Способ преимплантационного генетического тестирования болезни канаван

Изобретение относится к области медицины. Предложена тест-система для диагностики патогенных вариантов в гене ASPA, связанных с болезнью Канаван. Изобретение обеспечивает создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов NC_000017.10:g.3392637G>T, NM_000049.2:c.634+1G>T, NC_000017.10:g.3402327C>A, NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp в гене ASPA с двойной системой детекции - прямой и косвенной. 1 пр.

 

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.

Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования болезни Канаван. Болезнь Канаван - аутосомно-рецессивное заболевание, связанное с нарушением развития мозга. Оно относится к группе лейкодистрофий. Болезнь Канаван встречается с частотой от 1:6000 до 1:14000 у евреев ашкенази и более редко в других популяциях. При этом болезнь Канаван является самым частым детским дегенеративным заболеванием. Это заболевание приводит к летаргии, вялости, слабому плачу, отсутствию контроля над головой, гипотонии плохому зрению, рвоте и судорогам. Первые симптомы появляются в возрасте примерно трех месяцев. Макроцефалия становится заметна к 6 месяцам, и к этому же возрасту неврологические нарушения приводят к полному отсутствию моторного развития или значительно его замедляют. Слепота развивается к возрасту 6-18 месяцев. Обмороки наблюдаются у примерно 50% пациентов. В зависимости от тяжести симптомов смерть может наступить в детстве, но легкие формы встречаются и у взрослых людей. При аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 25%.

К заболеванию болезнь Канаван могут приводить патогенные генетические варианты в гене ASPA (Aspartoacylase, Аспартоацилаза), располагающемся на хромосоме 17. Этот ген кодирует белок аспартоацилаза, дефицит которого приводит к накоплению N-ацетил-L-аспартата в мозге, вызывающему дисфункции олигодендроцитов и деградацию миелина в фосфолипидном слое аксонов.

ПГТ болезни Канаван проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) [Richards S et al, 2015] в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленными патогенными вариантами, обуславливающими этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО, эмбрионы без патогенных вариантов в компаунд-гетерозиготе и, следовательно, без риска развития заболевания.

Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (англ. Whole Genome Amplification, WGA), a также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.

Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ болезни Канаван, предложенное Yaron и коллегами [Yaron Y. et al., 2005], с помощью мультплексной гнездовой ПЦР в 2 раунда. Важным преимуществом предлагаемого нами подхода является использование не только прямой диагностики, но и использование косвенной диагностики с помощью анализа наследования аллелей полиморфных маркеров, сцепленных с патогенным вариантом. Такой подход позволяет повысить достоверность результата ПГТ-М за счет увеличения вероятности выявления случая ADO (allele drop-out) - выпадения аллеля вследствие недостаточной его амплификации - при непосредственном тесте на наличие патогенного варианта у эмбриона. Также использование косвенной диагностики является основой универсальности предлагаемой нами тест-системы, так как позволяет проводить ПГТ-М для любого патогенного варианта гене ASPА.

Представленный нами метод ПГТ болезни Канаван решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.

Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов (NC_000017.10:g.3392637G>T (NM_000049.2:c.634+1G>T), NC_000017.10:g.3402327C>A (NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp) в гене ASPA с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетических вариантов NC_000017.10:g.3392637G>T (NM_000049.2:c.634+1G>T), NC_000017.10:g.3402327C>A (NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp) однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию патогенного варианта методом ГЩР-ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов), основанным на разнице последовательности в сайте рестрикции у различных аллелей. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией. Для этого на расстоянии не более 3 Мб (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена ASPА в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы (маркеры), называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПНР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 14 STR локусов для гена ASPA: D17S1.7, D17S1.8, D17S654, D17S1.9, D17S2.1, D17S2.3, D17S2.8, D17S1828, D17S4.4, D17S4.6, D17S559, D17S4.7, D17S5.1, D17S5.2. Перечень последовательностей праймеров с указанием маркера или патогенного варианта, для которых использованы указанные праймеры (внешние праймеры обозначены как Fout (прямой праймер) и Rout (обратные праймер), а внутренние - как Fin (прямой паймер) и Rin (обратный праймер)) представлены в SEQ ID NO 1-50.

Комбинация прямой и косвенной диагностики проводится для повышения достоверности результата с учетом осложнений, типичных для проведения диагностики в условиях ПГТ. Для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР были использованы праймеры SEQ ID NO 1-50. Прямая диагностика подразумевает анализ наличия самого патогенного варианта с помощью метода ПЦР-ПДРФ. Косвенная диагностика позволяет проанализировать наследование молекулярно-генетических полиморфных маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом. Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п.н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п.н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига праймеров в каждой паре не отличается более, чем на 1°С.

Подготовительный этап ПГТ

На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mМ, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10 mМ каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton Х-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсии эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.

В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.

Полугнездовая ПЦР

Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1×PCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.

В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1×PCR буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5×RediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μM каждого праймера, 1U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130×l Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона).

Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расщипления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет детектировать однонуклеотидные варианты, если они располагаются в сайте рестрикции. Более точную детекцию патогенного варианта может обеспечить секвенирование по методу Сэнгера, однако в условиях ПГТ метод ПЦР-ПДРФ оказывается более эффективным из-за сниженной вероятность выпадения аллеля (allele drop out, ADO) и, как следствие, ошибочного результата по оценке статуса эмбриона по патогенному варианту.

Для детекции патогенных вариантов NC_000017.10:g.3392637G>T (NM_000049.2:c.634+1G>T), NC_000017.10:g.3402327C>A (NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp) была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры:

• Для варианта NC_000017.10:g.3392637G>T (NM_000049.2:c.634+lG>T)

Внешние праймеры:

5'-TGTTCTGCTTCACGTTTTGC-3' (Fout),

5'-TATCCTGGCCATTGGGGAAT-3' (Rout),

Внутренние праймеры:

5'-ТСAAGGGGTTCTGAGAGCTG-3' (fin),

5'-TTTGATAACGTTACCTTCATTATTAGTTA-3' (rin_mm_mut)

• Для варианта NC_000017.10:g.3402327C>A (NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp)

Внешние праймеры:

5'-TCCTGGGGATCCCATGTTTT-3' (Fout),

5'-ATGTGCTTAGATGCCTACCG-3' (Rout),

Внутренние праймеры:

5'-GATGGGAAGACGATCCCACT-3' (fin),

5'-AGATGCCTACCGAATAAGGC-3' (rin).

Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции патогенного варианта использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза Tru1I разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза HincII разрезает только мутантный аллель варианта NC_000017.10:g.3392637G>T (NM_000049.2:c.634+1G>T). Эндонуклеаза BsuRI разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза CseI разрезает только мутантный аллель варианта NC_000017.10:g.3402327C>A (NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp). Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.

Пример

Пациенты А

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой каждый из родителей являлся носителем одного из патогенных вариантов NC_000017.10:g.3392637G>T (NM_000049.2:c.634+1G>T) и NC_000017.10:g.3402327C>A (NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp) в гене ASPА. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания болезнь Канаван в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.

Гаплотипирование семьи

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 14 STR локусов. Из них 10 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам (аллели, указанные с одной стороны от символа «/», для разных маркеров располагаются на одной хромосоме, то есть составляют группу сцепления): партнер пациентки (носитель патогенного варианта ASPA с. 857С>А (p.Ala286Asp)): D17S1.8 - 170/175, D17S654 - 284/277, D17S1.9 - 160/175, D17S2.1 - 189/193, D17S2.3 - 216/225, ASPA - p.A286D/N, D17S1828 - 121/123, D17S4.6 - 359/355, D17S559 - 221/221, D17S4.7 - 185/185, D17S5.1 -277/273, пациентка (носитель патогенного варианта c.634+1G>T): D17S1.8 > 170/173, D17S654 - 284/277, D17S1.9 - 182/175, D17S2.1 - 191/189, D17S2.3 - 116/216, ASPA - N/c.634+1G>T, D17S1828 - 119/127, D17S4.6 - 359/363, D17S559 - 231/229, D17S4.7 - 185/179, D17S5.1 - 270/277, ребенок без заболевания (носитель патогенного варианта cp.A286D): D17S1.8 - 171/171, D17S654 - 284/284, D17S1.9 - 161/182, D17S2.1 - 189/191, D17S2.3 - 216/216, ASPA - p.A286D/N, D17S1828 - 121/119, D17S4.6 - 359/359, D17S559 -221/231, D17S4.7 - 185/185, D17S5.1 - 277/270, ребенок без заболевания (носитель патогенного варианта c.634+1G>T): D17S1.8 - 175/173, D17S654 - 277/277, D17S1.9 - 176/176, D17S2.1 - 193/189, D17S2.3 - 225/216, ASPA - N/c.634+1G>T, D17S1828 - 123/127, D17S4.6 - 355/363, D17S559 - 221/229, D17S4.7 - 185/179, D17S5.1 - 273/277.

Преимплантационное генетическое тестирование

В цикле ЭКО было получено 3 эмбриона, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1×PBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на первом этапе в мультиплексной ПНР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На втором этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты: эмбрион1: D17S1.8 - 170/173, D17S654 - 277D17S1.9 - 175, D17S2.1 - 193/189D17S2.3 - ADO/216, ASPA - N/c.634+1G>TD17S1828 - 123/127, D17S4.6 - 355/363D17S559 - 221/229, D17S4.7 - 185/179D17S5.1 - 273/277; эмбрион2: D17S1.8 - 170/173, D17S654 -284/277, D17S1.9 - 160/175, D17S2.1 - 189, D17S2.3 - 216, ASPA -p.A286D/c.634+1G>T, D17S1828 - 121/127, D17S4.6 - 359/363, D17S559 - 221/229, D17S4.7 - 185/179, D17S5.1 - 277; эмбрион3: D17S1.8 - 175/173, D17S654 - 277, D17S1.9 - 175, D17S2.1 - 193/189, D17S2.3 - 225/216, ASPA - N/c.634+1G>T, D17S1828 - 123/127, D17S4.6 - 355/363, D17S559 - 221/229, D17S4.7 - 185/179, D17S5.1 - 273/277.

По результатам прямой и косвенной диагностики 2 эмбриона не унаследовали заболевание, у 1 эмбриона выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию. С согласия родителей для эмбрионов, не унаследовавших заболевание, провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов 1 эмбрион были рекомендован к переносу.

Перечень последовательностей праймеров

внешние праймеры обозначены как Fout (прямой праймер) и Rout (обратные праймер), а внутренние - как Fin (прямой паймер) и Rin (обратный праймер

• D17S1.7
SEQ ID NO 1: 5’-TCAGGTGGGGATAAAGGTC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 2: 5’-TCCCACTAACCTCCCTCC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 3: 5’-*CCTGATCACGGACACATCAC-3’ (Fin);
SEQ ID NO : 4 5’-TCTTGTGTTCTCACCCCTGA-3’ (Rin)

• D17S1.8
SEQ ID NO 5: 5’-AGGCTGTCTGTTTCATGAGC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 6: 5’-TCTGGTCAGAGATATTGTGGG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 7: 5’-*CCAAGGGTCCTTCTAGCTCT-3’ (Fin)

• D17S654
SEQ ID NO 8 5’-ACCTTCCTCCTCTGGATCAC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 9 5’-GGTTGGCAAGACCACTGTTA-3’ (Rout);
SEQ ID NO 10 5’-*GCCTACCCACTTTGTGAGTTT-3’ (Rin)

• D17S1.9
SEQ ID NO 11 5’-TCTGGGTATTCGGAGACACT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 12 5’-TGGTGCTCTTTAACCTGCTC-3’ (Rout);
SEQ ID NO 13 5’-*TACACCCATCTACCACTGCTT-3’ (Rin)

• D17S2.1
SEQ ID NO 14 5’-CTGCAGTAACACCTGGAACTC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 15 5’-TCTGGACCCTGAAAACTCCT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 16 5’-CTGCAGGGAATGTCTCCAT-3’ (Fin);
SEQ ID NO 17 5’-*AGGATACCGGGAAGGTTTG-3’ (Rin)

• D17S2.3
SEQ ID NO 18 5’-ACTGGGGGACGTCTTCTAATA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 19 5’-TGCAAAGCGTTAGGCTCTC-3’ (Rout);
SEQ ID NO 20 5’-*ACAAGTTCAGGTTCAGACAGGT-3’ (Rin)

• D17S2.8
SEQ ID NO 21 5’-AGATGGAAAGTGGGGAGTG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 225’-CGGATTCATTCTCCCTTGA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 23 5’-*GGACAGCTTTTTGACCAGG-3’ (Fin)

• D17S1828
SEQ ID NO 24 5’-TCCTCTCCAGGCTGTGG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 25 5’-TAGAGAAGAGGTGGGTGGG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 26 5’-ACTCTTTTTGGAGATTCAGGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 27 5’-*CACAGGTGCACTCACAGATT-3’ (Rin)

• D17S4.4
SEQ ID NO 28 5’-TTGTCCATCCATCCAGCA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 29 5’-GTCTGAGGGAACACAAGCAG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 30 5’-CAGCCTAATGGCTGAGACAG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 31 5’-*AAAGGACAGAAGGAGTGGGA-3’ (Rin)

• D17S4.6
SEQ ID NO 32 5’-CCGGGCTATGGCCTATT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 33 5’-TCAGACTAGTGGACCTTTAGGCT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 34 5’-GCTCTCTAGCTGGCTGGTT-3’ (Fin);
SEQ ID NO 35 5’-*CTCCTTTATCTCTGCACACCTC-3’ (Rin)

• D17S559
SEQ ID NO 36 5’-GAGATTTTGTCCAGTGGCTAGA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 37 5’-TGACATGATTTACGTCTCTCTCAA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 38 5’-*GTGCTACGTGTGGGTAGGAT-3’ (Fin);
SEQ ID NO 39 5’-TTGTTATATGTGCCCACGG-3’ (Rin)

• D17S4.7
SEQ ID NO 40: 5’-CCCCACCCCTGTCTTAAT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 41: 5’-ATATGGCTTCAGTGGGACC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 42: 5’-GACACAGGGAGCTTTGTTCA-3’ (Fin);
SEQ ID NO : 43 5’-*GGTTCCTTGAGCCTGATGAC-3’ (Rin)

• D17S5.1
SEQ ID NO 44: 5’-GGAGTACACAATGGCTGCA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 45: 5’-AACCTCCTGAGTAGCTGTGACTA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 46: 5’-*TGAGTACAGGACTACTGAGGGC-3’ (Fin)

• D17S5.2
SEQ ID NO 47 5’-AATGGCCGTATGTTCTTTATGTA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 48 5’-CACTCTCAATCTGGGCCG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 49 5’-*ACGTGCCAATTCAACCAT-3’ (Fin);
SEQ ID NO 50 5’-TGGTAGCTAAAGGGCGAAG-3’ (Rin)

Тест-система для диагностики патогенных вариантов NC_000017.10:g.3392637G>T, NM_000049.2:c.634+1G>T, NC_000017.10:g.3402327C>A, NM_000049.2:c.857C>A, p.Ala286Asp в гене ASPA, связанных с болезнью Канаван, с двойной системой детекции - прямой и косвенной, включающая ПЦР-смесь для первого раунда амплификации, содержащую 1×PCR буфер с Mg2+, 0,1 mM каждого дезоксинуклеотида, 0,15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl ДНК полимеразы HsTaq, 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы, ПЦР-смесь второго раунда амплификации, содержащую 1×PCR буфер с Mg2+, 0,5×RediLoad загрузочный буфер, 0,2 mM каждого дезоксинуклеотида, 0,2 μM каждого праймера, 1 U/μl ДНК полимеразы HsTaq, 6% DMSO и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы, причем праймеры для локусов представляют собой SEQ ID NO 1-50.