Продукты и способы для ухода за полостью рта, содержащие антифризные белки
Группа изобретений относится к биотехнологии и стоматологии. Способ восстановления или ингибирования, или защиты, или профилактики от зубной эрозии, или содействия зубной реминерализации, включающий нанесение на зуб композиции для ухода за полостью рта, содержащей антифризный белок (AFP) в количестве от 0,01 до 3 мас.% на основе общей массы композиции, и перорально приемлемый носитель. Причем AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот исходя из полипептидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков. Также представлены средство для чистки зубов, композиция для ухода за полостью рта, применение AFP, композиция для ухода за полостью рта для восстановления или ингибирования патологической зубной эрозии или зубной реминерализации (варианты), способ получения продукта для ухода за полостью рта и композиция жевательной резинки. Группа изобретений обеспечивает эффективное восстановление и смягчение эффектов патологической зубной эрозии, содействуя зубной реминерализации. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 3 пр.
Уровень техники
Зубная эмаль представляет собой тонкий твердый слой кальцинированного материала, который покрывает коронки зубов. Основным минеральным компонентом зубной эмали является гидроксиапатит, кристаллическая форма фосфата кальция. Химическая эрозия зубной эмали может возникать из-за воздействия на зубы кислых пищевых продуктов и напитков или желудочного сока, появляющегося в результате желудочно-кишечного рефлюкса. Эрозия зубной эмали может привести к повышенной чувствительности зубов из-за увеличения воздействия на канальцы дентина и увеличения видимости дентина, что приводит к появлению более желтых зубов. Слюнная пелликула (тонкий слой слюнных гликопротеинов, расположенных на зубах) является неотъемлемой частью защиты зубов от поражения эрозией. В результате люди, которые испытывают ксеростомию, более подвержены повреждению кислотной эрозией.
Существующие методы, разработанные для предотвращения эрозии эмали, включают включение источника свободного фторида в композиции для ухода за полостью рта. Фторид уменьшает повреждение эмали путем образования фторапатита, который растворяется при более низком значении рН, чем гидроксиапатит, и поэтому более устойчив к кислотному повреждению. Соли двухвалентного олова также были включены в композиции средства для чистки зубов для защиты поверхности эмали подобным образом, путем образования более устойчивого к кислоте минерального слоя. Полимеры также были описаны, которые покрывают и защищают поверхность эмали.
Кислоты также образуются в полости рта, когда бляшка, содержащая кариесогенные бактерии, метаболизирует углеводы. Поскольку бляшка образует барьер, контролирующий кинетику протонной и минеральной диффузии через эмаль, кислоты бляшки вызывают кариозные поражения. Включение фторидных ионов в композиции средства для чистки зубов является наиболее распространенным методом смягчения воздействия кислот бляшек. Фторид снижает скорость деминерализации и усиливает реминерализацию. Было также разработано несколько подходов для стабилизации фосфатных солей кальция или контроля значения рН бляшек для улучшения реминерализации.
Несмотря на то, что были разработаны методы для смягчения воздействия небактериально и бактериально образованных кислот на зубах, все еще существует потребность в обеспечении улучшенных композиций для ухода за полостью рта, которые эффективно восстанавливают эмаль после воздействия кислотной эрозии и бактериальных кислот.
Сущность изобретения
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что антифризные белки (AFP) эффективны для восстановления или смягчения эффектов патологической зубной эрозии, содействия реминерализации и/или усиления противокариозных эффектов фторида.
Например, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, AFP получают для введения в композицию с ингредиентами подходящего перорально приемлемого носителя, посредством разбавления в буфере, например, фосфатном буфере, таком как Na2HPO4 буфер (1.5 мМ) и CaCl2 (2.5 мМ), с обеспечением буферизованного раствора, имеющего почти нейтральное или слегка основное значение рН, например, рН 7-8, например, около рН 7.5, фильтрации и центрифугирования раствора с получением фильтрата, содержащего AFP. Биоцид (например, цетилпиридиния хлорид при 0.1%) и фторид могут быть добавлены в фильтрат. AFP затем может быть объединен с компонентами перорально приемлемого носителя, например, основой зубной пасты или жидкости для полоскания рта, с обеспечением композиции для ухода за полостью рта для восстановления или смягчения эффектов зубной эрозии, содействия реминерализации и/или усиления противокариозных эффектов фторида.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к композиции для ухода за полостью рта (Композиция 1 или 2 или 3), например, средству для чистки зубов, содержащей:
a) AFP;
b) перорально приемлемый носитель,
где AFP присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. Например, настоящее изобретение обеспечивает:
1.1. Композицию 1, в которой AFP представляет собой AFP насекомых.
1.2. Композицию 1, в которой AFP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 2.
1.3. Композицию 2, в которой AFP представляет собой растительный AFP.
1.4. Композицию 2, в которой AFP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 3….
1.5. Композицию 3, в которой AFP представляет собой AFP рыбы.
1.6. Композицию 3, в которой AFP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1 ….
1.7. Любую вышеуказанную композицию, содержащую фторид.
1.8. Любую вышеуказанную композицию, в которой AFP был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН, например, рН 7-8, например, применяя фосфатный буфер.
1.9. Любую вышеуказанную композицию, в которой AFP содержит биоцид, например, цетилпиридиния хлорид (СРС), при эффективной концентрации, например, 0.1% по массе фильтрата.
1.10. Любую вышеуказанную композицию, в которой AFP присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции, например, от 0.01 мас. % до 2 мас. %, например, около 0.02 мас. %, около 0.1 мас. %, около 0.5 мас. % или около 2 мас. % от общей массы композиции.
1.11. Любую вышеуказанную композицию, где композиция содержит эффективное количество фторида.
1.12. Любую вышеуказанную композицию, которая содержит количество фторида от 100 частей на миллион до 2500 частей на миллион, например, от 250 частей на миллион до 750 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион фторид.
1.13. Любую вышеуказанную композицию, содержащую перорально приемлемую соль цинка или оксид, например, выбранный из оксида цинка, цитрата цинка, лактата цинка, фосфата цинка, ацетата цинка, хлорида цинка, комплексов цинка с аминокислотами, и смесей любого из вышеуказанного, например, в которой количество цинка составляет от 0.1 мас. % до 3 мас. %, например, от около 1 до около 2 мас. %, как вычислено на основе массы иона цинка.
1.14. Любую вышеуказанную композицию, содержащую перорально приемлемую соль двухвалентного олова, например, SnF2 или SnCl2.
1.15. Любую вышеуказанную композицию, где композиция находится в форме, выбранной из средства для полоскания рта, зубной пасты, геля для ухода за зубами, зубного порошка, неабразивного геля, мусса, пены, средства для ароматизации рта в аэрозольной упаковке и таблетки, например, средства для чистки зубов, например, зубной пасты или средства для полоскания рта.
1.16. Любую вышеуказанную композицию, где композиция дополнительно содержит одно или более средств, выбранных из: абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающих образование конкрементов средств или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов и красителей.
1.17. Любую вышеуказанную композицию, в которой композиция представляет собой зубную пасту.
1.18. Любую вышеуказанную композицию, содержащую одну или более растворимых фосфатных солей, например, где "растворимые фосфатные соли" означают перорально приемлемую фосфатную соль, имеющую растворимость в воде по меньшей мере 1 г/100 мл при 25°С; например, в которой одной или более растворимыми фосфатными солями являются натриевые и/или калиевые соли пирофосфатов и/или полифосфатов, например, триполифосфаты; например, в которой одна или более растворимых фосфатных солей содержат тетранатрия пирофосфат (TSPP), триполифосфат натрия (STPP) или комбинацию TSPP и STPP; например, где одна или более растворимые фосфатные соли присутствуют в количестве 1-20%, например, 2-8%, например, около 5%, от массы композиции.
1.19. Любую вышеуказанную композицию, в которой фторид обеспечивается посредством соли, выбранной из фторида двухвалентного олова, фторида натрия, фторида калия, монофторфосфата натрия, фторсиликата натрия, фторсиликата аммония, аминфторида (например, N'-октадецилтриметилендиамин-N,N,N'-трис(2-этанол)-дигидрофторид), аммония фторида, фторида титана, гексафторсульфата и их комбинаций.
1.20. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее смачивающее средство, например, выбранное из глицерина, сорбитола, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля, ксилита и их смесей, например содержащее по меньшей мере 30%, например, 40-50% глицерина, от массы композиции.
1.21. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее одно или более поверхностно-активных веществ, например, выбранных из анионных, катионных, цвиттер-ионных и неионных поверхностно-активных веществ, и их смесей, например, где основа средства для чистки зубов содержит анионное поверхностно-активное вещество, например, поверхностно-активное вещество, выбранное из лаурилсульфата натрия, простоэфирного лаурилсульфата натрия и их смесей, например в количестве от около 0.3% до около 4.5 мас. %, например 1-2% лаурилсульфата натрия (SLS) от массы композиции.
1.22. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее цвиттер-ионное поверхностно-активное вещество, например, бетаиновое поверхностно-активное вещество, например, кокамидопропилбетаин, например в количестве от около 0.1% до около 4.5 мас. %, например 0.5-2% кокамидопропилбетаина от массы композиции.
1.23. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее модифицирующее вязкость количество одного или более из полисахаридных камедей, например, ксантановой камеди или каррагенана, кремнеземного сгустителя и их комбинаций.
1.24. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее полоски или фрагменты камеди.
1.25. Любую вышеуказанную композицию, содержащую отдушку, ароматизатор и/или краситель.
1.26. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее эффективное количество одного или более противомикробных средств, например, содержащее противомикробный агент, выбранный из галогенированного дифенилового простого эфира (например, триклозан), экстрактов трав и эфирных масел (например, экстракт розмарина, экстракт чая, экстракт магнолии, тимсл, ментол, эвкалиптол, гераниол, карвакрол, цитраль, хинокитол, катехин, метилсалицилат, галлат эпигаллокатехина, эпигаллокатехин, галловая кислота, экстракт мисуака, экстракт облепихи крушиновидной, прополис), бигуанидных антисептиков (например, хлоргексидин, алексидин или октенидин), соединений четвертичного аммония (например, цетилпиридиний хлорид (СРС), бензалконий хлорид, тетрадецилпиридиний хлорид (ТРС), N-тетрадецил-4-этилпиридиний хлорид (TDEPC)), фенольных антисептиков, гексетидина, октенидина, сангвинарина, повидон-йода, делмопинола, салифтора, ионов металлов (например, соли цинка, например, цитрат цинка, соли олова, соли меди, соли железа), сангвинарина, прополиса и оксигенирующих средств (например, перекись водорода, забуференный пероксиборат или пероксикарбонат натрия), фталевой кислоты и ее солей, моноперфталевой кислоты и ее солей и сложных эфиров, аскорбилстеарата, олеилсаркозина, алкилсульфата, диоктилсульфосукцината, салициланилида, домифенбромида, делмопинола, октапинола и других производных пиперидина, препаратов ницина, хлоритных солей, а также смесей любых из вышеперечисленных; например, содержащее триклозан или цетилпиридиния хлорид.
1.27. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее отбеливающее средство, например, выбранное из группы, состоящей из пероксидов, хлоритов металлов, перборатов, перкарбонатов, пероксикислот, гипохлоритов, а также их комбинаций; например, пероксид водорода или источник пероксида водорода, например, перекись мочевины или пероксидную соль или комплекс (например, такой как соли пероксифосфат, пероксикарбонат, перборат, пероксисиликат или персульфат, например пероксифосфат кальция, перборат натрия, перекись карбоната натрия, пероксифосфат натрия и персульфат калия).
1.28. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее агент, которые вмешивается в прикрепление бактерий или препятствует ему, например, solbrol или хитозан.
1.29. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее растворимую кальциевую соль, например, выбранную из сульфата кальция, хлорид кальция, нитрат кальция, ацетат кальция, лактат кальция и их комбинации.
1.30. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее физиологически или перорально приемлемую калиевую соль, например, нитрат калия или хлорид калия, в количестве, эффективном для уменьшения чувствительности зубов.
1.31. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее анионный полимер, например, синтетический анионный полимерный поликарбоксилат, например, в котором анионный полимер выбирают из от 1:4 до 4:1 сополимеров малеинового ангидрида или кислоты с другим полимеризуемым этиленненасыщенным мономером; например, в котором анионный полимер представляет собой сополимер метилвинилового простого эфира/малеинового ангидрида (PVM/MA), имеющий средневесовую молекулярную массу (M.W.) от около 30,000 до около 1,000,000, например от около 300,000 до около 800,000, например, в котором анионный полимер составляет около 1-5%, например, около 2%, от массы композиции.
1.32. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее освежитель дыхания, отдушку или ароматизатор.
1.33. Любую из вышеуказанных композиций, в которой значение рН композиции является почти нейтральным, например, около рН 7.
1.34. Любую из вышеуказанных композиций для применения для уменьшения и ингибирования кислотной эрозии, очищения зубов, уменьшения бактериально-образованной биопленки и бляшки, уменьшения восстановления десен, ингибирования зубного кариеса и образования полостей, и уменьшения зубной гиперчувствительности.
1.35. Любую вышеуказанную композицию для применения для уменьшения, ингибирования или восстановления эрозии зубной эмали.
1.36. Любую вышеуказанную композицию для применения, чтобы промотировать зубную реминерализацию.
1.37. Любую вышеуказанную композицию для применения для усиления противокариозных эффектов фторида.
В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения Композиция 1 или 2 или 3 представляет собой средство для чистки зубов, содержащее
a) AFP;
b) необязательно эффективное количество фторида;
c) перорально приемлемый носитель,
например, где количество AFP составляет от 0.01 мас. % до 2 мас. %, и
например, где фторид присутствует в количестве от 100 частей на миллион до 1000 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению представляет собой жевательную резинку, содержащую гуммиоснову, ароматизирующее вещество, подсластитель и AFP. Гуммиоснова присутствует в количестве от около 4,8% до около 90%, ароматизирующее вещество присутствует в количестве от около 0,1% до около 10%, подсластитель присутствует в количестве от около 0,1% до около 95%, и AFP присутствует в количестве от около 0,01% до около 0,5%.
Одним объектом настоящего изобретения является любая из композиций 1 или 2 или 3 и последующих, для применения для восстановления или ингибирования или защиты от или профилактики зубной эрозии, содействия реминерализации и/или усиления противокариозных эффектов фторида; например, для применения в любом из следующих способов согласно способу 1 и последующим.
Другим объектом настоящего изобретения является способ (способ 1 или 2 или 3) восстановления или ингибирования зубной эрозии, содействия реминерализации и/или усиления противокариозных эффектов фторида, включающий нанесение на зубы композиции, например, любой из композиции 1 или 2 или 3 и последующих, например, композиции для ухода за полостью рта, содержащей:
a) AFP
b) перорально приемлемый носитель,
где AFP присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. Например, настоящее изобретение обеспечивает:
1.1. Способ 1, в котором AFP представляет собой AFP насекомых.
1.2. Способ 1, в котором AFP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 2…
1.3. Способ 2, в котором AFP представляет собой растительный AFP.
1.4. Способ 2, в котором AFP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 3…
1.5. Способ 3, в котором AFP представляет собой AFP рыб.
1.6. Способ 3, в котором AFP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1…
1.7. Любой вышеуказанный способ, в котором AFP содержит фторид.
1.8. Любой вышеуказанный способ, в котором частично гидролизованный белок пшеницы был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН, например, рН 7-8, например, применяя фосфатный буфер.
1.9. Любой вышеуказанный способ, в котором AFP содержит биоцид, например, цетилпиридиния хлорид (СРС) при эффективной концентрации, например, 0.1% по массе фильтрата.
1.10. Любой вышеуказанный способ, в котором AFP присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции, например, от 0.01 мас. % до 2 мас. %, например, около 0.02 мас. %, около 1 мас. %, около 0.5 мас. % или около 2 мас. % от общей массы композиции.
1.11. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция содержит эффективное количество фторида.
1.12. Любой вышеуказанный способ, в котором количество фторида составляет от 100 частей на миллион до 1000 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион фторид.
1.13. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция находится в форме, выбранной из средства для полоскания рта, зубной пасты, геля для ухода за зубами, зубного порошка, неабразивного геля, мусса, пены, средства для ароматизации рта в аэрозольной упаковке и таблетки.
1.14. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция дополнительно содержит одно или более средств, выбранных из: абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающий образование конкрементов или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизирующих веществ и красителей.
1.15. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция представляет собой средство для чистки зубов, например, зубную пасту.
1.16. Любой вышеуказанный способ, в котором композицию выбирают из любой из Композиций 1 или 2 или 3 и последующих, указанных выше.
1.17. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ для уменьшения, ингибирования или восстановления зубной эрозии, например, эрозии эмали, например, в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий зубную эрозию или имеющий повышенный риск развития зубной эрозии.
1.18. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ промотирования зубной реминерализации, например, реминерализации эмали, например, в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий деминерализацию.
1.19. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ усиления противокариозных эффектов фторида, например, в которой в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий первые признаки зубного кариеса, например, начальный кариес эмали, или как имеющий активный кариес, или имеющий повышенный риск развития зубного кариеса.
1.20. Способ 1.15, в котором композиция содержит эффективное количество фторида и/или, в котором способ дополнительно содержит введение продукта для ухода за полостью рта, ополаскивателя для полости рта, содержащего эффективное количество фторида, или зубной пасты, содержащей эффективное количество фторида.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, настоящее изобретение обеспечивает применение AFP для получения композиции для ухода за полостью рта, например, согласно любой из композиций 1 или 2 или 3 и последующих, для восстановления или ингибирования зубной эрозии, содействия реминерализации и/или усиления противокариозных эффектов фторида, например, в любом из способов 1 или 2 или 3 и последующих.
Другим объектом настоящего изобретения является способ (способ 4) получения продукта для ухода за полостью рта, например, продукта для ухода за полостью рта, полезного для восстановления или ингибирования зубной эрозии, содействия реминерализации и/или усиления противокариозных эффектов фторида, например, продукта в соответствии с любой из композиции 1 или 2 или 3 и последующих, включающий
a) нейтрализацию AFP посредством разбавления водным буферным раствором, например, фосфатным буферным раствором, с получением раствора, имеющего почти нейтральное или слегка основное значение рН, например, рН 7-8;
b) фильтрацию и центрифугирование раствора продукта с а) с получением фильтрата, содержащего AFP;
c) добавление фторида (например, в форме перорально приемлемой соли, содержащей фторид, например, фторид натрия или монофторфосфат натрия), и необязательно биоцида (например, цетилпиридиния хлорида в эффективном количестве, например, от 0.01 до 1%, например, около 0.1% по массе фильтрата) к фильтрату продукта с b);
d) подмешивание продукта с с) к компонентам перорально приемлемого носителя с получением композиции для ухода за полостью рта, содержащей AFP в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции.
Например, настоящее изобретение обеспечивает композицию для ухода за полостью рта, содержащую AFP, например, композиция в соответствии с любой из композиции 1 или 2 или 3 и последующих, в которой композицию для ухода за полостью рта получают, или она является получаемой способом согласно способу 4 и последующим.
Другие области применимости настоящего изобретения станут очевидными на основании подробного описания, представленного ниже. Следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, с указанием предпочтительного варианта выполнения настоящего изобретения, предназначены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Нижеследующее описание предпочтительного варианта (вариантов) выполнения настоящего изобретения является просто иллюстративным по своей природе и никоим образом не предназначено для ограничения настоящего изобретения, его применения или использований.
Как применяется в настоящей заявке, диапазоны используются в качестве сокращения для описания каждого значения, находящегося в пределах диапазона. Любое значение в пределах диапазона может быть выбрано как конечная точка диапазона. Кроме того, все ссылки, приведенные в настоящей заявке, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта в определении в настоящей заявке и в процитированной ссылке настоящее описание преобладает.
Если не указано иное, все проценты и количества, приведенные в настоящей заявке и в другом месте в описании, следует понимать как относящиеся к процентам по массе. Указанные количества основаны на активной массе вещества.
Антифризные белки (AFP)
Антифризные белки (AFP) представляют собой белки из организмов, таких как определенные позвоночные, растения, грибы и бактерии, которые обеспечивают их выживание в неблагоприятных условиях. AFP также называют белками, структурирующими лед. AFP связываются с небольшими кристаллами льда, чтобы ингибировать рост и перекристаллизацию льда, который в противном случае был бы фатальным для организмов. Общей особенностью AFP является тепловой гистерезис, который представляет собой разницу между температурой плавления и точкой замерзания. Добавление AFP на границе раздела между твердым льдом и жидкой водой ингибирует термодинамически благоприятный рост кристалла льда. Рост льда кинетически ингибируется AFP, покрывающими поверхности льда, доступные для воды. Тепловой гистерезис легко измеряется в лаборатории с помощью нанолитрового осмометра.
Нет общей консенсусной последовательности AFP из различных организмов Crit Rev Biotechnol. 2008; 28: 57-82., Properties, potentials, and prospects of antifreeze proteins, Venketesh S1, Dayananda C; Journal of Experimental Biology 2015; 218: 1846-1855., Animal ice-binding (antifreeze) proteins and glycolipids: an overview with emphasis on physiological function, John G Duman.
Полезными для настоящего изобретения являются AFP из рыбы, такой как, например, американская бельдюга, или из растений, таких как плевел многолетний. Предпочтительные AFP являются такие, как из насекомых. Существуют два известных типа AFP насекомых, AFP Tenebrio и Dendroides, которые находятся в разных семействах насекомых. Они похожи друг на друга и состоят из различного числа 12 или 13-мерных повторов приблизительно 8,3-12,5 кДа. Особенно предпочтительными AFP из насекомых являются AFP из choristoneura fumiferana.
Особенно предпочтительными AFP являются имеющие следующие полипептидные последовательности:
ВМ 82 (SEQ ID NO: 1),
BM 80 (SEQ ID NO: 2),
BM 83 (SEQ ID NO: 3),
Особенно предпочтительными вариантами выполнения настоящего изобретения являются белки, имеющие полипептидные последовательности согласно SEQ ID NO: 1, 2, 3. Особенно предпочтительными вариантами выполнения настоящего изобретения являются также белки, которые возникают в результате замещения, введения или делеции по меньшей мере одной, двух, до 10, предпочтительно 5 аминокислот. Особенно предпочтительными являются белки, в которых замещены или удалены до 1%, до 3%, до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 1, 2, 3, и которые все еще имеют по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% биологического свойства исходных белков. Биологическое свойство белков в контексте настоящего изобретения означает тепловой гистерезис.
AFP также могут быть связаны с партнером слияния, предпочтительно при амино- или при карбокситерминальной части AFP. Партнер слияния может представлять собой, например, небольшую пептидную последовательность, такую как гистидиновая метка - последовательность из 6-10 гистидиновых остатков, которая полезна для очистки AFP. SEQ ID NO: 1, 2 или 3, например, несут на своем карбоксиконце his6 метку.
Партнером слияния могут также быть некоторые дополнительные аминокислоты при амино- и/или карбоксиконце AFP, которые являются результатом либо новообразования, либо инактивации сайтов распознавания для рестрикционных эндонуклеаз на уровне нуклеиновой кислоты.
AFP также могут быть связаны с партнером слияния, предпочтительно при амино- или при карбокситерминальной части AFP. Партнером слияния может быть, например, небольшая пептидная последовательность, такая как пептиды, связывающие гидроксиапатит, предпочтительно с пептидной последовательностью согласно SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 4 IDDYTRA
SEQ ID NO: 5 HPPLHHA
SEQ ID NO: 6 SPSTHWK
SEQ ID NO: 7 GSPATAA
SEQ ID NO: 8 GKVQAQS
SEQ ID NO: 9 YPVTPSI
SEQ ID NO: 10 IPTLPSS
SEQ ID NO: 11 YQGASEN
SEQ ID NO: 12 EHITTSN
SEQ ID NO: 13 RILITIP
SEQ ID NO: 14 IPITNLR
SEQ ID NO: 15 TTSTRHI
SEQ ID NO: 16 NERALTL
SEQ ID NO: 17 MQTVEVT
SEQ ID NO: 18 SWGTQTD
SEQ ID NO: 19 TLPASSV
Предпочтительные варианты AFP, связанного с гидроксиапатит-связывающим пептидом, является SEQ ID NO:20, которая представляет собой слияние SEQ NO: 4 и SEQ ID NO: 2, и SEQ ID NO: 21, которая представляет собой слияние SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 2
AFP в контексте настоящего изобретения также означает, что множество копий (т.е. мультимеры) AFP слиты вместе, например, два или три AFP - имеющие идентичную структуру (т.е. гомомеры) или различную структуру (т.е. гетеромеры) - образуют "супер AFP". Например, AFP из рыбы может быть слит вместе с AFP из насекомых, или два идентичных AFP из рыбы слиты вместе.
AFP в контексте настоящего изобретения также означает, что AFP связан с непептидной молекулой, такой как фармацевтическое лекарственное средство, витамин или ароматизатор. Таким образом, непептидная молекула может быть нацелена на зубную эмаль через AFP часть. Связывание непептидной молекулы с AFP возможно, например, путем взаимодействия с боковыми цепями аминокислот AFP, как например ОН в Ser или Thr или SH в Cys или Met или СООН в Asp или Glu или NH2 в Lys или Arg. Химическая связь может быть «постоянной», то есть той, которая не гидролизуется слюной, или она может быть «лабильной», то есть той, которая восприимчива к расщеплению слюной.
AFP влияют на образование кристаллов льда, а также на форму кристаллов льда, что можно увидеть в микроскоп, когда кристаллы льда, образовавшиеся в присутствии AFP, сравниваются с кристаллами льда без AFP. Если присутствует биоактивный AFP, кристаллы льда имеют острый вид по сравнению с круглым, капельноподобным видом кристаллов, образованных без AFP. Это также можно использовать для определения биологической активности AFP.
На Фиг. 1 показано образование кристаллов льда в присутствии и отсутствии AFP. (Вода означает дистиллированную воду без AFP).
AFP могут быть получены химически известными методами синтеза пептидов, например, твердофазным синтезом в соответствии с Меррифилдом.
Особенно полезными, однако, являются генетические способы получения, в которых последовательности нуклеиновых кислот, в частности последовательности ДНК, кодирующие AFP и, если желательно, один или более партнеры слияния, комбинируют таким образом, что экспрессия гена комбинированной последовательности нуклеиновой кислоты создает желаемый белок в организме-хозяине.
Подходящими организмами-хозяевами (организмы-производители) в контексте настоящего изобретения могут быть прокариоты (в том числе археи) или эукариоты, особенно бактерии, включая галобактерии и метанококки, грибы, клетки насекомых, растительные клетки и клетки млекопитающих, особенно предпочтительно Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (или родственные клетки), и другие.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к экспрессионным конструкциям, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению под генетическим контролем регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, а также векторы, содержащие по меньшей мере одну из указанных экспрессионных конструкций.
Предпочтение отдается таким конструкциям согласно настоящему изобретению, содержащим промотор 5' против хода транскрипции от конкретной кодирующей последовательности, и терминирующую последовательность 3' по ходу транскрипции, а также, при необходимости, дополнительные обычные регулирующие элементы, в каждом случае функционально связанные с указанной кодирующей последовательностью.
«Функциональная связь» означает последовательное расположение промотора, кодирующей последовательности, терминатора и, при необходимости, дополнительных регуляторных элементов таким образом, что каждый из регуляторных элементов способен выполнять свою функцию в соответствии с его предполагаемым использованием в связи с экспрессией кодирующей последовательности.
Примерами последовательностей, которые могут быть функционально связаны, являются нацеливающие последовательности, а также энхансеры, сигналы полиаденилирования и тому подобное. Другие регуляторные элементы содержат селектируемые маркеры, сигналы амплификации, точки начала репликации и т.п. Примеры подходящих регуляторных последовательностей описаны в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
В дополнение к этим регуляторным последовательностям естественная регуляция этих последовательностей может все еще присутствовать против хода транскрипции от фактических структурных генов и, при необходимости, была генетически модифицирована, так что естественная регуляция была отключена, и экспрессия генов была увеличена.
Предпочтительная конструкция нуклеиновой кислоты предпочтительно также содержит одну или более упомянутых ранее энхансерных последовательностей, которые функционально связаны с промотором и обеспечивают увеличение экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Дополнительные предпочтительные последовательности, такие как дополнительные регуляторные элементы или терминаторы, также могут быть вставлены при 3'-конце ДНК последовательностей.
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут присутствовать в конструкции в количестве одной или более копий. Конструкция может содержать еще дополнительные маркеры, такие как антибиотические резистентности или гены, которые дополняют ауксотрофию, для селекции конструкции, если это необходимо.
Примеры регуляторных последовательностей, которые предпочтительны для способа согласно настоящему изобретению, представлены в промоторах, таких как cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR или lambda-P поомотор, которые предпочтительно применяются в грамотрицательных бактериях. Другие примеры предпочтительных регуляторных последовательностей представлены в грамположительных промоторах amy и SP02, в промоторах дрожжей или грибов ADC1, MFalpha, АС, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Также возможно использовать искусственные промоторы для регуляции.
Чтобы экспрессироваться в организме-хозяине, конструкцию нуклеиновой кислоты предпочтительно вставляют в вектор, такой как, например, плазмида или фаг, что позволяет генам оптимально экспрессироваться в хозяине. Помимо плазмид и фагов, векторы также означают любые другие векторы, известные специалисту, т.е., например, вирусы, такие как SV40, CMV, бакуловирусы и аденовирусы, транспозоны, элементы IS, фазмиды, космиды и линейные или циклические ДНК, а также систему Agrobacterium.
Эти векторы могут либо реплицироваться автономно в организме-хозяине, либо реплицироваться хромосомально. Эти векторы составляют другой вариант выполнения настоящего изобретения. Примерами подходящих плазмид являются pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, рKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III''3-B1, tgt11 или pBdC1 в E.coli, pIJ101, pIJ364, pIJ702 или pIJ361 в Streptomyces, pUB110, pC194 или pBD214 в Bacillus, pSA77 или pAJ667 в Corynebacterium, pALS1, pIL2 или рВВ116 в грибах, 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 или pEMBLYe23 в дрожжах или pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 или pDH51 в растениях. Вышеуказанные плазмиды представляют собой небольшую часть возможных плазмид. Другие плазмиды также известны специалистам в данной области техники и раскрываются, например, в книге Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты дополнительно содержит с целью экспрессии других присутствующих генов также 3'- и/или 5'--концевые регуляторные последовательности для усиления экспрессии, которые выбраны для оптимальной экспрессии в зависимости от организма-хозяина и выбранного гена или генов.
Эти регуляторные последовательности предназначены для того, чтобы обеспечить экспрессию экспрессию генов и белков. В зависимости от организма-хозяина это может означать, например, что ген экспрессируется или сверхэкспрессируется только после индукции, или что он экспрессируется и/или сверхэкспрессируется немедленно.
В этом контексте, регуляторные последовательности или факторы могут предпочтительно оказывать благоприятное влияние на генную экспрессию введенных генов и тем самым увеличивать ее. Таким образом, регуляторные элементы могут преимущественно усиливаться на уровне транскрипции, посредством применения сильных сигналов транскрипции, таких как промоторы и/или энхансеры. Помимо этого, однако, также возможно усилить трансляцию путем улучшения стабильности мРНК, например.
В другом варианте выполнения вектора, вектор, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, также может быть предпочтительно введен в форме линейной ДНК в микроорганизмы и интегрирован в геном организма-хозяина посредством гетерологичной или гомологичной рекомбинации. Указанная линейная ДНК может состоять их линеаризованного вектора, такого как плазмида, или только из конструкции нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Чтобы достичь оптимальной экспрессии гетерологичных генов в организмах, целесообразно модифицировать последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с конкретной частотой использования кодона, применяемого в организме. Частоту использования кодона можно легко определить на основе компьютерных анализов других известных генов рассматриваемого организма.
Экспрессионную кассету согласно настоящему изобретению получают посредством слияния подходящего промотора с подходящей кодирующей нуклеотидной последовательностью и сигналом терминации или сигналом полиаденилирования. Для этой цели используются известные методы рекомбинации и клонирования, которые описаны, например, в Т. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), а также в T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) и в Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
Для экспрессии в подходящем организме-хозяине конструкцию рекомбинантной нуклеиновой кислоты или генную конструкцию преимущественно вставляют в специфичный для хозяина вектор, который позволяет оптимально экспрессировать гены в хозяине. Векторы хорошо известны квалифицированному специалисту и могут быть найдены, например, в "Cloning Vectors" (Pouwels Р.Н. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
Векторы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для получения рекомбинантных микроорганизмов, которые трансформированы, например, по меньшей мере одним вектором согласно настоящему изобретению, и могут быть использованы для получения полипептидов согласно настоящему изобретению. Предпочтительно вышеописанные рекомбинантные конструкции согласно настоящему изобретению вводятся в и экспрессируются в подходящей системе-хозяине. Предпочтительным согласно настоящему изобретению является применение общих методов клонирования и трансфекции, известных квалифицированному специалисту, таких как, например, соосаждение, слияние протопластов, электропорация, ретровирусная трансфекция и тому подобное, с целью экспрессии указанных нуклеиновых кислот в конкретной экспрессионной системе. Подходящие системы описаны, например, в существующих на сегодняшний день протоколах в Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds. Wiley Interscience, New York 1997, или Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
В соответствии с настоящим изобретением также возможно получение гомологично рекомбинантных микроорганизмов. С этой целью получают вектор, который содержит по меньшей мере одну часть гена согласно настоящему изобретению или кодирующей последовательности, в который, при необходимости, по меньшей мере одна аминокислотные деления, добавление или замещение были введены для того, чтобы модифицировать, например, функционально разрушить, последовательность согласно настоящему изобретению (нокаут вектор). Введенная последовательность может, например, также быть гомологом из родственного микроорганизма или быть получена из источника млекопитающих, дрожжей или насекомых. Вектор, используемый для гомологичной рекомбинации, альтернативно может быть сконструирован таким образом, что эндогенный ген мутирует или модифицируется каким-либо другим образом во время гомологичной рекомбинации, но все же кодирует функциональный белок (например, апстрим регуляторная последовательность быть модифицирована таким образом, который модифицирует экспрессию эндогенного белка). Модифицированный участок гена согласно настоящему изобретению находится в гомологичном рекомбинантном векторе. Конструкции подходящих векторов для гомологичной рекомбинации описана, например, в Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503.
Любые прокариотические или эукариотические организмы в принципе пригодны для использования в качестве рекомбинантных организмов-хозяев для нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или конструкции нуклеиновой кислоты. Предпочтительно используемые организмы-хозяева представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии, грибы или дрожжи. Предпочтительно применяются грамположительные или грамотрицательные бактерии, предпочтительно бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae или Nocardiaceae, особенно предпочтительно бактерии рода Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium или Rhodococcus.
В зависимости от организма-хозяина, организмы, используемые в способе согласно настоящему изобретению, выращиваются или культивируются способом, известным специалисту. Микроорганизмы обычно выращивают в жидкой среде, содержащей источник углерода, обычно в форме Сахаров, источник азота, обычно в форме органических источников азота, таких как дрожжевой экстракт или соли, такие как сульфат аммония, микроэлементы, такие как соли железа, марганца, магния, и, при необходимости, витамины, при температуре от 0 до 100°С, предпочтительно между 10 и 60°С, при газировании кислородом. Значение рН питательной жидкости может поддерживаться или не поддерживаться в контексте настоящего изобретения при фиксированном значении, т.е. регулируется во время роста. Рост может происходить периодически, полунепрерывно или непрерывно. Питательные вещества могут вводиться изначально в начале ферментации или впоследствии подаваться полунепрерывно или непрерывно. Ферменты могут быть выделены из организмов с использованием способа, описанного в примерах, или могут быть использованы для реакции в виде неочищенного экстракта.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам рекомбинантного получения полипептидов согласно настоящему изобретению или их функциональных биологически активных фрагментов, где способы включают культивирование продуцирующего полипептид микроорганизма, при необходимости индукцию экспрессии указанных полипептидов и выделение их из культуры. Таким образом, полипептиды могут также быть получены в промышленном масштабе, если это необходимо. Рекомбинантный микроорганизм можно культивировать и ферментировать известными способами. Например, бактерии могут размножаться в среде ТВ или среде LB и при температуре от 20 до 40°С и при значении рН от 6 до 9. Соответствующие условия культивирования подробно описаны, например, в Т. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Если полипептиды не секретируются в культуральную среду, клетки затем разрушают, и продукт выделяют из лизата известными способами выделения белков. Клетки могут необязательно разрушаться посредством высокочастотного ультразвука, посредством высокого давления, например, в прессе Френча, посредством осмолиза, посредством действия детергентов, лизирующих ферментов или органических растворителей, с использованием гомогенизаторов, или посредством комбинации нескольких перечисленных способов.
Полипептиды могут быть очищены с помощью известных хроматографических методов, таких как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), таких как хроматография на Q-сефарозе, ионообменная хроматография и гидрофобная хроматография, а также с помощью других обычных методов, таких как ультрафильтрация, кристаллизация, высаливание, диализ и нативный гель-электрофорез. Подходящие методы описаны, например, в Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [оригинальное название: The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York или в Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
Для выделения рекомбинантного белка может быть предпочтительно использовать векторные системы или олигонуклеотиды, которые удлиняют кДНК с помощью конкретных нуклеотидных последовательностей и, таким образом, кодируют измененные полипептиды или слитые белки, которые облегчают очистку, например. Примерами таких подходящих модификаций являются «метки», действующие как якоря, например, модификация, известная как гексагистидиновый якорь, или эпитопы, которые могут быть распознаны антителами в качестве антигенов (описаны, например, в Harlow, Е. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Другими подходящими метками являются, например, НА, кальмодулин-BD, GST, MBD; хитин-BD, метка стрептавидина-BD-Avi, метка Flag, Т7 и т.д. Эти якоря могут использоваться для прикрепления белков к твердой подложке, такой как, например, полимерная матрица, которая может быть введена в хроматографическую колонку, например, или к микротитровальной пластине или любой другой подложке. Соответствующие протоколы очистки могут быть получены от поставщиков коммерческих аффинных меток.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения AFP присутствует в композиции в количестве от 0,01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, AFP присутствует в композиции в количестве от 0,01 мас. % до 3 мас. %, или от 0,01 мас. % до 2 мас. %, или от 0,02 мас. % до 1 мас. % от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, AFP присутствует в композиции в количестве от 0,01 мас. % до 1 мас. %, или от 0,021 мас. % до 0,5 от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, AFP присутствует в композиции в количестве от 0,05 мас. % до 3 мас. %, или от 0,05 мас. % до 2 мас. %, или от 0,05 мас. % до 1 мас. % от общей массы композиции.
Перорально приемлемый носитель и необязательные ингредиенты
Выражение «перорально приемлемый носитель», как используется в настоящей заявке, обозначает носитель, изготовленный из материалов, которые являются безопасными и приемлемыми для перорального применения в предназначенных количествах и концентрациях, например, веществ, которые можно найти в традиционной зубной пасте и жидкости для полоскания рта. Такие вещества включают воду или другие растворители, которые могут содержать смачивающее средство, такой как глицерин, сорбит, ксилит и тому подобное. В некоторых аспектах термин «перорально приемлемый носитель» охватывает все компоненты композиции для ухода за полостью рта, за исключением гидролизованного растительного белка и фторида. В других аспектах термин относится к инертным или неактивным ингредиентам, которые служат для доставки AFP, и/или любых других функциональных ингредиентов, в полость рта.
Перорально приемлемые носители для использования в настоящем изобретении включают обычные и известные носители, используемые при изготовлении ополаскивателей для полости рта или жидкостей для полоскания рта, зубных паст, гелей для ухода за зубами, зубного порошка, пастилок, жвачек, шариков, съедобных полосой, таблеток и тому подобного. Носители должны быть выбраны с точки зрения совместимости друг с другом и с другими ингредиентами композиции.
Приведены следующие неограничивающие примеры. В композиции зубной пасты носителем обычно является система вода/смачивающее средство, которая обеспечивает основную фракцию от массы композиции. Альтернативно, компонент носителя композиции зубной пасты может содержать воду, один или более смачивающих средств и другие функциональные компоненты, отличные от AFP. В композиции ополаскивателя для полости рта или жидкости для полоскания рта носитель обычно представляет собой водно-спиртовую жидкую смесь, в которой AFP растворяют или диспергируют. В растворяемой пастилке носитель обычно содержит твердый матричный материал, который медленно растворяется в полости рта. В жевательных резинах носитель обычно содержит гуммиоснову, тогда как в съедобной полосе носитель обычно содержит один или более пленкообразующих полимеров.
Композиции для ухода за полостью рта, представленные в настоящей заявке, могут дополнительно содержать один или более дополнительных ингредиентов, выбранных из абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающих образование конкрементов или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов. Эти ингредиенты также могут рассматриваться как материалы-носители. Ниже приведены неограничивающие примеры.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один абразивный материал, полезный, например, в качестве полирующего агента. Можно использовать любой перорально приемлемый абразивный материал, но тип, тонкость (размер частиц) и количество абразивного материала следует выбирать так, чтобы зубная эмаль не подвергалась чрезмерному стиранию при стандартном использовании композиции. Подходящие абразивные материалы включают, без ограничения, диоксид кремния, например, в виде силикагеля, гидратированного диоксида кремния или осажденного диоксида кремния, оксид алюминия, нерастворимые фосфаты, карбонат кальция, смолистые абразивные материалы, такие как продукты конденсации мочевиноформальдегида и тому подобное. Среди нерастворимых фосфатов, полезных в качестве абразивных материалов, упоминают ортофосфаты, полиметафосфаты и пирофосфаты. Иллюстративными примерами являются дигидрат дикальция ортофосфата, кальция пирофосфат, [бета]-кальция пирофосфат, трикальция фосфат, полиметафосфат кальция и нерастворимый полиметафосфат натрия. Один или более абразивных материалов необязательно присутствуют в композиции для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению в количестве от 1 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции. Средний размер частиц абразивного материала, если он присутствует, обычно составляет от 0,1 до 30 мкм и предпочтительно от 5 до 15 мкм.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну бикарбонатную соль, полезную, например, для придания «ощущения чистоты» зубов и десен из-за вспучивания и выделения углекислого газа. Можно использовать любой перорально приемлемый бикарбонат, включая, без ограничения, бикарбонаты щелочных металлов, такие как бикарбонаты натрия и калия, бикарбонат аммония и тому подобное. Одна или более бикарбонатных солей необязательно присутствуют в общем количестве от 1 мас. % до 10% от массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один рН- модифицирующий агент. Такие агенты включают подкисляющие агенты для снижения значения рН, подщелачивающие агенты для повышения значения рН и буферные агенты для контроля значения рН в желаемом диапазоне. Например, одно или более соединений, выбранных из подкисляющих, подщелачивающих и буферных агентов, могут быть включены для обеспечения значения рН от 2 до 10 или в различных иллюстративных вариантах осуществления значения рН от 2 до 8, от 3 до 9, от 4 до 8, от 5 до 7, от 6 до 10 или от 7 до 9. Может быть использован любой перорально приемлемый рН-модифицирующий агент, включая, без ограничения, карбоновые, фосфорные и сульфоновые кислоты, кислотные соли (например, мононатрия цитрат, цитрат динатрия, мононатрия малат), гидроксиды щелочных металлов, такие как гидроксид натрия, карбонаты, такие как карбонат натрия, бикарбонаты, бораты, силикаты, фосфаты (например, мононатрия фосфат, тринатрия фосфат, пирофосфатные соли), имидазол и тому подобное. Одно или более рН-модифицирующих средств необязательно присутствуют в общем количестве, эффективном для поддержания композиции в перорально приемлемом диапазоне рН.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, полезное, например, для обеспечения повышенной стабильности композиции и содержащихся в ней компонентов, чтобы помочь очистить поверхность зубов посредством действия моющих средств и для обеспечения пены при перемешивании (например, при чистке с помощью композиции средства для чистки зубов композиция согласно настоящему изобретению). Можно использовать любое перорально приемлемое поверхностно-активное вещество, в том числе анионное, неионное или амфотерное. Подходящие анионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, растворимые в воде соли С8-20 алкилсульфатов, сульфонированные моноглицериды С8-20 жирных кислот, саркозинаты, таураты и тому подобное. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, полоксамеры, полиоксиэтиленсорбитана жирные кислоты, этоксилаты жирных спиртов, алкилфенола этоксилаты, третичные амины, оксиды, третичные фосфиноксиды, диалкилсульфоксиды и тому подобное. Подходящие амфотерные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, производные С8-20 алифатических вторичных и третичных аминов, имеющих анионную группу, такую как карбоксилат, сульфат, сульфонат, фосфат или фосфонат. Подходящим примером является кокоамилопропилбетаин. Одно или более поверхностно-активные вещества необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 10 мас. %, например, от 0,05 мас. % до 5 мас. % или от 0,1 мас. % до 2 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один модулятор пены, полезный, например, чтобы увеличить количество, вязкость или стабильность пены, образуемой композицией при перемешивании. Может применяться любой перорально приемлемый модулятор пены, включая, без ограничения, полиэтиленгликоли (ПЭГ). Один или более ПЭГ необязательно присутствуют в общем количестве от 0,1 мас. % до 10 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один загуститель, полезный, например, чтобы придать композиции желаемую консистенцию и/или ощущение во рту. Любой перорально приемлемый загуститель может быть использован, включая, без ограничения, карбомеры (карбоксивиниловые полимеры), каррагинаны, целлюлозные полимеры, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза (CMC) и их соли, природные камеди, такие как камедь карайи, ксантановая камедь, гуммиарабик и трагакантовая камедь, коллоидный магния алюминия силикат, коллоидный диоксид кремния и тому подобное. Один или более загустителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 15 мас. %, от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один модификатор вязкости, полезный, например, для ингибирования осаждения или разделения ингредиентов или для содействия повторному диспергированию ингредиентов при перемешивании жидкой композиции. Любой перорально приемлемый модификатор вязкости может быть использован, включая, помимо прочего, минеральное масло, вазелин, глины, диоксид кремния и тому подобное. Один или более модификаторов вязкости необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 10 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно смачивающее средство, которое может быть использовано для предотвращения затвердевания зубной пасты при воздействии воздуха. Может быть использован любое перорально приемлемое смачивающее средство, включая, помимо прочего, многоатомные спирты, такие как глицерин, сорбит, ксилит или низкомолекулярные ПЭГ. Большинство смачивающих средств также функционируют как подсластители. Одно или более смачивающих средств необязательно присутствуют в общем количестве от 1 мас. % до 50 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один подсластитель, который придает композиции вкус. Любой перорально приемлемый природный или искусственный подсластитель моно использовать, включая, без ограничения, декстрозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, маннозу, ксилозу, рибозу, фруктозу, левулозу, галактозу, кукурузный сироп, частично гидролизованный крахмал, гидрогенизированный гидролизат крахмала, сорбит, маннит, ксилит, мальтит, изомальт, аспартам, неотам, сахарин и их соли, интенсивные подсластители на основе дипептида, цикламаты и тому подобное. Один или более подсластителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0,005 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один ароматизатор, который усиливает вкус композиции. Любой перорально приемлемый природный или синтетический ароматизатор можно использовать, включая, но без ограничения, ванилин, шалфей, майоран, масло петрушки, масло мяты курчавой, коричное масло, масло грушанки (метилсалицилат), масло перечной мяты, масло гвоздики, лавровое масло, анисовое масло, эвкалиптовое масло, цитрусовые масла, фруктовые масла и эссенции и тому подобное. Также к ароматизаторам относятся ингредиенты, которые обеспечивают аромат и/или другие сенсорные эффекты во рту, включая эффекты охлаждения или потепления. Такие ингредиенты иллюстративно включают ментол, ментилацетат, ментиллактат, камфару, эвкалиптовое масло, эвкалиптол, эвгенол, кассию, оксанон, α-иризон, тимол, линалоол, бензальдегид, циннамальдегид, N-этил-п-ментан-3-карбоксамин, N,2,3-триметил-2-изопропилбутанамид, 3-(1-ментокси)-пропан-1,2-диол, глицерилацеталь коричного альдегида (CGA), ментон глицерин ацеталь (MGA) и тому подобное. Один или более ароматизаторов необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один краситель. Краситель может выполнять ряд функций. К ним относятся обеспечение окрашенного в белый или светлый цвет покрытия на поверхности зуба, что указывает на места на поверхности зуба, которые эффективно контактировали с композицией, и/или модификация внешнего вида композиции, чтобы повысить привлекательность для потребителя. Любой перорально приемлемый краситель может быть использован, включая, без ограничения, тальк, слюду, карбонат магния, карбонат кальция, силикат магния, магния алюминия силикат, диоксид кремния, диоксид титана, оксид цинка, оксид железа, железоаммониевый ферроцианид, марганцово-фиолетовый, титанированную слюду, оксихлорид висмута и тому подобное. Один или более красителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0,001 мас. % до 20 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит консервант. Консервант может быть выбран из парабенов, сорбата калия, бензилового спирта, феноксиэтанола, полиаминопропилбигуанида, каприловой кислоты, бензоата натрия и цетилпиридиния хлорида. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, консервант присутствует при концентрации от около 0,001 до около 1 мас. %, от общей массы композиции.
Следующие примеры иллюстрируют композиции согласно настоящему изобретению и их использование. Приведенные примеры композиций являются иллюстративными и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1 - Шероховатость поверхности
Бычий зуб разрезали, измельчили и отполировали с получением блоков эмали, имеющих приблизительные размеры 3 мм × 3 мм × 2 мм. Толщина эмали составляет около от 1 до 2 мм, и толщина дентина составляет около 1 мм. Все измерения проводили на поверхности эмали.
Шероховатость поверхности блоков эмали измеряли до и после кислотного травления. Кислотное травление достигалось посредством помещения блоков эмали в 1% раствор лимонной кислоты (рН 3.8) до достижения шероховатости поверхности (Sq) 100-200. Это значение Sq приводилось как шероховатость поверхности вытравленной эмали. (Sq является стандартным измерением, проведенным в основном согласно ISO 25178, как среднеквадратичное значение высоты относительно среднеарифметического значения высоты измеряемой поверхности, поэтому оно соответствует среднему значению всех абсолютных расстояний профиля от диаметральной плоскости в пределах площади измерения, так что если оно более высокое, это означает, что на поверхности имеется более выраженные пики и точки минимума, т.е. поверхность является шероховатой, и если оно более низкое, то поверхность более гладкая.) AFP разбавляют до конечной концентрации, применяя Na2НРO4 буфер (1.5 мМ) и СаСl2 (2.5 мМ). После нейтрализации до рН 7.5, раствор фильтруют и центрифугируют. Протравленные кислотой блоки эмали затем инкубируют с раствором, содержащим обработанный AFP при концентрации 5.5 мкМ или 55 мкМ (2 мл раствора на блок) в течение 60 минут.
После периода инкубации в течение 60 минут, блоки эмали инкубируют в растворе искусственной слюны (AS) (0.4 г NaCl, 0.4 г KCl, 0.8 г СаСl2, 0.69 г NaH2PO4, 1 г мочевины, 1 литр дистиллированной воды; рН 7 (установлено посредством применения 1М NaOH)) в течение 22 часов. Блоки эмали затем обрабатывают второй раз с помощью AFP, и инкубируют снова с искусственной слюной в течение 22 часов. Блоки затем промывают деионизированной водой (DI) и высушивают посредством воздуха перед измерением их шероховатости поверхности. Блоки эмали, обработанные с помощью 0.5% PBS, применяют в качестве отрицательного контроля для эксперимента. Результаты проиллюстрированы в Таблице 1. % восстановления представляет собой % уменьшения шероховатости поверхности (Sq), достигнутый посредством обработки белком, относительно шероховатости поверхности (необработанной) протравленной кислотой эмали.
Смотрите Фиг. 2. Восстанавливающая эффективность ВМ80 при низкой и высокой концентрации, применяя анализ шероховатости
Как указано в Таблице 1, AFP с SEQ ID NO2 эффективен для уменьшения шероховатости поверхности протравленных кислотой блоков эмали при концентрации 5.5, и соответственно 55 мкМ
Пример 2 - Наноиндентирование
Блоки эмали получили, как описано в Примере 1. Кислотное травление достигалось посредством помещения блоков эмали в 1% раствор лимонной кислоты (рН 3.8) на 15 минут. Твердость в нанодиапазоне и модуль Юнга на глубине 500 нм измеряли до и после протравливания. Протравленные блоки эмали инкубировали с раствором AFP с SEQ ID NO: 20, при концентрации 20 мкМ в течение 30 минут (2 мл раствора/блок), с последующей инкубацией с AS раствором, как описано в Примере 1, в течение от 22 до 24 часов. AFP и AS стадии инкубации повторяли еще два раза, после чего блоки эмали промывали DI водой и высушивали посредством воздуха. Твердость в нанодиапазоне и модуль Юнга обработанных блоков эмали измеряли на глубине 500 нм для оценки эффектов восстановления эмали посредством AFP. Раствор 500 частей на миллион фторида применяли в качестве положительного контроля для эксперимента. Результаты проиллюстрированы в Таблицах 2 и 3.
Смотрите Фиг. 3. Эффективность восстановления (твердость в нанодиапазоне) AFP, применяя наноиндентирование
Смотрите Фиг. 4. Эффективность восстановления (применяя модуль Юнга) AFP, применяя наноиндентирование
Как можно увидеть в Таблицах 2 и 3, AFP эффективен для восстановления эмали, подвергнутой кислотной эрозии.
Пример 3 - Микротвердость
Блоки эмали получили, как описано в Примере 1. Микротвердость измеряли, применяя прибор для определения твердости Micromet 6020 Micro с индентором с алмазным наконечником Кнупа и 50 г загрузкой (Buehler, Lake Bluff, IL, USA). Отбирали блоки с твердостью по Кнупу (КН) по меньшей мере 300. Блоки протравливали посредством погружения в 30% фосфорную кислоту на 15 секунд. КН на левой и правой сторонах блоков измеряли. Затем правые стороны блоков покрывали лентой перед обработкой блоком с помощью 20 мг/мл раствора AFP, причем каждый нейтрализован как описано в Примере 1, дважды, в течение 30 минут.(Лента на правой стороне блоков предотвращает воздействие на эту сторону раствора белка и служит в качестве внутреннего контроля). Блоки дважды промывали DI водой в течение 5 минут, 500 PRM между двумя обработками и после второй обработки. Затем ленту убирали, и блоки инкубировали в AS растворе (0.2 мМ MgCl2, 1 мМ СаСl2.Н2O, 20 мМ HEPES буфер, 4 мМ KН2РO4, 16 мМ KСl, 4.5 мМ NH4Cl, 300 частей на миллион NaF, 0.05 мас. % NaN3, при рН 7 (установлено с помощью 1М NaOH)) в течение 7 дней). После промывки блоков эмали DI водой и сушки промытых блоков посредством воздуха, микротвердость измеряли снова. Восстановление микротвердости поверхности (SMHL, реминерализация%) в процентах вычисляют следующим образом ((Микротвердостьвосстановленная - Микротвердостьпротравленная)/(Микротвердостьконтроль - Микротвердостьпротравленная))* 100.
Результаты анализа микротвердости проиллюстрированы в Таблице 4.
Смотрите Фиг. 5 Эффективность восстановления AFP, применяя микротвердость
Из Таблицы 4 можно увидеть, что все AFP эффективны для реминерализации поверхности эмали протравленных кислотой блоков эмали. Необходимо отметить, что для всех тестов на микротвердость, процент реминерализации с правой стороны/стороны внутреннего контроля, которая была погружена в искусственную слюну и имела некоторое восстановление от искусственной слюны, исключали из результатов, так что данные показывают дифференциальный эффект AFP.
В то время как конкретные варианты выполнения настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от объема настоящего изобретения, как определено в приложенной формуле изобретения.
1. Способ восстановления или ингибирования, или защиты от, или профилактики зубной эрозии, или содействия зубной реминерализации, включающий нанесение на зуб композиции для ухода за полостью рта, содержащей:
a) антифризный белок (AFP);
b) перорально приемлемый носитель,
причем AFP имеет полипептидную последовательность, согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей, согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков, и
где AFP присутствует в композиции в количестве от 0,01 мас.% до 3 мас.% на основе общей массы композиции.
2. Способ по п. 1, в котором AFP имеет полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 1%, до 3% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей, согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 80% и предпочтительно по меньшей мере 90% биологического свойства исходных белков.
3. Способ по п. 1, в котором AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 2, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей, согласно SEQ ID NO: 2, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% от биологического свойства исходного белка (SEQ ID NO: 2).
4. Способ по п. 1, в котором AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей, согласно SEQ ID NO: 1, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% от биологического свойства исходного белка (SEQ ID NO: 1).
5. Способ по п. 1, в котором AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей, согласно SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% от биологического свойства исходного белка (SEQ ID NO: 3).
6. Способ по п. 1, в котором AFP связан с гидроксиапатит-связывающим пептидом, который выбран из группы, образованной из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19.
7. Способ по п. 1, в котором AFP представляет собой гомомер или гетеромер AFP и связан с гидроксиапатит-связывающим пептидом, который выбран из группы, образованной из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19.
8. Способ по п. 1, где композиция для ухода за полостью рта дополнительно содержит эффективное количество фторида.
9. Способ по п. 1, в котором AFP присутствует в композиции в количестве от 0,01 до 2 мас.% от общей массы композиции.
10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором композиция представляет собой средство для чистки зубов.
11. Средство для чистки зубов, содержащее:
a) антифризный белок (AFP), который был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН;
b) эффективное количество фторида и
c) перорально приемлемый носитель,
причем AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей, согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков.
12. Композиция для ухода за полостью рта, содержащая:
a) антифризный белок (AFP);
c) перорально приемлемый носитель,
причем AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей, согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков, и
где AFP присутствует в композиции в количестве от 0,01 мас. % до 3 мас.% от общей массы композиции, для применения в восстановлении, или ингибирования эрозии зубной эмали, или содействия реминерализации зубной эмали.
13. Композиция по п. 12, дополнительно содержащая
b) эффективное количество фторида.
14. Применение антифризного белка (AFP) для получения композиции для ухода за полостью рта для восстановления, или ингибирования патологической зубной эрозии, или содействия зубной реминерализации,
причем AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков.
15. Способ получения продукта для ухода за полостью рта, содержащего антифризный белок (AFP), включающий:
a) нейтрализацию раствора AFP посредством разбавления водным буферным раствором с получением раствора, имеющего почти нейтральное или слегка основное значение рН;
b) фильтрацию и центрифугирование раствора продукта с а) с получением фильтрата, содержащего AFP;
с) добавление фторида к фильтрату продукта с b);
d) подмешивание продукта с с) к компонентам перорально приемлемого носителя,
причем AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков.
16. Способ по п. 15, дополнительно включающий добавление биоцида к фильтрату продукта с b) на стадии с).
17. Композиция для ухода за полостью рта, содержащая антифризный белок (AFP), где композиция для ухода за полостью рта получена или является получаемой способом по п. 15 или 16.
18. Композиция жевательной резинки, содержащая:
а) гуммиоснову
b) ароматизирующее вещество,
с) подсластитель, и
от около 0,01 мас.% до около 0,5 мас.% антифризного белка AFP от массы композиции жевательной резинки,
причем AFP имеет полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или полипептидную последовательность, которая возникает в результате замещения, введения или делеции до 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, и которая все еще имеет по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков.
