Способ одновременного получения деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов

Изобретение относится к медицине, а именно к изготовлению биоматериалов для регенеративной медицины, и раскрывает способ одновременного получения деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов. Способ характеризуется тем, что здоровые зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям, или донорские кадаверные зубы человека или животных обрабатывают, убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин, подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке. Перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала. Деминерализуют материал в растворе соляной кислоты. Полученный после деминерализации биоматериала солевой раствор используют для получения минерально-органического компонента: фильтруют, нейтрализуют, образующийся после нейтрализации осадок отделяют центрифугированием, трехкратно промывают, полученный материал замораживают, лиофилизируют, расфасовывают и стерилизуют радиационным способом, а деминерализованный дентин промывают, замораживают, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Способ может быть использован в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, регенеративной хирургии опорных тканей. 4 пр.

 

Изобретение относится к медицине, биотехнологиям, а именно - к изготовлению биоматериалов для регенеративной медицины - одновременному получению деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов человека и животных.

Известен способ изготовления костно-протезного материала, в котором получают предшественники трикальцийфосфатных (TCP) частиц; проводят их многоэтапное спекание при различных температурных режимах с получением ансамблей TCP-частиц диаметром в заданном диапазоне от 5 до 400 мкм [1]. Недостатком способа является интенсивная термическая обработка материала с потерей или резким снижением в процессе производства его остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств, связанных с нарушением его структуры.

Известен способ получения биоматериала на основе подложки из фосфата кальция, пропитанного раствором, по меньшей мере, одного коагулянта, представляющего собой производное кальция.[2]. Недостатком способа является отсутствие в материале органического матрикса и коллагеновых структур, влияющих на его регенеративные свойства.

Известен способ получения минерально-органического компонента костной ткани, заключающийся в том, что в качестве сырья используют солевой раствор, являющийся отходом производства костных трансплантатов, который фильтруют через бумажный фильтр, нейтрализуют, доводя его рН до 7,2-7,4; образующийся после нейтрализации осадок отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой, после чего снова центрифугируют и промывают водой и фосфатным буфером с рН 7,4±0,5 в течение 30 минут. После трехкратного промывания водой полученный материал замораживают при температуре - 50°С, лиофилизируют и разделяют на две фракции в соотношении 1:1; одну из фракций перемалывают на шаровой мельнице; обе фракции равномерно перемешивают, расфасовывают и стерилизуют материал радиационным способом [3].

Недостатком технологии является то, что она не предполагает использования в качестве материалов зубов; забора их как у живых людей (животных), так и кадаверов. Технология не предполагает получения одновременно и деминерализованного дентина и минерально-органического компонента; отсутствуют первичная стерилизация будущих материалов с помощью ультразвука, промежуточные этапы контроля материала и эффективности деминерализации с помощью оптического метода.

Целью изобретения является разработка способа одновременного получения деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов.

Эта цель достигается тем, что здоровые зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям или донорские кадаверные зубы человека или животных обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% перекисью водорода; убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением; подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц; перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 8 до 20, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 2,5 до 5; деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты; после деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,5 до 2, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,5 до 1,5; далее солевой раствор используют для получения минерально-органического компонента, а деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Предлагаемый способ предполагает использование в качестве материалов зубов. Это могут быть здоровые зубы человека и животных, в том числе удаленные по ортодонтическим показаниям. Данный материал достаточно распространен и может быть использован для заготовки биоматериалов. Кадаверный материал также может быть забран у трупов-доноров или у животных после их забоя, например, в процессе экспериментального исследования.

Способ предполагает получения одновременно и деминерализованного дентина и минерально-органического компонента. При этом низкочастотная ультразвуковая обработка с частотой 24-40 кГц позволяет выполнить первичную стерилизацию будущих биоматериалов. Этапный контроль эффективности деминерализации материала с помощью оптического метода исследования позволяет судить о возможности продолжения дальнейшего эффективного производства минерально-органического компонента из солевого раствора и деминерализованного дентина. Спектральная оценка поверхностей дентина до и после деминерализации стандартизирует характеристики получаемого продукта.

Предлагаемый способ одновременного безотходного получения деминерализованного дентинного материала и минерально-органического компонента дентина значительно оптимизирует производственный цикл, снижает время, расход сырья и трудозатраты, позволяя получить продукты, обладающие оптимальными остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами для успешной регенерации костной ткани.

Способ реализуется следующим образом. В качестве сырья используют здоровые зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям или донорские кадаверные зубы человека или животных. Материал обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% перекисью водорода. Убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением. Первично стерилизуют материал, осуществляя его низкочастотную ультразвуковую обработку с частотой 24-40 кГц.

Перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 8 до 20, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 2,5 до 5.

Деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты. После деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,5 до 2, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,5 до 1,5.

Солевой раствор, полученный после деминерализации дентина фильтруют через бумажный фильтр, нейтрализуют, доводя его рН до 7,2-7,4. Образующийся после нейтрализации осадок отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой, после чего снова центрифугируют и промывают водой и фосфатным буфером с рН 7,4±0,5 в течение 30 минут. После трехкратного промывания водой полученный материал замораживают при температуре - 50°С, лиофилизируют, расфасовывают и вторично стерилизуют радиационным способом.

Деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и вторично стерилизуют радиационным способом.

Способ иллюстрируется клиническими примерами.

Пример 1. Пациент М, 29 лет обратился в клинику с жалобами на «прикусывание» слизистой оболочки полости рта, образование язв в области зуба мудрости 1.8. Диагноз: дистопированный зуб мудрости (код по МКБ-10 - К07.3), принято решение об его удалении. Пациенту была проведена медикаментозная обработка полости рта и места инъекции анестезии и удаления. Интраоперационно полученный утильный материал - дистопированный здоровый зуб мудрости был соответствующим образом транспортирован на производство костных биоимплантатов. По предложенному способу он был использован для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 24 кГц.

Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 20, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 5. Деминерализацию выполняли в 2,4Н растворе соляной кислоты.

После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 составило 0,5, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 было равно 0,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент костной ткани из солевого раствора.

Пример 2. У трупа скоропостижно скончавшегося здорового мужчины, 29 лет, в рамках забора тканей и органов для трансплантации выполнен забор первых и вторых моляров. По предложенному способу они были использованы для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 40 кГц.

Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 8, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 2,5. Деминерализацию выполняли в 4,8Н растворе соляной кислоты.

После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 составило 2, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 было равно 1,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент из солевого раствора.

Пример 3. При доклиническом экспериментальном исследовании на свиньях выполнено удаление у живых животных под наркозом малых коренных зубов. По предложенному способу они были использованы для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 24 кГц. Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 20, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 5. Деминерализацию выполняли в 2,4Н растворе соляной кислоты.

После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 составило 0,5, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 было равно 0,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент костной ткани из солевого раствора.

Пример 4. При доклиническом экспериментальном исследовании на свиньях после выполнения гинекологических операций животных выводили из эксперимента на сроках 2,4 и 6 недель после операции. После забоя у животных были забраны малые коренные зубы. По предложенному способу они были использованы для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 40 кГц.

Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 8, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, равное 2,5. Деминерализацию выполняли в 4,8Н растворе соляной кислоты.

После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 составило 2, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1 было равно 1,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент из солевого раствора.

Предлагаемый способ может быть использован в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, регенеративной хирургии опорных тканей.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Патент РФ 2010154147/15, 06.05.2009. Костно-протезный материал и способ его изготовления // Патент России №2457000. 2012. / Такамаса С., Рюити М.

2. Патент РФ 2011102372/15, 22.06.2009. Биоматериалы на основе фосфата кальция // Патент России №2 501 571. 2013. / Балаге Т., Роше Н., Карль Ж.

3. Патент РФ на изобретение №2704114 от 24.10.2019 / Способ получения минерально-органического компонента костной ткани // Волова Л.Т., Писарева Е.В., Власов М.Ю., Долгушкин Д.А., Максименко Н.А.

Способ одновременного получения деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов, заключающийся в том, что полученный после деминерализации биоматериала солевой раствор фильтруют через бумажный фильтр, нейтрализуют, доводя его рН до 7,2-7,4; образующийся после нейтрализации осадок отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой, после чего снова центрифугируют и промывают водой и фосфатным буфером с рН 7,4±0,5 в течение 30 минут; после трехкратного промывания водой полученный материал замораживают при температуре -50°С, лиофилизируют, расфасовывают и стерилизуют радиационным способом; отличающийся тем, что здоровые зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям, или донорские кадаверные зубы человека или животных обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% перекисью водорода; убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением; подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц; перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 8 до 20, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 2,5 до 5; деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты; после деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,5 до 2, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,5 до 1,5; далее солевой раствор используют для получения минерально-органического компонента, а деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.