Способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами

Настоящее изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины, а именно к способу получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающему растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа, или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа, или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля. Настоящее изобретение обеспечивает разработку способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе бромелайна, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы бромелайна можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи, при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение бромелайна, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. 3 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу стабилизации бромелайна растворами гиалуроновой кислоты и графт-сополимерами с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА). Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии.

Бромелайн (КФ 3.4.22.4) - протеолитический фермент, найденный в различных растениях семейства бромелиевые (Bromeliaceae). Энзим, выделенный из Ananas comosus, является наиболее изученным. Молекула бромелайна из стебля этого растения содержит 285 аминокислотных остатков и представляет собой полипептидную цепь, скрепленную пятью дисульфидными связями и несущую одну сульфгидрильную группу. Оптимум каталитической активности фермента лежит при рН 7-10 в зависимости от субстрата, изоэлектрическая точка - 9.55. Константа Михаэлиса у бромелайна из разных источников имеет величину от 0.007 до 6.6 мМ. Температурный оптимум составляет 62°С.

Бромелайн широко распространен в медицинской практике, косметологии, кроме того, этот энзим используется в пищевой промышленности в тендеризации (размягчении) мясной продукции, для улучшения ее качества и свойств. Бромелайн применяется при косметическим лечении для уничтожения пигментации и рубцовой ткани [Патент RU 2429028 С2, МПК А61М 35/00, A61K 31/60, А61Р 17/02, А61Р 17/12, опубл. 20.09.2011, Бюл. №26], используется для изготовления лекарства для лечения и/или профилактики глазных болезней, которое обеспечивает уменьшение ангиогенеза [Патент RU 2472523 С2, МПК A61K 38/48, А61Р 27/02, опубл. 20.01.2013, Бюл. №2], входит в состав средств для профилактики заболеваний полости рта [Патент RU 2293551 C1, A61K 8/19, A61K 8/34, A61K 8/36, A61K 8/37, A61K 8/40, A61K 8/55, A61K 8/99, A61Q 11/00, опубл. 20.02.2007, Бюл. №5], профилактики распространения морщин, мимических морщинок, гиперпигментации, вялости и сухости кожи [Патент RU 2558848 С1, МПК A61K 8/98, A61Q 19/08, опубл. 10.08.2015, Бюл. №22]. Бромелайн используется в композиции, включающей гидролизованные белки дрожжей для обеспечения косметической активности и стабильности с течением времени [Патент RU 2491910 С2, МПК A61K 8/02, A61K 8/99, A61Q 5/12, A61Q 7/00, A61K 36/064, А61Р 17/06, А61Р 17/08, А61Р 17/10, опубл. 10.09. 2013, Бюл. №25].

Гиалуроновая кислота - природный линейный несульфатированный гликозаминогликан, представляющий собой крупные полисахаридные молекулы, состоящие из остатков D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, соединенных поочередно β-1,4- и β-1,3-гликозидными связями.

Существует множество препаратов в медицинской практике, косметологии, фармацевтической промышленности, которые включают гиалуроновую кислоту. Описана композиция на основе гиалуроновой кислоты, которая относится к наполнителям мягких тканей, например, кожным и подкожным наполнителям [Патент RU 2496473 С2, A61K 8/73, A61L 27/20, A61K 47/36, опубл. 27.10.13, Бюл. №30]. Гиалуроновая кислота используется для лечения глазных болезней, входит в состав имплантата, предназначенного для лечения глаукомы [Патент RU 2532333 С2, A61K 31/5575, А61Р 27/06, опубл. 10.11.2014, Бюл. №31]. В офтальмологии высокомолекулярная гиалуроновая кислота входит в состав мази для лечения повреждений переднего отрезка глазного яблока, которая обеспечивает усиление ранозаживляющего эффекта [Патент RU 2173136 C1, A61K 9/06, 31/728, А61Р 27/00, опубл. 10.09.2001]. Описан способ получения стерильного вязкоэластичного биополимера на основе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты для применения в медицине [Патент RU 2501811 С2, С08В 37/00, опубл. 20.12.2013, Бюл. №35]. Гиалуроновая кислота используется как средство, обладающее анаболическим действием и применяемое при патологических состояниях, связанных с мышечной дистрофией [Патент RU 2378007 C1, A61K 38/51, А61Р 21/06, опубл. 10.01.2010, Бюл. №1]. В косметологии известна композиция с омолаживающим действием и лифтинг-эффектом на основе гиалуроновой кислоты, которая позволяет достичь выраженный эстетический результат за счет физиологического механизма стимуляции выработки собственной гиалуроновой кислоты в коже [Патент RU 2543651 C1, A61K 8/44, A61K 8/64, A61Q 19/00, опубл. 10.03.2015, Бюл. №7].

Графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из N-винилимидазола или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата являются водорастворимыми в широкой области составов, кроме того водные растворы сополимеров, содержащих в боковых цепях звенья Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата являются термо- и рН-чувствительными и характеризуются наличием нижней критической температуры растворения (НКТР) [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and Ν,Ν-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z]. При содержании звеньев Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата от 45% выше и близком к нейтральному значению рН величина НКТР находится в области физиологических температур, что позволяет применять такие графт-сополимеры в качестве носителей для целевой доставки лекарственных средств [V.A. Kuznetsov, А.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol.76. P. 4929-4949; V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, M.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].

На данный момент нет сведений о комплексах растительного фермента бромелайна с гиалуроновой кислотой и полисахаридами, модифицированными виниловыми мономерами, такими как графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА).

Известен способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2677343 С2, МПК A61L 15/38, A61K 38/56, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 16.01.2019, Бюл. №3], который включает иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрице ионообменных волокон ВИОН КН-1 или ВИОН АН-1 в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон; в качестве буферного раствора для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0.05 Μ глициновый буфер с рН 9.0-10,5 или 0.05 Μ боратный буфер с рН 8.0 без добавления KCl, а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0.2 Μ ацетатный буфер с рН 5.0; инкубация проводится в течение 24 часов при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.

Недостатком способа является получение ферментного препарата в твердой фазе, не позволяющей проникать молекулам бромелайна в глубокие слои кожи.

Запатентован способ стабилизации ферментов - пепсина, химотрипсина, трипсина, панкреатина, папаина и других протеаз, путем добавления в их растворы полисахаридов - гуаровой камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, крахмала, декстрана, пуллулана, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, каррагинана, пектина, хитозана и прочих полисахаридов, а также производных целлюлозы: карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы [JPH034791A].

Известен способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана, который включает иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; инкубирование при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 Μ глициновый буфер с рН 8,6 для пищевого хитозана или с рН 9,0-9,5 для сукцината хитозана; либо 0,05 Μ ацетатный буфер с рН 5,5 для пищевого хитозана или 5,0 для сукцината хитозана; инкубирование проводится в течение 2 часов. Изобретение позволяет увеличить скорость ферментативной реакции и повысить эффективность использования полученного препарата, в том числе при осуществлении реакции на твердых поверхностях [Патент RU 2691611, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 14.06.2019 Бюл. №17].

В отличие от этих двух способов предложенное нами использование полисахаридов (карбоксиметилцеллюлозы и хитозана), модифицированных виниловыми мономерами (N-винилимидазолом или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом) обеспечивает большее количество связей между полисахаридом и ферментом в ходе иммобилизации, что увеличивает прочность образуемого комплекса и пролонгирует процесс высвобождения фермента в область поврежденных тканей. Кроме того, добавление в препарат гиалуроновой кислоты, которая обладает свойством глубокого проникновения в различные слои кожи, будет способствовать более качественному очищению бромелайном поверхностных слоев кожи и слизистых оболочек от белковых загрязнений.

Известно, что полимеры на основе поли-β-гликозидов (целлюлозы и ее производных, хитозана, гиалуроновой кислоты и т.д.) склонны к образованию пленок, которые могут защитить кожу от пересыхания или обеспечить дополнительную защиту на поверхности раневого повреждения. Однако способность образовывать конъюгаты у таких полимеров несколько ограничена рядом факторов: поверхностным зарядом, типом функциональной группы и т.д. Поэтому для придания ряда новых свойств целесообразно проводить химическую модификацию природных полисахаридов. Так, например, введение азольных заместителей повышает комплексообразующую способность полисахаридов и снижает поверхностный отрицательный заряд карбоксиметилцеллюлозы [V.А. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949], а введение звеньев Ν,Ν-диметиаминоэтилметакрилата не только снижает поверхностный заряд, но придает водному раствору модифицированного полисахарида стимулочувствительные свойства [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].

В качестве прототипа служила топическая противомикробная дерматологическая композиция [Патент RU 2668827 С2, МПК A61K 38/08, A61K 31/728, А61Р 31/00, А61Р 17/00, A61K 31/722, опубл. 02.10.2018, Бюл. №28], предложенная в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.

В отличие от прототипа в качестве действующего вещества мы используем не противомикробный пептид, а фермент бромелайн, который кроме антимикробных свойств обладает иммуномодулирующим действием, ускоряет процессы репарации тканей в результате деполимеризации межклеточных структур и модификации проницаемости сосудов, применяется для облегчения воспалительных процессов при травмах, снятия отека мягких тканей, а также для ускорения их восстановления после повреждений, обладает противораковыми свойствами и способностью предотвращать образование тромбов.

Кроме того, добавление нами в раствор графт-сополимеров карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) позволяет путем включения в полисахаридный гель (один из способов физической иммобилизации ферментов) дополнительно стабилизировать бромелайн и обеспечить ему пролонгированное действие.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе бромелайна, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы бромелайна можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи, при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение бромелайна, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.

Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающем растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.

Фиг. 1. Диаграмма значений каталитической активности (А) бромелайна в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 4°С.

Фиг. 2. Диаграмма значений каталитической активности (А) бромелайна в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 25°С.

Фиг. 3. Таблица 1. Вязкость препаратов, содержащих бромелайн, гиалуроновую кислоту и полисахариды, модифицированные виниловыми мономерами.

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве стабилизирующих агентов применяли три вида гиалуроновой кислоты (ООО «Лаборатория Гиалика») с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) и 800 (ВМГК) кДа. В качестве матрицы для иммобилизации бромелайна применяли графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) с молекулярной массой 50-100 кДа.

Стабилизацию бромелайна осуществляли путем растворения его навески массой 10 мг в 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) или 800 (ВМГК) кДа в концентрации 1.5% с последующим перемешиванием при комнатной температуре до полного растворения. Затем к полученной смеси добавляли для иммобилизации бромелайна графт-сополимер карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) (при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля (табл. 1).

Содержание белка в иммобилизованных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Измерение уровня протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине [ F. L. The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial characterization and the effect of feed on their composition // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry - 1992. - V. 103. - P. 575-578]. К 200 мкл образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера (рН 7.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при минус 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 200 мкл трис-HCl буфера и 200 мкл образца, который вносили после инкубации смеси в течение 2 часов при 37°С. За единицу каталитической активности бромелайна принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность бромелайна рассчитывали по формуле:

ПА=D*1000/120/200/C,

где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,

D - оптическая плотность пробы при 410 нм,

С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,

120 - время инкубации в минутах,

200 - объем пробы, в мкл,

1000 - пересчет в мкМ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Были проведены исследования стабильности бромелайна в растворах гиалуроновой кислоты (300, 500 и 800 кДа) по сравнению с нативным энзимом. Препараты инкубировали при 4 и 25°С в течение 0, 1, 2, 3, 7, 14 и 21 суток с дальнейшим измерением протеолитической активности. Полученные результаты отражены на фиг. 1, 2.

В ходе наших экспериментов было выявлено, что гиалуроновая кислота не ингибирует бромелайн. На фиг. 1 представлена диаграмма зависимости каталитической активности энзима от времени его хранения при 4°С. Установлено, что протеолитическая активность нативного бромелайна снижается с 1 до 7 дня инкубации с 80% до 35%. После 21 суток при температуре 4°С фермент сохраняет 32% своей активности. Бромелайн в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты после инкубации при 4°С на 1, 2 и 3 сутки проявляет 95, 87, 65% от исходной протеолитической активности. Энзим, находящийся в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты при 4°С, на 21 день имеет активность 37%. Установлено, что бромелайн в растворе среднемолекулярной гиалуроновой кислоты через 21 день сохраняет 59% своей активности при 4°С. Снижение каталитической способности в данном случае происходит постепенно без резких скачков. Активность бромелайна в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты после инкубации в холодильнике на 21 день составляет 76%.

На фиг. 2 изображена диаграмма изменения каталитической активности бромелайна после его хранения при 25°С. При 25°С нативный фермент снижает активность с 77% до 37% с 1 по 7 день инкубации, после 21 дня активность бромелайна составляет 34%. Энзим в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты после инкубации при 25°С на 1, 2 и 3 сутки сохраняет каталитическую способность на 88, 77, 57% от исходной протеолитической активности, на 21 день препарат бромелайна имеет 36% ферментативной способности. Бромелайн в растворе среднемолекулярной гиалуроновой кислоты через 21 день сохраняет 57% своей активности при 25°С. Показано, что активность бромелайна в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты после его хранения при 25°С на 21 день инкубации снижается до 44%.

Таким образом, был разработан способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) и высокомолекулярной (800 кДа) гиалуроновой кислоты с последующим добавлением графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) для иммобилизации бромелайна.

При этом полученный предложенным способом препарат можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а бромелайн при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи. Внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение бромелайна, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.

Способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающий растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа, или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа, или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.