RCC-ассоциированный антиген G250; RCC-ассоциированный белок G250; карбонат-дегидратаза IX; карбонангидраза 9; карбоангидраза; мембранный антиген MN; pMW1; антиген G250, ассоциированный с почечноклеточной карциномой

АНТИТЕЛА

Abgenix/Amgen: US 20040018198

Аффитело: молекулы анти-CAIX аффитела (http://www.affibody.com/en/Product-Portfolio/Pipeline/)

Bayer: US 7462696

Bayer/Morphosys: 3ее9 mAb - Petrul HM., et al Mol Cancer Ther. 2012 Feb; 11(2):340-9

Harvard Medical School: Антитела G10, G36, G37, G39, G45, G57, G106, G119, G6, G27, G40 and G125. Xu C., et al PLoS One. 2010 Mar 10; 5(3):e9625

Институт вирологии, Словацкая академия наук (Bayer) - US 5955075

- например, М75, номер доступа АТСС НВ 11128, или MN12, номер доступа АТСС НВ 11647

Институт вирологии, Словацкая академия наук: US 7816493

- например, моноклональное антитело М75, которое секретируется из гибридомы VU-M75, внесенной в депозитарий Американской коллекции типовых культур под номером АТСС НВ 11128; или моноклональное антитело V/10, секретируемое из гибридомы V/10-VU, внесенной в Бельгийскую координированную коллекцию микроорганизмов Международной депозитарной организации в лаборатории Laboratorium voor Moleculaire Bioloqie-Plasmidencollectie (LMBP) Гентского университета в г. Гент, Бельгия, под номером доступа LMBP 6009СВ.

Институт вирологии, Словацкая академия наук US 20080177046; US 20080176310; US 20080176258; US 20050031623

Novartis: US 20090252738

Wilex: US 7691375 - например, антитело, вырабатываемое гибридомной клеточной линией DSM ASC 2526.

Wilex: US20110123537; Rencarex: Kennett RH., et al Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb; 5(1):70-5 Xencor: US 20090162382

(45) EGFRvIII (рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), транскрипционный вариант 3,

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_201283

Genbank, версия номер NM_201283.1 GI:41327733

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:47 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_958440

Genbank, версия номер NP_958440.1 GI:41327734

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:47 пп

Перекрестные ссылки

Batra SK., et al Cell Growth Differ 1995; 6:1251-1259.

АНТИТЕЛА:

US 7628986 и US 7736644 (Amgen)

Например, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 142 и вариантов, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 144 и вариантов.

US 20100111979 (Amgen)

Например, антитело, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую:

CDR1, состоящую из последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей для области CDR1 антител 13.1.2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), и 333 (SEQ ID NO: 17);

CDR2, состоящую из последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей для области CDR2 антител 13.1.2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), и 333 (SEQ ID NO: 17); и

CDR3, состоящую из последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей для области CDR3 антител 13.1.2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), и 333 (SEQ ID NO: 17).

US 20090240038 (Amgen)

Например, антитело, имеющее по меньшей мере один из полипептидов тяжелой или легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, и любой их комбинации.

US 20090175887 (Amgen)

Например, антитело, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 13.1.2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), и 333 (SEQ ID NO: 17).

US 20090156790 (Amgen)

Например, антитело, имеющее полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи, причем по меньшей мере один из полипептидов тяжелой или легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, и любой их комбинации.

US 20090155282, US 20050059087 и US 20050053608 (Amgen)

Например, антитело, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 13.1.2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), и 333 (SEQ ID NO: 17).

MR1-1 (US 7129332; Duke)

Например, вариантное антитело, имеющее последовательность SEQ ID N0.18 с замещениями S98P-T99Y в VH CDR3, и F92W в VL CDR3.

L8A4, Н10, Y10 (Wikstrand CJ., et al Cancer Res. 1995 Jul 15; 55(14):3140-8; Duke)

US 20090311803 (Гарвардский университет)

Например, SEQ ID NO: 9 для вариабельной области тяжелой цепи антитела и SEQ ID NO: 3 для аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи

US 20070274991 (EMD72000, также известный как матузумаб; Гарвардский университет) Например, SEQ ID NO: 3 и 9 для легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно

US 6129915 (Schering)

Например, SEQ. ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

mAb CH12 - Wang H., et al FASEBJ. 2012 Jan; 26(1):73-80 (Shanghai Cancer Institute).

RAbDMvIII - Gupta P., et al BMC Biotechnol. 2010 Oct 7; 10:72 (Stanford University Medical Center).

mAb Ua30 - Ohman L., et al Tumour Biol. 2002 Mar-Apr; 23(2):61-9 (Uppsala University).

Han DG., et al Nan Fang Yi Ke DaXueXue Bao. 2010 Jan; 30(1):25-9 (Xi'an Jiaotong University).

(46) CD33 (молекула CD33)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа M_23197

Genbank, версия номер NM_23197.1 GI:180097

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА51948

Genbank, версия номер ААА51948.1 GI:188098

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Перекрестные ссылки

Simmons D., et al J. Immunol. 141 (8), 2797-2800 (1988)

Прочая информация

Официальный символ: CD33

Другие названия: SIGLEC-3, SIGLEC3, р67

Другие обозначения: антиген CD33 (gp67); gp67; поверхностный антиген миелоидной клетки CD33; lg-подобный лектин 3, связывающий сиаловую кислоту; lg-подобный лектин 3 связывания сиаловой кислоты

АНТИТЕЛА

Н195 (линтузумаб) - Raza A., et al Leuk Lymphoma. 2009 Aug; 50(8): 1336-44; US 6,759,045 (Seattle Genetics/Immunomedics)

mAb OKT9: Sutherland, D.R. et al. Proc Natl Acad Sci USA 78(7): 4515-4519 1981, Schneider. C., et al J Biol Chem 257, 8516-8522 (1982)

mAb E6: Hoogenboom, H.R., et al J Immunol 144, 3211-3217 (1990)

US 6590088 (Human Genome Sciences)

Например, SEQ ID NO: 1 и 2, и номер доступа АТСС 97521

US 7557189 (Immunogen)

Например, антитело или его фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6.

(47) CD19 (молекула CD19)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001178098

Genbank, версия номер NM_001178098.1 GI:296010920

Genbank, дата обновления записи: 10 сентября, 2012, 12:43 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001171569

Genbank, версия номер NP_001171569.1 GI:296010921

Genbank, дата обновления записи: 10 сентября, 2012, 12:43 дп

Перекрестные ссылки

Tedder TF., et al J. Immunol. 143 (2): 712-7 (1989)

Прочая информация

Официальный символ: CD19

Другие названия: В4, CVID3

Другие обозначения: В-лимфоцитарный антиген CD19; антиген В4 поверхности В-лимфоцитов; антиген Leu-12 поверхности Т-клеток; дифференцировочный антиген CD19

АНТИТЕЛА

Immunogen: HuB4 - Al-Katib AM., et al Clin Cancer Res. 2009 Jun 15; 15(12):4038-45.

4G7: M., et al Protein Eng Des Sel. 2009 Mar; 22(3): 135-47

Например, последовательности на Фиг. 3 публикации Knappik, A. et al. J Mol Biol 2000 Feb; 296(1):57-86

AstraZeneca /MedImmune: MEDI-551 - Herbst R., et al J Pharmacol Exp Ther. 2010 Oct; 335(1):213-22

Glenmark Pharmaceuticals: GBR-401 - Hou S., et al Mol Cancer Ther November 2011 (Meeting Abstract Supplement) С164

US 7109304 (Immunomedics)

Например, антитело, содержащее последовательность hA19Vk (SEQ ID NO: 7) и последовательность hA19VH (SEQ ID NO: 10)

US 7902338 (Immunomedics)

Например, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который содержит последовательности определяющих комплементарность областей CDR легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 16 (KASQSVDYDGDSYLN); CDR2 SEQ ID NO: 17 (DASNLVS); и CDR3 SEQ ID NO: 18 (QQSTEDPWT), и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 19 (SYWMN); CDR2 SEQ ID NO: 20 (QIWPGDGDTNYNGKFKG) и CDR3 SEQ ID NO: 21 (RETTTVGRYYYAMDY), а также содержит каркасный участок (FR) человеческого антитела и последовательности константной области с одним или более аминокислотными остатками каркасной области, замещенными из соответствующих последовательностей каркасной области исходного мышиного антитела, и причем указанные замещенные остатки FR содержат замещение серина на фенилаланин по остатку 91 Kabat вариабельной области тяжелой цепи.

Medarex: MDX-1342 - Cardarelli РМ., et al Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb; 59(2):257-65.

MorphoSys /Xencor: MOR-208/XmAb-5574 - Zalevsky J., et al Blood. 2009 Apr 16; 113(16):3735-43

US 7968687 (Seattle Genetics)

Антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

4G7 chim - Lang P., et al Blood. 2004 May 15; 103(10):3982-5 (University of Tubingen) Например, Фиг. 6 и SEQ ID NO: 80 в US 20120082664

Zhejiang University School of Medicine: 2E8 - Zhang J., et al J Drug Target. 2010 Nov; 18(9):675-8

(48) IL2RA (рецептор интерлейкина 2, альфа); эталонная последовательность NCBI: NM_00417.2);

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_000417

Genbank, версия номер NM_000417.2 GI:269973860

Genbank, дата обновления записи: 09 сентября, 2012, 04:59 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_000408

Genbank, версия номер NP_000408.1 GI:4557667

Genbank, дата обновления записи: 09 сентября, 2012, 04:59 пп

Перекрестные ссылки

Kuziel W.A., et al J. Invest. Dermatol. 94 (6 SUPPL), 27S-32S (1990)

Прочая информация

Официальный символ: IL2RA

Другие названия: RP11-536К7.1, CD25, IDDM10, IL2R, TCGFR

Другие обозначения: альфа-субъединица рецептора FIL-2; IL-2-RA; альфа-субъединица IL-2R; IL2-RA; антиген ТАС; альфа-субъединица рецептора интерлейкина-2; р55

АНТИТЕЛА

US 6383487 (Novartis/UCL: Baxilisimab [Simulect])

US 6521230 (Novartis/UCL: Baxilisimab [Simulect])

Например, антитело, имеющее антиген-связывающий сайт, который содержит по меньшей мере один домен, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; или указанные CDR1, CDR2 и CDR3 в последовательности в целом содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 7, 8 и 9 в последовательности в целом.

Даклизумаб - Rech AJ., et al Ann N Y Acad Sci. 2009 Sep; 1174:99-106 (Roche)

(49) AXL (рецепторная тирозинкшаза AXL)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа M76125

Genbank, версия номер М76125.1 GI:292869

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:53 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА61243

Genbank, версия номер ААА61243.1 GI:29870

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:53 дп

Перекрестные ссылки

J.P., et al Mol. Cell. Biol. 11 (10), 5016-5031 (1991); Bergsagel P.L., et al J. Immunol. 148 (2), 590-596(1992)

Прочая информация

Официальный символ: AXL

Другие названия: JTK11, UFO

Другие обозначения: онкоген AXL; AXL-трансформирующая последовательность/ген;

AXL онкоген; рецептор UFO тирозинпротеинкиназы

АНТИТЕЛА

YW327.6S2 - Ye X., et al Oncogene. 2010 Sep 23; 29(38):5254-64. (Genentech)

BergenBio: BGB324 (http://www.bergenbio.com/BGB324)

(50) CD30 - TNFRSF8 (8 член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа М83554

Genbank, версия номер М83554.1 GI: 180095

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:53 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА51947

Genbank, версия номер ААА51947.1 GI: 180096

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:53 дп

Перекрестные ссылки

Durkop Н., et al Cell 68 (3), 421-427 (1992)

Прочая информация

Официальный символ: TNFRSF8

Другие названия: CD30, D1S166E, Ki-1

Другие обозначения: рецептор CD30L; антиген Ki-1; рецептор цитокина CD30; антиген CD30 активации лимфоцитов; 8 член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли

(51) ВСМА (антиген созревания В-клеток) - TNFRSF17 (17 член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа Z29574

Genbank, версия номер Z29574.1 GI:471244

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:40 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа САА82690

Genbank, версия номер САА82690.1 GI:471245

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:40 дп

Перекрестные ссылки

Laabi Y., et al Nucleic Acids Res. 22 (7), 1147-1154 (1994)

Прочая информация

Официальный символ: TNFRSF17

Другие названия: ВСМ, ВСМА, CD269

Другие обозначения: антиген созревания В-клето; фактор созревания В-клеток; белок созревания В-клеток; 17 член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли

(52) CT Ags - СТА (антигены рака яичек)

Перекрестные ссылки

Fratta Е., et al. Mol Oncol. 2011 Apr; 5(2): 164-82; Lim SH., at al Am J Blood Res. 2012; 2(1):29-35.

(53) CD 174 (Льюис Y) - FUT3 (фукозилтрансфераза 3 (галактозид-3(4)-L-фукозжтрансфераза, группа крови Льюиса)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM000149

Genbank, версия номер NM000149.3 GI: 148277008

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 04:49 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_000140

Genbank, версия номер NP_000140.1 GI:4503809

Genbank, дата обновления записи: 26 июня, 2012, 04:49 пп

Перекрестные ссылки

Kukowska-Latallo, J.F., et al Genes Dev. 4 (8), 1288-1303 (1990)

Прочая информация

Официальный символ: FUT3

Другие названия: CD 174, FT3B, FucT-III, LE, Les

Другие обозначения: FT Льюиса; альфа-(1,3/1,4)-фукозилтрансфераза; альфа-4-фукозилтрансфераза группы крови Льюиса; фукозилтрансфераза III; галактозид-3(4)-L-фукозилтрансфераза

(54) CLEC14A (член А семейства 14 лектиновых доменов С-типа; Genbank, номер доступа NM175060)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM175060

Genbank, версия номер NM175060.2 GI:371123930

Genbank, дата обновления записи: 01 апреля, 2012, 03:34 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_778230

Genbank, версия номер NP_778230.1 GI:28269707

Genbank, дата обновления записи: 01 апреля, 2012, 03:34 пп

Прочая информация

Официальный символ: CLEC14A

Другие названия: UNQ236/PR0269, C14orf27, CEG1, EGFR-5

Другие обозначения: член А семейства 14 лектинового домена С-типа; С1ЕСТ и белок, содержащий EGF-подобный домен; рецептор 5 эпидермального фактора роста

(55) GRP78 - HSPA5 (белок 5 теплового шока 70 кДа (глюкозорегулируемый белок, 78 кДа)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM005347

Genbank, версия номер NM005347.4 GI:305855105

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:42 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_005338

Genbank, версия номер NP_005338.1 GI.16507237

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:42 пп

Перекрестные ссылки

Ting J., et al DNA 7 (4), 275-286 (1988)

Прочая информация

Официальный символ: HSPA5

Другие названия: BIP, GRP78, MIF2

Другие обозначения глюкозорегулируемый белок 78 кДа; белок grp78, связывающий полостной Са(2+) эндоплазматического ретикулюма; белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина

(56)CD70 (молекула CD70) L08096

Нуклеотид

Genbank, номер доступа L08096

Genbank, версия номер L08096.1 GI:307127

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2012, 08:54 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА36175

Genbank, версия номер ААА36175.1 GI:307128

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2012, 08:54 дп

Перекрестные ссылки

Goodwin R.G., et al Cell 73 (3), 447-456 (1993)

Прочая информация

Официальный символ: CD70

Другие названия: CD27L, CD27LG, TNFSF7

Другие обозначения: лиганд CD27; CD27-L; антиген CD70; антиген Ki-24; поверхностный антиген CD70; 7 член суперсемейства фактора (лиганда) некроза опухоли; 7 член суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли

АНТИТЕЛА

MDX-1411 против CD70 (Medarex)

h1F6 (Oflazoglu, Е., et al, Clin Cancer Res. 2008 Oct 1; 14(19):6171-80; Seattle Genetics) Например, см. US 20060083736, SEQ ID NO: 1, 2, 11 и 12, и Фиг. 1.

(57) Антигены, специфические для стволовых клеток. Например:

• 5Т4 (см. строку (63) ниже)

• CD25 (см. строку (48) ниже)

• CD32

○ Полипептид

■ Genbank, номер доступа АВК42161

■ Genbank, версия номер АВК42161.1 GI: 117616286

■ Genbank, дата обновления записи: 25 июля, 2007, 03:00 пп

• LGR5/GPR49

○ Нуклеотид

■ Genbank, номер доступа NM_003667

■ Genbank, версия номер NM_003667.2 GI:24475886

■ Genbank, дата обновления записи: 22 июля, 2012, 03:38 пп

○ Полипептид

■ Genbank, номер доступа NP_003658

■ Genbank, версия номер NP_003658.1 GI:4504379

■ Genbank, дата обновления записи: 22 июля, 2012, 03:38 пп

• Проминин/CD 133

○ Нуклеотид

■ Genbank, номер доступа NM_006017

■ Genbank, версия номер NM_006017.2 GI:224994187

■ Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:47 пп

○ Полипептид

■ Genbank, номер доступа NP_006008

■ Genbank, версия номер NP 006008.1 GI:5174387

■ Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:47 пп

(58) ASG-5

Перекрестные ссылки

(Smith L.M., et. al AACR 2010 Annual Meeting (abstract #2590); Gudas J.M., et.al. AACR 2010 Annual Meeting (реферат №4393)

АНТИТЕЛА

Ahth-AGS-5 антитело: М6.131 (Smith, L.M., et. al AACR 2010 Annual Meeting (реферат №2590)

(59) ENPP3 (эктонуклеотидная пирофосфатаза/фосфодиэстераза 3)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF005632

Genbank, версия номер AF005632.2 GI:4432589

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 09:41 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААС51813

Genbank, версия номер ААС51813.1 GI:2465540

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 09:41 пп

Перекрестные ссылки

Jin-Hua P., et al Genomics 45 (2), 412-415 (1997)

Прочая информация

Официальный символ: ENPP3

Другие названия: RP5-988G15.3, В10, CD203c, NPP3, PD-IBETA, PDNP3

Другие обозначения: E-NPP 3; dJ1005H11.3 (фосфодиэстераза I/нуклеотид-пирофосфатаза 3); dJ914N13.3 (фосфодиэстераза I/нуклеотид-пирофосфатаза 3); 3 член семейства эктонуклеотидных пирофосфатаз/фосфодиэстераз; gp130RB13-6; бета-фосфодиэстераза I; фосфодиэстераза I/нуклеотид-пирофосфатаза 3; бета-фосфодиэстераза-I

(60) PRR4 (пролин-богатый 4 (лакримальный))

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_007244

Genbank, версия номер NM_007244.2 GI:154448885

Genbank, дата обновления записи: 28 июня, 2012, 12:39 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_009175

Genbank, версия номер NP_009175.2 GI:154448886

Genbank, дата обновления записи: 28 июня, 2012, 12:39 пп

Перекрестные ссылки

Dickinson D.P., et al Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (10), 2020-2031 (1995)

Прочая информация

Официальный символ: PRR4

Другие названия: LPRP, PROL4

Другие обозначения: лакримальный пролин-богатый белок; пролин-богатый белок 4, ассоциированный с карциномой носоглотки; пролин-богатый полипептид 4; пролин-богатый белок 4

(61) GCC - GUCY2C (гуанилатциклаза 2С (рецептор термостабильного энтеротоксина)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_004963

Genbank, версия номер NM_004963.3 GI:222080082

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:50 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_004954

Genbank, версия номер NP_004954.2 GI:222080083

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:50 пп

Перекрестные ссылки

De Sauvage F.J., et al J. Biol. Chem. 266 (27), 17912-17918 (1991); Singh S., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (3), 1455-1463 (1991)

Прочая информация

Официальный символ: GUCY2C

Другие названия: DIAR6, GUC2C, MUCIL, STAR

Другие обозначения: GC-C; рецептор STA; гуанилилциклаза С; hSTAR; рецептор термостабильного энтеротоксина; кишечная гуанилатциклаза

(62) Liv-1 - SLC39A6 (6 член семейства носителей растворенных веществ 39 (транспортер цинка))

Нуклеотид

Genbank, номер доступа U41060

Genbank, версия номер U41060.2 GI:12711792

Genbank, дата обновления записи: 30 ноября, 2009, 04:35 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА96258

Genbank, версия номер ААА96258.2 GI:12711793

Genbank, дата обновления записи: 30 ноября, 2009, 04:35 пп

Перекрестные ссылки

Taylor KM., et al Biochim Biophys Acta. 2003 Apr 1; 1611(1-2):16-30

Прочая информация

Официальный символ: SLC39A6

Другие названия: LIV-1

Другие обозначения: белок LIV-1, регулируемый эстрогеном; ZIP-6; эстроген-регулируемый белок LIV-1; 6 член семейства носителей растворенных веществ 39 (транспортер ионов металлов); 6 член семейства носителей растворенных веществ 36; транспортер цинка ZIP6; zrt- и Irt-подобный белок 6

(63) 5Т4, трофобластный гликопротеин, TPBG - TPBG (трофобластный гликопротеин)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AJ012159

Genbank, версия номер AJ012159.1 GI:3805946

Genbank, дата обновления записи: 01 февраля, 2011, 10:27 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа САА09930

Genbank, версия номер САА09930.1 GI:3805947

Genbank, дата обновления записи: 01 февраля, 2011, 10:27 дп

Перекрестные ссылки

King K.W., et al Biochim. Biophys. Acta 1445 (3), 257-270 (1999)

Прочая информация

• Официальный символ: TPBG

• Другие названия: 5Т4, 5T4AG, М6Р1

• Другие обозначения: онкофетальный антиген 5Т4; онкофетальный трофобластный гликопротеин 5Т4; онкотрофобластный гликопротеин 5Т4

• См. WO 2015/155345

(64) CD56 - NCMA1 (молекула адгезии нервных клеток 1)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_000615

Genbank, версия номер NM_000615.6 GI:336285433

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:32 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_000606

Genbank, версия номер NP_000606.3 GI:94420689

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:32 пп

Перекрестные ссылки

Dickson, G., et al, Cell 50 (7), 1119-1130 (1987)

Прочая информация

Официальный символ: NCAM1

Другие названия: CD56, MSK39, NCAM

Другие обозначения: антиген, распознаваемый моноклональным антителом 5.1H11; молекула адгезии нервных клеток, NCAM

АНТИТЕЛА

Immunogen: HuN901 (Smith SV., et al Curr Opin Mol Ther. 2005 Aug; 7(4):394-401) Например, см. гуманизированное из мышиного N901 антитело. См. Фиг. 1b и 1е в публикации Roguska, М.А., et al. Proc Natl Acad Sci USA Feb 1994; 91:969-973.

(65) CanAg (опухолеассоциированный антиген CA242)

Перекрестные ссылки

Haglund С., et al Br J Cancer 60:845-851, 1989; Baeckstrom D., et al J Biol Chem 266:21537-21547, 1991

АНТИТЕЛА

huC242 (Tolcher AW et al., J Clin Oncol. 2003 Jan 15; 21(2):211-22; Immunogen) Например, см. US 20080138898 A1, SEQ ID NO: 1 и 2

(66) FOLR1 (фолатныйрецептор 1)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа J05013

Genbank, версия номер J05013.1 GI:182417

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА35823

Genbank, версия номер AAA35823.1 GI:182418

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 дп

Перекрестные ссылки

Elwood Р.С., et al J. Biol. Chem. 264 (25), 14893-14901 (1989)

Прочая информация

Официальный символ: FOLR1

Другие названия: FBP, FOLR

Другие обозначения: FR-альфа; FBP клеток KB; фолат-связывающий белок взрослых; фолат-связывающий белок; фолатный рецептор альфа; фолатный рецептор взрослых; антиген MOv18, ассоциированный с опухолью яичника

АНТИТЕЛА

М9346А - Whiteman KR., et al Cancer Res April 15, 2012; 72(8 Supplement): 4628 (Immunogen)

(67) GPNMB (гликопротеин (трансмембранный) nmb)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа X76534

Genbank, версия номер Х76534.1 GI:666042

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:10 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа САА54044

Genbank, версия номер САА54044.1 GI:666043

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:10 дп

Перекрестные ссылки

Weterman М.А., et al Int. J. Cancer 60 (1), 73-81 (1995)

Прочая информация

Официальный символ: GPNMB

Другие названия: UNQ1725/PR09925, HGFIN, NMB

Другие обозначения: гликопротеин NMB; гликопротеин nmb-подобный белок; остеоактивин; трансмембранный гликопротеин HGFIN; трансмембранный гликопротеин NMB

АНТИТЕЛА

Celldex Therapeutics: CR011 (Tse KF., et al Clin Cancer Res. 2006 Feb 15; 12(4): 1373-82) Например, см. EP1827492 В1, SEQ ID NO: 22, 24, 26, 31, 33 и 35

(68) TIM-1 - HAVCR1 (клеточный рецептор 1 вируса гепатита A)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF043724

Genbank, версия номер AF043724.1 GI:2827453

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 06:24 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААС39862

Genbank, версия номер ААС39862.1 GI:2827454

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 06:24 пп

Перекрестные ссылки

Feigelstock D., et al J. Virol. 72 (8), 6621-6628 (1998)

Прочая информация

Официальный символ: HAVCR1

Другие названия: HAVCR, HAVCR-1, KIM-1, KIM1, TIM, TIM-1, TIM1, TIMD-1, TIMD1

Другие обозначения: белок 1 домена Т-клеточного иммуноглобулина и муцинового домена; белок 1 Т-клеточной мембраны; молекула 1 почечного повреждения

(69) RG-1/мишень опухоли предстательной железы Mindin - Mindin/RG-1

Перекрестные ссылки

Parry R., et al Cancer Res. 2005 Sep 15; 65(18):8397-405

(70) B7-H4 - VTCN1 (ингибитор 1 активации Т-клеток, содержащий V-образный домен)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа ВХ648021

Genbank, версия номер ВХ648021.1 GI:34367180

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 08:40 дп

Перекрестные ссылки

Sica GL., et al Immunity. 2003 Jun; 18(6):849-61

Прочая информация

Официальный символ: VTCN1

Другие названия: RP11-229А19.4, В7-Н4, В7Н4, B7S1, В7Х, B7h.5, PRO1291, VCTN1

Другие обозначения: член Н4 семейства В7; член 1 суперсемейства В7; костимулирующая молекула В7х Т-клеток; костимулирующая молекула В7х Т-клеток; ингибитор 1 активации Т-клеток, содержащий V-образный домен; иммунный костимулирующий белок В7-Н4

(71) РТК7 (протеинтирозинкиназа 7 РТК7)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF447176

Genbank, версия номер AF447176.1 GI:17432420

Genbank, дата обновления записи: 28 ноября, 2008, 01:51 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа AAL39062

Genbank, версия номер AAL39062.1 GI:17432421

Genbank, дата обновления записи: 28 ноября, 2008, 01:51 пп

Перекрестные ссылки

Park S.K., et al J. Biochem. 119 (2), 235-239 (1996)

Прочая информация

Официальный символ: РТК7

Другие названия: ССК-4, ССК4

Другие обозначения: киназа 4 карциномы толстой кишки; неактивная тирозин-протеинкиназа 7; псевдорецептор 7 тирозинкиназы; белок 7, подобный тирозин-протеинкиназе

(72) CD37 (молекула CD37)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001040031

Genbank, версия номер NM_001040031.1 GI:91807109

Genbank, дата обновления записи: 29 июля, 2012, 02:08 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001035120

Genbank, версия номер NP_001035120.1 GI:91807110

Genbank, дата обновления записи: 29 июля, 2012, 02:08 пп

Перекрестные ссылки

Schwartz-Albiez R., et al J. Immunol. 140 (3), 905-914 (1988)

Прочая информация

Официальный символ: CD37

Другие названия: GP52-40, TSPAN26

Другие обозначения: антиген CD37; антиген 37 клеточной дифференцировки; антиген лейкоцитов CD37; антиген поверхности лейкоцитов CD37; тетраспанин-26; tspan-26

АНТИТЕЛА

Boehringer Ingelheim: mAb 37.1 (Heider КН., et al Blood. 2011 Oct 13; 118(15):4159-68)

Trubion: CD37-SMIP (G28-1 scFv-Ig) ((Zhao X., et al Blood 2007; 110: 2569-2577) Например, см. US 20110171208 A1, SEQ ID NO: 253

Immunogen: K7153A (Deckert J., et al Cancer Res April 15, 2012; 72(8 Supplement): 4625)

(73) CD138-SDC1 (синдекан 1)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AJ551176

Genbank, версия номер AJ551176.1 GI:29243141

Genbank, дата обновления записи: 01 февраля, 2011, 12:09 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа CAD80245

Genbank, версия номер CAD80245.1 GI:29243142

Genbank, дата обновления записи: 01 февраля, 2011, 12:09 пп

Перекрестные ссылки

FP., et al Am J Clin Pathol. 2004 Feb;121(2):254-63

Прочая информация

Официальный символ: SDC1

Другие названия: CD138, SDC, SYND1, синдекан

Другие обозначения: антиген CD138; гепарансульфат-протеогликан, рецептор фактора роста фибробластов; синдекан, протеогликан 1; синдекан-1

АНТИТЕЛА

Biotest: химеризованное MAb (nBT062) - (Jagannath S., et al Poster ASH#3060, 2010; WIPO патентная заявка WO/2010/128087)

Например, см. US 20090232810, SEQ ID NO: 1 и 2

Immunogen: B-B4 (Tassone P., et al Blood 104_3688-3696)

Например, см. US 20090175863 A1, SEQ ID NO: 1 и 2

(74) CD74 (молекула CD74, главный комплекс гистосовместимости, инвариантная цепь II класса)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_004355

Genbank, версия номер NM_004355.1 GI:343403784

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:30 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_004346

Genbank, версия номер NP_004346.1 GI:10835071

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:30 пп

Перекрестные ссылки

Kudo, J., et al Nucleic Acids Res. 13 (24), 8827-8841 (1985)

Прочая информация

Официальный символ: CD74

Другие названия: DHLAG, HLADG, II, Ia-GAMMA

Другие обозначения: антиген CD74 (инвариантный полипептид главного комплекса гистосовместимости, ассоциированный с антигеном II класса); гамма-цепь антигена гистосовместимости II класса HLA; инвариантная цепь, ассоциированная с антигенами HLA-DR; HLA-DR-гамма; la-ассоциированная инвариантная цепь; гамма-цепь HLA-DR МНС; гамма-цепь антигенов II класса; р33

АНТИТЕЛА

Immunomedics: hLLl (милатузумаб) - Berkova Z., et al Expert Opin Investig Drugs. 2010 Jan; 19(1):141-9)

Например, см. US 20040115193, SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 и 24 Genmab: HuMax-CD74 (см. вебсайт)

(75) Клаудины - CL (клаудины)

Перекрестные ссылки

Offner S., et al Cancer Immunol Immunother. 2005 May; 54(5):431-45, Suzuki H., et al Ann N Y AcadSci. 2012 Jul; 1258:65-70)

У людей описаны 24 члена указанного семейства - см. литературные ссылки.

(76) EGFR (рецептор эпидермального фактора роста)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_005228

Genbank, версия номер NM_005228.3 GI:41927737

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:47 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_005219

Genbank, версия номер NP_005219.2 GI:29725609

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:47 пп

Перекрестные ссылки

Dhomen NS., et al Crit Rev Oncog. 2012; 17(1):31-50

Прочая информация

Официальный символ: EGFR

Другие названия: ERBB, ERBB1, HER1, PIG61, mENA

Другие обозначения: гомолог вирусного онкогена эритробластного лейкоза птиц (v-erb-b); белок 40, ингибирующий рост клеток; белок 61, вызывающий клеточную пролиферацию; прото-онкоген с-ErbB-1; рецепторная тирозин-протеинкиназа erbB-1

АНТИТЕЛА

BMS: цетуксимаб (эрбитукс) - Broadbridge VT., et al Expert Rev Anticancer Ther. 2012 May; 12(5):555-65.

Например, см. US 6217866 - депозитарный номер АТТС 9764.

Amgen: панитумумаб (вектибикс) - Argiles G., et al Future Oncol. 2012 Apr; 8(4):373-89 Например, см. US 6235883, SEQ ID NO: 23-38.

Genmab: залутумумаб - Rivera F., et al Expert Opin Biol Ther. 2009 May; 9(5):667-74.

YM Biosciences: нимотузумаб - Ramakrishnan MS., et al MAbs. 2009 Jan-Feb; 1(1):41-8.

Например, см. US 5891996, SEQ ID NO: 27-34.

(77) Her3 (ErbB3) - ERBB3 (гомолог 3 вирусного онкогена эритробластного лейкоза v-erb-b2 (птиц))

Нуклеотид

Genbank, номер доступа М34309

Genbank, версия номер М34309.1 GI:183990

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА35979

Genbank, версия номер ААА35979.1 GI:306841

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:47 пп

Перекрестные ссылки

Plowman, G.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (13), 4905-4909 (1990)

Прочая информация

Официальный символ: ERBB3

Другие названия: ErbB-3, HER3, LCCS2, MDA-BF-1, с-erbB-3, с-erbB3, erbB3-S, р180-ErbB3, p45-sErbB3, p85-sErbB3

Другие обозначения: протоонкоген-подобный белок с-ErbB-3; рецепторная тирозин-протеинкиназа erbB-3; рецептор HER3 клеточной поверхности тирозинкиназного типа

АНТИТЕЛА

Merimack Pharma: ММ-121 (Schoeberl В., et al Cancer Res. 2010 Mar 15; 70(6):2485-2494) Например, см. US 2011028129, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

(78) RON - MST1R (макрофаг-стгшулирующий рецептор 1 (c-met-родственная тирозинкиназа))

Нуклеотид

Genbank, номер доступа Х70040

Genbank, версия номер Х70040.1 GI:36109

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:17 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ССА49634

Genbank, версия номер ССА49634.1 GI:36110

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:17 пп

Перекрестные ссылки

Ronsin С., et al Oncogene 8 (5), 1195-1202 (1993)

Прочая информация

Официальный символ: MST1R

Другие названия: CD136, CDw136, РТК8, RON

Другие обозначения: рецептор MSP; MST1R, вариант RON30; MST1R, вариант RON62; протеин-тирозинкиназа 8 РТК8; RON, вариант Е2Е3; c-met-родственная тирозинкиназа; рецептор макрофаг-стимулирующего белка; p185-Ron; растворимый вариант 1 RON; растворимый вариант 2 RON; растворимый вариант 3 RON; растворимый вариант 4 RON

(79) ЕРНА2 (ЕРНрецептор А2)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа ВС037166

Genbank, версия номер ВС037166.2 GI:33879863

Genbank, дата обновления записи: 06 марта, 2012, 01:59 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААН37166

Genbank, версия номер ААН37166.1 GI:22713539

Genbank, дата обновления записи: 06 марта, 2012, 01:59 пп

Перекрестные ссылки

Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)

Прочая информация

Официальный символ: ЕРНА2

Другие названия: ARCC2, СТРА, СТРР1, ЕСК

Другие обозначения: рецептор 2 эфринового типа А; рецепторная протеин-тирозинкиназа эпителиальных клеток; растворимый вариант 1 ЕРНА2; рецептор ЕСК тирозин-протеинкиназы

АНТИТЕЛА

Medimmune: 1С1 (Lee JW., et al Clin Cancer Res. 2010 May 1; 16(9):2562-2570)

Например, см. US 20090304721 A1, Фиг. 7 и 8.

(80) CD20 - MS4A1 (трансмембранные 4-домены, подсемейство А, член 1)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа М27394

Genbank, версия номер М27394.1 GI:179307

Genbank, дата обновления записи: 30 ноября, 2009, 11:16 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА35581

Genbank, версия номер ААА35581.1 GI:179308

Genbank, дата обновления записи: 30 ноября, 2009, 11:16 дп

Перекрестные ссылки

Tedder T.F., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1), 208-212 (1988)

Прочая информация

Официальный символ: MS4A1

Другие названия: B1, Вр35, CD20, CVID5, LEU-16, MS4A2, S7

Другие обозначения: антиген CD20 В-лимфоцитов; антиген В1 клеточной поверхности В-лимфоцитов; антиген CD20; рецептор CD20; антиген Leu-16 поверхности лейкоцитов

АНТИТЕЛА

Genentech/Roche: ритуксимаб - Abdulla NE., et al BioDrugs. 2012 Apr 1; 26(2):71-82. Например, см. US 5736137, депозитарный номер АТСС НВ-69119.

GSK/Genmab: офатумумаб - Nightingale G., et al Ann Pharmacother. 2011 Oct; 45(10):1248-55. Например, см. US 20090169550 A1, SEQ ID NO: 2, 4 и 5.

Immunomedics: велтузумаб - Goldenberg DM., et al LeukLymphoma. 2010 May; 51(5):747-55. Например, см. US 7919273B2, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

(81) Тенасцин С - TNC (тенасцин С)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_002160

Genbank, версия номер NM_002160.3 GI:340745336

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:33 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_002151

Genbank, версия номер NP_002151.2 GI:153946395

Genbank, дата обновления записи: 23 сентября, 2012, 02:33 пп

Перекрестные ссылки

Nies D.E., et al J. Biol. Chem. 266 (5), 2818-2823 (1991); Siri A., et al Nucleic Acids Res. 19 (3), 525-531 (1991)

Прочая информация

Официальный символ: TNC

Другие названия: 150-225, GMEM, GP, НХВ, JI, TN, TN-C

Другие обозначения: GP 150-225; цитотактин; глиома-ассоциированный антиген внеклеточного матрикса; гексабрахион (тенасцин); мышечно-сухожильный антиген; нейронектин; тенасцин; тенасцин-С, изоформа 14/AD1/16

АНТИТЕЛА

Philogen: G11 (von Lukowicz Т., et al JNucl Med. 2007 Apr; 48(4):582-7) и F16 (Pedretti M., et al Lung Cancer. 2009 Apr; 64(1):28-33)

Например, см. US 7968685, SEQ ID NO: 29, 35, 45 и 47.

(82) FAP (альфа-белок активации фибробластов)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа U09278

Genbank, версия номер U09278.1 GI:1888315

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 09:22 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААВ49652

Genbank, версия номер ААВ49652.1 GI:1888316

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 09:22 дп

Перекрестные ссылки

Scanlan, M.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (12), 5657-5661 (1994)

Прочая информация

Официальный символ: FAP

Другие названия: DPPIV, FAPA

Другие обозначения: мембраносвязанная желатиназа меланомы 170 кДа; интегральная мембранная серин-протеаза; сепраза

(83) DKK-1 (Dickkopf 1 гомолог (Xenopus laevis)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_012242

Genbank, версия номер NM_012242.2 GI:61676924

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:48 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_036374

Genbank, версия номер NP_036374.1 GI:7110719

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:48 пп

Перекрестные ссылки

Fedi P. et al J. Biol. Chem. 274 (27), 19465-19472 (1999)

Прочая информация

Официальный символ: DKK1

Другие названия: UNQ492/PRO1008, DKK-1, SK

Другие обозначения: dickkopf-родственный белок-1; dickkopf-1-подобный; dickkopf-подобный белок 1; dickkopf-родственный белок 1; hDkk-1

АНТИТЕЛА

Novartis: BHQ880 (Fulciniti М., et al Blood 2009 Jul 9; 114(2):371-379) Например, см. US 20120052070 A1, SEQ ID NO: 100 и 108.

(27a) CD52 (молекула CD52)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_001803

Genbank, версия номер NM_001803.2 GI:68342029

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:48 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_001794

Genbank, версия номер NP_001794.2 GI:68342030

Genbank, дата обновления записи: 30 сентября, 2012, 01:48 пп

Перекрестные ссылки

Xia M.Q., et al Eur. J. Immunol. 21 (7), 1677-1684 (1991)

Прочая информация

Официальный символ: CD52

Другие названия: CDW52

Другие обозначения: антиген САМРАТН-1; антиген CD52 (антиген САМРАТН-1); антиген CDW52 (антиген САМРАТН-1); антиген 1 Cambridge pathology; эпидидимальный секреторный белок Е5; he5; человеческий эпидидимис-специфический белок 5

АНТИТЕЛА

Алемтузумаб (кампат) - Skoetz N., et al Cochrane Database Syst Rev. 2012 Feb 15; 2:CD008078.

Например, см. Drugbank, номер доступа DB00087 (BIOD00109, BTD00109)

(85) CS1 - SLAMF7 (7 член семейства SLAM)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа NM_021181

Genbank, версия номер NM_021181.3 GI: 1993571

Genbank, дата обновления записи: 29 июня, 2012, 11:24 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа NP_067004

Genbank, версия номер NP_067004.3 GI:19923572

Genbank, дата обновления записи: 29 июня, 2012, 11:24 дп

Перекрестные ссылки

Boles K.S., et al Immunogenetics 52 (3-4), 302-307 (2001)

Прочая информация

Официальный символ: SLAMF7

Другие названия: UNQ576/PR01138, 19А, CD319, CRACC, CS1

Другие обозначения: белок 19А24; CD2, субпопуляция 1; CD2-подобный рецептор, активирующий цитотоксичные клетки; СБ2-подобный рецептор активации цитотоксичных клеток; мембранный белок FOAP-12; новый LY9 (антиген 9 лимфоцитов)-подобный белок; белок 19А

АНТИТЕЛА

BMS: элотузумаб/HuLuc63 (Benson DM., et alJ Clin Oncol. 2012 Jun 1; 30(16):2013-2015)

Например, см. US 20110206701, SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 16.

(86) Эндоглин - ENG (эндоглин)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа AF035753

Genbank, версия номер AF035753.1 GI:3452260

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 06:36 пп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААС32802

Genbank, версия номер ААС32802.1 GI:3452261

Genbank, дата обновления записи: 10 марта, 2010, 06:36 пп

Перекрестные ссылки

Rius С., et al Blood 92 (12), 4677-4690 (1998)

Официальный символ: ENG

Прочая информация

Другие названия: RP11-228 В15.2, CD105, END, ННТ1, ORW, ORW1

Другие обозначения: антиген CD105

(87) Аннексии Al - ANXA1 (аннексии A1)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа Х05908

Genbank, версия номер Х05908.1 GI:34387

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:02 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ССА29338

Genbank, версия номер ССА29338.1 GI:34388

Genbank, дата обновления записи: 02 февраля, 2011, 10:02 дп

Перекрестные ссылки

Wallner B.P., et al Nature 320 (6057), 77-81 (1986)

Прочая информация

Официальный символ: ANXA1

Другие названия: RP11-71А24.1, ANX1, LPC1

Другие обозначения: аннексии I (липокортин I); аннексин-1; калпактин II; калпактин-2; хромобиндин-9; липокортин I; р35; белок, ингибирующий фосфолипазу А2

(88) V-САМ (CD106) - VCAM1 (молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа)

Нуклеотид

Genbank, номер доступа М60335

Genbank, версия номер М60335.1 GI:340193

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:56 дп

Полипептид

Genbank, номер доступа ААА61269

Genbank, версия номер ААА61269.1 GI:340194

Genbank, дата обновления записи: 23 июня, 2010, 08:56 дп

Перекрестные ссылки

Hession С, et al J. Biol. Chem. 266 (11), 6682-6685 (1991)

Прочая информация

Официальный символ: VCAM1

Другие названия: CD106, INCAM-100

Другие обозначения: антиген CD106; васкулярный белок клеточной адгезии 1

Последовательности антител

Анти-интегрин ανβ6

RHAB6.2

RHCB6.2

RHF

RHFB6

RHAY100bP

RKF

RKFL36L50

RKC

Анти-CD33

CD33 Hum195 VH

CD33Hum195 VK

Анти-CD19

VH B4 CD 19 с измененной поверхностью

VK В4 CD 19 с измененной поверхностью

Анти-Her2

VH цепь герцептина

VL цепь герцептина

Анти-CD25

VK симулекта (также известного как базиликсимаб)

VH симулекта

Анти-PSMA

Деиммунизированный VH '1

Деиммунизированный VK '1

Деиммунизированный VH1 '5

Деиммунизированный VH2 '5

Деиммунизированный VH3 '5

Деиммунизированный VH4 '5

Деиммунизированный VK1 '5

Деиммунизированный VK2 '5

Деиммунизированный VK3 '5

Деиммунизированный VK4 '5

Деиммунизированный VK DI '5

Деиммунизированный VH DI '5

Гуманизированная RHA '5

Гуманизированная RHB '5

Гуманизированная RHC '5

Гуманизированная RHP '5

Гуманизированная RHE '5

Гуманизированная RHF '5

Гуманизированная RHG '5

Гуманизированная RKA '5

Гуманизированная RKB '5

Гуманизированная RKC '5

Гуманизированная RKD '5

Гуманизированная RKE '5

Гуманизированная RKF '5

Гуманизированная RKG '5

Исходное антитело также может быть гибридным белком, содержащим последовательность альбумин-суязывающего пептида (АВР) (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Антитела по данному изобретению включают гибридные белки с последовательностями АВР, описанными в публикациях: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 в Таблицах III и IV, страница 35038; (ii) US 2004/0001827 в параграфе [0076]; и (iii) WO 01/45746 на страницах 12-13, и все указанные публикации включены в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте реализации антитело образовано для направленного специфического воздействия на связанный с опухолью антиген α_νβ₆.

Клеточно-связывающий агент может иметь метку, например, для облегчения обнаружения или очистки указанного агента до внедрения в конъюгат или в составе конъюгата. Мета может быть биотиновой меткой. В другом варианте реализации клеточно-связывающий агент может иметь радиоизотопную метку.

Присоединение звена, представляющего собой линкер, к звену, предствляющему собой лиганд

Звено, представляющее собой лиганд присоединяют к звену, представляющему собой линкер, через дисульфидную связь.

В одном варианте реализации связь между звеном, представляющим собой лиганд, и лекарственным соединением-линкером образуется между тиольной группой цистеинового остатка в звене, предствляющем собой лиганд, и малеимидной группой в звене, представляющем собой лекарственное соединение-линкер.

Цистеиновые остатки звена, представляющего собой лиганд могут быть доступны для реакции с функциональной группой звена, представляющего собой линкер с образованием связи. В других вариантах реализации, например, если звено, представляющее собой лиганд, представляет собой антитело, тиольные группы антитела могут участвовать в межцепочечных дисульфидных связях. Указанные межцепочечные связи можно превращать в свободные тиольные группы, например, посредством обработки антитела агентом DTT перед осуществлением реакции с функциональной группой звена, представляющего собой линкер.

В некоторых вариантах реализации цистеиновый остаток внедряют в тяжелую или легкую цепь антитела. Положения для вставки цистеина посредством замещения тяжелых или легких цепей антитела включают положения, описанные в опубликованной заявке США №2007-0092940 и в публикации международного патента WO 2008070593, которые включены в данный документ.

Способы лечения

Соединения по данному изобретению можно использовать в способе терапии. Также предложен способ лечения, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества конъюгата формулы I. Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для обеспечения благоприятного эффекта для пациента. Такой благоприятный эффект может представлять собой облегчение по меньшей мере одного симптома. Фактически введенное количество, а также частота и схема введения зависят от природы и тяжести патологического состояния, подлежащего лечению. Назначение лечения, например, определение дозы, входит в ответственность врачей общей практики и другого медицинского персонала.

Конъюгат можно вводить отдельно или в комбинации с другими способами лечения, одновременно или последовательно, в зависимости от патологического состояния, подлежащего лечению. Примеры способов лечения и терапий включают, но не ограничиваются ими, химиотерапию (введение активных агентов, включая, например, лекарства); хирургические операции; и лучевую терапию.

Фармацевтические композиции по данному изобретению и для применения в соответствии с данным изобретением могут содержать, помимо активного ингредиента, т.е. конъюгата формулы I, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, известные специалистам в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала зависит от способа введения, который может быть пероральным, или посредством инъекции, например, кожной, подкожной или внутривенной.

Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть в форме таблетки, капсулы, порошка или в жидкой форме. Таблетка может содержать твердый носитель или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, нефтяной, животный или растительный жир, минеральное масло или синтетическое масло. Может быть включен физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или другого сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Капсула может содержать твердый носитель, такой как желатин.

Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции, или инъекции в очаг поражения активный ингредиент должен быть в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и имеет подходящий рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области техники могут получить подходящие растворы с применением, например, изотоничных сред, таких как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, лактатный раствор Рингера для инъекций. При необходимости можно добавлять консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки.

Указанные конъюгаты можно использовать для лечения пролиферативного заболевания и аутоиммунного заболевания. Термин «пролиферативное заболевание» относится к нежелательной или неконтролируемой клеточной пролиферации избыточных или патологических клеток, которые являются нежелательными, такой как неопластический или гиперпластический рост in vitro или in vivo.

Примеры пролиферативных патологических состояний включают, но не ограничиваются ими, доброкачественную, пред-злокачественную и злокачественную клеточную пролиферацию, включая, но не ограничиваясь этим, неоплазмы и опухоли (например, гистоцитому, глиому, астроцитому, остеому), рак (например, рак легких, мелкоклеточный рак легких, желудочно-кишечный рак, рак кишечника, рак толстой кишки, карцинома молочной железы, карцинома яичника, рак предстательной железы, рак яичек, рак печени, рак почек, рак молочного пузыря, рак поджелудочной железы, рак головного мозга, саркома, остеосаркома, саркома Капоши, меланома), лейкозы, псориаз, болезни костей, фибропролиферативные расстройства (например, соединительных тканей) и атеросклероз. Другие раковые заболевания, представляющие интерес, включают, но не ограничиваются ими, гематологические заболевания; злокачественные заболевания, такие как лекйозы и лимфомы, такие как неходжкинская лимфома и подтипы, такие как DLBCL, лимфома из клеток маргинальной зоны, из клеток мантийной зоны и фолликулярная лимфома, лимфома Ходжкина, AML и другие раковые заболевания из В- или Т-клеток.

Примеры аутоиммунного заболевания включают следующие: ревматоидный артрит, аутоиммунные демиелинизирующие заболевания (например, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит), псориатический артрит, эндокринная офтальмопатия, увеоретинит, системная красная волчанка, миастения гравис, болезнь Грейса, гломерулонефрит, аутоиммунное гепатологическое расстройство, воспалительная болезнь кишечника(наприме, болезнь Крона), анафилаксия, аллергическая реакция, синдром Шегрена, сахарный диабет I типа, первичный билиарный цирроз, гранулематоз Вегенера, фибромиалгия, полимиозит, дерматомиозит, множественная эндокринная недостаточность, синдром Шмидта, аутоиммунный увеит, болезнь Аддисона, адреналит, тиреоидит, тиреоидит Хашимото, аутоиммунная болезнь щитовидной железы, перниционзная анемия, желудочная атрофия, хронический гепатит, волчаночный гепатит, атеросклероз, подострая кожная красная волчанка, гипопаратиреоз, синдром ДРесслера, аутоиммунная тромбоцитопения, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическая анемия, обыкновенная пузырчатка, пузырчатка, герпетиформный дерматит, очаговая алопеция, пемфигоид, склеродермия, прогрессирующий системный склероз, CREST-синдром (кальциноз, феномен Рейно, пищеводная дискинезия, склеродактилия и телеангиэктазия), аутоиммунное беслодие мужчин и женщин, анкилозирующий спондилит, язвенный колит, смешанная болезнь соединительной ткани, нодозный полиартериит, системный некротизирующий васкулит, атопический дерматит, атопический ринит, синдром Гудпасчера, болезнь Шагаса, саркоидоз, ревматическая лихорадка, астма, привичный выкидыш, антифосфолипидный синдром, аллергический альвеолит фермеров, мультиформная эритема, посткардиотомный синдром, синдром Кушинга, аутоиммунный хронический активный гепатит, легочная аллергия птицеводов, токсический эпидермальный некролиз, синдром Альпорта, альвеолит, аллергический альвеолит, фиброзирующий альвеолит, интерстициальная болезнь легких, нодозная эритема, гангренозная пиодермия, трансфузионная реакция, артериит Такаясу, ревматическая полимиалгия, височный артериит, шистозомоз, гигантоклеточный артериит, аскаридоз, аспергиллоз, синдром Самптера, экзема, лимфоматоидный гранулематоз, болезнь Бехчета, синдром Каштана, болезнь Кавасаки, денге, энцефаломиелит, эндокардит, эдомиокардиальный фиброз, эндофтальмит, стойко возвышающаяся эритема, псориаз, эритробластоз плода, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелти, филяриоз, циклит, хронический циклит, гетерохронический циклит, циклит Фукса, нефроматия IgA, пурпура Геноха-Шонлейна, болезнь «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата, кардиомиопатия, синдром Итона-Ламберта, рецидивирующий полихондрит, криоглобулинемия, макроглобулинемия Вальденстрема, синдром Эванса и аутоиммунная гонадная недостаточность.

В некоторых вариантах реализации аутоиммунное заболевание представляет собой расстройство В-лимфоцитов (например, системная красная волчанка, синдром Гудпасчера, ревматоидный артрит и диабет I типа), Th1-лимфоцитов (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз, синдром Шегрена, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, первичный билиарный цирроз, гранулематоз вегенера, туберкулез или болезнь «трансплантат против хозяина») или Th2-лимфоцитов (например, атопический дерматит, системная красная волчанка, атопическая астма, риноконъюнктивит, аллергический ринит, синдром Оменна, системный склероз или хроническая болезнь «трансплантат против хозяина»). В целом, расстройства, затрагивающие дендритные клетки, включают расстройства Th1-лимфоцитов или Th2-лимфоцитов. В некоторых вариантах реализации аутоиммунное расстройство представляет собой иммунологическое расстройство, опосредованное Т-клетками.

В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,01 до около 10 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,01 до около 5 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,05 до около 5 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 5 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 4 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,05 до около 3 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 3 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 2 мг/кг на одну дозу.

Содержание лекарственного вещества

Содержание лекарственного вещества (р) представляет собой среднее количество PBD лекарств на один клеточно-связывающий агент, например, антитело. Если соединения по данному изобретению связаны с цистеинами, то содержание лекарственного вещества может составлять от 1 до 8 единиц лекарства (D) на один клеточно-связывающий агент, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 фрагментов лекарства ковалентно связаны с клеточно-связывающим агентом. Композиции конъюгатов включают совокупности клеточно-связывающих агентов, например, антител, конъюгированных с лекарственным соединением в количестве от 1 до 8. Если соединения по данному изобретению связаны с лизинами, то содержание лекарственного вещества может составлять от 1 до 80 единиц лекарства (D) на один клеточно-связывающий агент, хотя предпочтительным может быть верхний предел 40, 20, 10 или 8. Композиции конъюгатов включают совокупности клеточно-связывающих агентов, например, антител, конъюгированных с лекарственным соединением в количестве от 1 до 80, от 1 до 40, от 1 до 20, от 1 до 10 или от 1 до 8.

Среднее количество лекарств на одно антитело в препаратах ADC, полученных в результате реакций конъюгации, можно определить стандартными способами, такими как УФ, обратно-фазовая ВЭЖХ, ГИХ, масс-спектроскопия, твердофазный иммуноферментный анализ и электрофорез. Также можно определить количественное распределение ADC с точки зрения р. С помощью твердофазного иммуноферментного анализа можно определить среднее значение р в конкретном препарате ADC (Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). Однако распределение значений p (лекарства) нельзя определить по связыванию антитело-антиген и по пределу обнаружения твердофазного иммуноферментного анализа. Кроме того, твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения конъюгатов антитело-лекарственное соединение не обеспечивает определение положений, в которых фрагменты лекарственного соединения присоединены к антителу, такому как фрагменты тяжелой цепи или легкой цепи, конкретных аминокислотных остатков. В некоторых случаях разделение, очистку и определение характеристик гомогенного ADC, в котором р представляет собой определенное значение, полученное на основании ADC с другим содержанием лекарства, можно осуществлять с помощью, например, обратно-фазовой ВЭЖХ или электрофореза. Такие технологии также применимы к другим типам конъюгатов.

Для некоторых конъюгатов антитело-лекарственное соединение, р может быть ограничен количеством центров присоединения в антителе. Например, антитело может иметь только одну или несколько тиольных групп цистеина, или может иметь только одну или несколько достаточно реакционноспособных тиольных групп, к которым может быть присоединен линкер. Более высокое содержание лекарства, например, р>5, может приводить к агрегации, нестабильности, токсичности или снижению клеточной проницаемости некоторых конъюгатов антитело-лекарственное соединение.

Как правило, в реакции конъюгации с антителом конъюгируется меньшее количество фрагментов лекарственных соединений, чем теоретически возможное максимальное количество. Антитело может содержать, например, множество лизиновых остатков, которые не взаимодействуют с лекарственным соединением-линкером (А или В). Только самые реакционноспособные лизиновые группы могут взаимодействовать с амин-реакционным линкерным реагентом. Также, только самые реакционноспособные цистеиновые тиольные группы могут взаимодействовать с тиол-реакционным линкерным реагентом. В целом, антитела не содержат много, если вообще содержат, свободных и реакционноспособных цистеиновых тиольных групп, которые можно связывать с фрагментом лекарственных соединений. Большинство цистеиновых тиольных остатков в антителах указанных соединений существуют в виде дисульфидных мостиков, и их необходимо восстанавливать восстановительным агентом, таким как дитиотреитол (DTT) или ТСЕР, в условиях частичного или полного восстановления. Содержание лекарства (отношение лекарственное соединение/антитело) в ADC можно регулировать несколькими различными способами, включая: (i) ограничение молярного избытка лекарственного соединения-линкера (А или В) относительно антитела, (ii) ограничение времени или температуры реакции конъюгации, и (iii) условия частичного или ограниченного восстановления для модификации цистеинового тиола.

Некоторые антитела содержат способные к восстановлению межцепочечные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антителам можно придавать реакционную способность для конъюгации с линкерными реагентами посредством их обработки восстановительным агентом, таким как DTT (дитиотреитол). Каждый цистеиновый мостик теоретически будет образовывать два реакционноспособных тиольных нуклеофила. Дополнительные нуклеофильные группы можно внедрять в антитела посредством реакции лизинов с 2-иминотиоланом (реагент Трота), в результате чего амин превращается в тиол. Рекционноспособные тиольные группы можно внедрять в антитело (или его фрагмент) посредством конструирования одного, двух, трех, четырех или более цистеиновых остатков (например, получения мутантных антител, содержащих один или более неприродных цистеиновых аминокислотных остатков). В US 7521541 описано конструирование антител посредством внедрения реакционноспособных цистеиновых аминокислот.

Цистеиновые аминокислоты можно конструировать по реакционноспособным сайтам антитела, которые не образуют внутрицепочечные или межмолекулярные дисульфидные связи (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO 2009/052249). Сконструированные цистеиновые тиолы могут взаимодействовать с линкерными реагентами или с реагентами лекарственное соединение-линкер по данному изобретению, которые содержат тиол-реакционные электрофильные группы, такие как малеимид или альфа-галоамиды, с образованием ADC с цистеин-сконструированными антителами и PBD фрагментами лекарственных соединений. Таким образом, положение фрагмента лекарственного соединения можно проектировать, контролировать и знать. Можно контролировать содержание лекарственного соединения, поскольку тиольные группы сконструированного цистеина обычно взаимодействуют с тиол-реакционными линкерными реагентами или реагентами лекарственное соединение-линкер с высоким выходом. Конструирование IgG антитела для внедрения цистеиновой аминокислоты посредством замещения в одном сайте тяжелой или легкой цепи обеспечивает два новых цистеина в симметричном антителе. Содержание лекарства около 2 может быть обеспечено с почти полной гомогенностью продукта конъюгации ADC.

Если более одной нуклеофильной или электрофильной группы антитела взаимодействует с промежуточным лекарственным соединением-линкером, или с линкерным реагентом, а затем с фрагментом лекарственного соединения, то полученный продукт представляет собой смесь ADC соединений с распределением фрагментов лекарственных соединений, присоединенных к антителу, например, 1, 2, 3 и т.д. Методы жидкостной хроматографии, такие как полимерная обратно-фазовая (ПОФ) хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия (ГИХ), могут обеспечивать разделение соединений в смеси по значению содержания лекарственного соединения. Можно выделять препараты ADC с одним значением содержания лекарства (р), однако такое единственное значение содержания ADC все еще может означать гетерогенную смесь, поскольку фрагменты лекарственных соединений могут быть присоединены через линкер в разных сайтах антитела.

Таким образом, композиции конъюгатов антитело-лекарственное соединение по данному изобретению включают смеси соединений-конъюгатов антитело-лекарственное соединение, в которых антитело имеет один или более фрагментов PBD лекарственного соединения и в которых фрагменты лекарственного соединения могут быть присоединены к антителу у различных аминокислотных остатков.

В одном варианте реализации среднее количество димерных пирролобензодиазепиновых групп на один клеточно-связывающий агент составляет от 1 до 20. В некоторых вариантах реализации указанный диапазон выбран из диапазонов от 1 до 8, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 4 и от 4 до 8.

В некоторых вариантах реализации присутствует одна димерная пирролобензодиазепиновая группа на один клеточно-связывающий агент.

Общие способы синтеза

Синтез PBD соединений подробно описан в следующих ссылках, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки:

a) WO 00/12508 (страницы 14-30);

b) WO 2005/023814 (страницы 3-10);

c) WO 2004/043963 (страницы 28-29); и

d) WO 2005/085251 (страницы 30-39).

Способ синтеза

Соединения лекарственного линкера по данному изобретению (А и В) можно синтезировать в соответствии с приведенными примерами.

Синтез конъюгатов лекарственных соединений

Конъюгаты можно получать так, как описано ранее. Антитела можно конъюгировать с соединениями лекарственное соединение-линкер (А или В), как описано в публикации Doronina et al., Nature Biotechnology, 2003, 21, 778-784). Вкратце, антитела (4-5 мг/мл) в PBS, содержащем 50 мМ бората натрия при рН 7,4, восстанавливают гидрохлоридом трис(карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) при 37°С. Ход реакции, в которой восстанавливают межцепочечные дисульфиды, контролируют по реакции с 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) и продолжают реакцию до достижения требуемого значения отношения тиолы/mAb. Затем восстановленное антитело охлаждают до 0°С и алкилируют, используя 1,5 эквивалента малеимидного лекарственного линкера на один тиол антитела. Через 1 час реакцию гасят добавлением 5 эквивалентов N-ацетилцистеина. Погашенный лекарственное соединение-линкер удаляют гель-фильтрацией на колонке PD-10. Затем ADC стерильно фильтруют через шприц-фильтр 0,22 мкм. Концентрацию белка можно определять спектральным анализом при 280 нм и 329 нм, соответственно, с поправкой на вклад поглощения лекарства при 280 нм. Можно использовать эксклюзионную хроматографию для определения степени агрегации антитела, и можно использовать ОФ-ВЭЖХ для определения содержания остаточного NAC-погашенного лекарственного линкера.

Дополнительные предпочтения

Следующие предпочтения можно применять в отношении всех аспектов данного изобретения, описанных выше, или можно они могут относиться к одному аспекту. Предпочтения можно комбинировать друг с другом в любом сочетании.

В некоторых вариантах реализации заместитель С11 может быть в следующем стереохимическом положении относительно соседних групп:

В других вариантах реализации заместитель С11 может быть в следующем стереохимическом положении относительно соседних групп:

В одном варианте реализации данного изобретения соединение формулы III представляет собой А.

В одном варианте реализации данного изобретения соединение формулы III представляет собой В.

В одном варианте реализации данного изобретения звено лекарственного линкера формулы III представляет собой D^L-A.

В одном варианте реализации данного изобретения звено лекарственного линкера формулы III представляет собой D^L-B.

Примеры

Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя силикагель Merck Kieselgel 60 F254, с флуоресцентным индикатором на алюминиевых пластинах. Визуализацию ТСХ осуществляли с помощью УФ света или паров йода, если не указано иное. Флэш-хроматографию проводили с применением силикагеля Merck Kieselgel 60 F254. Растворители для экстракции и хроматографии приобретали и использовали без дополнительной очистки у компании VWR, Великобритания. Все химические реактивы приобретали у компании Aldrich.

Значения химических сдвигов протонного ЯМР измеряли на дельта-шкале при 400 МГц на приборе Bruker AV400. Использовали следующие сокращения: с, синглет; д, дублет; т, триплет; к, квартет; квин., квинтет; м, мультиплет; ш, широкий. Константы связывания записывали в Гц. Колоночную хроматографию проводили на автоматической системе Isolera (Biotage), используя нормально-фазовые картриджи SNAP.

Ниже представлены условия ЖХ/МС:

Данные ЖХМС записывали на приборе ЖХ/МС серии Nexera компании Shimadzu с квадрупольным МС Shimadzu LCMS-2020, с ионизацией электрораспылением. Подвижная фаза А - 0,1% муравьиной кислоты в воде. Подвижная фаза В - 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле.

Градиент быстрой хроматографии: первоначальный состав 5% В выдерживали в течение 0,25 мин., затем повышали от 5% В до 100% В за 2 минуты. Указанный состав выдерживали в течение 0,50 мин. при 100% В, затем возвращали к 5% В за 0,05 мин. и выдерживали в течение 0,05 мин. Общее время пропускания градиента составляло 3 минуты. Скорость потока 0,8 мл/мин. Диапазон длины волны обнаружения: 190-800 нм. Температура печи: 50°С. Колонка: Waters Acquity UPLC ВЕН Shield RP18 1,7 мкм 2,1×50 мм.

Градиент длинной хроматографии: первоначальный состав 5% В выдерживали в течение 1 мин., затем повышали от 5% В до 100% В за 9 минут. Указанный состав выдерживали в течение 2 мин. при 100% В, затем возвращали к 5% В за 0,10 мин. и выдерживали в течение 3 мин. Общее время пропускания градиента составляло 15 минуты. Скорость потока 0,6 мл/мин. Диапазон длины волны обнаружения: 190 - 800 нм. Температура печи: 50°С. Колонка: АСЕ Excel 2 C18-AR, 2 мкм, 3,0×100 мм.

Пример 1

(а) (S)-2-(метоксикарбонил)-4-метиленпирролидиния хлорид (3)

Имеющееся в продаже производное пролина (1) приобретали у компании Omegachem

(i) (S)-1-тре-бутил-2-метил-4-метиленпирролидин-1,2-дикарбоксилат (2)

Карбонат калия (19,92 г, 14 ммоль, 3,0 экв.) добавляли к перемешанному раствору карбоновой кислоты 1 (10,92 г, 48 ммоль, 1,0 экв.) в ДМФА (270 мл). Полученную белую суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего добавляли йодметан (21,48 г, 9,5 мл, 151 ммоль, 3,15 экв.). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре на 3 дня. ДМФА удаляли ротационным испарением при пониженном давлении с получением желтого остатка, который разделяли между этилацетатом и водой. Органический слой отделяли, а водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой, насыщали солью и сушили над сульфатом магния. Этилацетат удаляли ротационным испарением при пониженном давлении с получением неочищенного продукта в виде желтого маслянистого вещества. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией [85% н-гексан/15% этилацетат] с получением продукта в виде бесцветного маслянистого вещества (10,74 г, 93%).

(ii) (S)-2-(метоксикарбонил)-4-метиленпирролидиния хлорид (3)

Раствор 4 М хлористоводородной кислоты в диоксане (63 мл, 254,4 ммоль, 4,5 экв.) добавляли к фрагменту Вос-защищенного кольца С 2 (13,67 г, 56,6 ммоль, 1,0 экв.) при комнатной температуре. Наблюдали выделение газа, что свидетельствует о высвобождении CO₂ и удалении группы Вое. Продукт выпадал в осадок в виде белого твердого вещества, и добавляли дополнительное количество диоксана для облегчения перемешивания реакционной смеси, которую оставляли перемешиваться в течение одного часа, а затем разбавляли диэтиловым эфиром. Выпавший в осадок продукт собирали факуумным фильтрованием и промывали дополнительным количеством диэтилового эфира. После сушки на воздухе получали требуемый продукт в виде белого порошка (9,42 г, 94%).

(b) трет-Бутил-(5-(3-(5-амино-4-((S)-2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (12)

(i) 1',3'-Бис[2-метокси-4-(метоксикарбонил)фенокси]пропан (5)

Диизопропилазодикарбоксилат (71,3 мл, 73,2 г, 362 ммоль) по каплям добавляли в течение 60 минут к перемешиваемому с помощью верхней мешалки раствору метилваниллата 4 (60 г, 329 ммоль) и Ph₃P (129,4 г, 494 ммоль) в безводном ТГФ (800 мл) при 0-5°С (лед/ацетон) в атмосфере азота. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 0-5°С еще 1 час, после чего по каплям добавляли раствор 1,3-пропандиола (11,4 мл, 12,0 г, 158 ммоль) в ТГФ (12 мл) в течение 20 минут. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали 5 дней. Полученный белый осадок 3 собирали вакуумным фильтрованием, промывали ТГФ и сушили в вакуумном эксикаторе до постоянной массы. Выход = 54,68 г (84% относительно 1,3-пропандиола). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС, 3,20 мин (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 427 ([М+Na]^+., 10); ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,64 (дд, 2Н, J=1,8, 8,3 Гц), 7,54 (д, 2Н, J=1,8 Гц), 6,93 (д, 2Н, J=8,5 Гц), 4,30 (т, 4Н, J=6,1 Гц), 3,90 (с, 6Н), 3,89 (с, 6Н), 2,40 (п, 2Н, J=6,0 Гц).

(ii) 1',3'-Бис[2-метокси-4-(метоксикарбонил)-5-нитрофенокси]пропан (6)

Твердый Cu(NO₃)₂.3H₂O (81,54 г, 337,5 ммоль) медленно добавляли к перемешиваемой с помощью верхней мешалки суспензии сложного бис-эфира. 5 (54,68 г, 135 ммоль) в уксусном ангидриде (650 мл) при 0-5°С (лед/ацетон). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 1 часа при 0-5°С, а затем оставляли нагреваться до комнатной температуры. На этой стадии наблюдали умеренную экзотерму (около 40-50°С), сопровождающуюся загущением смеси и выделением NO₂. Добавляли дополнительное количество уксусного ангидрида (300 мл) и оставляли реакционную смесь перемешиваться в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь выливали на лед (~ 1,5 л), перемешивали и оставляли нагреваться до комнатной температуры. Образовавшийся желтый осадок собирали вакуумным фильтрованием и сушили в эксикаторе с получением требуемого бис-нитросоединения 6 в виде желтого твердого вещества. Выход = 66,7 г (100%). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС 3,25 мин. (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 517 ([М+Na]^+., 40); ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,49 (с, 2Н), 7,06 (с, 2Н), 4,32 (т, 4Н, J=6,0 Гц), 3,95 (с, 6Н), 3,90 (с, 6Н), 2,45-2,40 (м, 2Н). См. ссылку Thurston 1996.

(iii) 1',3'-Бис(4-карбокси-2-метокси-5-нитрофенокси)пропан (7)

Суспензию метилового сложного эфира 6 (66,7 г, 135 ммоль) в ТГФ (700 мл) обрабатывали 1 н. раствором NaOH (700 мл) и энергично перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре. Через 4 дня перемешивания суспензия превращалась в раствор темного цвета, который подвергали ротационному испарению при пониженном давлении для удаления ТГФ. Полученный водный остаток подкисляли до рН 1 с помощью концентрированной HCl и собирали бесцветный осадок 7, и тщательно сушили в вакуумной печи (50°С). Выход = 54,5 г (87%). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС 2,65 мин. (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 489 ([М+Na]^+., 30); ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 7,62 (с, 2Н), 7,30 (с, 2Н), 4,29 (т, 4Н, J=6,0 Гц), 3,85 (с, 6Н), 2,30-2,26 (м, 2Н).

(iv) Диметил-1,1'-(4,4'-(пропан-1,3-диилбис(окси))бис(5-метокси-2-нитробензоил))(2S,2'S)-бис(4-метиленпирролидин-2-карбоксилат) (8)

Каталитическое количество безводного ДМФА (2,4 мл) добавляли к перемешанной суспензии оксалилхлорида (14,7 г, 9,8 мл, 115,8 ммоль, 3 экв.) и димерного ядра 7 (18 г, 38,6 ммоль, 1 экв.) в безводном ДХМ (500 мл) при комнатной температуре. После добавления ДМФА наблюдали энергичное выделение газа и перемешивали реакционную смесь в течение 18 часов в круглодонной колбе, оснащенной сушильной трубкой с хлоридом кальция. Полученный прозрачный раствор выпаривали при пониженном давлении и растирали твердое вещество с эфиром. Твердый продукт собирали вакуумным фильтрованием, промывали дополнительным количеством эфира и сушили in vacuo при 40°С в течение 1,5 часа. Затем полученное твердое вещество по частям добавляли к суспензии кольца С 3 (15,1 г, 84,9 ммоль, 2,2 экв.) и TEA (19,5 г, 27 мл, 119,6 ммоль, 5 экв.) в сухом ДХМ (375 мл), поддерживая температуру от -40 до -50°C с помощью бани из сухого льда/ацетонитрила. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при -40°С в течение 1 часа, а затем оставляли нагреваться до комнатной температуры, после чего ЖХМС показала полное расходование исходного вещества. Реакционную смесь разбавляли дополнительным количеством ДХМ и последовательно промывали водным раствором хлористоводородной кислоты (1 М, 2×200 мл), насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2×250 мл), водой (250 мл), насыщенным солевым раствором (250 мл), сушили (MgSO₄). ДХМ удаляли ротационным испарением при пониженном давлении с получением продукта в виде желтого пенистого вещества (25,72 г, 94%). Аналитические данные: RT 1,59 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 713 ([М+Н]^+., 100)

(v) ((Пропан-1,3-диилбис(окси))бис(5-метокси-2-нитро-4,1-фенилен))бис(((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-ил)метанон) (9)

Твердый боргидрид лития (3,18 г, 146 ммоль, 3 экв.) одной порцией добавляли к раствору сложного эфира 8 (34,72 г, 48,7 ммоль, 1 экв.) в сухом ТГФ (350 мл) в атмосфере азота при 0°С (ледяная баня). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 0°С в течение 30 минут, а затем оставляли нагреваться до комнатной температуры, после чего наблюдали выпадение в осадок оранжевого смолистого вещества. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре еще на 2 часа, а затем охлаждали на ледяной бани и обрабатывали водой с получением желтой суспензии. Осторожно добавляли хлористоводородную кислоту (1 М) до прекращения выделения газа. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (х 4) и промывали объединенные органические слои водой (х 1), насыщенным солевым раствором (х 1) и сушили (MgSO₄). Этилацетат удаляли ротационным испарением при пониженном давлении с получением желтого пенистого вещества. В результате очистки колоночной флэш-хроматографией [градиентное элюирование смесью ДХМ/МеОН от 0% до 5% с приращениями 1%] получали продукт в виде бледно-желтого пенистого вещества (23,1 г, 72%). Аналитические данные: RT 1,23 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 657 ([М+Н]^+., 100)

(vi) ((Пропан-1,3-диилбис(окси))бис(5-метокси-2-нитро-4,1-фенилен))бис(((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-ил)метанон) (10)

Раствор бис-спирта 9 (10 г, 15,2 ммоль, 1 экв.), трет-бутилдиметилсилилхлорида (5,97 г, 39,6 ммоль, 2,6 экв.) и имидазола (5,38 г, 79 ммоль, 5,2 экв.) в сухом ДМФА (80 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь выливали в воду (500 мл) с получением желтого осадка. Смесь экстрагировали ДХМ (4×100 мл), а объединенные экстракты промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении с получением вязкой желтой маслянистой жидкости. После очистки колоночной хроматографией [Biotage Isolera, градиентное элюирование, начиная со смеси гексана 60%/EtOAc 40% до 100% EtOAc, 8 объемов колонки, 100 г картридж Snap Ultra®] получали продукт в виде желтого пенистого вещества (11,8 г, 88%). Аналитические данные: RT 2,20 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 885 ([М+Н]^+., 100), 907 ([М+Na]^+., 50)

(vii) ((Пропан-1,3-диилбис(окси))бис(2-амино-5-метокси-4,1-фенилен))бис(((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-ил)метанон) (11)

Цинковый порошок (31,9 г, 488 ммоль, 40 экв.) активировали посредством перемешивания/обработки ультразвуком с 1 М HCl в течение 10 минут. Цинк отфильтровывали, промывая 1 М HCl, водой (х 3) и МеОН (х 2). Активированный цинк добавляли к раствору нитро-TBS соединения 10 (10,8 г, 12,2 ммоль, 1 экв.) в МеОН (88 мл) и 5% раствора муравьиной кислоты/МеОН (440 мл). Температура повышалась до 37°С, а реакционная смесь изменялась с желтого на бесцветный раствор. После убывания экзотермы (20 мин.) реакция была завершена, по данным ЖХМС. Реакционную смесь отфильтровывали через целит, промывая EtOAc. EtOAc часть промывали насыщенным раствором бикарбоната (х 4) [осторожно, выделяется газ!], водой (х 1), насыщенным солевым раствором (х 1), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении с получением желтого твердого вещества. После очистки колоночной флэш-хроматографией [н-гексан/EtOAc 50/50 об./об. до 100% EtOAc с приращениями 10%] получали продукт в виде желтого пенистого вещества (9,5 г, 86%). Аналитические данные: RT 2,12 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 825 ([М+H]^+., 60), 847 ([М+Na]^+., 30)

(viii) трет-Бутил-(5-(3-(5-амино-4-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (12)

Раствор бис-анилина 11 (3,27 г, 3,96 ммоль) и ди-трет-бутилдикарбоната (0,85 г, 3,96 ммоль) в сухом ТГФ (125 мл) нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 24 часов. Реакционную смесь охлаждали и выпаривали растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией [н-гексан/EtOAc 50/50 об./об. До 100% EtOAc с приращениями 10%, затем EtOAc/МеОН 98/2 об./об.] с получением требуемого продукта в виде желтого пенистого вещества (1,63 г, 44%). Аналитические данные: RT 2,28 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 925 ([М+Н]^+., 70), 947 ([М+Na]^+., 100)

(с) Alloc-Val-Ala-PABOH (17)

(i) Alloc-Val-OH (14)

Аллилхлорформиат (41 г, 36,2 мл, 0,34 моль, 1,2 экв.) по каплям добавляли к перемешанному раствору L-валина 13 (33,25 г, 0,28 моль, 1 экв.) и карбоната калия (58,9 г, 0,426 моль, 1,5 экв.) в воде (650 мл) и ТГФ (650 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. ТГФ выпаривали при пониженном давлении, а оставшийся раствор экстрагировали диэтиловым эфиром (или МТБЭ) (х 2). Водную часть подкисляли до рН 2 концентрированной HCl и экстрагировали ДХМ (х 3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным солевым раствором (х 1), сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении с получением бесцветного маслянистого вещества (57,1 г). Его использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

(ii) Alloc-Val-OSu (15)

К перемешанному раствору соединения 14 (57,1 г, 0,28 моль, 1 экв.) и N-гидроксисукцинимида (32,68 г, 0,28 моль, 1 экв.) в сухом ТГФ (800 мл) добавляли дициклогексилкарбодиимид (58,6 г, 0,28 моль, 1 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционную смесь отфильтровывали. Твердое вещество промывали ТГФ и концентрировали объединенный фильтрат при пониженном давлении. Маслянистый/твердый остаток повторно растворяли в ДХМ и оставляли стоять при 0°С в течение 30 минут. Суспензию фильтровали, промывая холодным ДХМ. После выпаривания фильтрата при пониженном давлении получали сукцинимидный сложный эфир в виде белого твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

(iii) Alloc-Val-Ala-OH (16)

Раствор Alloc-Val-OSu 15 (11,67 г, 39,0 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (50 мл) добавляли к раствору H-Ala-OH (3,66 г, 41,08 ммоль, 1,05 экв.) и NaHCO₃ (3,61 г, 43,03 ммоль, 1,1 экв.) в ТГФ (100 мл) и H₂O (100 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 часов и выпаривали ТГФ при пониженном давлении. рН доводили до 3-4 с помощью лимонной кислоты, в результате чего в осадок выпадало белое смолистое вещество. Его экстрагировали этилацетатом (6×150 мл) и промывали объединенные экстракты H₂O (200 мл), насыщенным солевым раствором (200 мл), сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении с получением белого твердого вещества. После растирания с диэтиловым эфиром (xs) получали чистый продукт в виде белого порошка (7,93 г, 74%). Аналитические данные: RT 2,17 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 295 ([М+Na]^+., 63), 273 ([М+1]^+., 60).

(iv) Alloc-Val-Ala-PABOH (17)

EEDQ (4,79 г, 19,3 ммоль, 1,05 экв.) добавляли к раствору спирта (2,38 г, 19,3 ммоль, 1,05 экв.) и Alloc-Val-Ala-OH 16 (5,02 г, 18,4 ммоль, 1,0 экв.) в сухом ТГФ (100 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 часов. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением бледно-коричневого твердого вещества. Твердое вещество растирали с диэтиловым эфиром и фильтровали, промывая избытком диэтилового эфира. В результате получали продукт в виде белого твердого вещества (6,2 г, 89%). Аналитические данные: RT 2,50 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 400,6 ([M+Na]^+., 50), 378,6 ([М+1]^+., 60).

(d) 4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пирроло-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35-триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил-(11S,11aS)-11-гидрокси-7-метокси-8-(3-(((S)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11a-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-8-ил)окси)пропокси)-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат (23)

(i) трет-бутил-(5-(3-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)-4-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (18)

Триэтиламин (0,38 г, 0,53 мл, 3,8 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к перемешанному раствору моно-Вос защищенного бис-анилина (12) (1,6 г, 1,72 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (0,184 г, 0,62 ммоль, 0,36 экв.) в сухом ТГФ (25 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 40°С, через 5 минут образец обрабатывали метанолом и с помощью ЖХМС определяли его как метилкарбонат. Аналитические данные: RT 2,32 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 983 ([М+Н]^+., 55), 1005 ([М+Na]^+., 100)

Раствор/суспензию бензилового спирта (17) (1,52 г, 2,35 ммоль, 1,4 экв.) и триэтиламина (0,26 г, 0,36 мл, 2,6 ммоль, 1,5 экв.) в сухом ТГФ (40 мл) пропускали через капельную воронку в свежеполученный изоцианат. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 2,5 часа. Реакционную смесь оставляли охлаждаться, фильтровали и выпаривали фильтрат досуха с получением неочищенного продукта в виде желтого маслянистого вещества, которое очищали колоночной флэш-хроматографией [н-гексан/EtOAc 50/50 об./об.], в результате чего получали продукт в виде желтого стекловидного вещества (1,192 г). Смешанные фракции очищали колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 0% до 1%] с получением дополнительного количества продукта (0,22 г). Продукт объединяли с получением продукта в виде желтого пенистого вещества (1,41 г, 63%). Аналитические данные: RT 2,27 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1328 ([М+Н]^+., 30), 1350 ([М+Na]^+., 100)

(ii) трет-бутил-(5-(3-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)-4-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (19)

1,0 М раствор TBAF в ТГФ (2,34 мл, 2,34 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к раствору бис-TBS соединения (18) (1,41 г, 1,06 ммоль, 1,0 экв.) в безводном ТГФ (12 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, растворитель удаляли при пониженном давлении и очищали остаток колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 0% до 4% с приращениями 1%] с получением требуемого продукта в виде белого пенистого вещества (0,98 г, 84%). Аналитические данные: RT 1,62 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1100 ([М+Н]^+., 60), 1122 ([М+Na]^+., 100)

(iii) 4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(11S,11aS)-8-(3-(((11S,11aS)-10-(трет-бутоксикарбонил)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,10,11,11a-гексагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-8-ил)окси)пропокси)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат (20)

IBX (45 мас. %, 1,3 г, 2,09 ммоль, 2,4 экв.) добавляли к раствору бис-спирта 19 (0,959 г, 0,87 ммоль, 1,0 экв.) в безводном ДМСО (25 мл). Раствор перемешивали при 30°С в течение 18 часов. ЖХМС анализ показал присутствие небольшого количества частично циклизованного материала. Добавляли дополнительное количество IBX (45 мас. %, 0,049 г, 0,17 ммоль, 0,2 экв.) и продолжали реакцию еще 18 часов. Реакционную смесь выливали в воду (200 мл) и собирали образовавшийся осадок фильтрованием, промывая водой. Осадок растворяли в ДХМ (150 мл) и промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл). Органическую часть сушили (MgSO₄) и выпаривали с получением белого твердого вещества. В результате очистки колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 0% до 4% с приращениями 1%] получали продукт в виде белого твердого вещества (0,696 г, 73%). Аналитические данные: RT 1,55 мин.; МС (ЭР⁺) m/z. (относительная интенсивность) 1096 ([М+Н]^+., 20), 1118 ([M+Na]^+., 100)

(iv) 4-((S)-2-((S)-2-амино-2-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(11S,11aS)-8-(3-(((11S,11aS)-10-(трет-бутоксикарбонил)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,10,11,11а-гексагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-8-ил)окси)пропокси)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат (21)

Pd(PPh₃)₄ (14 мг, 12,28 мкмоль, 0,02 экв.) добавляли к раствору циклизованного продукта 20 (0,673 г, 0,61 ммоль, 1,0 экв.) и пирролидина (55 мг, 63 мкл, 0,8 ммоль, 1,25 экв.) в безводном ДХМ (30 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (70 мл) и промывали насыщенным раствором NH₄Cl (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO₄) и выпаривали с получением грязновато-белого пенистого вещества. Продукт растирали с диэтиловым эфиром и сушили с получением продукта (0,62 г, 100%), который использовали без дополнительной очистки. Аналитические данные: RT 1,16 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1012 ([М+H]^+., 80), 1034 ([М+Na]^+., 20)

(v) трет-бутил-(11S,11aS)-8-(3-(((11S,11aS)-10-(((4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35-триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаоксо-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил)окси)карбонил)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,10,11,11а-гексагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-8-ил)окси)пропокси)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат (22)

EDCI.HCl (0,13 г, 0,66 ммоль, 1,1 экв.) добавляли к мутному раствору соединения 21 (0,61 г, 0,6 ммоль, 1,0 экв.) и Mal-dPEG₈®-OH (0,393 г, 0,66 ммоль, 1,1 экв.) в CHCl₃ (25 мл). Прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа, разбавляли CHCl₃ (100 мл), промывали насыщенным солевым раствором (2×100 мл), сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении с получением желтого пенистого вещества. В результате очистки колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 0% до 6% с приращениями 1%] получали продукт в виде белого пенистого вещества (0,786 г, 82%). Аналитические данные: RT 1,44 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1586 ([М+H]^+. 0,40), 1609 ([М+Na]^+., 100)

(vi) 4-((2S,5S)-3 7-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35-триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо) бензил-(11S,11aS)-11-гидрокси-7-метокси-8-(3-(((S)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11a-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-8-ил)окси)пропокси)-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат (23)

Ледяной 95% раствор ТФК_(водн.) (10 мл) добавляли к Вос-защищенному соединению 22 (0,759 г, 0,48 ммоль, 1,0 экв.), охлажденному до 0°С (ледяная баня). Желтый раствор перемешивали при 0°С в течение 1 часа. Реакционную смесь выливали на лед/воду (200 мл) и подщелачивали смесь до рН 8 твердым NaHCO₃. Смесь экстрагировали ДХМ (4×50 мл) и промывали объединенные экстракты насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении. Продукт очищали колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 0% до 8% с приращениями 1%] с получением бледно-желтого пенистого вещества (0,445 г, 65%). Аналитические данные: RT 1,37 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1468 ([М+H]^+., 0,40)

Пример 2

Альтернативный синтез трет-бутил-(5-(3-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)-4-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамата (19)

(i) ((2S,2'S)-(4,4'-(пропан-1,3-диилбис(окси))бис(5-метокси-2-нитробензоил))-бис(4-метиленпирролидин-1,2-диил))бис(метилен)диацетат (24)

Раствор ацетилхлорида (21,1 мл, 23,3 г, 297 ммоль) в ДХМ (100 мл) по каплям, в течение 20 минут добавляли к перемешанному раствору бис-спирта (9) (75 г, 114 ммоль) и триэтиламина (34,7 г, 343 ммоль) в безводном ДХМ (900 мл) при 0-5°С в атмосфере азота. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали еще 60 минут. Реакционную смесь промывали ледяным 0,5 М раствором HCl (500 мл), насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (250 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл) и сушили (MgSO₄). После удаления растворителя ротационным испарением получали бледно-желтое пенистое вещество, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход = 66,7 г (79%). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС (7,60 мин. (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 741,2 ([М+1]^+,, 60) 763,3 ([М+Na]^+,, 100)); ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 57,73 (с, 2Н), 6,83 (с, 2Н), 5,12 (д, 2Н, J=12 Гц), 5,02 (с, 2Н), 4,89 (с, 2Н), 4,79 (м, 2Н), 4,61 (м, 1Н), 4,35 (м, 6Н), 3,98 (с, 6Н), 3,87 (д, 1Н, J=4,0 Гц), 3,76 (м, 3Н), 2,87-2,83 (м, 2Н), 2,56-2,43 (м, 4Н), 2,05 (с, 4Н), 1,96 (с, 2Н).

(ii) ((2S,2'S)-(4,4'-(пропан-1,3-диилбис(окси))бис(2-амино-5-метоксибензоил))-бис(4-метиленпирролидин-1,2-диил))бис(метилен)диацетат (25)

10% раствор муравьиной кислоты в метаноле (500 мл) добавляли за один раз, через делительную воронку, к раствору бис-спирта (24) (66 г, 0,09 моль) в метаноле (1000 мл), содержащему цинк* (145 г, 2,22 моль), при комнатной температуре. Температуру реакционной смеси быстро повышали до 42°С, а затем снова охлаждали до комнатной температуры с помощью бани с холодной водой. Избыток цинка удаляли фильтрованием через короткий слой целита, который затем промывали этилацетатом (100 мл). Фильтрат разбавляли этилацетатом (1400 мл) и промывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (1500 мл), водой (500 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл) и сушили (MgSO₄). После удаления растворителя ротационным испарением получали желтое твердое вещество, которое очищали колоночной хроматографией (4% метанол/ДХМ) с получением продукта в виде бледно-желтого пенистого вещества. Выход = 38,1 г (63%). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС (6,61 мин. (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 681,2 ([М+1]^+,, 100)); ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 6,74 (с, 2Н), 6,31 (с, 2Н), 5,02 (шс, 2Н), 4,97 (шс, 2Н), 4,80 (с, 2Н), 4,33-4,10 (м, 16Н), 3,78 (с, 3Н), 2,78 (м, 2Н), 2,46 (м, 2Н), 2,34 (м, 2Н), 2,04 (с, 6Н).

(iii) ((S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-(ацетоксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-амино-5-метоксибензоил)-4-метиленпирролидин-2-ил)метилацетат (26)

Вос-ангидрид (21,6 г, 31,7 ммоль) добавляли к раствору диамина (25) (6,92 г, 31,7 ммоль) в ТГФ (200 мл) при комнатной температуре. Затем полученный раствор нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 3 часов, охлаждали и выпаривали досуха при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией (70-100% этилацетат/гексан) с получением продукта в виде бледно-желтого твердого вещества. Выход = 8,4 г (34%). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС (хроматография за 3 минуты) (1,64 мин. (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 781,2 ([М+Na]^+,, 30)); ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,32 (шс, 1Н), 7,87 (с, 1Н), 6,80 (с, 1Н), 6,73 (с, 1Н), 5,02 (м, 3H), 4,79 (3H), 4,34-4,09 (м, 14Н), 3,83 (с, 3Н), 3,78 (с, 3H), 2,81-2,74 (м, 2Н), 2,48-2,36 (м, 4Н), 2,04 (м, 7Н), 1,49 (с, 9Н).

(iv) ((S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-(ацетоксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-5-метоксибензоил)-4-метиленпирролидин-2-ил)метилацетат (27)

Триэтиламин (0,57 г, 5,6 ммоль) добавляли за один раз к раствору амина (26) (2 г, 2,56 ммоль) и трифосгена (0,27 г, 0,92 ммоль) в ТГФ (30 мл) в атмосфере азота. Полученную смесь нагревали при 40°С в течение 5 минут. Небольшую аликвоту гасили метанолом, и ЖХМС показала завершение превращения в метилкарбамат (m/z 983, М+1). За один раз добавляли суспензию SG3366 (2,25 г, 3,48 ммоль) и триэтиламина (0,39 г, 3,84 ммоль) в ТГФ (50 мл) и нагревали полученную смесь при 40°С в течение 4 часов. После охлаждения белое твердое вещество удаляли фильтрованием и выпаривали фильтрат досуха при пониженном давлении, и очищали колоночной хроматографией (1-3% метанол/ДХМ) с получением продукта в виде бледно-желтого твердого вещества. Выход = 2,1 г (69%). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС (8,26 мин. (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 1184,3 ([М+1]⁺, 70), 1206,3 ([М+Na]^+,, 100)); ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 7,62 (с, 2Н), 7,30 (с, 2Н), 4,29 (т, 4Н, J=6,0 Гц), 3,85 (с, 6Н), 2,30-2,26 (м, 2Н).

(v) ((S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-(ацетоксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-5-метоксибензоил)-4-метиленпирролидин-2-ил)метилацетат (19)

Карбонат калия (1,16 г, 8,44 ммоль) растворяли в воде (8,4 мл) и добавляли к раствору диацетата (27) (2,0 г, 1,69 ммоль) в метаноле (40 мл). Полученную смесь перемешивали при 25°С в течение 30 минут, затем выпаривали досуха при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в воде (100 мл), подкисляли (рН 3) 1 М раствором лимонной кислоты и экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Объединенные экстракты промывали водой (100 мл), насыщенным солевым раствором (30 мл) и сушили (MgSO₄). После удаления растворителя при пониженном получали продукт в виде грязновато-белого твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход = 1,6 г (87%). Аналитические данные: Удовлетворительная чистота по ЖХ/МС (7,32 мин. (ЭР+) m/z (относительная интенсивность) 1100,7 ([M+1]⁺, 50), 1122,3 ([М+Na]^+,, 100)); ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ9,98 (шс, 1Н), 9,09 (шс, 1Н), 8,73 (шс, 1Н), 8,14 (д, J=8 Гц, 1Н), 7,59 (д, J=8 Гц, 2Н), 7,33 (д. J=8 Гц, 2Н), 7,21 (м, 3Н), 6,90 (шс, 2Н), 5,91 (м, 1Н), 5,30 (д, J=4 Гц, 1Н), 5,19 (д, J=4 Гц, 1Н), 5,00 (м, 6Н), 4,70-4,35 (м, 6Н), 4,15-3,88 (м, 12Н), 3,77 (с, 3Н), 3,67 (с, 3Н), 2,82-2,67 (м, 2Н), 2,42 (м, 3Н), 2,21 (т, J=4 Гц, 2Н), 1,98 (м, 6Н), 1,42 (с, 9Н), 1,31 (д, J=8 Гц, 3Н), 0,90 (д, J=4 Гц, 3Н), 0,84 (д, J=4 Гц, 3Н).

Пример 3

а) Аллил-(5-(3-(5-амино-4-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (28)

Раствор аллилхлорформиата (1,05 г, 0,9 мл, 8,7 ммоль, 0,9 экв.) по каплям добавляли к раствору бис-анилина (11) (8,02 г, 9,7 ммоль, 1 экв.) и пиридина (1,15 г, 1,2 мл, 14,55 ммоль, 1,9 экв.) в сухом ДХМ (350 мл) при -78°С (баня из сухого льда/ацетона). Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 1 часа, а затем оставляли нагреваться до комнатной температуры. Реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором сульфата меди (250 мл), водой (250 мл), насыщенным раствором бикарбоната натрия (250 мл), насыщенным солевым раствором и сушили (MgSO₄). После ротационного испарения при пониженном давлении получали неочищенный продукт .После очистки флэш-хроматографией [50% н-гексан/50% этилацетат, до 20% н-гексан/80% этилацетат, до 100% этилацетата, до 1% метанол/99% этилацетат] получали бис-alloc продукт (2,066 г), требуемый момо-alloc продукт (4,33 г, 49%) и восстановленный бис-анилин (1,96 г). Аналитические данные: RT 2,26 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 909 ([М+1]^+., 100); 931 ([М+Na]^+., 100)

(b) 4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(5-(3-(5-(((аллилокси)карбонил)амино)-4-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидия-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (29)

Триэтиламин (1,22 г, 1,7 мл, 12,1 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к перемешанному раствору моно-boc защищенного бис-анилина (28) (5,0 г, 5,5 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (0,59 г, 1,98 ммоль, 0,36 экв.) в сухом ТГФ (75 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре.

Реакционную смесь нагревали до 40°С, через 5 минут образец обрабатывали метанолом и с помощью ЖХМС определяли его как метилкарбонат. Аналитические данные: RT 2,30 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 967 ([М+Н]^+., 25), 989 ([М+Na]^+., 100)

Раствор/суспензию бензилового спирта (17) (3,11 г, 8,25 ммоль, 1,5 экв.) и триэтиламина (0,83 г, 1,1 мл, 2,6 ммоль, 1,5 экв.) в сухом ТГФ (75 мл) пропускали через капельную воронку в свежеполученный изоцианат. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 5 часов, затем в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь остывали охлаждаться, фильтровали и выпаривали фильтрат досуха с получением неочищенного продукта в виде желтого маслянистого вещества, которое очищали колоночной флэш-хроматографией [50% н-гексан/50% этилацетат до 40% н-гексан/60% этилацетат], в результате чего получали продукт в виде желтого стекловидного вещества (1,25 г, 17%). Аналитические данные: RT 2,26 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1312 ([М+H]⁺, 25), 1335 ([M+Na]⁺, 35)

(c) 4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(5-(3-(5-(((аллилокси)карбонил)амино)-4-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (30)

1,0 М раствор TBAF в ТГФ (5,2 мл, 5,2 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к раствору бис-TBS соединения (29) (3,096 г, 2,36 ммоль, 1,0 экв.) в безводном ТГФ (25 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, растворитель удаляли при пониженном давлении и очищали остаток колоночной флэш-хроматографией [этилацетат/метанол от 0% до 6% с приращениями 1%] с получением требуемого продукта в виде белого пенистого вещества (1,91 г, 75%). Аналитические данные: RT 1,56 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1084 ([М+Н]^+., 100), 1106 ([М+Na]^+., 90)

(d) Аллил-(11S,11aS)-8-(3-(((11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,10,11,11а-гексагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-8-ил)окси)пропокси)-11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1H-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат (31)

IBX (45 мас. %, 2,06 г, 3,3 ммоль, 2,4 экв.) добавляли к раствору бис-спирта 30 (1,49 г, 1,38 ммоль, 1,0 экв.) в безводном ДМСО (40 мл). Раствор перемешивали при 30°С в течение 18 часов. ЖХМС анализ показал присутствие небольшого количества частично циклизованного материала. Добавляли дополнительное количество IBX (45 мас. %, 0,171 г, 0,275 ммоль, 0,2 экв.) и продолжали реакцию еще 24 часа. Реакционную смесь выливали в воду (200 мл) и собирали образовавшийся осадок фильтрованием, промывая водой. Осадок растворяли в ДХМ (150 мл) и промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл). Органическую часть сушили (MgSO₄) и выпаривали с получением белого твердого вещества. В результате очистки колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 0% до 3% с приращениями 1%] получали продукт в виде белого твердого вещества (1,06 г, 72%). Аналитические данные: RT 6,88 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1080 ([М+Н]^+., 50), 1102([M+Na]^+., 100)

(e) 4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(11S,11aS)-11-гидрокси-7-метокси-8-(3-(((S)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11а-тетрагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-8-ил)окси)пропокси)-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11a-тетрагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат (32)

Pd(PPh₃)₄ (44 мг, 38,5 мкмоль, 0,04 экв.) добавляли к раствору циклизованного продукта 31 (1,04 г, 0,96 ммоль, 1,0 экв.) и пирролидина (0,171 мг, 196 мкл, 2,4 ммоль, 2,5 экв.) в безводном ДХМ (30 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (30 мл) и промывали насыщенным раствором NH₄Cl (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO₄) и выпаривали с получением грязновато-белого пенистого вещества. Продукт растирали с диэтиловым эфиром и сушили с получением продукта (0,86 г, 100%), который использовали без дополнительной очистки. Аналитические данные: RT 1,10 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 894 ([М+Н]^+., 30)

(f) 4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35-триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил-(11S,11aS)-11-гидрокси-7-метокси-8-(3-(((S)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11a-тетрагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-8-ил)окси)пропокси)-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат (23)

EDCI.HCl (0,203 г, 1,06 ммоль, 1,1 экв.) добавляли к раствору соединения 32 (0,86 г, 0,96 ммоль, 1,0 экв.) и Mal-dPEG₈®-OH (0,57 г, 0,96 ммоль, 1,1 экв.) в сухом ДХМ (30 мл) и CHCl₃ (с получением прозрачного раствора). Прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов, затем добавляли дополнительное количество EDCI.HCl (0,037 г, 0,19 ммоль, 0,2 экв.) и продолжали реакцию еще 24 часа. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (70 мл), промывали водой (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении с получением желтого пенистого вещества. В результате очистки колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 0% до 6% с приращениями 1%] получали продукт в виде грязновато-белого пенистого вещества (0,56 г, 40%). Аналитические данные: RT 6,13 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1468 ([М+Н]^+., 20)

Пример 4

(а) Аллил-(2-((R)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-(3-(4-((R)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-((((4-((10S,13S)-10-изопропил-13-метил-8,11-диоксо-2,5-диокса-9,12-диазатетрадекан-14-амидо)бензил)окси)карбонил)амино)-2-метоксифенокси)пропокси)-4-метоксифенил)карбамат (34)

Триэтиламин (0,049 г, 0,07 мл, 0,48 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к перемешанному раствору моно-alloc защищенного бис-анилина (23) (0,2 г, 0,22 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (0,024 г, 0,079 ммоль, 0,36 экв.) в сухом ТГФ (5 мл) в атмосфере аргона при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 40°С, через 5 минут образец обрабатывали метанолом и с помощью ЖХМС определяли его как метилкарбонат. Аналитические данные: RT 2,27 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 967 ([М+H]^+., 80), 989([M+Na]^+., 100)

Раствор/суспензию бензилового спирта (33) (0,121 г, 0,29 ммоль, 1,3 экв.) и триэтиламина (0,029 г, 0,04 мл, 0,29 ммоль, 1,3 экв.) в сухом ТГФ (5 мл) пропускали через капельную воронку в свежеполученный изоцианат. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 4 часов, затем в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь оставляли охлаждаться, фильтровали и выпаривали фильтрат досуха с получением неочищенного продукта, который очищали колоночной флэш-хроматографией [Biotage Isolera™ CHCl₃/МеОН от 2% до 4%, градиентное элюирование]. В результате получали продукт (0,237 г, 79%). Аналитические данные: RT 2,19 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1358 ([М+Н]^+., 30), 1380 ([М+Na]^+., 15)

(b) 4-((10S,13S)-10-изопропил-13-метил-8,11-диоксо-2,5-диокса-9,12-диазатетрадекан-14-амидо)бензил-(5-(3-(5-амино-4-((R)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-2-метоксифенокси)пропокси)-2-((R)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метоксифенил)карбамат (35)

Pd(PPh₃)₄ (0,3 г, 0,25 ммоль, 0,06 экв.) добавляли к раствору alloc-защищенного промежуточного соединения 34 (5,89 г, 4,3 ммоль, 1,0 экв.) и пирролидина (0,46 г, 530 мкл, 6,5 ммоль, 1,5 экв.) в безводном ДХМ (50 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли ДХМ и промывали насыщенным раствором NH₄Cl, насыщенным солевым раствором, сушили (MgSO₄) и выпаривали с получением неочищенного продукта. Продукт очищали колоночной флэш-хроматографией [Biotage Isolera™ ДХМ/МеОН от 1% до 3%] с получением продукта (4,53 г, 83%), который имел общую чистоту 80% и использовали без дополнительной очистки. Аналитические данные: RT 2,10 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1275 ([М+Н]^+., 40).

(c) 4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(2-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирропидин-1-карбонил)-5-(3-(4-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-((((4-((10S,13S)-10-изопропил-13-метил-8,11-диоксо-2,5-диокса-9,12-диазатетрадекан-14-амидо)бензил)окси)карбонил)амино)-2-метоксифенокси)пропокси)-4-метоксифенил)карбамат (36)

Триэтиламин (0,35 г, 48 мкл, 0,34 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к перемешанному раствору анилина (35) (0,2 г, 0,157 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (0,017 г, 57 мкмоль, 0,36 экв.) в сухом ТГФ (5 мл) в атмосфере аргона при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 40°С, через 5 минут образец обрабатывали метанолом и с помощью ЖХМС определяли его как метилкарбонат.Аналитические данные: RT 2,15 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1333 ([М+Н]^+., 40), 1354 ([М+Na]^+., 35).

Раствор/суспензию бензилового спирта (17) (0,071 г, 0,19 ммоль, 1,2 экв.) и триэтиламина (19 мг, 26 мкл, 0,19 ммоль, 1,2 экв.) в сухом ТГФ (5 мл) пропускали через капельную воронку в свежеполученный изоцианат. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 4 часов, затем в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали и выпаривали фильтрат досуха с получением неочищенного продукта, который очищали колоночной флэш-хроматографией [Biotage Isolera™ CHCl₃/МеОН от 2% до 3%, градиентное элюирование] с получением продукта (0,152 г, 58%). Аналитические данные: RT 2,12 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1677 ([М+Н]^+., 30), 1700 ([M+Na]^+., 100).

(d) 4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(2-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-(3-(4-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-5-((((4-((10S,13S)-10-изопропил-13-метил-8,11-диоксо-2,5-диокса-9,12-диазатетрадекан-14-амидо)бензил)окси)карбонил)амино)-2-метоксифенокси)пропокси)-4-метоксифенил)карбамат (37)

1,0 М раствор TBAF в ТГФ (3,4 мл, 3,4 ммоль, 2,0 экв.) добавляли к раствору бис-TBS соединения (36) (2,86 г, 1,7 ммоль, 1,0 экв.) в безводном ТГФ (30 мл) в атмосфере аргона. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов, реакционную смесь разбавляли CHCl₃ и промывали водой, насыщенным солевым раствором, сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении с получением желтого твердого вещества. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией [Biotage Isolera™ CHCl₃/МеОН, градиентное элюирование с элюированием продукта при 4% МеОН] с получением требуемого продукта (1,365 г) и дополнительно очищали смешанные фракции колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 1% до 5%] с получением дополнительного количества продукта (0,562 г), в результате чего получали общий выход требуемого продукта (1,93 г, 75%). Аналитические данные: RT 1,55 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1449 ([М+1]^+., 25); 1471 ([M+Na]^+., 20).

(e) 4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(11S,11aS)-11-гидрокси-8-(3-(((S)-10-(((4-((10S,13S)-10-изопропил-13-метил-8,11-диоксо-2,5-диокса-9,12-диазатетрадекан-14-амидо)бензил)окси}карбонил)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,10,11,11а-гексагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-8-ил)окси)пропокси)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат (38)

IBX (45 мас. %, 0,236 г, 0,38 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к раствору бис-спирта 37 (0,25 г, 0,17 ммоль, 1,0 экв.) в безводном ДМСО (12 мл). Раствор перемешивали при 30°С в течение 3,5 дней. Реакционную смесь выливали в воду (100 мл) и собирали образовавшийся осадок фильтрованием, промывая водой. Осадок экстрагировали ДХМ (5×30 мл) и промывали объединенные фракции насыщенным раствором NaHCO₃ (60 мл), водой (60 мл) и насыщенным солевым раствором (60 мл). Органическую часть сушили (MgSO₄) и выпаривали с получением неочищенного продукта. В результате очистки колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 1% до 5%] получали продукт в виде белого твердого вещества (0,158 г, 64%). Аналитические данные: RT 1,53 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1445 ([М+1]^+., 20); 1467 ([М+Na]^+., 30).

(f) 4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(11S,11aS)-11-гидрокси-8-(3-(((11S,11aS)-11-гидрокси-10-(((4-((10S,13S)-10-изопропил-13-метил-8,11-диоксо-2,5-диокса-9,12-диазатетрадекан-14-амидо)бензил)окси)карбонил)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,10,11,11а-гексагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-8-ил)окси)пропокси)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат (39)

Pd(PPh₃)₄ (8 мг, 6,9 мкмоль, 0,06 экв.) добавляли к раствору циклизованного продукта 38 (0,158 г, 0,109 ммоль, 1,0 экв.) и пирролидина (0,01 г, 12 мкл, 0,15 ммоль, 1,5 экв.) в безводном ДХМ (10 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Реакционную смесь разбавляли CHCl₃ и промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия, насыщенным солевым раствором, сушили (MgSO₄) и выпаривали с получением неочищенного продукта. Продукт растирали с диэтиловым эфиром (х 3) и сушили с получением продукта (0,136 г, 100%), который использовали без дополнительной очистки. Аналитические данные: RT 1,21 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1361 ([М+1]^+., 50); 1384 ([М+Na]^+., 10).

(g) 4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35-триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил-(11S,11aS)-11-гидрокси-8-(3-(((11S,11aS)-11-гидрокси-10-(((4-((10S,13S)-10-изопропил-13-метил-8,11-диоксо-2,5-диокса-9,12-диазатетрадекан-14-амидо)бензил)окси)карбонил)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,10,11,11а-гексагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-8-ил)окси)пропокси)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат (40)

Раствор соединения 39 (0,136 г, 0,1 ммоль, 1,0 экв.), Mal-dPEG₈®-OH (0,066 г, 0,11 ммоль, 1,1 экв.) и EDCI.HCl (0,022 г, 0,11 ммоль, 1,1 экв.) в сухом ДХМ (10 мл) и МеОН (1 капля) перемешивали при комнатной температуре в течение 1,45 часа. Реакционную смесь разбавляли CHCl₃ и промывали водой, насыщенным солевым раствором, сушили (MgSO₄) и выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. В результате очистки колоночной флэш-хроматографией [CHCl₃/МеОН от 1% до 9%] получали продукт в виде белого твердого вещества (0,123 г, 63%). Аналитические данные: [α]²¹_D = +112,5° (с=0,4, ВЭХЖ CHCl₃); RT 6,37 мин.; МС (ЭР⁺) m/z (относительная интенсивность) 1936 ([М+1]^+., 35); 1958 ([M+Na]^+., 15).

Пример 5 - Конъюгирование

Конъюгат трастузумаб-23

50 мМ раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4 (PBS) добавляли (50 молярных эквивалентов/антитело, 35 микромоль, 700 мкл) к 24,14 мл раствора антитела, трастузумаба (105 мг, 700 наномоль) в восстанавливающем буфере, содержащем PBS и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) с конечной концентрацией антитела 4,35 мг/мл. Восстанавливающую смесь нагревали при +37°С в течение 3 часов (или до полного восстановления, по данным УВЭЖХ) в инкубаторе при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании. После охлаждения до комнатной температуры в восстановленном антителе, посредством центрифугирования на спиновом фильтре, заменяли буфер на буфер повторного окисления, содержащий PBS с рН 7,4 и 1 мМ ЭДТК, для удаления избытка восстановительного агента. Добавляли 50 мМ раствор дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA, 10 молярных эквивалентов/антитело, 7 микромоль, 140 мкл) в ДМСО и оставляли смесь для повторного окисления взаимодействовать в течение 16 часов при комнатной температуре при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании с концентрацией антитела 2,3 мг/мл (или более добавленной DHAA, и оставляли смесь взаимодействовать до полного повторного окисления цистеиновых тиолов с образованием межцепочечных цистеиновых дисульфидов, по данным УВЭЖХ). Затем смесь повторного окисления стерильно отфильтровывали и разбавляли буфером для конъюгирования, содержащим PBS с рН 7,4, 1 мМ ЭДТК, до конечной концентрации антитела 1,0-1,5 мг/мл. Соединение 23 (SG3400) добавляли в виде раствора в ДМСО (10 молярных эквивалентов/антитело, 1 микромоль в 1,0 мл ДМСО) к 9 мл полученного раствора повторно окисленного антитела (15 мг, 100 наномоль) до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.). Раствор перемешивали в течение 1,5 часа при комнатной температуре, затем прекращали конъюгирование посредством добавления N-ацетилцистеина (4 микромоль, 40 мкл при 100 мМ), разбавляли до >50 мл в PBS и очищали конъюгат трастузумаб-23 спиновым фильтрованием с использованием 15 мл спинового фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно фильтровали и анализировали.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150 мм × 2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила на восстановленном образце конъюгата трастузумаб-А при 280 нм и 330 нм (специфического в отношении соединения А), показал неконъюгированные легкие цепи и смесь неконъюгированных тяжелых цепей, а также тяжелые цепи, присоединенные к одной молекуле соединения 23, что согласуется с отношением лекарства к антителу (DAR), составляющим 1,71 молекулы соединения 23 на одно антитело.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5 мкм 7,8×300 мм (с защитной колонкой 7 мкм 6,0×40 мм), элюируя стерильно отфильтрованным буфером SEC, содержащим 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.), на образце конъюгата трастузумаб-23 при 280 нм, показал чистоту мономера 94%. SEC анализ УВЭЖХ показал концентрацию конечного конъюгата трастузумаб-23 при 0,84 мг/мл в 15 мл, полученная масса конъюгата трастузумаб-23 составила 12,7 мг (выход 84%).

Конъюгат трастузумаб-40

50 мМ раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4 (PBS) добавляли трастузумаб (50 молярных эквивалентов/антитело, 50 микромоль, 1,0 мл) к 34,5 мл раствора антитела (150 мг, 1,0 микромоль) в восстанавливающем буфере, содержащем PBS и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) с конечной концентрациейю антитела 4,35 мг/мл. Восстанавливающую смесь нагревали при +37°С в течение 3 часов (или до полного восстановления, по данным УВЭЖХ) в инкубаторе при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании. После охлаждения до комнатной температуры в восстановленном антителе, посредством центрифугирования на спиновом фильтре, заменяли буфер на буфер повторного окисления, содержащий PBS и 1 мМ ЭДТК, для удаления избытка восстановительного агента. Добавляли 50 мМ раствор дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA, 50 молярных эквивалентов/антитело, 50 микромоль, 1,0 мкл) в ДМСО и оставляли смесь для повторного окисления взаимодействовать в течение 2 часов при комнатной температуре (или до полного повторного окисления цистеиновых тиолов с образованием межцепочечных цистеиновых дисульфидов, по данным УВЭЖХ) при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании с концентрацией антитела 2-3 мг/мл. Затем смесь повторного окисления стерильно отфильтровывали и разбавляли буфером для конъюгирования, содержащим PBS, 1 мМ ЭДТК, до конечной концентрации антитела ~1,5 мг/мл. Соединение 40 добавляли в виде раствора в ДМСО (10 молярных эквивалентов/антитело, 1 микромоль в 0,9 мл ДМСО) к 9 мл полученного раствора повторно окисленного антитела (15 мг, 100 наномоль). Раствор перемешивали в течение 1,25 часа при комнатной температуре, после чего реакцию конъюгирования останавливали добавлением N-ацетилцистеина (4 микромоль, 40 мкл при 100 мМ) и разбавляли до >50 мл в PBS. Смесь для конъюгирования очищали спиновым фильтрованием с использованием 15 мл спинового фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно фильтровали, анализировали и хранили при +4°С. Стадии восстановления и повторного окисления контролировали посредством сравнения относительных количеств отдельных легких и тяжелых цепей с полноразмерным антителом, по данным УВЭЖХ анализа, на системе Shimadzu Prominence, используя колонку Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150×2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила. УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150 мм × 2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила на восстановленном образце конъюгата трастузумаб-В при 280 нм и 330 нм (специфического в отношении соединения 40), показал неконъюгированные легкие цепи и смесь неконъюгированных тяжелых цепей, а также тяжелые цепи, присоединенные к одной молекуле соединения 40, что согласуется с отношением лекарства к антителу (DAR), составляющим 1,68 молекулы соединения 40 на одно антитело.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм 4,6×150 мм (с защитной колонкой 4 мкм 3,0×20 мм), элюируя со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованного буфера SEC, содержащего 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.), на образце конъюгата трастузумаб-40 при 280 нм, показал чистоту мономера 93%, а примеси не обнаружены. SEC анализ УВЭЖХ показал концентрацию конечного конъюгата трастузумаб-В 0,74 мг/мл в 17 мл, полученная масса конъюгата трастузумаб-40 составила 12,5 мг (выход 83%).

Конъюгат R347-23

50 мМ раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4 (PBS) добавляли (42 молярных эквивалента/антитело, 56 микромоль, 1,12 мл при 50 мМ) к 14,09 мл раствора антитела (200 мг, 1,33 микромоль) в восстанавливающем буфере, содержащем PBS и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) с конечной концентрацией антитела 4,0 мг/мл. Восстанавливающую смесь нагревали при +25°С в течение 24 часов (или до полного восстановления, по данным УВЭЖХ) в инкубаторе при умеренном (<100 об./мин.) встряхивании. После охлаждения до комнатной температуры в восстановленном антителе, с помощью установки тангенциальной проточной фильтрации (TFF), используя mPES, волоконный фильтр MidiKros^® 30 кДа с площадью поверхности 115 см², заменяли буфер на буфер повторного окисления, содержащий PBS с рН 7,4 и 1 мМ ЭДТК, для удаления избытка восстановительного агента. Восстановленное антитело центрифугировали в течение 3 минут при 4000 об./мин., а затем фильтровали с использованием мембранного фильтра 0,45 мкм. Добавляли 50 мМ раствор дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA, 15 молярных эквивалентов/антитело, 20 микромоль, 400 мкл при 50 мМ) в ДМСО и оставляли смесь для повторного окисления взаимодействовать в течение 16 часов при комнатной температуре при умеренном (<100 об./мин.) встряхивании с концентрацией антитела 2,5 мг/мл (или до полного повторного окисления цистеиновых тиолов с образованием межцепочечных цистеиновых дисульфидов, по данным УВЭЖХ). Смесь для повторного окисления центрифугировали в течение 3 минут при 4000 об./мин., а затем стерильно фильтровали с использованием мембранного фильтра 0,2 мкм. Соединение 23 добавляли в виде раствора в ДМСО (10 молярных эквивалентов/антитело, 13,3 микромоль в 6,6 мл ДМСО) к 80 мл полученного раствора повторно окисленного антитела (200 мг, 1,33 микромоль) до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.). Раствор встряхивали в течение 3 часов при +25°С, а затем останавливали конъюгирование с помощью N-ацетилцистеина (72,3 микромоль, 0,72 мл при 100 мМ).

Избыток свободного лекарства удаляли с помощью установки тангенциальной проточной фильтрации (TFF), используя mPES, волоконный фильтр MidiKros^® 30 кДа с площадью поверхности 115 см², на буфер, содержащий PBS с рН 7,4. Степень удаления свободного лекарства контролировали с помощью ОФ-УВЭЖХ, используя неразбавленный конъюгат. После полного удаления свободного лекарственного соединения ADC составляли в лекарственную форму с 25 мМ гистидина, 200 мМ сахарозы, рН 6,0, с помощью TFF, используя mPES, волоконный фильтр MidiKros^® 30 кДа с площадью поверхности 115 см². Весь процесс конъюгирования R347 с соединением 23 повторяли с использованием 400 мг антитела и также очищали с помощью TFF. ADC обеих партий объединяли, а затем фильтровали с использованием фильтра Mustang в стерильной атмосфере, а затем хранили далее при -78°С.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150 мм × 2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила на восстановленном образце конъюгата при 214 нм и 330 нм (специфического в отношении соединения 23), показал смесь легких и тяжелых цепей, присоединенных к нескольким молекулам соединения 23, что согласуется с отношением лекарства к антителу (DAR), составляющим 1,71 молекулы соединения 23 на одно антитело.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм 4,6×150 мм (с защитной колонкой 4 мкм 3,0×20 мм), элюируя со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованного буфера SEC, содержащего 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.), на образце ADC при 280 нм, показал чистоту мономера более 97%. SEC анализ УВЭЖХ показал концентрацию конечного ADC при 1,92 мг/мл в 265 мл, полученная масса ADC составила 509 мг (выход 85%).

Конъюгат R347-40

50 мМ раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4 (PBS) добавляли (50 молярных эквивалентов/антитело, 20 микромоль, 0,4 мл) к 13,25 мл раствора антитела (60 мг, 0,4 микромоль) в восстанавливающем буфере, содержащем PBS и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) с конечной концентрацией антитела 4,5 мг/мл. Восстанавливающую смесь нагревали при +37°С в течение 3 часов (или до полного восстановления, по данным УВЭЖХ) в инкубаторе при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании. После охлаждения до комнатной температуры в восстановленном антителе, посредством центрифугирования на спиновом фильтре, заменяли буфер на буфер повторного окисления, содержащий PBS и 1 мМ ЭДТК, для удаления избытка восстановительного агента. Добавляли 50 мМ раствор дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA, 12 молярных эквивалентов/антитело, 4,8 микромоль, 96 мкл) в ДМСО и оставляли смесь для повторного окисления взаимодействовать в течение 17 часов при комнатной температуре (или до полного повторного окисления цистеиновых тиолов с образованием межцепочечных цистеиновых дисульфидов, по данным УВЭЖХ) при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании с концентрацией антитела ~1,6 мг/мл. Затем смесь повторного окисления стерильно отфильтровывали и разбавляли буфером для конъюгирования, содержащим PBS, 1 мМ ЭДТК, до конечной концентрации антитела ~1,5 мг/мл. Соединение 40 добавляли в виде раствора в ДМСО (11 молярных эквивалентов/антитело, 0,44 микромоль в 0,45 мл ДМСО) к 4,05 мл полученного раствора повторно окисленного антитела (6 мг, 40 наномоль). Раствор перемешивали в течение 1,25 часа при комнатной температуре, после чего реакцию конъюгирования останавливали добавлением N-ацетилцистеина (1,76 микромоль, 17,6 мкл при 100 мМ). Смесь для конъюгирования очищали спиновым фильтрованием с PBS, с использованием 15 мл спинового фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно фильтровали, анализировали и хранили при +4°С.

Стадии восстановления и повторного окисления контролировали посредством сравнения относительных количеств отдельных легких и тяжелых цепей с полноразмерным антителом, по данным УВЭЖХ анализа, на системе Shimadzu Prominence, используя колонку Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150×2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила. УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150 мм × 2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила на восстановленном образце конъюгата R347-40 при 280 нм и 330 нм (специфического в отношении конъюгата 40), показал неконъюгированные легкие цепи и смесь неконъюгированных тяжелых цепей, а также тяжелые цепи, присоединенные к одной молекуле соединения 40, что согласуется с отношением лекарства к антителу (DAR), составляющим 1,86 молекулы соединения 40 на одно антитело.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5 мкм 7,8×300 мм (с защитной колонкой 7 мкм 6,0×40 мм), элюируя стерильно отфильтрованным буфером SEC, содержащим 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.), на образце конъюгата R347-40 при 280 нм, показал чистоту мономера 97%, а примеси не обнаружены. SEC анализ УВЭЖХ показал концентрацию конечного конъюгата R347-40 при 0,87 мг/мл в 5,5 мл, полученная масса конъюгата R347-40 составила 4,8 мг (выход 80%).

Конъюгат HLL2-23

50 мМ раствор DTT (дитиотреитола) в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4 (PBS) добавляли (40 молярных эквивалентов/антитело, 40 микромоль, 825 мкл) к 37,5 мл раствора антитела HLL2 (150 мг, 1 микромоль) в восстанавливающем буфере, содержащем PBS и 1 мМ этиле ндиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) с конечной концентрацией антитела 4 мг/мл. Восстановительную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи при умеренном (135 об./мин.) встряхивании. В восстановленном антителе меняли буфер на PBS+1 мМ ЭДТК (для удаления избытка DTT) с помощью TFF (устройство тангенциальной проточной фильтрации, половолоконная кассета Spectrum Labs с площадью поверхности 115 см² с номинальным отсечением по молекулярной массе 50 кДа). Образец фильтровали, используя шприц-фильтр 0,4 мкм, для удаления дебриса со стадии TFF, и доводили концентрацию антитела до 1,5 мг/мл перед повторным окислением. Добавляли 50 мМ раствор дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA, 15 молярных эквивалентов/антитело, 13,9 микромоль, 0,28 мл) в ДМСО и оставляли смесь для повторного окисления взаимодействовать в течение 16 часов при комнатной температуре при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании. Затем смесь для повторного окисления стерильно фильтровали; получали 139 мг антитела (92,6 мл в виде раствора 1,5 мг/мл), 14 мл которого использовали для конъюгирования с соединением 23 (приблизительно 21 мг антитела, 0,14 микромоль). Соединение 23 добавляли в виде раствора в ДМСО (10 молярных эквивалентов/антитело, 0,33 микромоль в 0,133 мл ДМСО) к 14 мл полученного раствора повторно окисленного антитела. К смеси для конъюгирования добавляли 1,27 мл ДМСО для доведения конечной концентрации ДМСО до 10% (об./об.) и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре при умеренном встряхивании (135 об./мин.). Затем удаляли свободное лекарственное соединение из конъюгата антитело-лекарственное соединение посредством тщательной диафильтрации в PBS с использованием спинового фильтровального устройства (центробежный фильтр Amicon Ultra-30K, Millipore). Полученную конъюгационную смесь стерильно фильтровали и анализировали с помощью УВЭЖХ.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150 мм × 2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила на восстановленном образце конъюгата при 214 нм (ADC) и 330 нм (специфического в отношении соединения 23), показал смесь тяжелых цепей, конъюгированных или присоединенных к 1 молекуле соединения 23, что согласуется с отношением лекарства к антителу (DAR), составляющим 1,64 молекулы соединения 23 на одно антитело.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм 4,6×150 мм (с защитной колонкой 4 мкм 3,0×20 мм), элюируя со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованного буфера SEC, содержащего 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.), на образце ADC при 280 нм, показал чистоту мономера более 97%. SEC анализ УВЭЖХ показал концентрацию конечного ADC при 2,06 мг/мл в 10 мл, полученная масса ADC составила 20,6 мг.

Конъюгат анти-CD79b-23

50 мМ раствор DL-дитиотреитола (DTT) в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4 (PBS) добавляли (80 молярных эквивалентов/антитело, 53,3 микромоль, 1,07 мл) к 25 мл раствора антитела CD79b (100 мг, 667 нмоль) в восстанавливающем буфере, содержащем PBS и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) с конечной концентрацией антитела 4 мг/мл. Восстановительную смесь оставляли взаимодействовать при комнатной температуре в течение ночи при умеренном встряхивании. В восстановленном антителе, посредством центрифугирования на спиновом фильтре, заменяли буфер на буфер повторного окисления, содержащий PBS и 1 мМ ЭДТК, для удаления избытка восстановительного агента. Добавляли 50 мМ раствор дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA, 15 молярных эквивалентов/антитело, 9,28 микромоль, 185 мкл) в ДМСО и оставляли смесь для повторного окисления взаимодействовать в течение 16 часов при комнатной температуре при умеренном (<150 об./мин.) встряхивании. Затем смесь для повторного окисления стерильно фильтровали; соединение 23 добавляли в виде раствора в ДМСО (15 молярных эквивалентов/антитело, 1,8 микромоль в 1,0 мл ДМСО) к 9 мл полученного раствора повторно окисленного антитела (18 мг, 120 наномоль) до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.) и конечной концентрации антитела 1,8 мг/мл в PBS + 1 мМ ЭДТК. Раствор перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре при умеренном встряхивании (135 об./мин.), затем прекращали конъюгирование посредством добавления N-ацетилцистеина (7,2 микромоль, 72 мкл при 100 мМ), затем очищали спиновым фильтрованием с использованием 15 мл спинового фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно фильтровали и анализировали.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Phenomenex Aeris 3,6 мкм ХВ-С18 150 мм × 2,1 мм, элюируя градиентом воды и ацетонитрила на восстановленном образце конъюгата при 280 нм (ADC) и 330 нм (специфического в отношении соединения 23), показал неконъюгированные легкие цепи и смесь неконъюгированных тяжелых цепей, а также тяжелые цепи, присоединенные к 1 или 2 молекулам соединения 23, что согласуется с отношением лекарства к антителу (DAR), составляющим 2,08 молекулы соединения 23 на одно антитело.

УВЭЖХ анализ на системе Shimadzu Prominence, который проводили с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм 4,6×150 мм (с защитной колонкой 4 мкм 3,0×20 мм), элюируя со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованного буфера SEC, содержащего 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.), на образце ADC при 280 нм, показал чистоту мономера более 98%. SEC анализ УВЭЖХ показал концентрацию конечного ADC при 1,62 мг/мл в 7,6 мл, полученная масса ADC составила 12,28 мг.

Пример 5 - in vitro испытание

Среду из субконфлюэнтной (конфлюэнтность 80-90%) клеточной культуры в колбе Т75 аспирировали и промывали колбу PBS (около 20 мл) и опустошали. Добавляли трипсин-ЭДТК (5 мл), колбу возвращали в насыщенный газом инкубатор при 37°С примерно на 5 минут, затем резко постукивали для отделения осадка и открепления клеток от пластика. Клеточную суспензию переносили в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл с винтовой крышкой, разбавляли средой для роста до конечного объема 15 мл, затем центрифугировали (400g в течение 5 минут). Надоеадочный раствор аспирировали и повторно суспендировали осадок в 10 мл культуральной среды. Может потребоваться повторный отбор пипеткой для получения монодисперсной клеточной суспензии. Концентрацию и жизнеспособность клеток измеряли на клетках, окрашенных трипановым синим, с помощью гемоцитометра. Клетки разбавляли до 2×10⁵/мл, распределяли (50 мкл/лунка) в 96-луночные плоскодонные планшеты и инкубировали в течение ночи перед использованием.

Исходный раствор (1 мл) конъюгата антитело-лекарственное соединение (ADC) (20 мкг/мл) получали разбавлением стерилизованного через фильтр ADC в среде для клеточных культур. Серию 8×10-кратных разбавлений исходного ADC проводили в 24-луночном планшете посредством серийного переноса 100 мкл в 900 мкл среды для клеточных культур.

Разбавленный ADC распределяли (50 мкл/лунка) в 4 экземплярах в лунки 96-луночного планшета, содержащие 50 мкл клеточной суспензии, высеянной в предыдущий день. В контрольные лунки помещали 50 мкл среды для клеточных культур.

96-луночный планшет, содержащий клетки и ADC, инкубировали при 37°С в насыщенном СО₂ инкубаторе в течение времени воздействия.

По окончании периода инкубации измеряли жизнеспособность клеток с помощью анализа MTS. MTS (Promega) помещали (20 мкл на лунку) в каждую лунку и инкубировали в течение 4 часов при 37°С в насыщенном CO₂ инкубаторе. Поглощение в лунках измеряли при 490 нм. Процентное выживание клеток рассчитывали по среднему поглощению в 4 лунках, обработанных ADC, в сравнении со средним поглощением в 4 контрольных, необработанных лунках (100%). IC₅₀ определяли по данным зависимости ответа от дозы с помощью GraphPad Prism, используя алгоритм нелинейного сглаживания кривой: сигмоидальная, 4PL Х представляет собой log(концентрации).

Испытание анти-CD79b-23

Концентрацию и жизнеспособность клеток из субконфлюентной (конфлюентность 80-90%) клеточной культуры в колбе Т75 измеряли посредством окрашивания трипановым синим и подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток LUNA-II™. Клетки разбавляли до 2×10⁵/мл, распределяли (50 мкл/лунка) в 96-луночные плоскодонные планшеты.

Исходный раствор (1 мл) конъюгата антитело-лекарственное соединение (ADC) (20 мкг/мл) получали разбавлением стерилизованного через фильтр ADC в среде для клеточных культур. Серию 8×10-кратных разбавлений исходного ADC проводили в 24-луночном планшете посредством серийного переноса 100 мкл в 900 мкл среды для клеточных культур. Разбавленный ADC распределяли (50 мкл/лунка) в 4 экземплярах в лунки 96-луночного планшета, содержащие 50 мкл клеточной суспензии, высеянной ранее. В контрольные лунки помещали 50 мкл среды для клеточных культур. 96-луночный планшет, содержащий клетки и ADC, инкубировали при 37°С в насыщенном CO₂ инкубаторе в течение времени воздействия.

По окончании периода инкубации измеряли жизнеспособность клеток с помощью анализа MTS. MTS (Promega) помещали (20 мкл на лунку) в каждую лунку и инкубировали в течение 4 часов при 37°С в насыщенном CO₂ инкубаторе. Поглощение в лунках измеряли при 490 нм. Процентное выживание клеток рассчитывали по среднему поглощению в 4 лунках, обработанных ADC, в сравнении со средним поглощением в 4 контрольных, необработанных лунках (100%). IC₅₀ определяли по данным зависимости ответа от дозы с помощью GraphPad Prism, используя алгоритм нелинейного сглаживания кривой: сигмоидальная кривая зависимости ответа от дозы с переменным углом наклона.

Время инкубации ADC составляло 4 дня с WSUDLCL2 (В-клеточная неходжкинская лимфома) и SUDHL4 (В-лимфоциты), 5 дней для Granta519 (В-клеточная неходжкинская лимфома) и 6 дней для BJAB (лимфома Беркитта). WSUDLCL2 и SUDHL4 выращивали в среде RPMI 1640 с Glutamax + 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки HyClone™, Granta519 в DMEM + Glutamax с 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки HyClone™ и BJAB в RPMI 1640 + Glutamax с 20% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки HyClone™.

Пример 6

Мыши

Возраст самок мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (Fox Chase SCID®, С1-17/Icr-Prkdcscid, Charles River) составлял десять недель, диапазон массы тела (BW) от 16,2 до 21,9 г на 1 день исследования. Животных обеспечивали водой ad libitum (обратный осмос, 1 м.д. Cl) и модифицированным кормом NIH 31, а также облученным кормом Lab Diet®, состоящим из 18,0% неочищенного белка, 5,0% неочищенного жира и 5,0% неочищенного волокна. Мышей содержали на подстилке для лабораторных животных Enricho'cobs™ в статических микроизоляторах с 12-часовым циклом освещения при 20-22°С (68-72°F) и влажности 40-60%. Компания CR Discovery Services, в частности, действует в соответствии с рекомендациями Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных в отношении обездвиживания, содержания, хирургических операций и регуляции обеспечения корма и жидкости, а также ветеринарного ухода. Программа по содержанию и использованию животных в компании CR Discovery Services аккредитована Международной ассоциацией по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC), что гарантирует соблюдение принятых стандартов по содержанию и использованию лабораторных животных.

In Vivo имплантация и рост опухоли

Ксенотрансплантаты получали из карцином молочной железы человека ВТ474, хранящихся в компании CR Discovery Services, посредством серийной подкожной трансплантации мышам SCID (см. выше). В день имплатации опухоли каждой экспериментальной мыши вводили 1 мм³ фрагмента ВТ474, который имплантировали подкожно в правый бок, и контролировали рост опухоли по среднему размеру, приближающемуся к требуемому диапазону от 100 до 150 мм³. Через тридцать три дня после имплантации опухоли, в день, обозначенный как 1 день исследования, животных разделяли на девять групп, каждая из которых состояла из десяти мышей с объемом опухоли у каждой от 75 до 144 мм³, и средний объем опухоли в группе составлял 111-112 мм³. Опухоли измеряли в двух направлениях с помощью штангенциркуля и рассчитывали объем по формуле:

где w = ширина и = длина опухоли в мм. Массу опухоли можно оценить при допущении, что 1 мг эквивалентен 1 мм³ объема опухоли.

Лечение 1

Лечение начинали на 1 день в группах мышей (n=10) с развившимися подкожными опухолями ВТ474 (75-196 мм³). Трастузумаб-23 вводили внутривенно однократно на 1 день (qd x 1) в двух дозах (0,3 и 1 мг/кг). Группу, которую лечили носителем, использовали в качестве контрольной группы для анализа эффективности. Опухоли измеряли два раза в неделю до окончания исследования на 60 день. Каждую мышь усыпляли по достижении конечного объема опухоли 800 мм³ или до последнего дня, в зависимости от того, что наступит раньше. Для каждой мыши рассчитывали время до конечной точки (ТТЕ).

Результат лечения определяли по процентной отсрочке роста опухоли (%TGD), которую рассчитывали как процентное увеличение среднего ТТЕ у мышей, проходивших лечений, по сравнению с контрольными мышами, и разность между группами считали статистически значимой при Р≤0,05 с использованием логрангового анализа выживания. Мышей контролировали по ответу полной регрессии (CR) и частичной регрессии (PR).

Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением. Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением. Все схемы были приемлемо переносимыми.

Среднее ТТЕ для контрольных мышей, которых лечили носителем, составляло 44,4 дня, что соответствует максимально возможной TGD 15,6 дня (35%) для 60-дневного исследования. Схемы введения ADC обеспечивали максимально возможную TGD, обеспечивали преимущество выживания, которое было статистически достоверно отлично от контрольных мышей, которых лечили носителем (Р<0,01), и не может быть определено на основании логрангового анализа (Р>0,05). Различия в группах лечения ADC были заметными только по MTV в последний день и по количеству и типу ответов регрессии, вызываемых каждой схемой.

Трастузумаб-23 в дозе 1 мг/кг вызвал четыре частичные регрессии (PR). Результаты представлены на Фиг. 1.

Лечение 2

Лечение начинали на 1 день в группах мышей (n=9 или 10) с развившимися подкожными опухолями ВТ474 (108-196 мм³). Трастузумаб-40 вводили внутривенно однократно на 1 день (qd х 1) в двух дозах (0,3 и 1 мг/кг). Группу, которую лечили носителем, использовали в качестве контрольной группы для анализа эффективности. Опухоли измеряли два раза в неделю до окончания исследования на 62 день. Каждую мышь усыпляли по достижении конечного объема опухоли 1000 мм³ или до последнего дня, в зависимости от того, что наступит раньше. Для каждой мыши рассчитывали время до конечной точки (ТТЕ).

Результат лечения определяли по процентной отсрочке роста опухоли (%TGD), которую рассчитывали как процентное увеличение среднего ТТЕ у мышей, проходивших лечений, по сравнению с контрольными мышами, и разность между группами считали статистически значимой при Р≤0,05 с использованием логрангового анализа выживания. Мышей контролировали по ответу полной регрессии (CR) и частичной регрессии (PR).

Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением. Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением.

Все схемы были приемлемо переносимыми. Среднее ТТЕ для контрольных мышей, которых лечили носителем, составляло 52,9 дня, что соответствует максимально возможной TGD 9,1 дня (17%) для 62-дневного исследования. Схемы лечения ADC обеспечивали максимально возможную TGD, однако лишь лечение с использованием 1 мг/кг обеспечивало преимущество выживания, которое было статистически достоверно отлично от контрольных мышей, которых лечили носителем (Р<0,001).

Трастузумаб-40 в дозе 1 мг/кг вызвал четыре частичные регрессии (PR) и одну полную регрессию (CR), которая сохранялась в конце исследования как выживание без опухоли (TFS). Результаты представлены на Фиг. 2.

Пример 7

Культура опухолевых клеток

Клетки карциномы-лимфомы желудка человека NCI-N87 выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл сульфата стрептомицина и 25 мкг/мл гентамицина. Клетки выращивали в колбах для тканевых культур в увлажненном инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха.

In Vivo имплантация и рост опухоли

Клетки NCI-N87, использованные для имплантации, собирали на логарифмической фазе роста и повторно суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), содержащем 50% Matrigel™ (BD Biosciences). В день имплантации опухоли каждой экспериментальной мыши (мыши SCID, как в примере 6) в правый бок вводили подкожную инъекцию 1×10⁷ клеток (0,1 мл клеточной суспензии) и контролировали рост опухоли по среднему размеру, приближающемуся в требуемому диапазону от 100 до 150 мм³. Через одиннадцать дней, в день, обозначенный как 1 день исследования, мышей разделяли на одиннадцать групп в соответствии с рассчитанным размером опухоли, и каждая группа состояла из десяти животных с размером опухоли у каждой из них от 88 до 144 мм³, и средний объем опухоли в группе составлял 119-121 мм³. Опухоли измеряли в двух направлениях с помощью штангенциркуля и рассчитывали объем по формуле:

где w = ширина и = длина опухоли в мм. Массу опухоли можно оценить при допущении, что 1 мг эквивалентен 1 мм³ объема опухоли.

Лечение 1

Лечение начинали на 1 день в группах мышей (n=10) с развившимися подкожными опухолями NCI-N87 (88-144 мм³). Трастузумаб-23 вводили внутривенно однократно на 1 день (qd x 1) в двух дозах (0,3 и 1 мг/кг). Группу, которую лечили носителем, использовали в качестве контрольной группы для анализа эффективности. Опухоли измеряли два раза в неделю до окончания исследования на 81 день. Каждую мышь усыпляли по достижении конечного объема опухоли 800 мм³ или до последнего дня, в зависимости от того, что наступит раньше. Для каждой мыши рассчитывали время до конечной точки (ТТЕ).

Результат лечения определяли по процентной отсрочке роста опухоли (%TGD), которую рассчитывали как процентное увеличение среднего ТТЕ у мышей, проходивших лечений, по сравнению с контрольными мышами, и разность между группами считали статистически значимой при Р≤0,05 с использованием логрангового анализа выживания. Мышей контролировали по ответу полной регрессии (CR) и частичной регрессии (PR).

Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением. Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением. Все схемы были приемлемо переносимыми.

Среднее ТТЕ для контрольных мышей, которых лечили носителем, составляло 53,4 дня, что соответствует максимально возможной TGD 27,6 дня (52%) для 81-дневного исследования. Трастузумаб-23, испытанный в дозе 1 мг/кг, обеспечивал преимущество выживания, которое было статистически достоверно отлично от контрольных мышей, которых лечили носителем (Р<0,001), и приводил к максимально возможной TGD. При 0,3 мг/кг среднее ТТЕ составляло 80,5 дня, что соответствует TGD 27,1 дня (51%).

Трастузумаб-23 в дозе 1 мг/кг вызвал одну частичную регрессию (PR). Результаты представлены на Фиг. 3.

Лечение 2

Лечение начинали на 1 день в группах мышей (n=10) с развившимися подкожными опухолями NCI-N87 (75-126 мм³). Трастузумаб-40 вводили внутривенно однократно на 1 день (qd x 1) в двух дозах (0,3 и 1 мг/кг). Группу, которую лечили носителем, использовали в качестве контрольной группы для анализа эффективности. Опухоли измеряли два раза в неделю до окончания исследования на 83 день. Каждую мышь усыпляли по достижении конечного объема опухоли 800 мм³ или до последнего дня, в зависимости от того, что наступит раньше. Для каждой мыши рассчитывали время до конечной точки (ТТЕ).

Результат лечения определяли по процентной отсрочке роста опухоли (%TGD), которую рассчитывали как процентное увеличение среднего ТТЕ у мышей, проходивших лечений, по сравнению с контрольными мышами, и разность между группами считали статистически значимой при Р≤0,05 с использованием логрангового анализа выживания. Мышей контролировали по ответу полной регрессии (CR) и частичной регрессии (PR). Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением. Переносимость лечения оценивали посредством измерения массы тела и частоты наблюдения признаков побочных эффектов, связанных с лечением. Все схемы были приемлемо переносимыми.

Среднее ТТЕ для контрольных мышей, которых лечили носителем, составляло 44,9 дня, что соответствует максимально возможной TGD 38,1 дня (85%) для 83-дневного исследования. Трастузумаб-40 (0,3 мг/кг) демонстрировал среднее ТТЕ 54,2 дня, что соответствует TGD 9,3 дня (21%). Трастузумаб-40 (1 мг/кг) демонстрировал среднее ТТЕ 61,6 дня, что соответствует TGD 16,7 дня (37%).

Результаты представлены на Фиг. 4.

Пример 8 - испытания токсичности/терапевтический индекс Исследование на крысах:

Использовали исследование токсичности однократной дозы для определения максимально переносимой дозы (MTD) и профиля безопасности конъюгата трастузумаб-23. Самцам крыс Спрага-Доули (Harlan, Inc) вводили однократную болюсную внутривенную инъекцию через хвостовую вену, используя контрольный носитель (25 мМ гистидин-HCl, 7% сахарозы, 0,02% полисорбата 80, рН 6,0) или экспериментальное вещество (трастузумаб-23). В процессе исследования оценивали различные параметры, включая смертность, физические нагрузки, наблюдения поведения в клетке, массу тела, изменение массы тела, клиническую патологию (клинические химические анализы, гематологию и коагуляцию) и показатели макропатологии. Всех животных усыпляли на 29 день исследования (SD).

Контроль = 25 мМ гистидина-HCl, 7% сахарозы, 0,02% полисорбата 80, рН 6,0

Переносимость определяли на основании конечных критериев токсичности, включая снижение массы тела (>10%) и угнетение костного мозга. На основании минимальных неблагоприятных наблюдений при высокой дозе, определяли максимально переносимую дозу (MTD) у крыс после однократной дозы трастузумаба-23, которая составляла >7 мг/кг и была наивысшей из проверенных доз.

Терапевтический индекс

Терапевтический индекс можно рассчитать делением максимально переносимой однократной дозы (MTD) неприцельного ADC у крыс на минимально эффективную однократную дозу (MED) прицельного ADC. MED представляет собой однократную дозу, необходимую для достижения стаза опухоли в модели in vivo через 28 дней (для ксенотрансплантата NCI-N87).

Так, для конъюгатов соединения 23 терапевтический индекс представляет собой MTD, составляющую более 7 мг/кг, деленную на MED, составляющую менее 1 мг/кг (см. Фиг. 3 через 28 дней), в результате чего терапевтический индекс составляет более 7.

Исследование на яванских макаках:

Исследование токсичности однократной дозы проводили на самцах яванских макак (Масаса fascicularis) из Камбоджи после однократной внутривенной (IV) болюсной инъекции ADC-SG3400. Исследование проводили в 2 фазы. На 1 фазе животным (n=1) вводили дозу 1, 3 или 6 мг/кг для определения оптимального уровня дозы для использования на 2 фазе. Животным медленно вводили болюсную внутривенную инъекцию через подкожную вену, используя контрольный носитель (25 мМ гистидина, 20 мМ сахарозы, рН 6,0) или экспериментальное вещество (трастузумаб-23). На основании наблюдений существенного снижения массы тела при дозе 6 мг/кг, для 2 фазы исследования выбирали уровень дозы 4,5 мг/кг. На 2 фазе животным (n=3) на 1 день вводили однократную дозу 4,5 мг/кг конъюгата трастузумаб-23 и вскрывали труп животного на 71 или 72 день.

Переносимость определяли на основании конечных критериев токсичности, включая снижение массы тела (>10%) и угнетение костного мозга. У животных, которым вводили трастузумаб-23, не наблюдали незапланированную гибель. Главными наблюдениями было снижение массы тела и угнетение костного мозга в максимально испытанной дозе 6 мг/кг.На основании полученных данных и минимальных признаков токсичности при следующей наименьшей дозе, MTD конъюгата трастузумаб-23 у яванских макак составила 4,5 мг/кг.

Все документы и другие ссылки, упомянутые выше, включены в данный документ посредством ссылки.

1. Конъюгат формулы I:

L - (D^L)_p (I)

где L представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент к опухолеассоциированному антигену, D^L представляет собой звено, представляющее собой лекарственное соединение-линкер формулы II:

где

либо:

(a) R¹⁰ и R¹¹ образуют двойную азот-углеродную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны; либо

(b) R¹¹ представляет собой OH и R¹⁰ представляет собой:

;

p представляет собой целое число от 1 до 20.

2. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что D^L представляет собой D^L-A:

.

3. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что D^L представляет собой D^L-B:

.

4. Конъюгат по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что антитело или антиген-связывающий фрагмент представляет собой антитело, которое связывается с одним или более опухолеассоциированными антигенами или рецепторами клеточной поверхности, выбранными из (1)-(88):

(1) BMPR1B;

(2) E16;

(3) STEAP1;

(4) 0772P;

(5) MPF;

(6) Napi3b;

(7) Sema 5b;

(8) PSCA hlg;

(9) ETBR;

(10) MSG783;

(11) STEAP2;

(12) TrpM4;

(13) CRIPTO;

(14) CD21;

(15) CD79b;

(16) FcRH2;

(17) HER2;

(18) NCA;

(19) MDP;

(20) IL20R-альфа;

(21) Brevican;

(22) EphB2R;

(23) ASLG659;

(24) PSCA;

(25) GEDA;

(26) BAFF-R;

(27) CD22;

(28) CD79a;

(29) CXCR5;

(30) HLA-DOB;

(31) P2X5;

(32) CD72;

(33) LY64;

(34) FcRH1;

(35) IRTA2;

(36) TENB2;

(37) PSMA – FOLH1;

(38) SST;

(38.1) SSTR2;

(38.2) SSTR5;

(38.3) SSTR1;

(38.4)SSTR3;

(38.5) SSTR4;

(39) ITGAV;

(40) ITGB6;

(41) CEACAM5;

(42) MET;

(43) MUC1;

(44) CA9;

(45) EGFRvIII;

(46) CD33;

(47) CD19;

(48) IL2RA;

(49) AXL;

(50) CD30 - TNFRSF8;

(51) BCMA - TNFRSF17;

(52) CT Ags – CTA;

(53) CD174 (Льюис Y) - FUT3;

(54) CLEC14A;

(55) GRP78 – HSPA5;

(56) CD70;

(57) Специфические антигены стволовых клеток;

(58) ASG-5;

(59) ENPP3;

(60) PRR4;

(61) GCC – GUCY2C;

(62) Liv-1 – SLC39A6;

(63) 5T4;

(64) CD56 – NCMA1;

(65) CanAg;

(66) FOLR1;

(67) GPNMB;

(68) TIM-1 – HAVCR1;

(69) RG-1/Мишень опухоли предстательной железы Mindin – Mindin/RG-1;

(70) B7-H4 – VTCN1;

(71) PTK7;

(72) CD37;

(73) CD138 – SDC1;

(74) CD74;

(75) Клаудины – CL;

(76) EGFR;

(77) Her3;

(78) RON - MST1R;

(79) EPHA2;

(80) CD20 – MS4A1;

(81) Тенасцин C – TNC;

(82) FAP;

(83) DKK-1;

(84) CD52;

(85) CS1 - SLAMF7;

(86) Эндоглин – ENG;

(87) Аннексин A1 – ANXA1;

(88) V-CAM (CD106) - VCAM1.

5. Конъюгат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что антитело или антиген-связывающий фрагмент представляет собой антитело со сконструированным цистеином.

6. Конъюгат по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что p представляет собой целое число от 1 до 8.

7. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что p равен 1, 2, 3 или 4.

8. Композиция для лечения пролиферативных заболеваний, содержащая смесь конъюгатов по любому из пп. 1-7, в которой среднее значение p в указанной смеси соединений-конъюгатов составляет от примерно 1 до примерно 8.

9. Фармацевтическая композиция для лечения пролиферативных заболеваний, содержащая конъюгат по любому из пп. 1-7, содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное вещество.

10. Конъюгат по любому из пп. 1-7 или фармацевтическая композиция по п. 9 для применения при лечении пролиферативного заболевания у субъекта.

11. Конъюгат для применения по п. 10, отличающийся тем, что заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак.

12. Применение конъюгата по любому из пп. 1-7 или фармацевтической композиции по п. 9 в способе медицинского лечения, причем способ медицинского лечения предназначен для лечения рака.

13. Способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 9 нуждающемуся в этом пациенту.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что в комбинации с указанным конъюгатом пациенту вводят химиотерапевтический агент.

15. Применение конъюгата по любому из пп. 1-7 в способе производства лекарственного средства для лечения пролиферативного заболевания.

16. Способ лечения млекопитающего, страдающего от пролиферативного заболевания, включающий введение эффективного количества конъюгата по любому из пп. 1-7 или фармацевтической композиции по п. 9.

17. Соединение формулы III:

где

либо:

(a) R¹⁰ и R¹¹ образуют двойную азот-углеродную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны; либо

(b) R¹¹ представляет собой OH и R¹⁰ представляет собой:

.

18. Соединение по п. 17, представляющее собой A:

.

19. Соединение по п. 17, представляющее собой B:

.

20. Способ синтеза конъюгата по любому из пп. 1-7, включающий стадию конъюгирования соединения по любому из пп. 17-19 с антителом или его антиген-связывающим фрагментом.