Композиция пептидов коллагена кожи рыбы и её применение в качестве лекарственного средства

Настоящее изобретение относится к композиции пептидов, характеризующейся аминограммой, согласно которой: глицин, гидроксипролин и пролин содержатся в таких мольных количествах, что отношение каждого из количеств к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 20,0% до 24,5%, от 6,0% до 12,0% и от 10,6% до 14,6% соответственно; композиция пептидов содержит количество пептидов с молекулярной массой менее 1400 Да, такое что отношение указанного количества к количеству пептидов в композиции составляет менее 40%; при этом молекулярные массы и количества пептидов в композиции определяют путем эксклюзионной хроматографии. Композиция предназначена для лечения желудочно-кишечных заболеваний и применяется в пищу. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 20 ил., 7 табл.

 

Настоящее изобретение относится к композиции пептидов коллагена из кожи рыб. Настоящее изобретение относится, в частности, к такой композиции пептидов, полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб. Настоящее изобретение также относится к такой композиции для ее применения в качестве лекарственного средства. Таким образом, настоящее изобретение относится к применению такой композиции для терапевтического или профилактического лечения заболевания, поражающего организм человека или животного. Настоящее изобретение относится, в частности, к такой композиции для ее применения в качестве лекарственного средства для лечения кандидоза желудочно-кишечного тракта у людей или животных и/или для лечения воспаления кишечника у людей или животных. Настоящее изобретение также относится к такой композиции для ее применения в качестве лекарственного средства для стимулирующего микробиоту лечения.

В документе FR 2720067 описан пептидный порошок, полученный путем гидролиза папаином богатого коллагеном исходного материала, происходящего из кожи или скелета рыб, моллюсков или ракообразных. В полученном пептидном порошке 38% пептидов имеют молекулярную массу от 10000 Да до 50000 Да. Композиция пептидов согласно документу FR 2720067 характеризуется широким диапазоном молекулярных масс, в частности, долей пептидов с молекулярной массой более 10000 Да, составляющей более 10%. Композиция пептидов согласно документу FR 2720067 является гетерогенной по размеру пептидов и содержит фракцию водорастворимых пептидов, составляющую всего от 80% до 90%. Такие порошки пептидов с высокой молекулярной массой, составляющей более 10000 Да, являются не полностью растворимыми в воде. Также они не полностью усваиваются желудочно-кишечным трактом и поэтому создают проблемы с точки зрения их биодоступности.

В документе FR 2720067 также описано применение такого пептидного порошка, полученного из рыб, обитающих на большой глубине, для терапевтического лечения воспаления сухожилий суставов нижних конечностей (коленей, путовых суставов и копыт) скаковых лошадей. Получение такой композиции является проблематичным. Оно затруднительно, поскольку требуется добыча глубоководных рыб. Кроме того, такой порошок ограничен в применении для лечения воспаления суставов.

Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в преодолении указанных недостатков.

Настоящее изобретение направлено на обеспечение новой композиции пептидов, получаемой путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса, при этом указанные пептиды являются водорастворимыми - т.е. на 100% водорастворимыми - и полностью усваиваются желудочно-кишечным трактом.

Настоящее изобретение также направлено на обеспечение новой, получаемой путем ферментативного гидролиза композиции пептидов коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса.

Настоящее изобретение также направлено на обеспечение такой композиции пептидов, которую можно применять в качестве лекарственного средства.

В частности, настоящее изобретение также направлено на обеспечение такой композиции пептидов, получаемой путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса, которую можно применять в качестве лекарственного средства.

Настоящее изобретение также направлено на обеспечение такой композиции пептидов, характеризующейся распределением кажущихся молекулярных масс указанных пептидов, охватывающим узкий диапазон от примерно одной тысячи до нескольких тысяч дальтонов, т.е. не содержащей пептиды с высокой кажущейся молекулярной массой, и также содержащей низкую долю пептидов с низкой кажущейся молекулярной массой.

Настоящее изобретение направлено на обеспечение такой композиции пептидов, которую можно применять в качестве лекарственного средства для лечения кандидоза кишечного тракта.

Настоящее изобретение также направлено на обеспечение такой композиции пептидов, которую можно применять в качестве лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, в частности, воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК).

Настоящее изобретение также направлено на обеспечение такой композиции пептидов, которую можно применять для обеспечения равновесия и поддержания кишечной флоры (или микробиоты).

Настоящее изобретение также направлено на обеспечение применения такой композиции пептидов, получаемой путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса, в качестве пищевой добавки.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции пептидов, характеризующейся аминограммой, согласно которой:

- глицин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 20,0% до 24,5%;

- гидроксипролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 6,0% до 12,0%, в частности, от 7,0% до 11,0%;

- пролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 10,6% до 14,6%, в частности, от 11,6% до 13,6%, в частности, от 12,1% до 13,1%, предпочтительно примерно 12,6%;

при этом композиция пептидов, по результатам анализа путем эксклюзионной хроматографии, в процессе которой каждый из пептидов композиции пептидов элюируется со временем удерживания, которое характеризует кажущуюся молекулярную массу указанного пептида, характеризуется кривой элюирования (т.е. кривой элюирования на хроматограмме) пептидов, имеющих значение площади под кривой (т.е. значение, представляющее собой массовое количество пептидов), соответствующее кажущейся молекулярной массе пептидов менее 1400 Да, такое что отношение указанной площади к общей площади под кривой (соответствующей всем пептидам в композиции) составляет менее 40%, в частности, менее 38%, предпочтительно от 30% до 38%, в частности, от 30% до 35%;

при этом указанный анализ проводят, как описано ниже:

на колонке для фильтрации с размерами 300×7,8 мм, содержащей неподвижную фазу, образованную из силикагеля с пористостью 5 мкм;

температуру колонки поддерживают на уровне 40°С;

с применением в качестве подвижной фазы раствора, образованного (А) сверхчистой водой, содержащей 0,1 об. % трифторуксусной кислоты, и (В) ацетонитрилом, где объемное отношение А/В составляет 75/25;

введение в верхнюю часть колонки для гель-фильтрации объема раствора, содержащего композицию пептидов;

скорость потока подвижной фазы в колонке составляет 0,6 мл/мин, и;

пептиды композиции детектируют по поглощению при длине волны 214 нм.

Во всем объеме текста "аминограмма" обозначает список свободных аминокислот, образующих посредством пептидной цепи (или связывания) последовательность пептида или последовательность пептидов из смеси пептидов. Такую аминограмму получают путем анализа - в частности, путем общего анализа или анализа последовательности - аминокислот, составляющих пептид или смесь пептидов.

В частности, природу и количество аминокислот, составляющих пептиды композиции согласно настоящему изобретению, определяют при помощи любого из способов общего анализа, известных сами по себе специалистам в данной области техники. В частности, указанный анализ проводят в соответствии со стандартом ISO 13903:2005 путем анализа содержания свободных аминокислот и общего содержания аминокислот с применением анализатора аминокислот или с применением оборудования для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Гидроксипролин анализируют путем непрерывного анализа и колориметрического детектирования.

Аминограмма, полученная путем общего анализа композиции согласно настоящему изобретению, демонстрирует аминокислотный состав коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса. Таким образом, настоящее изобретение относится к такой композиции пептидов, получаемой путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса под воздействием цистеиновой протеазы растительного происхождения - в частности, протеазы класса ЕС 3.4.22.2-. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что применение такой цистеиновой протеазы позволяет получать композицию пептидов, которые являются водорастворимыми, т.е. 100% водорастворимыми, и которые полностью усваиваются желудочно-кишечным трактом, которая характеризуется распределением кажущихся молекулярных масс, охватывающим узкий диапазон от примерно одной тысячи до нескольких тысяч дальтонов, т.е. не содержащей пептиды с высокой кажущейся молекулярной массой, и также содержащей низкую долю пептидов с низкой кажущейся молекулярной массой.

Кроме того, разделение пептидов композиции пептидов согласно настоящему изобретению осуществляют, в зависимости от их кажущейся молекулярной массы, подвергая композицию пептидов стадии аналитического разделения путем жидкостной хроматографии на колонке для фильтрации с пористым силикагелем (BioSep-SEC-S2000, Phenomenex, Le Peck, France) с высокой поверхностной плотностью силанольных групп.

В качестве подвижной фазы применяют раствор, содержащий (A) сверхчистую воду с добавленной к ней трифторуксусной кислотой (0,1 об. %) и (B) ацетонитрил (А/В; 75/25; об./об.). Во время анализа температуру колонки для фильтрации поддерживают на уровне 40°С. скорость потока подвижной фазы в неподвижной фазе составляет 0,6 мл/мин. Объем подлежащей анализу композиции пептидов, вводимой в верхнюю часть колонки для гель-фильтрации, составляет 25 мкл, и детектирование проводят непрерывно по поглощению при длине волны 214 нм. Получают хроматограмму, на которой каждый пик характеризуется значением продолжительности или времени удерживания (выраженным в минутах после введения смеси, подлежащей анализу, в верхнюю часть колонки), определенным при максимальном значении поглощения пика. Кажущуюся молекулярную массу каждого из пептидов, соответствующую указанному значению времени удерживания при максимальном значении поглощения каждого пика, определяют при помощи предварительно построенной калибровочной кривой, полученной путем анализа - в тех же условиях проведения хроматографии, как описаны выше - пептидов с определенными кажущимися молекулярными массами. Например, такую калибровочную кривую получают путем анализа, в тех же условиях проведения хроматографии, смеси пептидов/белков сравнения с известными кажущимися молекулярными массами от 100 Да до 30 кДа.

С помощью хроматограммы, представляющей изменение поглощения при 214 нм в течение хроматографического анализа композиции пептидов согласно настоящему изобретению, долю пептидов с кажущейся молекулярной массой менее 1400 Да определяют путем оценки отношения значения площади под кривой - т.е. значения суммы площадей под пиками кривой - соответствующей пептидам с кажущейся молекулярной массой менее 1400 Да к значению общей площади под всей кривой - т.е. значение суммы площадей под каждым пиком кривой - соответствующему всем пептидам композиции пептидов.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции пептидов, получаемой путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса под воздействием цистеиновой протеазы растительного происхождения, при этом каждый из пептидов композиции содержит от 2 до нескольких десятков аминокислот, предпочтительно от 2 аминокислот до 100 аминокислот.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой глицин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 20,0% до 22,4%, в частности, от 20,0% до 21.9%, в частности, от 20,4% до 21,4%.

В некоторых других вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой глицин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 22,4% до 24,9%, в частности, от 22,9% до 24,4%, в частности, от 23,0% до 24,0%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой гидроксипролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 7,0% до 9,0%, в частности, от 7,5% до 8,5%, предпочтительно от 7,7% до 8,5%.

В некоторых других вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой гидроксипролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 9,5% до 11,5%, в частности, от 10,0% до 11,0%, предпочтительно примерно 10,5%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой глутаминовая кислота содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 8,0% до 13,0%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой глутаминовая кислота содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 8,0% до 10,0%, в частности, от 8,5% до 9,5%, предпочтительно от 9,0% до 9,5%.

В некоторых других вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой глутаминовая кислота содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 10,5% до 12,5%, в частности, от 11,0% до 12,0%, предпочтительно примерно 11,6%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой аргинин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 6,9% до 10,9%, в частности, от 7,9% до 9,9%, в частности, от 8,0% до 9,0%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой аланин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 7,3% до 11,5%, в частности, от 8,0% до 10,0%, в частности, от 8,1% до 9,6%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой аспарагиновая кислота содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 3,1% до 7,1%, в частности, от 4,1% до 6,1%, в частности, от 4,6% до 5,6%, предпочтительно от 5,0% до 5,5%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой лизин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 1,5% до 5,5%, в частности, от 2,5% до 4,5%, в частности, от 3,0% до 4,0%, предпочтительно от 3,1% до 3,6%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой серии содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 1,5% до 5,5%, в частности, от 2,5% до 4,5%, в частности, от 3,0% до 4,0%, предпочтительно от 3,2% до 3,6%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой треонин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0,7% до 4,7%, в частности, от 1,7% до 3,7%, в частности, от 2,2% до 3,2%, предпочтительно от 2,4% до 2,8%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой лейцин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0,6% до 4,6%, в частности, от 1,6% до 3,6%, в частности, от 2,1% до 3,1%, предпочтительно от 2,4% до 2,9%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой фенилаланин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0,3% до 4,3%, в частности, от 1,3% до 3,3%, в частности, от 1,8% до 2,8%, предпочтительно от 1,8% до 2,4%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой валин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 4,0%, в частности, от 1,0% до 3,0%, в частности, от 1,5% до 2,5%, предпочтительно от 1,8% до 2,5%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой изолейцин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 3,5%, в частности, от 0,5% до 2,5%, в частности, от 0,9% до 2,0%, предпочтительно от 0,9% до 1,6%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой гидроксилизин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 3,5%, в частности, от 0,5% до 2,5%, в частности, от 1,0% до 2,0%, предпочтительно примерно 1,5%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой гистидин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 3,3%, в частности, от 0 до 2,3%, в частности, от 0,5% до 1,5%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой метионин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 2,5%, в частности, от 0 до 2,0%, в частности, от 0,5% до 1,8%, предпочтительно от 0,7% до 1,6%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой тирозин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 1,5%, в частности, от 0 до 1,0%, в частности, от 0 до 0,9%, предпочтительно от 0,2% до 0,8%.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой цистеин и цистин содержатся в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 2%, в частности, от 0 до 1,0%, в частности, от 0 до 0,5%, предпочтительно примерно 0,03%.

Композиция согласно настоящему изобретению имеет аминограмму, согласно которой незаменимые аминокислоты (лизин, метионин, фенилаланин, треонин, валин, лейцин, изолейцин и гистидин) совместно составляют от 15% до 20%.

Предпочтительно в некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере 90% - в частности, по меньшей мере 95% - пептидов композиции пептидов имеют кажущуюся молекулярную массу менее 15000 Да (дальтонов), в частности, от 200 Да до 15000 Да, предпочтительно от 200 Да до 14000 Да, в частности, от 200 Да до 13000 Да. Предпочтительно в некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере 90% пептидов композиции пептидов имеют кажущуюся молекулярную массу от 200 Да до 12000 Да.

Пептиды композиции согласно настоящему изобретению имеют узкое распределение кажущихся молекулярных масс, охватывающее узкий диапазон от примерно одной сотни до нескольких тысяч дальтонов, т.е. не содержащий пептиды с высокой кажущейся молекулярной массой, содержащие более 100 аминокислот, и также имеющий низкую долю пептидов с низкой кажущейся молекулярной массой.

Предпочтительно в некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением пептиды композиции имеют среднее значение кажущейся молекулярной массы от 2500 Да до 3600 Да, в частности, от 2700 Да до 3600 Да. Поскольку каждый пептид в композиции пептидов согласно настоящему изобретению вносит массовый вклад в композицию, среднее значение кажущейся молекулярной массы пептидов композиции соответствует среднему каждого значения, называемому взвешенным значением, кажущейся молекулярной массы каждого взвешенного пептида в виде значения, представляющего массовый вклад каждого пептида в композиции. Значение, представляющее массовый вклад каждого пептида или группы пептидов в композиции, выражается в процентах от значения площади под кривой, соответствующей указанному пептиду или указанной группе пептидов, по сравнению со значением общей площади под кривой, соответствующей всем пептидам композиции.

На практике взвешенное значение кажущейся молекулярной массы группы пептидов, соответствующих одному и тому же пику хроматограммы, соответствует значению кажущейся молекулярной массы, считанному в верхней точке (максимум) указанного пика хроматограммы, умноженному на отношение значения площади под кривой указанного пика к (общей) площади под кривой хроматограммы. "Площадь под кривой" или "площадь под пиком" обозначает площадь пространства между кривой, формирующей пик хроматограммы, и базовой линией хроматограммы. В частности, площадь под одним из пиков хроматограммы находится между двумя минимумами кривой хроматограммы, заключающими между собой верхнюю точку (или максимум) кривой хроматограммы.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации композиция пептидов согласно настоящему изобретению, по результатам анализа путем эксклюзионной хроматографии, в процессе которой каждый из пептидов композиции пептидов элюируется со временем удерживания, которое характеризует кажущуюся молекулярную массу указанного пептида, имеет кривую, представляющую элюирование (т.е. хроматограмму) пептидов, имеющих значение площади под указанной кривой (т.е. значение площади, представляющее массовое количество пептидов), соответствующее пептидам с кажущейся молекулярной массой более 10000 Да - в частности, от 10000 Да до 50000 Да, such такое что отношение указанной площади к общей площади под кривой (соответствующей всем пептидам в композиции) составляет менее 15%, в частности, менее 10%. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами реализации указанное отношение составляет от 2,5% до 8,5%.

В соответствии с другими конкретными вариантами реализации композиция пептидов согласно настоящему изобретению может не содержать пептидов с высокой молекулярной массой. В соответствии с указанными другими конкретными вариантами реализации композиция пептидов согласно настоящему изобретению получена из водорастворимых пептидов.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации композиция пептидов согласно настоящему изобретению, по результатам анализа путем эксклюзионной хроматографии, в процессе которой каждый из пептидов композиции пептидов элюируется со временем удерживания, которое характеризует кажущуюся молекулярную массу указанного пептида, имеет кривую, представляющую элюирование (т.е. хроматограмму) пептидов, имеющих значение площади под указанной кривой (т.е. значение площади, представляющее массовое количество пептидов), соответствующее пептидам с кажущейся молекулярной массой от 1800 Да до 10000 Да, такое что отношение указанной площади к общей площади под кривой (соответствующей всем пептидам в композиции) составляет более 35% - в частности, от 35% до 70%, в частности, от 45% до 65%. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами реализации указанное отношение составляет от 49% до 55%.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации композиция пептидов согласно настоящему изобретению, по результатам анализа путем эксклюзионной хроматографии, в процессе которой каждый из пептидов композиции пептидов элюируется со временем удерживания, которое характеризует кажущуюся молекулярную массу указанного пептида, имеет кривую, представляющую элюирование (т.е. хроматограмму) пептидов, имеющих значение площади под указанной кривой (т.е. значение площади, представляющее массовое количество пептидов), соответствующее пептидам с кажущейся молекулярной массой от 600 Да до 1800 Да, такое что отношение указанной площади к общей площади под кривой (соответствующей всем пептидам в композиции) составляет от 15% до 45% - в частности, от 20% до 40%, в частности, от 25% до 35%. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами реализации указанное отношение составляет от 27% до 32%.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации композиция пептидов согласно настоящему изобретению, по результатам анализа путем эксклюзионной хроматографии, в процессе которой каждый из пептидов композиции пептидов элюируется со временем удерживания, которое характеризует кажущуюся молекулярную массу указанного пептида, имеет кривую, представляющую элюирование (т.е. хроматограмму) пептидов, имеющих значение площади под указанной кривой (т.е. значение площади, представляющее массовое количество пептидов), соответствующее пептидам с кажущейся молекулярной массой менее 600 Да, такое что отношение указанной площади к общей площади под кривой (соответствующей всем пептидам в композиции) составляет менее 10%. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами реализации указанное отношение составляет от 8,5% до 14,5%.

Предпочтительно композиция согласно настоящему изобретению, по результатам хроматографического анализа на анионообменной колонке, в процессе которого каждый из пептидов композиции пептидов элюируется из колонки со временем удерживания, которое характеризует его заряд, имеет:

- значение площади под пиком, соответствующим анионным пептидам;

- значение площади под пиком, соответствующим нейтральным пептидам, и;

- значение площади под пиком, соответствующим катионным пептидам;

такие, что отношение указанного значения площади под пиком, соответствующим анионным пептидам, к сумме значений площадей под пиками, соответствующими анионным пептидам, нейтральным пептидам и катионным пептидам композиции, составляет от 27,0% до 45%, в частности, от 30% до 45%, в частности, от 35% до 43%, предпочтительно от 35% до 40%;

при этом значение площади под пиком, соответствующим анионным пептидам, значение площади под пиком, соответствующим катионным пептидам, и значение площади под пиком, соответствующим нейтральным пептидам, определены путем хроматографического анализа в условиях, описанных ниже:

применение хроматографической колонки с размерами 100×7,8 мм, содержащей в качестве неподвижной фазы гидрофильную анионообменную смолу, функционализированную группами четвертичного аммония, с размером частиц 10 мкм;

применение в качестве первой подвижной фазы для элюирования катионных пептидов и нейтральных пептидов 5 мМ водного Трис-буфера (С) при рН 8,35 в течение 7 минут с момента введения композиции, подлежащей анализу, в верхнюю часть колонки, а затем применение второй подвижной фазы для элюирования анионных пептидов, в которой отношение объема буфера (D), образованного 5 мМ Трис, 5 М NaCl при рН 8,35, к объему буфера (С) линейно увеличивается от 0 до 100% в течение 30 минут;

со скоростью потока подвижной фазы в колонке 1 мл/мин;

анализ проводят при температуре 25°С, и;

с детектированием по поглощению при длине волны 214 нм на выходе из колонки.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением пептиды композиции согласно настоящему изобретению, по результатам анализа гидрофобности путем обращенно-фазовой жидкостной хроматографии, имеют время удерживания от 16 мин до 36 мин;

указанный анализ гидрофобности проводят в следующих условиях:

применение хроматографической колонки с размерами 250×4,6 мм, содержащей неподвижную фазу, образованную из диоксида кремния, привитого бутильными группами, с размером частиц 5 мкм и значением пористости

применение в качестве первой подвижной фазы для элюирования гидрофильных пептидов раствора (Е) трифторуксусной кислоты в концентрации 0,1% в сверхчистой воде в течение 7 минут с момента введения композиции, подлежащей анализу, в верхнюю часть колонки, а затем применение второй подвижной фазы для элюирования гидрофобных пептидов, в которой отношение объема раствора (F) трифторуксусной кислоты в концентрации 0,1% (по объему) в воде, содержащей 40% ацетонитрила, к объему раствора (Е) линейно увеличивается от 0 до 40% в течение 30 минут;

со скоростью потока подвижной фазы в колонке 0,6 мл/мин;

анализ проводят при температуре 40°С, и;

с детектированием по поглощению при длине волны 214 нм на выходе из колонки.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит пептиды, которые являются гидрофобными по природе, которые элюируются из колонки, указанной выше, и в условиях, указанных выше, со временем удерживания, соответствующим процентному содержанию ацетонитрила от 12% до 38%. Среднее время удерживания пептидов композиции согласно настоящему изобретению составляет 26 мин, что соответствует процентному содержанию ацетонитрила в элюенте 25%.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением композиция пептидов находится в жидком состоянии. Это может быть раствор композиции пептидов согласно настоящему изобретению в жидком растворителе, в частности, в водном растворителе.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением композиция пептидов находится в твердом состоянии. Композиция пептидов может находиться в форме твердого вещества в разделенном виде. В частности, это может быть твердое вещество в по меньшей мере частично дегидратированном состоянии. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению может находиться в форме порошка.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением композиция пептидов не содержит углеводов.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением композиция пептидов не содержит жиров.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением твердые вещества композиции пептидов содержат массовую долю пептидов коллагена более 95%, в частности, более 99%. Таким образом, композиция пептидов содержит количество пептидов коллагена такое, что массовое отношение пептидов коллагена в твердых веществах композиции пептидов к твердым веществам композиции пептидов составляет более 95%, в частности, более 99%.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением пептиды композиции являются водорастворимыми. Предпочтительно пептиды композиции являются водорастворимыми пептиды композиции пептидов являются 100% водорастворимыми. Предпочтительно композиция пептидов является гидросовместимой.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением пептиды композиции пептидов образуются в результате контролируемого ферментативного гидролиза коллагена из кожи по меньшей мере одной рыбы, выбранной из группы, состоящей из рыб семейства Pangasiidae - в частности, Pangasius hypophtalmus (или Pangasianodon hypophtalmus), Pangasius pangasius, Pangasius bocourti - и из семейства Cichlidae - в частности, из рода Oreochromis, в частности, Oreochromis niloticus, или из рода Tilapia. Предпочтительно пептиды композиции пептидов образуются в результате контролируемого ферментативного гидролиза коллагена из кожи по меньшей мере одной рыбы, обитающей в водах умеренного пояса.

Настоящее изобретение также распространяется на применение такой композиции пептидов для терапевтического лечения организма человека или животного. Таким образом, настоящее изобретение также распространяется на такую композицию пептидов для ее применения в качестве лекарственного средства. Таким образом, настоящее изобретение распространяется на такую композицию пептидов для ее применения в качестве лекарственного средства для профилактического или терапевтического лечения по меньшей мере одного заболевания организма человека или животного.

В частности, настоящее изобретение также распространяется на композицию пептидов для ее применения в качестве лекарственного средства для по меньшей мере одного из следующих лечений:

- лечение желудочно-кишечного заболевания;

- лечение кандидоза кишечного тракта;

- лечение желудочно-кишечного воспаления, и;

- поддержание кишечной микробиоты.

Настоящее изобретение также распространяется на любое применение композиции пептидов согласно настоящему изобретению в пище человека. В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящее изобретение также распространяется на любое применение композиции пептидов согласно настоящему изобретению в пище человека, исключая любое применение в качестве лекарственного средства. В частности, композицию согласно настоящему изобретению преимущественно применяют в качестве пищевой добавки.

Настоящее изобретение также распространяется на композицию пептидов, полученную способом, в котором:

- собирают кожу рыб из вод умеренного пояса - в частности, из семейства Pangasiidae и/или из семейства Cichlidae, а затем;

- последовательно проводят следующие стадии:

по меньшей мере одну стадию мытья кожи, а затем;

по меньшей мере одну стадию обработки кожи кислотой или щелочью, подходящую для экстракции по меньшей мере части коллагена из кожи, а затем;

по меньшей мере одну стадию гидролиза коллагена по меньшей мере одной цистеиновой протеазой растительного происхождения - в частности, по меньшей мере одной протеазой Carica - при температуре менее 75°С, а затем;

прерывание ферментативного гидролиза путем нагревания коллагенового гидролизата до температуры, превышающей температуру денатурации каждой из цистеиновых протеаз, с получением таким образом композиции пептидов.

Предпочтительно в способе согласно настоящему изобретению после стадии обработки кожи кислотой или щелочью проводят по меньшей мере одну жидкостную/твердофазную экстракцию коллагена в воде, нагретой до температуры от 60°С до 98°С. Предпочтительно в способе согласно настоящему изобретению затем проводят стадию разделения - в частности, стадию разделения путем осаждения - фракции, содержащей твердые вещества (или жиры) и раствора, содержащего экстрагированный коллаген, а затем раствор, содержащий экстрагированный коллаген, подвергают стадии очистки, например, путем фильтрования при помощи диатомовой земли и/или деминерализации на ионообменной смоле, подходящей для получения очищенного раствора, содержащего коллаген, при этом твердые вещества в очищенном растворе содержат массовую долю коллагена по меньшей мере 99%, в частности, по меньшей мере 99,5%, в частности, по меньшей мере 99,8%. Получают очищенный раствор коллагена, содержащий по существу чистый коллаген. В частности, получают такой очищенный раствор коллагена, который является по существу бесцветным. В частности, получают такой очищенный раствор коллагена, который по существу - в частности, полностью - не содержит эластина. Очищенный раствор концентрируют с получением очищенного коллагенового геля, а затем очищенный коллагеновый гель подвергают стадии гидролиза коллагена.

Такой процесс позволяет получать композицию пептидов согласно настоящему изобретению, которая является по существу бесцветной. Такой процесс позволяет получать композицию пептидов согласно настоящему изобретению, которая по существу не содержит эластина. В частности, он позволяет получать такую композицию пептидов согласно настоящему изобретению без какой-либо стадии хроматографической очистки композиции пептидов.

В таком процессе преимущественно и в соответствии с настоящим изобретением проводят последующую стадию фильтрования композиции пептидов. Предпочтительно также проводят стадию пастеризации композиции пептидов в течение по меньшей мере 2 минут при температуре пастеризации по меньшей мере от 85°С до 90°С.

В таком процессе преимущественно и в соответствии с настоящим изобретением проводят стадию сушки композиции пептидов. Указанную стадию композиции пептидов проводят путем сушки распылением с получением таким образом композиции согласно настоящему изобретению, которая является по существу дегидратированной и находится в форме порошка.

Таким образом, настоящее изобретение распространяется на композицию пептидов, полученную способом, в котором:

- собирают кожу рыб из вод умеренного пояса в частности, из семейства Pangasiidae и/или из семейства Cichlidae, а затем;

- последовательно проводят следующие стадии:

по меньшей мере одну стадию мытья кожи, а затем;

по меньшей мере одну стадию обработки кожи кислотой, подходящую для экстракции по меньшей мере части коллагена из кожи, а затем;

по меньшей мере одну стадию гидролиза коллагена по меньшей мере одной цистеиновой протеазой растительного происхождения - в частности, по меньшей мере одной протеазой Carica - при температуре менее 75°С, а затем;

прерывание ферментативного гидролиза путем нагревания коллагенового гидролизата до температуры, превышающей температуру денатурации каждой из цистеиновых протеаз, с получением таким образом композиции пептидов;

указанная композиция пептидов по результатам общего анализа имеет аминокислотный состав, при котором:

- глицин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 20,0% до 24,5%;

- гидроксипролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 6,0% до 12,0%;

- пролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 10,6% до 14,6%;

композиция пептидов, по результатам анализа путем эксклюзионной хроматографии, в процессе которой каждый из пептидов композиции пептидов элюируется со временем удерживания, которое характеризует кажущуюся молекулярную массу указанного пептида, имеет кривую элюирования (т.е. кривую элюирования на хроматограмме) пептидов, имеющих значение площади под кривой (т.е. значение, представляющее собой массовое количество пептидов), соответствующее кажущейся молекулярной массе пептидов менее 1400 Да, такое что отношение указанного значения площади к общей площади под кривой (соответствующей всем пептидам в композиции) составляет менее 40%;

указанный анализ проводят, как описано ниже:

на колонке для фильтрации с размерами 300×7,8 мм, содержащей неподвижную фазу, образованную из силикагеля с пористостью 5 мкм;

температуру колонки поддерживают на уровне 40°С;

с применением в качестве подвижной фазы раствора, образованного (A) сверхчистой водой, содержащей 0,1 об. % трифторуксусной кислоты, и (B) ацетонитрилом, где объемное отношение А/В составляет 75/25;

введение в верхнюю часть колонки для гель-фильтрации объема раствора, содержащего композицию пептидов;

скорость потока подвижной фазы в колонке составляет 0,6 мл/мин, и;

пептиды композиции детектируют по поглощению при длине волны 214 нм.

Настоящее изобретение также относится к композиции пептидов, к такой композиции пептидов для ее применения в качестве лекарственного средства, к способу получения такой композиции пептидов и к такой композиции пептидов, получаемой при помощи такого способа ее получения, характеризующейся комбинацией всех или некоторых характеристик, указанных выше или ниже.

Другие задачи, характеристики и преимущества настоящего изобретения станут очевидны при ознакомлении со следующим описанием, которое является не ограничивающим и относится к прилагаемым чертежам, на которых:

- фигура 1 представляет собой хроматограмму, представляющую анализ композиции пептидов согласно настоящему изобретению путем гель-фильтрации;

- фигура 2 представляет собой хроматограмму, представляющую ВЭЖХ анализ композиции пептидов согласно настоящему изобретению на анионообменной смоле;

- фигура 3 представляет собой хроматограмму, представляющую анализ композиции пептидов согласно настоящему изобретению путем обращенно-фазовой хроматографии;

- фигура 4 представляет собой графическое изображение, представляющее изменение массы тела мышей, у которых воспаление толстой кишки было вызвано натриевой солью сульфата декстрана (DSS);

- фигура 5 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа IL-1β в толстой кишке у мышей методом ELISA;

- фигура 6 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа IL-6 в толстой кишке у мышей методом ELISA;

- фигура 7 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа TNF-α в толстой кишке у мышей методом ELISA;

- фигура 8 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа TGF-β в толстой кишке у мышей методом ELISA;

- фигура 9 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа грибковой флоры методом ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 10 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа Saccharomyces cerevisiae методом ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 11 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа Enterobacteriaceae методом ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 12 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа Firmicutes методом ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 13 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа Bacteroidetes методом ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 14 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа Faecalibacterium prausnitzii методом ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 15 представляет собой графическое изображение гистограммы результата анализа Lactobacillus murinus методом ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 16 представляет собой графическое изображение гистограммы анализа матричной РНК TGF-β методом количественной ОТ-ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 17 представляет собой графическое изображение гистограммы анализа матричной РНК индуцибельной NO-синтазы (iNOS) методом количественной ОТ-ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 18 представляет собой графическое изображение гистограммы анализа матричной РНК Fizz1 методом количественной ОТ-ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 19 представляет собой графическое изображение гистограммы анализа матричной РНК 5-LOX методом количественной ОТ-ПЦР в толстой кишке у мышей;

- фигура 20 представляет собой графическое изображение гистограммы анализа матричной РНК 12/15-LOX методом количественной ОТ-ПЦР в толстой кишке у мышей.

Процесс получения композиции согласно настоящему изобретению

Собирали или приобретали кожу рыб из вод умеренного пояса, в частности, рыб семейства Pangasiidae - в частности, Pangasius hypophtalmus (или Pangasianodon hypophtalmus), Pangasius pangasius, Pangasius bocourti - и/или сомов или рыб семейства Cichlidae - в частности, рода Oreochromis, в частности, Oreochromis niloticus, или рода Tilapia.

Последовательно проводили стадии промывки кожи, кислотной обработки промытой кожи, экстракции и очистки коллагена. Затем проводили стадию ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб, полученного таким образом, с получением композиции согласно настоящему изобретению. Для этого воду нагревали до температуры от 70°С до 75°С. Коллаген из кожи рыбы постепенно выливали в горячую воду при перемешивании, так что массовая доля коллагена в воде составляла 45%, и рН раствора доводили до рН 6,0. Затем в раствор повторно растопленного коллагена добавляли цистеиновую протеазу растительного происхождения. В качестве цистеиновой протеазы выбирали по меньшей мере одну протеазу Carica , в частности, липаин (Lypaine®, LYVEN, Collombelles, France) в сухом состоянии. Массовое отношение цистеиновой протеазы к массе коллагена адаптировали в зависимости от желаемых условий гидролиза. Например, массовое отношение цистеиновой протеазы к массе коллагена составляло 0,2%. Температуру раствора поддерживали на уровне от 65°С до 70°С, адаптированном для стимулирования ферментативной активности цистеиновой протеазы и поддержания оптимальной текучести коллагенового гидролизата, с учетом того факта, что вязкость коллагенового гидролизата снижается со временем гидролиза. Раствор выдерживали при указанной температуре в течение примерно 45 минут.

Реакцию ферментативного гидролиза останавливали нагреванием коллагенового гидролизата до температуры, превышающей температуру денатурации цистеиновой протеазы, например, до температуры от 85°С до 90°С, в течение 20 минут. Гидролизат коллагена из кожи рыб необязательно подвергали стадии фильтрования, а затем стадии пастеризации в течение по меньшей мере 2 минут при температуре пастеризации по меньшей мере от 85°С до 90°С.

Затем гидролизат коллагена или пептиды коллагена подвергали стадии сушки в условиях, подходящих для получения композиции согласно настоящему изобретению в виде порошка с заранее определенным размером частиц.

Структурные характеристики пептидов композиции согласно настоящему изобретению

Аминокислотный состав

Определение характеристик композиции пептидов, образующейся в результате гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса в соответствии с настоящим изобретением, проводили путем анализа содержания свободных аминокислот и общего содержания аминокислот с применением анализатора аминокислот или с применением оборудования для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии со стандартом ISO 13903:2005. Для сравнения определяли аминокислотный состав гидролизата коллагена из кожи холодноводных рыб (минтай Аляски), добытых из глубоководных районов Берингова моря (Аляска). Результаты сравнения представлены в таблице 6 ниже.

Также проводили характеризацию композиции пептидов согласно настоящему изобретению по распределению кажущихся молекулярных масс пептидов, по полярности пептидов и по гидрофобности пептидов.

Анализ кажущихся молекулярных масс пептидов

Распределение кажущихся молекулярных масс пептидов, составляющих композицию согласно настоящему изобретению, анализировали путем гель-проникающей хроматографии на колонке для жидкостной хроматографии с размерами 300×7,8 мм, в которой неподвижная фаза состояла из геля на основе диоксида кремния (BioSep-SEC-S2000, Phenomenex, Le Peck, France) с пористостью 5 мкм. Колонку для фильтрации поддерживали при температуре 40°С. Подвижная фаза состояла из смеси, содержащей (А) сверхчистую воду с добавленной к ней трифторуксусной кислотой (0,1 об. %) и (В) ацетонитрила (А/В; 75/25; об./об.). Скорость потока подвижной фазы поддерживали на уровне 0,6 мл/мин. Объем раствора, содержащего композицию пептидов, подлежащую анализу, составлял 25 мкл. Детектирование проводили на выходе из колонки для гель-проникающей хроматографии путем измерения поглощения при длине волны 214 нм. Параллельно строили калибровочную кривую для определения изменения кажущейся молекулярной массы от времени удерживания. Для построения указанной калибровочной кривой выбирали известные пептиды с молекулярной массой от 100 Да до 30 кДа. Известными стандартами являются пролин, глутатион, рибонуклеаза А и трипсин с кажущимися молекулярными массами 115 Да, 307 Да, 13,7 кДа и 28,2 кДа, соответственно.

Кажущиеся молекулярные массы и времена удерживания, выраженные в минутах, для стандартов приведены в таблице 1 ниже:

Пептиды последовательно элюировались из колонки в зависимости от их уменьшающейся кажущейся молекулярной массы. Значение времени удерживания каждого из семейств пептидов композиции, подлежащей анализу, соответствующие пику на хроматограмме, считывали в верхней точке каждого из пиков хроматограммы и преобразовывали в значение кажущейся молекулярной массы путем сравнения с калибровочной кривой. Относительные значения количеств каждого из семейств пептидов соответствуют значению площади под кривой каждого из пиков хроматограммы. Указанные значения выражали отношением значения площади под кривой, соответствующей семейству пептидов, к сумме значений площади каждого из семейств пептидов.

Значения времен удерживания (мин), соответствующие кажущиеся молекулярные массы (Да) и проценты площади под кривой (выраженные в процентах от общей площади под кривой), соответствующие каждому из семейств пептидов хроматограммы, представленной на фигуре 1, приведены в таблице 2 ниже. Каждая группа пептидов, соответствующая пику на хроматограмме, идентифицируется значением кажущейся молекулярной массы, соответствующим максимуму указанного пика на хроматограмме.

Доля пептидов композиции согласно настоящему изобретению хроматограмма которой представлена на фигуре 1, и значения которой приведены в таблице 2 - для которой кажущаяся молекулярная масса менее 1400 Да, составляла 31,2% (кажущиеся молекулярные массы со значениями от 983 Да до 333 Да) относительно всех пептидов композиции.

Средняя кажущаяся молекулярная масса пептидов композиции согласно настоящему изобретению, значения кажущихся молекулярных масс которых приведены в таблице 2, составляла 3442 Да. Среднюю кажущуюся молекулярную массу пептидов композиции определяли, как среднее значений взвешенных кажущихся молекулярных масс, соответствующих каждой группе пептидов композиции, соответствующих одному и тому же пику на хроматограмме. Взвешенное значение кажущейся молекулярной массы группы пептидов одного и того же пика на хроматограмме соответствует значению кажущейся молекулярной массы в верхней точке (максимуме) пика, взвешенному по отношению значения площади под кривой соответствующего пика к (общей) площади под кривой хроматограммы. "Площадь под кривой" или "площадь под пиком" обозначает площадь пространства между кривой, формирующей пик хроматограммы, и базовой линией хроматограммы. В частности, площадь под одним из пиков хроматограммы находится между двумя минимумами кривой хроматограммы, заключающими между собой верхнюю точку (или максимум) кривой хроматограммы.

Для обобщения в таблице 3 ниже представлены средние значения времен удерживания (мин), соответствующих кажущихся молекулярных масс (Да) и процентов площади под кривой каждого из семейств пептидов, соответствующие отдельным анализам трех композиций пептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Средняя доля пептидов в композициях в соответствии с настоящим изобретением, значения которых приведены в 3 и молекулярная масса которых составляет менее 1400 Да, составляла 35,2% (по существу соответствует кажущимся молекулярным массам от 983 Да до 340 Да).

Анализ полярности составляющих пептидов

Анализировали долю анионных пептидов в композиции согласно настоящему изобретению, распределение кажущихся молекулярных масс которых приведено в таблице 2, т.е. долю пептидов, имеющих отрицательный заряд при рН 8,35. Также анализировали долю нейтральных и/или катионных пептидов в композиции согласно настоящему изобретению, т.е. долю пептидов, имеющих общий нейтральный заряд при рН 8,35 или имеющих положительный заряд при рН 8,35. Такой анализ проводили путем ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в которой неподвижная фаза представляла собой анионообменную смолу (Hydrophase HP-SAX, Interchim, France) с размером частиц 10 мкм. Хроматографическая колонка для ионообменной ВЭЖХ имела размеры 100×7,8 мм.

Хроматографическую колонку для ВЭЖХ кондиционировали путем ионного обмена в трис(гидроксиметил)аминометановом (Трис) буфере при концентрации 5 мМ в воде, рН которого доводили до значения 8,35.

Температуру колонки поддерживали на уровне 25°С. Скорость потока подвижной фазы в колонке составляла 1 мл/мин. Образец композиции пептидов, подлежащей анализу, готовили таким образом, чтобы его концентрация составляла 2 г/л, путем разбавления в сверхчистой воде. Объем 90 мкл указанного раствора, подлежащего анализу, вводили в верхнюю часть колонки. Детектирование проводили путем непрерывного измерения поглощения при 214 нм.

С момента введения образца в верхнюю часть колонки подвижная фаза состояла из 5 мМ Трис с рН 8,35 (раствор А) в течение 7 минут, а затем в подвижной фазе линейно увеличивали долю раствора В, образованного 5 мМ Трис, 5 М NaCl, рН 8,35, от 0 до 100% относительно раствора А в течение 30 минут. Затем элюирование проводили раствором В в течение 2 минут.

Полученная хроматограмма представлена на фигуре 2. Анионные пептиды выходили из колонки со временем удерживания от 10 мин до 17,5 мин, что соответствует концентрации NaCl от 0,5 М до 1,7 М. Доля анионных пептидов в композиции пептидов согласно настоящему изобретению, анализ которой представлен на фигуре 2, составляла 36,9%. Нейтральные и катионные пептиды выходили из колонки со временем удерживания от 1 минуты до 8 минут. Доля нейтральных и катионных пептидов в композиции пептидов согласно настоящему изобретению, анализ которой представлен на фигуре 2, составляла 57,5%.

Для обобщения указанный анализ воспроизводили на трех композициях пептидов в соответствии с настоящим изобретением. Средняя доля анионных пептидов в указанных композициях в соответствии с настоящим изобретением составляла от 27,9% до 42,5%, и средняя доля нейтральных и катионных пептидов в указанных композициях в соответствии с настоящим изобретением составляла от 57,5% до 72,1%.

Анализ гидрофобности составляющих пептидов

Гидрофобность составляющих пептидов в композиции согласно настоящему изобретению анализировали путем обращенно-фазовой жидкостной хроматографии на колонке с диоксидом кремния, привитым бутильными группами (Vydac 214ТР™ С₄, Grace, Epernon, France), с размерами 250×4,6 мм. Размер частиц составлял 5 мкм, и его пористость составляла 300 Å.

Колонку кондиционировали в сверхчистой воде, подкисленной 0,1% трифторуксусной кислотой. Температуру колонки поддерживали на уровне 40°С. Скорость потока подвижной фазы в колонке составляла 0,6 мл/мин. Образец композиции пептидов, подлежащей анализу, готовили таким образом, чтобы его концентрация составляла 2 г/л, путем разбавления в сверхчистой воде. Объем 100 мкл указанного раствора, подлежащего анализу, вводили в верхнюю часть колонки. Детектирование проводили путем непрерывного измерения поглощения при 214 нм.

С момента введения образца в верхнюю часть колонки подвижная фаза состояла из подкисленной воды (раствор А) в течение 7 минут, а затем в подвижной фазе линейно увеличивали долю раствора В, образованного водой, подкисленной 0,1% (по объему) трифторуксусной кислотой, и содержащего 40% ацетонитрила, от 0 до 100% относительно раствора А в течение 30 минут.

Полученная хроматограмма представлена на фигуре 3. Пептиды композиции согласно настоящему изобретению выходили из колонки со временем удерживания от 16 мин до 36 мин, что соответствует процентному содержанию ацетонитрила в элюенте от 12% до 38%. Среднее время удерживания пептидов композиции согласно настоящему изобретению составляло 26 мин, что соответствует процентному содержанию ацетонитрила в элюенте 25%.

Биологическое действие композиции согласно настоящему изобретению

Действие в отношении колонизации Candida albicans и при кандидозе желудочно-кишечного тракта

Анализировали действие композиции согласно настоящему изобретению при кандидозе желудочно-кишечного тракта, индуцированного у самок мышей C57BL/6 возрастом 8 недель и с массой тела 20-25 г. Указанным мышам в течение 21 дня давали композицию согласно настоящему изобретению в количестве 4 г/кг/день. На 21^ый день индуцировали кандидоз желудочно-кишечного тракта путем принудительного введения каждой мыши 5×10⁷ дрожжевых клеток. В период от 2 дня (D2) до 7 дня (D7) после индуцирования собирали экскременты мышей и оценивали уровень дрожжей (КОЕ/мг экскрементов) в хромогенной среде. Результаты приведены в таблице 4 ниже в сравнении со значениями, полученными для мышей, у которых индуцировали кандидоз желудочно-кишечного тракта, но которых не лечили композицией согласно настоящему изобретению.

Композиция согласно настоящему изобретению индуцирует снижение уровня Candida albicans.

Противовоспалительная композиция пептидов согласно настоящему изобретению

Проводили сравнительный анализ стимуляции экспрессии рецепторов воспалительных макрофагов 1 типа (M1) и/или рецепторов противовоспалительных макрофагов 2 типа (М2) при помощи композиции пептидов в соответствии с настоящим изобретением, полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса, и при помощи композиции пептидов, полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи холодноводных рыб (не включена в объем настоящего изобретения).

Макрофаги/моноциты здоровых субъектов-людей культивировали в течение 24 часов в присутствии композиции для предварительной обработки (контроль без пептидов коллагена, не включен в объем настоящего изобретения, таблица 7) в концентрации 100 мкг/мл питательной среды. Оценивали действия указанной предварительной обработки на экспрессию характеристических рецепторов макрофагов 1 типа (M1, воспалительные) и на экспрессию характеристических рецепторов макрофагов 2 типа (М2, противовоспалительные) по уровню продуцирования свободных кислородных радикалов (активные формы кислорода, АФК) рецепторами макрофагов 1 типа, специфически стимулируемых сложным форболовым эфиром ("12-миристат-13-ацетат-форбол, TPA") в концентрации 100 мкМ, или рецепторами макрофагов 2 типа, специфически стимулируемых неопсонизированным зимозаном (NOZ) в концентрации 100 мкг/мл. Уровень продуцирования свободных кислородных радикалов измеряли по хемилюминесценции в присутствии люминола в концентрации 66 мкМ. Результаты, приведенные в таблице 7 ниже, представляют средние значения, полученные по результатам трех анализов.

Наблюдали, что макрофаги/моноциты, не обработанные (не индуцированные) NOZ и ТРА, имеют уровень продуцирования свободных кислородных радикалов, который является по существу постоянным в зависимости от характера предварительной обработки (без коллагена, в соответствии с настоящим изобретением, и не включена в объем настоящего изобретения).

Макрофаги/моноциты, предварительно обработанные композицией пептидов в соответствии с настоящим изобретением, т.е. полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса, демонстрируют повышенную экспрессию рецепторов противовоспалительных макрофагов 2 типа (М2), определяемую интенсивностью хемилюминесценции (5,06×10⁸ AU), индуцированной NOZ, по сравнению с макрофагами/моноцитами, предварительно обработанными композицией пептидов, не включенной в объем настоящего изобретения, т.е. полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи холодно водных рыб (3,91×10⁸ AU).

Макрофаги/моноциты, предварительно обработанные композицией пептидов в соответствии с настоящим изобретением, т.е. полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи рыб из вод умеренного пояса, демонстрируют пониженную экспрессию рецепторов воспалительных макрофагов 1 типа (M1), определяемую интенсивностью хемилюминесценции (6,75×10⁸ AU), индуцированной ТРА, по сравнению с макрофагами/моноцитами, предварительно обработанными композицией пептидов, не включенной в объем настоящего изобретения, т.е. полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи холодноводных рыб (1,49×10⁹ AU).

Композиция пептидов согласно настоящему изобретению имеет противовоспалительный фенотип по сравнению с композицией пептидов, не включенной в объем настоящего изобретения, то есть полученной путем ферментативного гидролиза коллагена из кожи холодноводных рыб, за счет увеличения уровня экспрессии рецепторов противовоспалительных макрофагов 2 типа 2 (М2) и снижения уровня экспрессии рецепторов воспалительных макрофагов 1 типа (M1).

Композиция пептидов в соответствии с настоящим изобретением, получаемая из кожи рыб из вод умеренного пояса и имеющая аминограмму, согласно которой:

- глицин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 20,0% до 24,5%;

- гидроксипролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 6,0% до 12,0%;

- пролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 10,6% до 14,6%;

имеет такой противовоспалительный фенотип, подтверждаемый анализами воспаления толстой кишки на мышиной модели, который не обнаруживается для композиции пептидов, получаемой из кожи холодноводных рыб и имеющей аминограмму, как описано в таблице 6.

Воспаление толстой кишки в мышиной модели

Противовоспалительное действие композиции пептидов согласно настоящему изобретению демонстрировали на мышиной модели фармакологического воспаления, индуцированного натриевой солью сульфата декстрана (DSS, MP Biomedical LLC, Canada), характеризующегося потерей массы и кровавой диареей.

Изучали действие композиции пептидов согласно настоящему изобретению на ограничение потери массы у мышей, получавших DSS. Самкам лабораторных мышей C57BL/6 возрастом от 10 до 11 недель и с массой тела от 20 до 25 грамм в течение 7 дней (D₁-D₇) давали DSS, растворенный в концентрации 1,5% (мас./об.) в питьевой воде для мышей. Указанным мышам также в течение 12 дней (D₁-D₁₂) давали композицию согласно настоящему изобретению в количестве 0,1 г/кг/день; 1 г/кг/день и 4 г/кг/день. Указанное количество композиции согласно настоящему изобретению добавляли в питьевую воду для мышей. В D₁₂ мышей умерщвляли.

Исследовали 5 партий мышей, каждая из которых состояла из 10 мышей, где:

- партии 1 в течение 7 дней давали DSS;

- партии 2 в течение 7 дней давали DSS и в течение 12 дней давали композицию согласно настоящему изобретению в количестве 0,1 г/кг/день;

- партии 3 в течение 7 дней давали DSS и в течение 12 дней давали композицию согласно настоящему изобретению в количестве 1 г/кг/день;

- партии 4 в течение 7 дней давали DSS и в течение 12 дней давали композицию согласно настоящему изобретению в количестве 4 г/кг/день;

- партии 5 в течение 7 дней давали DSS и в течение 12 дней давали гидролизованный казеин, не включенный в настоящее изобретение, в количестве 0,1 г/кг/день.

Параллельно осуществляли контроль на 5 мышах, которым не давали DSS, у которых не индуцировали воспаление и которым не давали композицию пептидов согласно настоящему изобретению.

1. Исследование массы тела

Массу каждой мыши измеряли каждый день и рассчитывали потерю массы для каждой из мышей в каждой партии. Результаты представлены на фигуре 4, на которой контроль представлен пустыми кружками партия 1 представлена заполненными кружками партия 2 представлена пустыми квадратами партия 3 представлена заполненными квадратами партия 4 представлена пустыми треугольниками и партия 5 представлена заполненными треугольниками Наблюдали, что, начиная с дозировки 0,1 г/кг/день (партия 2, ), композиция согласно настоящему изобретению ограничивала потерю массы мышей. Указанное ограничение также наблюдали для дозировок 1 г/кг/день (партия 3, ) и 4 г/кг/день (партия 4, ). Указанное ограничение не наблюдали для лечения гидролизованным казеином (партия 5, ), при котором потеря массы являлась сравнимой с потерей массы мышей из партии 1

Композиция согласно настоящему изобретению позволяет ограничить или даже практически полностью устранить потерю массы, вызванную воспалением, вызванным натриевой солью сульфата декстрана (DSS), у мышей. Композицию согласно настоящему изобретению можно применять в качестве лекарственного средства, в частности, для лечения воспаления толстой кишки.

2. Гистология

В поперечных гистологических срезах толстой кишки мышей, которым вводили только DSS, наблюдали после бихроматического окрашивания гематоксилином и эозином значительную инфильтрацию воспалительных клеток в слизистой и подслизистой оболочке. Толщина эпителия уменьшалась. В эпителии наблюдали обширное язвообразование. В поперечных гистологических срезах толстой кишки мышей, которым вводили DSS и композицию согласно настоящему изобретению в количестве 0,1 г/кг/день, 1 г/кг/день и 4 г/кг/день, наблюдали после бихроматического окрашивания гематоксилином и эозином, плотно упакованные прямые трубчатые железы, что характерно для здорового и нормально функционирующего эпителия.

3. Макроскопический индекс

Для каждого условия вычисляли макроскопический индекс на основании системы, созданной согласно шкале Уоллеса (Wallace), в части, касающейся внешнего вида экскрементов, наличия повреждений толстой кишки, массы толстой кишки и длины толстой кишки, согласно шкале Уоллеса (Е.S. Kimball, N.Н. Wallace, С.R. Schneider, М.R. D'Andrea and P.J. Hornby; 2004; Neurogastroenterol Motil; 16, 811-818. Vanilloid receptor 1 antagonists attenuate disease severity in dextran sulfate sodium-induced colitis in mice). Чем сильнее воспаление толстой кишки, тем выше значение макроскопического индекса, и чем здоровее толстая кишка, тем ниже значение макроскопического индекса.

Средние значения и стандартное отклонение макроскопического индекса мышей из партий 1-5 приведены в таблице 5 ниже.

Наблюдали снижение макроскопического индекса, вызванное лечением композицией согласно настоящему изобретению, т.е. улучшение воспалительного состояния толстой кишки, вызванное композицией согласно настоящему изобретению.

4. Ингибирование экспрессии провоспалительных маркеров у мышей

В день D₁₂ мышей умерщвляли и анализировали уровень экспрессии провоспалительных цитокинов в толстой кишке способом ELISA:

- IL-1β: уровень IL-1β анализировали способом ELISA и выражали в пикограммах (пг) IL-1β на миллиграмм (мг) толстой кишки. Результаты показаны на фигуре 5, где первый столбец (белый столбец) соответствует анализу, который проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали статистически значимое (р<0,05) уменьшение экспрессии IL-1β в толстой кишке мышей, которым вводили композицию пептидов согласно настоящему изобретению в дозах 0,1 г/кг/день, 1 г/кг/день и 4 г/кг/день, по сравнению с толстой кишкой мышей, у которых индуцировали воспаление под действием DSS, и мышей, у которых индуцировали воспаление под действием DSS и которым вводили гидролизованный казеин. Указанный эффект подтверждали путем анализа матричной РНК IL-1β в рамках количественной ОТ-ПЦР, в частности, (р<0,01) для доз 0,1 г/кг/день и 1 г/кг/день;

- IL6: уровень IL6 анализировали способом ELISA и выражали в пикограммах (пг) IL6 на миллиграмм (мг) толстой кишки. Результаты показаны на фигуре 6, где первый столбец (белый столбец) соответствует анализу, который проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали статистически значимое уменьшение экспрессии IL6 в толстой кишке мышей, которым вводили композицию пептидов согласно настоящему изобретению в дозах 0,1 г/кг/день (р<0,01), 1 г/кг/день (р<0,01) и 4 г/кг/день (р<0,05), по сравнению с толстой кишкой мышей, у которых индуцировали воспаление под действием DSS, и мышей, у которых индуцировали воспаление под действием DSS и которым вводили гидролизованный казеин. Указанный эффект подтверждали путем анализа матричной РНК IL6 в рамках количественной ОТ-ПЦР;

- TNF-α: уровень TNF-α анализировали способом ELISA и выражали в пикограммах (пг) TNF-α на миллиграмм (мг) толстой кишки. Результаты показаны на фигуре 7, где первый столбец (белый столбец) соответствует анализу, который проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали статистически значимое уменьшение экспрессии TNF-α в толстой кишке мышей, которым вводили композицию пептидов согласно настоящему изобретению в дозах 0,1 г/кг/день (р<0,05), 1 г/кг/день (р<0,05) и 4 г/кг/день (р<0,05), по сравнению с толстой кишкой мышей, у которых индуцировали воспаление под действием DSS, и мышей, у которых индуцировали воспаление под действием DSS и которым вводили гидролизованный казеин.

В анализе путем количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) матричных РНК МСР1 показано статистически значимое снижение уровня указанных мРНК, индуцируемых DSS, в частности, для доз 0,1 г/кг/день (р<0,01) и 1 г/кг/день (р<0,05) композиции пептидов согласно настоящему изобретению.

Анализ путем количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) матричных РНК индуцибельной NO-синтазы (iNOS) показан на фигуре 17, где первый столбец (белый столбец) соответствует анализу, который проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали статистически значимое уменьшение уровня мРНК iNOS, индуцируемых DSS, для доз 0,1 г/кг/день (р<0,05) и 1 г/кг/день (р<0,05) композиции пептидов согласно настоящему изобретению.

5. Стимулирование экспрессии противовоспалительных маркеров у мышей

В день D₁₂ мышей умерщвляли и анализировали уровень экспрессии противовоспалительных маркеров в толстой кишке:

- TGF-β: уровень TGF-β анализировали способом ELISA и выражали в пикограммах (пг) TGF-β на миллиграмм (мг) толстой кишки. Результаты показаны на фигуре 8, где первый столбец (белый столбец) соответствует анализу, который проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали стимулирование экспрессии TGF-β в толстой кишке мышей, которым вводили композицию пептидов согласно настоящему изобретению в дозах 0,1 г/кг/день, по сравнению с толстой кишкой мышей, у которых индуцировали воспаление под действием DSS. Указанный эффект подтверждали путем анализа матричной РНК TGF-β в рамках количественной ОТ-ПЦР, в частности, для доз 0,1 г/кг/день и 1 г/кг/день композиции пептидов согласно настоящему изобретению (фигура 16);

- Fizz1: Fizz1 является маркером противовоспалительных макрофагов М2. Анализ путем количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) матричных РНК Fizz1 показан на фигуре 18, где первый столбец (белый столбец) соответствует анализу, который проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали статистически значимое увеличение уровня матричных мРНК Fizz1, снижаемых DSS, для доз 0,1 г/кг/день (р<0,05), 1 г/кг/день (р<0,01) и 4 г/кг/день (р<0,05) композиции пептидов согласно настоящему изобретению;

- также наблюдали статистически значимое увеличение уровня матричных мРНК Ym1, снижаемых DSS, для доз 0,1 г/кг/день (р<0,05) композиции пептидов согласно настоящему изобретению.

6. Влияние композиции пептидов согласно настоящему изобретению на флору толстой кишки - микробиоту толстой кишки

В день D₁₂ умерщвляли мышей и проводили количественную оценку флоры толстой кишки у указанных мышей путем ПЦР (полимеразная цепная реакция). Значения нормировали на общее количество бактерий или грибков и по уровню β-актина. β-актин представляет собой ген сравнения, который позволяет проводить стандартизацию по количеству анализируемых тканей толстой кишки. В частности, проводили количественную оценку следующих параметров:

- общая грибковая флора, которую определяли путем количественной амплификации рибосомной ДНК грибков ITS1-2. Отношение R количества рибосомной ДНК грибков ITS1-2 к количеству ДНК β-актина показано на фигуре 9, где первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению восстанавливает грибковую флору, в частности, при дозе 4 г/кг/день;

- дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые определяли путем количественной амплификации рибосомной ДНК 26S. Отношение R количества рибосомной ДНК 26S к количеству ДНК β-актина показано на фигуре 10. Первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению статистически значимо восстанавливает флору Saccharomyces cerevisiae при дозах 0,1 г/кг/день (р<0,05), 1 г/кг/день (р<0,05) и 4 г/кг/день (р<0,05). В указанном случае S. cerevisiae обладает противовоспалительным потенциалом;

- флора Enterobacteriaceae, которую определяли путем количественной амплификации рибосомной ДНК 16S. Отношение R количества рибосомной ДНК 16S к количеству ДНК β-актина показано на фигуре 11. Первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Четвертый столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению обеспечивает снижение уровня флоры Enterobacteriaceae, индуцируемой DSS, при концентрации 0,1 г/кг/день. Enterobacteriaceae связаны с провоспалительным потенциалом;

- флора Firmicutes, которую определяли путем количественной амплификации рибосомной ДНК 16S на фрагменте гена, позволяющем проводить анализ разнообразия филума. Отношение R количества такой рибосомной ДНК 16S к количеству ДНК β-актина показано на фигуре 12. Первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению вызывает статистически значимое снижение уровня флоры Firmicutes, индуцируемой DSS, при концентрациях 0,1 г/кг/день (р<0,05), 1 г/кг/день (р<0,05) и 4 г/кг/день (р<0,05), но также вызывает снижение не индуцированной флоры Firmicutes при тех же концентрациях. Следует отметить, что увеличение уровня флоры Firmicutes обычно наблюдают при воспалительном заболевании желудочно-кишечного тракта (ВЗК, воспалительных заболеваниях кишечника);

- флора Bacteroidetes, которую определяли путем количественной амплификации рибосомной ДНК 16S на фрагменте гена, позволяющем проводить анализ разнообразия филума. Отношение R количества такой рибосомной ДНК 16S к количеству ДНК β-актина показано на фигуре 13. Первый столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Второй столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Трений столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Четвертый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Пятый столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению вызывает статистически значимое снижение уровня флоры Bacteroidetes, индуцируемой DSS, при концентрациях 0,1 г/кг/день (р<0,05), 1 г/кг/день (р<0,05) и 4 г/кг/день (р<0,05). Увеличение уровня Bacteroidetes обычно наблюдают при воспалительном заболевании желудочно-кишечного тракта (ВЗК);

- флора Faecalibacterium prausnitzii, которую определяли путем количественной амплификации специфической ДНК. Отношение R количества такой специфической ДНК к количеству ДНК β-актина показано на фигуре 14. Первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению вызывает статистически значимое увеличение уровня флоры Faecalibacterium prausnitzii, разрушаемой DSS, при концентрациях 0,1 г/кг/день (р<0,01), 1 г/кг/день (р<0,01) и 4 г/кг/день (р<0,01). Увеличение уровня Faecalibacterium prausnitzii обычно наблюдают при воспалительном заболевании желудочно-кишечного тракта (ВЗК). Также Faecalibacterium prausnitzii предположительно обладает противовоспалительными свойствами;

- флора Lactobacillus murinus, которую определяли путем количественной амплификации специфической ДНК. Отношение R количества такой специфической ДНК к количеству ДНК β-актина показано на фигуре 15, где первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению вызывает увеличение уровня флоры Lactobacillus murinus при концентрациях 0,1 г/кг/день, 1 г/кг/день и 4 г/кг/день (р<0,05). Также Lactobacillus murinus предположительно обладает противовоспалительными свойствами.

7. Влияние композиции пептидов согласно настоящему изобретению на ферменты липидного обмена арахидоновой кислоты:

- 5-LOX: анализ путем количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) матричных РНК фермента 5-липоксигеназы (5-LOX) показан на фигуре 19, где первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали статистически значимое снижение экспрессии 5-LOX для доз композиции пептидов согласно настоящему изобретению 0,1 г/кг/день (р<0,01) и 1 г/кг/день (р<0,01) по сравнению с контролем, не индуцированным DSS. Композиция пептидов согласно настоящему изобретению оказывает ингибирующее влияние на экспрессию 5-LOX, способствуя продуцированию провоспалительных липидных медиаторов;

- 12/15-LOX: анализ путем количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) матричных РНК фермента 12/15-липоксигеназы (12/15-LOX) показан на фигуре 20, где первый столбец (белый столбец) соответствует исследованию, которое проводили у контрольных мышей. Второй столбец (столбец с диагональной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 1. Третий столбец (столбец с вертикальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 4. Четвертый столбец (столбец с горизонтальной штриховкой) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 3. Пятый столбец (серый столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 2. Шестой столбец (черный столбец) соответствует анализу, который проводили у мышей из партии 5. Наблюдали статистически значимое увеличение экспрессии 12/15-LOX для доз композиции пептидов согласно настоящему изобретению 0,1 г/кг/день (р<0,01) и 1 г/кг/день (р<0,01) по сравнению с контролем, не индуцированным DSS.

Очевидно, что настоящее изобретение охватывает разнообразные варианты реализации и способы применения. В частности, включены различные способы применения в качестве лекарственного средства, не выходящие за рамки объема защиты настоящего изобретения.

1. Композиция пептидов для лечения желудочно-кишечного заболевания, имеющая аминограмму, согласно которой:

- глицин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 20,0% до 24,5%;

- гидроксипролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 6,0% до 12,0%;

- пролин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 10,6% до 14,6%;

- аланин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 7,3% до 11,3%;

- глутаминовая кислота содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 8,0% до 13,0%;

- серин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 1,5% до 5,5%;

- аргинин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 6,9% до 10,9%;

- аспарагиновая кислота содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 3,1% до 7,1%;

- треонин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0,7% до 4,7%;

- лизин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 1,5% до 5,5%;

- лейцин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0,6% до 4,6%;

- валин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 0,40%;

- гистидин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 3,3%;

- фенилаланин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0,3% до 4,3%;

- метионин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 2,5%;

- изолейцин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 3,5%;

- гидроксилизин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 3,5%;

- тирозин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 1,5%;

- цистеин содержится в таком мольном количестве, что отношение указанного количества к сумме мольных количеств аминокислот в композиции составляет от 0 до 2,0%;

при этом композиция пептидов, по результатам анализа путем эксклюзионной хроматографии, в процессе которой каждый из пептидов композиции пептидов элюируется со временем удерживания, которое характеризует кажущуюся молекулярную массу указанного пептида, характеризуется кривой элюирования пептидов, имеющих значение площади под кривой, соответствующее кажущейся молекулярной массе пептидов менее 1400 Да, такое что отношение указанной площади к общей площади под кривой составляет менее 40%;

при этом пептиды указанной композиции пептидов имеют среднее значение кажущейся молекулярной массы от 2500 Да до 3600 Да;

при этом указанный анализ проводят, как описано ниже:

- на колонке для фильтрации с размерами 300 × 7,8 мм, содержащей неподвижную фазу, образованную из силикагеля с пористостью 5 мкм;

- температуру колонки поддерживают на уровне 40ºC;

- с применением в качестве подвижной фазы раствора, образованного (A) сверхчистой водой, содержащей 0,1 об.% трифторуксусной кислоты, и (B) ацетонитрилом, где объемное отношение A/B составляет 75/25;

- введение в верхнюю часть колонки для гель-фильтрации объема раствора, содержащего композицию пептидов;

- скорость потока подвижной фазы в колонке составляет 0,6 мл/мин; и

- пептиды композиции детектируют по поглощению при длине волны 214 нм,

где пептиды композиции образуются в результате контролируемого ферментативного гидролиза коллагена из кожи по меньшей мере одной рыбы, выбранной из группы, включающей рыб семейства Pangasiidae и семейства Cichlidae.

2. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что каждый пептид композиции имеет кажущуюся молекулярную массу от 200 Да до 12000 Да.

3. Композиция по любому из пп. 1 и 2, характеризующаяся тем, что по результатам хроматографического анализа на анионообменной колонке, в процессе которого каждый из пептидов композиции пептидов элюируется из колонки со временем удерживания, которое характеризует его заряд, она имеет:

- значение площади под пиком, соответствующим анионным пептидам;

- значение площади под пиком, соответствующим нейтральным пептидам; и

- значение площади под пиком, соответствующим катионным пептидам;

такие, что отношение указанного значения площади под пиком, соответствующим анионным пептидам, к сумме значений площадей под пиками, соответствующими анионным пептидам, нейтральным пептидам и катионным пептидам композиции, составляет от 27,0% до 45%;

при этом значение площади под пиком, соответствующим анионным пептидам, значение площади под пиком, соответствующим катионным пептидам, и значение площади под пиком, соответствующим нейтральным пептидам, определены путем хроматографического анализа в условиях, описанных ниже:

- применение хроматографической колонки с размерами 100 × 7,8 мм, содержащей в качестве неподвижной фазы гидрофильную анионообменную смолу, функционализированную группами четвертичного аммония, с размером частиц 10 мкм;

- применение в качестве первой подвижной фазы для элюирования катионных пептидов и нейтральных пептидов 5 мМ водного Трис-буфера (C) при pH 8,35 в течение 7 мин с момента введения композиции, подлежащей анализу, в верхнюю часть колонки, а затем применение второй подвижной фазы для элюирования анионных пептидов, в которой отношение объема буфера (D), полученного из 5 мМ Трис, 5 М NaCl при pH 8,35, к объему буфера (C) линейно увеличивается от 0 до 100% в течение 30 мин;

- со скоростью потока подвижной фазы в колонке 1 мл/мин;

- анализ проводят при температуре 25ºC; и

- с детектированием по поглощению при длине волны 214 нм на выходе из колонки.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, характеризующаяся тем, что пептиды, по результатам анализа гидрофобности путем обращенно-фазовой жидкостной хроматографии, имеют время удерживания от 16 мин до 36 мин;

указанный анализ гидрофобности проводят в следующих условиях:

- применение хроматографической колонки с размерами 250 × 4,6 мм, содержащей неподвижную фазу, полученную из диоксида кремния, привитого бутильными группами, с размером частиц 5 мкм и значением пористости 300 Å;

- применение в качестве первой подвижной фазы для элюирования гидрофильных пептидов раствора (E) трифторуксусной кислоты в концентрации 0,1% в сверхчистой воде в течение 7 мин с момента введения композиции, подлежащей анализу, в верхнюю часть колонки, а затем применение второй подвижной фазы для элюирования гидрофобных пептидов, в которой отношение объема раствора (F) трифторуксусной кислоты в концентрации 0,1% в воде, содержащей 40% ацетонитрила, к объему раствора (E) линейно увеличивается от 0 до 40% в течение 30 мин;

- со скоростью потока подвижной фазы в колонке 0,6 мл/мин;

- анализ проводят при температуре 40ºC; и

- с детектированием по поглощению при длине волны 214 нм на выходе из колонки.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, характеризующаяся тем, что она находится в жидком состоянии.

6. Композиция по любому из пп. 1-4, характеризующаяся тем, что она представляет собой твердое вещество в разделенном виде.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, характеризующаяся тем, что она не содержит углеводов.

8. Композиция по любому из пп. 1-7, характеризующаяся тем, что она не содержит жиров.

9. Композиция по любому из пп. 1-8, характеризующаяся тем, что пептиды композиции являются водорастворимыми.

10. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что желудочно-кишечное заболевание представляет собой кандидоз кишечного тракта.

11. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что желудочно-кишечное заболевание представляет собой желудочно-кишечное воспаление.

12. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что желудочно-кишечное заболевание представляет собой поддержание кишечной микробиоты.

13. Применение композиции по п. 1 в качестве добавки в пищу человека.