Биспецифические антитела к человеческому cd20/человеческому рецептору трансферрина и способы их применения

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к биспецифическим антителам к человеческому CD20 и человеческому рецептору трансферрина, и может быть использовано в медицине. Полученные антитела, состоящие из двух пар легких и двух пар тяжелых цепей антитела и слитого с тяжелой цепью Fab-фрагмента с SEQ ID NO: 6-9, SEQ ID NO: 1-3, 10, SEQ ID NO: 11-13, 22 или SEQ ID NO: 14-17, могут быть использованы для связывания CD20 и рецептора трансферрина. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к биспецифическим антителам к человеческому CD20 и человеческому рецептору трансферрина, способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела и их применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лимфоциты представляют собой одну из популяций белых кровяных клеток. Они специфически распознают и отвечают на чужеродный антиген. Существует три основных класса лимфоцитов: В лимфоциты (В-клетки), Т лимфоциты (Т-клетки) и естественные киллерные (NK, от англ. natural killer) клетки. В лимфоциты - это клетки, отвечающие за образование антител и обеспечение гуморального иммунитета. В-клетки созревают в костном мозге и покидают костный мозг, экспрессируя на своей поверхности антигенсвязывающие антитела. Когда наивная В-клетка впервые встречается с антигеном, к которому специфично ее мембраносвязанное антитело, клетка начинает быстро делиться, и ее потомки дифференцируются в В-клетки памяти и эффекторные клетки, обозначаемые «плазматическими клетками». В-клетки памяти имеют большую продолжительность жизни и продолжают экспрессировать мембраносвязанные антитела с той же специфичностью, как и исходные родительские клетки. Плазматические клетки не продуцируют мембраносвязанное антитело, но вместо этого продуцируют секретируемую форму антитела. Секретируемые антитела являются основными эффекторными молекулами гуморального иммунитета.

Антиген CD20 (также обозначаемый В-лимфоцитарным дифференцировочным антигеном, Вр35) является гидрофобным трансмембранным белком с молекулярной массой приблизительно 35 кДа, расположенным на пре-В и зрелых В лимфоцитах (Valentine et al., J. Biol.) Chem. 264 (1989) 11282-11287; and Einfeld et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717). Антиген также экспрессируется более чем у 90% В-клеточных неходжкинских лимфом (НХЛ) (Anderson et al., Blood 63 (1984) 1424-1433), но не обнаруживается на гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Tedder et al., J. Immunol. 135 (1985) 973-979). Полагают, что CD20 регулирует ранние стадии процесса активации при инициации клеточного цикла и дифференцировке (Tedder et al., см. выше) и, возможно, выполняет роль кальциевого ионного канала (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195).

С учетом экспрессии CD20 на В-клеточных лимфомах данный антиген эффективно использовали в качестве терапевтической мишени при лечении указанных лимфом. С учетом экспрессии CD20 на В-клеточных лимфомах данный антиген может служить кандидатом для таргетной терапии указанных лимфом. По существу, такое адресное воздействие в целом можно описать следующим образом: пациенту вводят антитела, специфические к поверхностному антигену CD20 В-клеток. Указанные антитела к CD20 специфически связываются с антигеном CD20 (предположительно) нормальных и злокачественных В-клеток; антитело, связанное с поверхностным антигеном к CD20, может приводить к разрушению и истощению злокачественных В-клеток. Кроме того, химические агенты или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, могут быть конъюгированы с антителом к CD20, так что обеспечивается специфическая «доставка» агента к неопластическим В-клеткам. Независимо от подхода, основной задачей является разрушение опухоли; специфический подход определяется тем, какое именно антитело к CD20 применяют и, следовательно, существующие подходы направленного воздействия на антиген CD20 могут существенно различаться. Например, антитело ритуксимаб (ритуксан®), которое представляет собой полученное путем генетической инженерии химерное мышиное/человеческое моноклональное антитело, направленное против человеческого антигена CD20 (доступное для приобретения в компании Genentech, Inc., Южный Сан Франциско, Калифорния, США), применяют для лечения пациентов с рецидивирующей или рефрактерной низкой степени дифференцировки или фолликулярной CD20-положительной В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ). Ритуксимаб представляет собой антитело, обозначаемое "С2В8" в US 5,736,137 и US 5,776,456. Исследования механизма действия in vitro показали, что ритуксан® связывается с человеческим комплементом и вызывает лизис клеток В-лимфоидных линий благодаря комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC, от англ. complement-dependent cytotoxicity) (Reff et al., Blood 83 (1994) 435-445). Кроме того, он демонстрирует существенную активность в исследованиях антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC, от англ. antibody-dependent cellular cytotoxicity). Доклинические исследования in vivo показали, что ритуксан® вызывает истощение В-клеток в периферической крови, лимфоузлах и костном мозге яванского макака, предположительно, за счет комплемент- и клеточно-опосредованных процессов (Reff et al., Blood 83 (1994) 435-445). Другие антитела к CD20, показанные при терапии НХЛ, включают мышиное антитело Зевалин™, которое связано с радиоактивной меткой, иттрием-90 (IDEC Pharmaceuticals, Сан Диего, Калифорния, США), Бексар™, которое представляет собой другое полностью мышиное антитело, конъюгированное с 1-131 (Corixa, WA, USA).

CD20 также представляет собой подходящий антиген-мишень для лечения аутоиммунных заболеваний. Ритуксимаб исследовали при различных доброкачественных аутоиммунных заболеваниях, при которых В-клетки и аутоантитела предположительно играют роль в патофизиологии заболевания (см., например, Edwards et al., Biochem. Soc. Trans. 30 (2002) 824-828). Опубликованы данные, что ритуксимаб способен облегчать проявления и симптомы таких заболеваний, как, например, ревматоидный артрит (PA) (Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61 (2002) 883-888; Edwards et al., Arthritis Rheum. 46 (Suppl. 9) (2002) S46; Stahl et al., Ann. Rheum. Dis. 62 (Suppl. 1) (2003) OP004; Emery et al., Arthritis Rheum. 48 (2003) S439), волчанка (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5 (2003) 157-159; Leandro et al., Arthritis Rheum. 46 (2002) 2673-2677; Gorman et al., Lupus, 13 (2004) 312-316), иммунная тромбоцитопеническая пурпура (D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44 (2003) 561-562; Stasi et al., Blood 98 (2001) 952-957; Saleh et al., Semin. Oncol. 27 (Suppl. 12) (2000) 99-103; Zaia et al., Haematologica 87 (2002) 189-195; Ratanatharathorn et al., Ann. Int. Med. 133 (2000) 275-279), истинная эритроцитарная аплазия (Auner et al., Br. J. Hematol. 116 (2002) 725-728); аутоиммунная анемия (Zaja et al., Haematologica 87 (2002) 189-195 (исправления показаны в Haematologica 87 (2002) 336), синдром холодовой агглютинации (Layios et al., Leukemia 15 (2001) 187-188; Berentsen et al., Blood 103 (2004) 2925-2928; Berentsen et al., Br. J. Hematol. 115 (2001) 79-83; Bauduer, Br. J. Hematol. 112 (2001) 1083-1090; Damiani et al., Br. J. Hematol. 114 (2001) 229-234), синдром тяжелой инсулинорезистентности типа В (Coll et al., N. Engl. J. Med. 350 (2004) 310-311, смешанная криоглобулинемия (De Vita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9 (2002) S206/S469), миастения гравис (Zaja et al., Neurology 55 (2000) 1062-1063; Wylam et al., J. Pediatr. 143 (2003) 674-677), гранулематоз Вегенера (Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44 (2001) 2836-2840), рефрактерная обыкновенная пузырчатка (Dupuy et al., Arch. Dermatol. 140 (2004) 91-96), дерматомиозит (Levine, Arthritis Rheum. 46 (Suppl. 9) (2002) S1299), синдром Шегрена (Somer et al., Arthritis & Rheumatism 49 (2003) 394-398), активная смешанная криоглобулинемия типа II (Zaja et al., Blood 101 (2003) 3827-3834), обыкновенная пузырчатка (Dupay et al., Arch. (Dupay et al., Arch. Dermatol. 140 (2004) 91-95), аутоиммунная нефропатия (Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74 (2003) 485-489), паранеопластический опсо-миоклональный синдром (Pranzatelli et al. Neurology 60 (Suppl. 1) (2003) PO5.128:A395) и рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (RRMS) (Cross et al. (реферат) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, (2003) 20-21).

Публикации, касающиеся терапии ритуксимабом включают: Perotta and Abuel, Blood 10 (I998) (part 1-2) 88B; Perotta et al., Blood 94 (1999) 49 (abstract); Matthews, R., Ann. Rheum. Di's, см. выше; Leandro et al., Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al., Arthritis and Rheumatism 46 (2002) 2673-2677; Weide et al., Lupus 12 (2003) 779-782; Edwards and Cambridge, Rheumatology 40 (2001) 205-211; Cambridge et al., Arthritis Rheum. 46 (Suppl. 9) (2002) S1350; Edwards et al., Arthritis and Rheumatism 46 (2002) S197; Levine and Pestronk, Neurology 52 (1999) 1701-1704; De Vita et al., Arthritis & Rheum. 46 (2002) 2029-2033; Hidashida et al., Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Tuscano, J., Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Martin and Chan, Immunity 20 (2004) 517-527; Silverman and Weisman, Arthritis and Rheumatism 48 (2003) 1484-1492; Kazkaz and Isenberg, Current opinion in pharmacology 4 (2004) 398-402; Virgolini and Vanda, Biomedicine & pharmacotherapy 58 (2004) 299-309; Klemmer et al., Arthritis and Rheumatism 48 (2003) 9,S (SEP) S624-S624; Kneitz et al., Immunobiology 206 (2002) 519-527; Arzoo et al., Annals of the Rheumatic Diseases 61 (2002) p922-924; Comment in Ann. Rheum. Dis. 61 (2002) 863-866; "Future Strategies in Immunotherapy" by Lake and Dionne, in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (2003 by John Wiley & Sons, Inc.); Liang and Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, раздел: CD20 as an Immunotherapy Target, 2002 entitled "CD20"; приложение 4A озаглавленное "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens" by Stockinger et al., Eds: Coligan et al., in Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley & Sons, Inc.); Penichet and Morrison, "CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering" in Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, раздел: Chimeric, Humanized and Human Antibodies; опубликовано в интернете 15 января 2002; Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44 (2001) 2836-2840; Koegh et al., "Rituximab for Remission Induction in Severe ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients", American College of Rheumatology, Session Number: 28-100, Session Title: Vasculitis, Session Type: ACR Concurrent Session, Primary Category: 28 васкулит, сессия 10/18/2004 (http://www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp); Eriksson, Kidney and Blood Pressure Research 26 (2003) 294; Jayne et al., Kidney and Blood Pressure Research, 26 (2003) 294; Jayne, постер 88 (11th International Vasculitis and ANCA workshop), 2003 American Society of Nephrology; Stone and Specks in the Clinical Trial Research Summary of the 2002-2003 Immune Tolerance Network, http://www.immunetolerance.org/reseaTclT/autoimmune/trial s/stone.html; Leandro et at, Arthritis Rheum. 48 (Suppl. 9) (2003) S1160.

Патенты и публикации, касающиеся антител к CD20, включают: US 5,776,456, US 5,736,137, US 5,843,439, US 6,399,061, US 6,682,734, US 2002/0197255 A1, US 2003/0021781 A1, US 2003/0082172 A1, US 2003/0095963 A1, US 2003/0147885 A1; US 6,455,043; WO 00/09160; WO 00/27428; WO 00/27433; WO 00/44788; WO 01/10462; WO 01/10461; WO 01/10460; US 2001/0018041 A1, US 2003/0180292 A1, WO 01/34194; US 2002/0006404; WO 02/04021; US 2002/0012665 A1; WO 01/74388; US 2002/0058029 A1; US 2003/0103971 A1; US 2002/0009444 A1; WO 01/80884; WO 01/97858; US 2002/0128488 A1; WO 02/34790; WO 02/060955; WO 02/096948; WO 02/079255; US 6,171,586 B1; WO 98/56418; WO 98/58964; WO 99/22764; WO 99/51642; US 6,194,551 B1; US 6,242,195 B1; US 6,528,624 B1; US 6,538,124; WO 00/42072; WO 00/67796; WO 01/03734; US 2002/0004587 A1; WO 01/77342; US 2002/0197256; US 2003/0157108 A1; US 6,565,827 B1; US 6,090,365 B1; US 6,287,537 B1; US 6,015,542; US 5,843,398; US 5,595,721; US 5,500,362; US 5,677,180; US 5,721,108; US 6,120,767; US 6,652,852 B1; US 6,410,391 B1; US 6,224,866 B1; WO 00/20864; WO 01/13945; WO 00/67795; US 2003/0133930 A1; WO 00/74718; WO 00/76542; WO 01/72333; US 6,368,596 B1; US 6,306,393; US 2002/0041847 A1; US 2003/0026801 A1; WO 02/102312; US 2003/0068664; WO 03/002607; WO 03/049694; US 2002/0009427 A1; US 2003/0185796 A1; WO 03/061694; US 2003/0219818 A1; US 2003/0219433 A1; WO 03/068821; US 2002/0136719 A1; WO 2004/032828; WO 2004/035607; US 2004/0093621; US 5,849,898; EP 0,330,191; US 4,861,579; EP 0,332,865; WO 95/03770; US 2001/0056066; WO 2004/035607; WO 2004/056312; US 2004/0093621; WO 2004/103404. Публикации, касающиеся антитела к CD20, включают: Teeling, J., et al., Blood 10(2004) 1182.

WO 2014/033074 относится к челнокам, проходящим через гематоэнцефалический барьер, которые связываются с рецепторами гематоэнцефалического барьера, и способам их применения. Низкоаффинные антитела к рецепторам гематоэнцефалического барьера и их применение описаны в WO 2012/075037. WO 2014/189973 относится к антителам рецептору трансферрина и способам их применения. Молекулярный челнок, проходящий через гематоэнцефалический барьер, содержащий эффекторный компонент, линкер и один моновалентный связывающий компонент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, описан в WO 2015/101588. WO 2010/033587 касается способов лечения прогрессирующего рассеянного склероза у пациента и изделию с инструкциями для указанного применения. Способ лечения, купирования или предупреждения заболеваний, отвечающих на терапию антителом к CD20, у пациентов, страдающих ими, включающий введение пациенту по меньшей мере одной дозы антитела к CD20, вызывающей частичное истощение, предложен в WO 2012/096924. Hawker, K., et al. (Ann. Neurol. 66 (2009) 460-471) представили результаты рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого многоцентрового исследования ритуксимаба у пациентов с первичным прогрессирующим рассеянным склерозом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одним аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее

а) одно (полноразмерное) антитело, содержащее по две пары легких (полноразмерных) цепей антитела и тяжелых (полноразмерных) цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой тяжелая (полноразмерная) цепь антитела и легкая (полноразмерная) цепь антитела специфически связываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом любой одной из тяжелых цепей (полноразмерного) антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из (полноразмерных) легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из (полноразмерных) тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat), где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (СН1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

В одном воплощении дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом тяжелой цепи посредством пептидного линкера.

В одном воплощении N-конец вариабельного домена тяжелой цепи Fab фрагмента слит с С-концом (полноразмерной) тяжелой цепи или с С-концом пептидного линкера.

В одном воплощении

а) (полноразмерная) тяжелая цепь, которая слита с дополнительными Fab-фрагментами, имеет в качестве С-концевых аминокислотных остатков (тяжелой цепи) трипептид LSP, пролин которого непосредственно слит с первым аминокислотным остатком дополнительного Fab-фрагмента или пептидного линкера посредством пептидной связи, и

б) (полноразмерная) тяжелая цепь, которая не слита с дополнительными Fab-фрагментами, имеет в качестве С-концевых аминокислотных остатков (тяжелой цепи) трипептид LSP или SPG или PGK.

В одном воплощении (полноразмерное) антитело представляет собой

а) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1,

б) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4,

в) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G,

д) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,

е) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,

ж) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, Н310А и Н435А в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно, или

з) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и Т256Е в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно, или

и) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, Н310А, Н433А и Y436A в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно.

В одном воплощении дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом тяжелой цепи, содержащей мутацию T366W, или с С-концом тяжелой цепи, содержащей мутации T366S, L368A и Y407V.

В одном воплощении

(полноразмерное) антитело относится к человеческому антителу подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно, и

дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом тяжелой цепи, содержащей мутацию T366W, или с С-концом тяжелой цепи, содержащей мутации T366S, L368A и Y407V.

В одном воплощении биспецифическое антитело содержит

i) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 01 на 70% или более,

ii) тяжелую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 02 на 70% или более,

iii) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 03 на 70% или более, и

iv) Fab фрагмент тяжелой цепи, последовательность которого идентична последовательности SEQ ID NO: 04 на 70% или более,

где

SEQ ID NO: 01 имеет аминокислотную последовательность

SEQ ID NO: 02 имеет аминокислотную последовательность

и

SEQ ID NO: 04 имеет аминокислотную последовательность

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело, содержащее (полноразмерную) легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (полноразмерную) тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02, (полноразмерную) легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, и Fab фрагмент антитела, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04.

В одном воплощении биспецифическое антитело является моноклональным.

Одним аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее

а) первый и второй Fab фрагмент, где каждый сайт связывания первого и второго Fab фрагмента специфически связываются с первым антигеном,

б) третий Fab фрагмент, где сайт связывания третьего Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном, и где третий Fab фрагмент содержит кроссовер доменов, так что вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) заменены друг на друга, и

в) Fc-область, содержащую первый полипептид Fc-области и второй полипептид Fc-области,

где и первый, и второй Fab фрагмент содержит фрагмент тяжелой цепи и полноразмерную легкую цепь,

где С-конец фрагмента тяжелой цепи первого Fab фрагмента слит с N-концом первого полипептида Fc-области,

где С-конец фрагмента тяжелой цепи второго Fab фрагмента слит с N-концом вариабельного домена легкой цепи третьего Fab-фрагмента, и С-конец 1 константного домена тяжелой цепи третьего Fab-фрагмента слит с N-концом второго полипептида Fc-области,

где каждая из полноразмерных легких цепей первого и второго Fab-фрагмента содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждый из фрагментов тяжелых цепей первого и второго Fab-фрагмента содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

В одном воплощении первый и второй полипептиды Fc-области относятся

а) к подклассу IgG1 человека,

б) к подклассу IgG4 человека,

в) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) к подклассу IgG4 человека с мутациями S228P, L235E и P329G,

д) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно,

е) к подклассу IgG4 человека с мутациями S228P и P329G в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно,

ж) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, Н310А и Н435А в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно, или

з) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и Т256Е в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно, или

ж) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A, P329G, Н310А, Н433А и Y436A в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно.

В одном воплощении одна из цепей третьего Fab фрагмента слита с полипептидом Fc области, содержащим мутацию T366W, или с полипептидом Fc области, содержащим мутации T366S, L368A и Y407V.

В одном воплощении биспецифическое антитело содержит

i) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 14 по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% или 95% или более,

ii) тяжелую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 15 по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% или 95% или более,

iii) цепь антитела с кроссовером, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 16 по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% или 95% или более, и

iv) модифицированную тяжелую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 17 по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% или 95% или более,

где

SEQ ID NO: 14 имеет аминокислотную последовательность

SEQ ID NO: 15 имеет аминокислотную последовательность

SEQ ID NO: 16 имеет аминокислотную последовательность

и

SEQ ID NO: 17 имеет аминокислотную последовательность

Одним аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее две полноразмерные легкие цепи, каждая из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, полноразмерную тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, цепь антитела с кроссовером, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и модифицированную тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

В одном воплощении биспецифическое антитело является моноклональным.

Одним аспектом по данному описанию является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело по данному описанию.

Одним аспектом по данному описанию является клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по данному описанию, кодирующую биспецифическое антитело по данному описанию.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ получения биспецифического антитела по данному описанию, включающий следующие стадии:

а) культивирование клетки-хозяина по данному описанию с продуцированием биспецифического антитела и

б) выделение биспецифического антитела из клетки или среды культивирования и, таким образом, получение биспецифического антитела по данному описанию.

Одним аспектом по данному описанию является иммуноконъюгат, содержащий биспецифическое антитело по данному описанию и цитотоксический агент.

Одним аспектом по данному описанию является фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело по данному описанию и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним аспектом по данному описанию является антитело по данному описанию для применения в качестве лекарственного средства.

Одним аспектом по данному описанию является антитело по данному описанию для лечения онкологического заболевания.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в лечении заболевания с пролиферацией В-клеток.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в ингибировании роста опухолевых клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении ингибирование осуществляют в головном мозге.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в лечении карциномы. В одном предпочтительном воплощении карцинома представляет собой карциному головного мозга/в головном мозге.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в лечении лимфомы. В одном предпочтительном воплощении лимфома представляет собой первичную лимфому центральной нервной системы (ПЛЦНС).

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в лечении аутоиммунного заболевания. В одном воплощении аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз. В одном предпочтительном воплощении аутоиммунное заболевание представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в истощении опухолевых клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении истощение осуществляют в головном мозге.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в истощении циркулирующих В-клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении истощение осуществляют в головном мозге.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в истощении секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20.

Одним аспектом по данному описанию является применение биспецифического антитела по данному описанию для изготовления лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения пролиферативного заболевания. В одном воплощении пролиферативное заболевание представляет собой В-клеточное лимфопролиферативное заболевание. В одном воплощении пролиферативное заболевание представляет собой В-клеточную лимфому. В одном предпочтительном воплощении пролиферативное заболевание представляет собой первичную лимфому центральной нервной системы.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения опухоли.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения карциномы человека.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения аутоиммунного заболевания. В одном воплощении аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспалительных ответов, таких как воспалительные кожные заболевания, включая псориаз и дерматит (например, атопический дерматит); системной склеродермии и склероза; ответов, связанных с воспалительными заболеваниями кишечника (такими как болезнь Крона и язвенный колит); респираторного дистресс-синдрома (включая респираторный дистресс синдром взрослых; РДСВ); дерматита; менингита; энцефалита; увеита; колита; гломерулонефрита; аллергических состояний, таких как экзема и астма и других состояний, включающих инфильтрацию Т-клетками и хронические воспалительные ответы; атеросклероза; нарушения адгезии лейкоцитов; ревматоидного артрита; системной красной волчанки (СКВ); сахарного диабета (например, сахарного диабета I типа или инсулин-зависимого сахарного диабета); рассеянного склероза; синдрома Рейно; аутоиммунного тиреоидита; аллергического энцефаломиелита; синдрома Шегрена; юношеского диабета; а также иммунных ответов, ассоциированных с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типов, опосредуемых цитокинами и Т-лимфоцитами, обычно обнаруживаемых при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, гранулематозе и васкулите; пернициозной анемии (болезни Аддисона); заболеваний, включающих диапедез лейкоцитов; воспалительных нарушений в центральной нервной системе (ЦНС); синдрома полиорганной недостаточности; гемолитической анемии (включая криоглобулинемию или анемию с положительной пробой Кумбса); миастении гравис; заболеваний, опосредуемых комплексами антиген-антитело; заболеваний с образованием антител к базальной мембране клубочков; антифосфолипидного синдрома; аллергического неврита; базедовой болезни; миастенического синдрома Ламберта-Итона; буллезного пемфигоида; пузырчатки; аутоиммунных полиэндокринопатий; болезни Рейтера; синдрома мышечной скованности; болезни Бехчета; гигантоклеточного артериита; нефрита, вызванного иммунными комплексами; IgA нефропатии; IgM полинейропатии; иммунной тромбоцитопенической пурпуры (ИТП) или аутоиммунной тромбоцитопении. В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рассеянного склероза. В одном предпочтительном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения вторичного прогрессирующего рассеянного склероза.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для истощения опухолевых клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении истощение осуществляют в головном мозге.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для истощения циркулирующих В-клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении истощение осуществляют в головном мозге.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, имеющего пролиферативное заболевание, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию. В одном воплощении пролиферативное заболевание представляет собой В-клеточное лимфопролиферативное заболевание.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, имеющего карциному, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию. В одном предпочтительном воплощении карцинома представляет собой карциному головного мозга/в головном мозге.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, имеющего лимфому, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию. В одном предпочтительном воплощении лимфома представляет собой первичную лимфому центральной нервной системы (ПЛЦНС).

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, страдающего аутоиммунным заболеванием, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию. В одном воплощении аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз. В одном предпочтительном воплощении аутоиммунное заболевание представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ ингибирования роста опухолевых клеток, экспрессирующих CD20, у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для ингибирования роста опухолевых клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении ингибирование осуществляют в головном мозге.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ истощения опухолевых клеток, экспрессирующих CD20, у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для истощения опухолевых клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении ингибирование осуществляют в головном мозге.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ истощения циркулирующих В-клеток, экспрессирующих CD20, у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для истощения циркулирующих В-клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении ингибирование осуществляют в головном мозге.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20, у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения рассеянного склероза у человека, включающий введение человеку терапевтически эффективного количества антитела по данному описанию, которое связывается с человеческим CD20 и истощает В-клетки, и где антитело не конъюгировано с цитотоксическим агентом.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Димеризуемые модули выступы-во-впадины и их применение в инженерии антител описаны Carter P.; Ridgway J.В.В.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73. Образование дополнительных дисульфидных мостиков в СН3 домене описано Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681.

Общая информация, относящаяся к нуклеотидным последовательностям легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека, приведена Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

В данном описании положения аминокислот всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепей пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat, описанной Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), которая обозначается в данном описании «системой нумерации Kabab. В частности, систему нумерации Kabat (см. стр. 647-660) Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) используют для константного домена легкой цепи CL изотипов каппа и лямбда, а систему нумерации EU-индекс, предложенную Kabat (см. стр. 661-723), которая в целях ясности обозначается в данном описании «системой нумерации EU-индекс, предложенной Kabab, используют для константных доменов тяжелой цепи (СН1, шарнирный участок, СН2 и СН3).

I. ТЕРМИНОЛОГИЯ

«Гематоэнцефалический барьер», или ГЭБ относится к физиологическому барьеру между периферической системой кровообращения и головным и спинным мозгом, образованному плотными контактами в плазматической мембране эндотелия капилляров мозга, создающими плотный барьер, ограничивающий транспортировку в мозг молекул, даже таких небольших, как мочевина (60 Дальтон). ГЭБ в головном мозге, гематоспинальный барьер в спинном мозге и гематоретинальный барьер в роговице представляют собой непрерывный барьер между капиллярной кровью и ЦНС и в данном описании вместе обозначаются гематоэнцефалическим барьером, или ГЭБ. ГЭБ также охватывает гематоликворный барьер (хороидные сплетения), где барьер скорее состоит из эпендимоцитов, чем из эндотелиальных клеток капилляров.

Термины «антитело к человеческому CD20» и «антитело, специфически связывающееся с человеческим CD20» относится к антителу, которое способно связываться с человеческим CD20 с достаточной аффинностью, так что антитело может применяться в качестве диагностического и/или терапевтического агента, мишенью которого является CD20.

Таким образом, термин также охватывает антитела, которые связываются с укороченным фрагментом человеческого CD20.

Примеры антител, которые связываются с антигеном CD20, включают: «С2В8», который в настоящее время называют «ритуксимаб» («ритуксан»®) (US 5,736,137); меченное иттрием [90] мышиное антитело 2В8, обозначаемое «Y2B8» (US 5,736,137); мышиный IgG2a «В1», возможно меченный 131I с получением антитела «131I-В1» (Бексар™) (US 5,595,721); мышиное моноклональное антитело «1F5» (Press et al., Blood 69 (1987) 584-591); «химерное антитело 2Н7» (US 5,677,180); моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1В3, В-С1 или NU-B2, описанные в публикациях международного семинара по типированию лейкоцитарных антигенов (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed.) p. 440, Oxford University Press (1987)); и моноклональное антитело, описанное в US 8,883,980.

Антиген «CD20» представляет собой негликозилированный фосфопротеин приблизительно 35 кДа, обнаруживаемый на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов. CD20 экспрессируется на ранних стадиях развития пре-В-клеток и остается до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует как на нормальных В-клетках, так и на злокачественных В-клетках. Другие обозначения CD20, встречающиеся в литературе, включают «В-лимфоцитарный антиген» и «Вр35». Антиген CD20 описан, например, Clark et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 (1985) 1766. См. также SEQ ID NO: 05.

«Аутоиммунное заболевание» в данном документе обозначает незлокачественное заболевание или нарушение, возникающее из и направленное против собственных тканей индивидуума. Термин «аутоиммунные заболевания» в данном описании не охватывает злокачественные или раковые заболевания или состояния, в частности не охватывает В-клеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), волосатоклеточный лейкоз и хронический миелобластный лейкоз. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают воспалительные ответы, такие как воспалительные кожные заболевания, включая псориаз и дерматит (например, атопический дерматит); системную склеродермию и склероз; ответы, связанные с воспалительными заболеваниями кишечника (такими как болезнь Крона и язвенный колит); респираторный дистресс-синдром (включая респираторный дистресс синдром взрослых; РДСВ); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; колит; гломерулонефрит; аллергические состояния, такие как экзема и астма и другие состояния, включающие инфильтрацию Т-клетками и хронические воспалительные ответы; атеросклероз; нарушение адгезии лейкоцитов; ревматоидный артрит; системную красную волчанку (СКВ); сахарный диабет (например, сахарный диабет I типа или инсулин-зависимый сахарный диабет); рассеянный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит; аллергический энцефаломиелит; синдром Шегрена; юношеский диабет; а также иммунные ответы, ассоциированные с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типов, опосредуемые цитокинами и Т-лимфоцитами, обычно обнаруживаемые при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, гранулематозе и васкулите; пернициозную анемию (болезнь Аддисона); заболевания, включающие диапедез лейкоцитов; воспалительные нарушения в центральной нервной системе (ЦНС); синдром полиорганной недостаточности; гемолитическую анемию (включая криоглобулинемию или анемию с положительной пробой Кумбса); миастению гравис; заболевания, опосредуемые комплексами антиген-антитело; заболевания с образованием антител к базальной мембране клубочков; антифосфолипидный синдром; аллергический неврит; базедову болезнь; миастенический синдром Ламберта-Итона; буллезный пемфигоид; пузырчатку; аутоиммунные полиэндокринопатии; болезнь Рейтера; синдром мышечной скованности; болезнь Бехчета; гигантоклеточный артериит; нефрит, вызванный иммунными комплексами; IgA нефропатию; IgM полинейропатию; иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП) или аутоиммунную тромбоцитопению, но не ограничиваются ими.

«Антагонист» представляет собой молекулу, которая при связывании с поверхностным маркером В-клетки разрушает, вызывает гибель или истощение В-клеток у млекопитающих и/или нарушает одну или несколько В-клеточных функций, например, снижая или предотвращая гуморальный ответ, обеспечиваемый В-клетками. Антагонист способен вызывать истощение В-клеток (например, снижать уровни циркулирующих В-клеток) у получающего его млекопитающего. Такое истощение может достигаться различными механизмами, такими как антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индукция гибели В-клеток (например, в результате апоптоза). Антагонисты включают антитела, синтетические или нативные пептидные последовательности и низкомолекулярные вещества, которые связываются с В-клеточным маркером, возможно, конъюгированным или слитым с цитотоксическим агентом.

Антагонисты, «ингибирующие рост», представляют собой такие антагонисты, которые уменьшают пролиферацию клетки, экспрессирующей антиген, с которым связывается антагонист. Например, антагонист может предупреждать или уменьшать пролиферацию В-клеток in vitro и/или in vivo.

Антагонисты, которые «индуцируют апоптоз», представляют собой такие антагонисты, которые вызывают программируемую клеточную гибель, например, В-клетки, по результатам стандартных тестов на апоптоз, таких как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сморщивание клетки, расширение эндоплазматического ретикулума, фрагментация клетки и/или образование мембранных везикул (называемых апоптозными тельцами).

Антагонист, «который связывается» с антигеном, представляющим интерес, например, В-клеточным поверхностным маркером, представляет собой антагонист, способный связывать этот антиген с достаточной аффинностью и/или авидностью, так что антагонист может найти применение в качестве терапевтического агента, мишенью которого является клетка, экспрессирующая антиген.

«Центральная нервная система» или «ЦНС» относится к комплексу нервных тканей, контролирующих функции организма, и охватывает головной мозг и спинной мозг.

«Рецептор гематоэнцефалического барьера» (сокращенно «РГЭБ») представляет собой внеклеточный мембрано-связанный белок-рецептор, экспрессируемый эндотелиальными клетками головного мозга, способный переносить молекулы через ГЭБ или использоваться для переноса введенных экзогенных молекул. Примеры РГЭБ в данном описании включают: рецептор трансферрина (TfR), рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-R), рецепторы липопротеинов низкой плотности, включая, без ограничения, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности белок 1 (LRP1) и родственный рецептору липопротеинов низкой плотности белок 8 (LRP8), а также гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF). Одним из предпочтительных РГЭБ является рецептор трансферрина (TfR).

«Рецептор трансферрина» (TfR) представляет собой трансмембранный гликопротеин (с молекулярной массой приблизительно 180000 Да), состоящий из двух субъединиц, связанных дисульфидными связями (каждая имеет кажущуюся молекулярную массу приблизительно 90000 Да), задействованный в поглощении железа у позвоночных. В одном воплощении указанный TfR представляет собой человеческий TfR, содержащий аминокислотную последовательность, указанную, например, Schneider et al. (Nature 311 (1984) 675-678).

«Мультиспецифическое антитело» обозначает антитело, специфически связывающееся по меньшей мере с двумя различными эпитопами одного и того же антигена или двух различных антигенов. Примеры мультиспецифических антител могут связываться как РГЭБ, так и с антигеном головного мозга. Мультиспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител (например, биспецифических антител F(ab')2) или их комбинаций (например, полноразмерное антитело плюс дополнительные scFv или Fab фрагменты). Также описаны модифицированные антитела с двумя, тремя или более (например, четырьмя) функциональными антигенсвязывающими сайтами (см., например, US 2002/0004587 А1).

«Акцепторные каркасные участки человеческого происхождения» в целях данного описания представляют собой каркасные участки, содержащие аминокислотную последовательность каркасных участков вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящие из каркасной последовательности иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной последовательности человеческого происхождения, согласно описанию, приведенному ниже. Акцепторные каркасные участки «происходящие из» каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных каркасных участков человеческого происхождения могут содержать такую же аминокислотную последовательность или могут иметь замены аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях последовательность акцепторной каркасной последовательности VL человеческого происхождения идентична последовательности каркасных участков VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасных участков человеческого происхождения.

«Аффинность» относится к прочности суммы всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в данном описании «аффинность связывания» обозначает собственную аффинность связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно в целом охарактеризовать константой диссоциации (k_d). Аффинность можно определить стандартными способами, известными в области техники, такими как поверхностный плазмонный резонанс, включая описанные в данном документе.

Антитело «зрелой аффинности» относится к антителу с одной или несколькими модификациями в одной или более чем одной гипервариабельной области (HVR, от англ. hypervariable regions), по сравнению с родительским антителом, которое не имеет таких модификаций, указанные модификации приводят к улучшению аффинности антитела к его антигену(ам).

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела и мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность, но не ограничивается ими.

Термин «антитело-зависимая клеточная цитотоксичность» (ADCC, от англ. antibody-dependent cellular cytotoxicity) обозначает функцию, опосредуемую связыванием Fc-рецептора, и относится к лизису клеток-мишеней, вызываемому антителом по данному описанию в присутствии эффекторных клеток. В одном воплощении ADCC определяют при воздействии на препарат экспрессирующих CD19 клеток эритроидного ряда (например, клеток К562, экспрессирующих рекомбинантный человеческий CD19) антитела по данному описанию в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) или эффекторные клетки, выделенные из лейкоконцентрата, такие как моноциты или естественные киллерные (NK, от англ. natural killer) клетки. Клетки-мишени метят ⁵¹Сr и затем инкубируют с антителом. Меченные клетки инкубируют с эффекторными клетками и анализируют высвобождение ⁵¹Сr в надосадочную жидкость. Контроли включают инкубацию эндотелиальных клеток-мишеней с эффекторными клетками, но в отсутствие антитела. Способность антитела запускать начальные стадии, опосредующие ADCC, исследуют, определяя их связывание с клетками, экспрессирующими рецепторы Fcγ, такими как клетки с рекомбинантной экспрессией FcγRI и/или FcγRIIA или NK клетки (экспрессирующими в основном FcγRIIIA). В одном предпочтительном воплощении определяют связывание с FcγR на NK клетках.

«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, содержащей часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами антител, но не ограничиваются ими.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или биологического вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или биологического вида.

«Класс» антитела обозначает тип константного домена или константной области его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них далее подразделяются на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Термин «цитотоксический агент», используемый в данном описании, относится к веществу, которое ингибирует или препятствует клеточной функции и/или вызывает клеточную гибель или деструкцию. Цитотоксические агенты включают, без ограничения, радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, подавляющие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или обладающие ферментативной активностью токсины бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже.

Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность» (CDC, от англ. complement-dependent cytotoxicity) относится к лизису клеток, вызванному антителом по данному описанию в присутствии комплемента. В одном воплощении CDC определяют при воздействии антитела по данному описанию на экспрессирующие CD19 эндотелиальные человеческие клетки в присутствии комплемента. В одном воплощении клетки помечены кальцеином. О наличии CDC свидетельствует лизис 20% или более клеток-мишеней при концентрации 30 мкг/мл. Связывание с компонентом комплемента C1q можно определить посредством ИФА (иммуноферментного анализа). В таком исследовании на поверхности планшета для ИФА иммобилизуют антитело в диапазоне концентраций и добавляют очищенный человеческий C1q или человеческую сыворотку. Связывание C1q определяют при помощи антитела, направленного против C1q, с последующим добавлением меченного пероксидазой конъюгата. Связывание (максимальное связывание Вmах) определяют как оптическую плотность при 405 нм (OD405) для субстрата пероксидазы ABTS® (2,2'-азино-ди-[3-этилбензтиазолин-6-сульфонат (6)]).

«Эффекторные функции» относятся к такой биологической активности, присущей Fc области антитела, которая варьируется в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: Связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), связывание Fc-рецепторов, антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточных рецепторов) и активацию В клеток.

Эффекторные функции, зависящие от связывания Fc-рецепторов, могут быть опосредованы взаимодействием Fc-области антитела с Fc-рецепторами (FcR), которые представляют собой специализированные рецепторы клеточной поверхности гемопоэтических клеток. Fc-рецепторы относятся к суперсемейству иммуноглобулинов, и показано, что они опосредуют как элиминацию покрытых антителом патогенов вследствие фагоцитоза иммунных комплексов, так и лизис эритроцитов и многих других клеток-мишеней (например, опухолевых клеток), покрытых соответствующим антителом, благодаря антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см., например, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcR классифицируют по их специфичности в отношении изотипов иммуноглобулинов: Fc рецепторы к антителам IgG обозначают FcyR. Связывание Fc рецепторов описано, например, Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; and Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.

Перекрестное связывание рецепторов с Fc-областями IgG антител (FcγR) запускает огромное разнообразие эффекторных функций, включая фагоцитоз, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность и высвобождение воспалительных медиаторов, а также удаление иммунных комплексов и регуляцию выработки антител. У человека описано три класса FcγR, а именно:

- FcγRI (CD64) связывает мономерный IgG с высокой аффинностью и экспрессируется на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах и эозинофилах. Модификации Fc-области IgG по меньшей мере по одному аминокислотному остатку из E233-G236, Р238, D265, N297, А327 и Р329 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat) уменьшают связывание с FcγRI. Остатки в положениях 233-236 IgG2, встроенные в IgG1 и IgG4, уменьшали связывание с FcγRI в 103 раз и устраняли ответ моноцитов человека на сенсибилизированные антителом красные кровяные клетки (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

- FcγRII (CD32) связывает комплексы IgG с аффинностью от умеренной до средней и широко экспрессируется. Данный рецептор можно подразделить на два подтипа, FcγRIIA и FcγRIIB. FcγRIIA обнаруживается на многих клетках, задействованных в киллинге (например, макрофагах, моноцитах, нейтрофилах) и по-видимому, способен активировать процесс киллинга. FcγRIIB по-видимому играет роль в процессе ингибирования и обнаруживается на В-клетках, макрофагах, а также на тучных клетках и эозинофилах. На В-клетках его функция, по-видимому, заключается в подавлении дальнейшего образования иммуноглобулинов и переключении изотипов, например, на класс IgE. FcγRIIB, находящийся на макрофагах, ингибирует фагоцитоз, опосредуемый FcγRIIA. В-форма, находящаяся на эозинофилах и тучных клетках, может способствовать подавлению активации указанных клеток, опосредованной связыванием IgE с его отдельным рецептором. Сниженное связывание с FcγRIIA обнаруживается, например, у антител, содержащих Fc-область IgG с мутациями по меньшей мере одного аминокислотного остатка из E233-G236, Р238, D265, N297, А327, Р329, D270, Q295, А327, R292 и K414 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).

- FcγRIII (CD16) связывает IgG с аффинностью от умеренной до средней и существует в двух формах. FcγRIIIA обнаруживается на NK клетках, макрофагах, эозинофилах и некоторых моноцитах и Т клетках и опосредует ADCC. FcγRIII В экспрессируется на высоком уровне на нейтрофилах. Сниженное связывание с FcγRIIIA обнаруживается, например, у антител, содержащих Fc-область IgG с мутациями по меньшей мере одного аминокислотного остатка из E233-G236, Р238, D265, N297, А327, Р329, D270, Q295, А327, S239, Е269, Е293, Y296, V303, А327, K338 и D376 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).

Картирование сайтов связывания IgG1 человека с Fc-рецепторами, указанные выше сайты мутаций и способы определения связывания с FcγRI и FcγRIIA описаны Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

«Эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, обозначает количество, эффективное для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата при необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени.

Термин «Fc рецептор», используемый в данном описании, относится к активирующим рецепторам, отличающимся наличием цитоплазматической последовательности ITAM, ассоциированной с рецептором (см., например, Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290). Такими рецепторами являются FcγRI, FcγRIIA и FcγRIIIA. Термин «отсутствие связывания с FcγR» означает, что при концентрации антитела 10 мкг/мл связывание антитела, описанного в данном документе, с NK клетками составляет 10% или менее от связывания, зарегистрированного для анти-ОХ40L антитела LC.001, согласно описанию в WO 2006/029879.

Тогда как IgG4 демонстрирует сниженное связывание с FcR, антитела других подклассов IgG демонстрируют выраженное связывание. Однако, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (потеря углевода Fc), Рrо329 и 234, 235, 236 и 237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435 представляют собой остатки, модификация которых также снижает связывание с FcR (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; и ЕР 0307434). В одном воплощении антитело по данному описанию относится к подклассу IgG1 или IgG2 и содержит мутацию PVA236, GLPSS331 и/или L234A/L235A. В одном воплощении антитело по данному описанию относится к подклассу IgG4 и содержит мутацию L235E. В одном воплощении антитело дополнительно содержит мутацию S228P.

Термин «Fc область» в данном документе обозначает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую по меньшей мере часть константной области. Термин охватывает последовательности нативных Fc областей и вариантов Fc областей. В одном воплощении Fc область тяжелой цепи IgG человека располагается между Cys226 или Рго230 и карбокси-концом тяжелой цепи. При этом С-концевой лизин (Lys447) Fc области может присутствовать или отсутствовать.

Антитела по данному описанию содержат Fc-область, в одном воплощении Fc-область имеет человеческое происхождение. В одном воплощении Fc-область содержит все части константной области человеческого происхождения. Fc-область антитела непосредственно вовлечена в активацию комплемента, связывание C1q, активацию С3 и связывание Fc-рецепторов. При том, что влияние антитела на систему комплемента зависит от некоторых условий, связывание с C1q обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-области. Такие сайты связывания известны в области техники и описаны, например, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; и ЕР 0 307 434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 обычно демонстрируют способность активировать комплемент, связывать C1q и активировать С3, тогда как IgG4 не активирует систему комплемента, не связывает C1q и не активирует С3.

Термин «Fc-область антитела» хорошо известен специалистам в области техники и основывается на расщеплении антител папаином. В одном воплощении Fc-область представляет собой Fc-область человеческого происхождения. В одном воплощении Fc-область относится к подклассу IgG4, содержит мутации S228P и/или L235E (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat). В одном воплощении Fc-область относится к подклассу IgG1, содержит мутации L234A и/или L235A (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).

«Каркасные участки» или «FR» (от англ. framework regions) обозначают остатки в составе вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR, от англ. hypervariable region). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно располагаются в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» в данном описании используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу аналогичную структуре нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc область, описанную в данном документе. «Полноразмерное антитело» представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, СН1, СН2 и СН3. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, константные домены с нативной последовательностью человеческого происхождения) или варианты аминокислотной последовательности. Более конкретно, полноразмерное антитело содержит две легких цепи антитела (каждая содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи) и две тяжелых цепи антитела (каждая содержит вариабельный домен тяжелой цепи, шарнирный участок и константные домены тяжелой цепи СН1, СН2 и СН3). С-концевые аминокислотные остатки K или GK в двух тяжелых цепях полноразмерного антитела могут присутствовать или отсутствовать, независимо друг от друга.

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внедрена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомков этих клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки и их потомков, независимо от числа пассажей. Потомство может не быть абсолютно идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может иметь мутации. Термины также охватывают потомков с мутациями, обладающих такой же функцией или биологической активностью, как и исходно трансформированные клетки, прошедшие скрининг или отбор.

«Консенсусная каркасная область человеческого происхождения» обозначает каркасную область, представляющую собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выборке каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Как правило, последовательности VL или VH иммуноглобулина человека выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, как в описании Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении, применительно к VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, как в описании Kabat et al., см. выше. В одном воплощении, применительно к VH, подгруппа представляет собой подгруппу III, как в описании Kabat et al., см. выше.

«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки HVR, не являющиеся человеческими, и аминокислотные остатки FR человека. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а обычно, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR) соответствуют таковым из иммуноглобулинов, не являющихся человеческими, и все или по существу все FR соответствуют таковым человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящую из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое прошло гуманизацию.

Термин «гипервариабельный участок», или «HVR» (от англ. hypervariable region) в данном документе обозначает каждый из участков вариабельных доменов антитела, содержащих гипервариабельные аминокислотные остатки («участки, определяющие комплементарность», или CDR (от англ. complementarity determining regions)) и/или формирующих петли определенной структуры («гипервариабельные петли») и/или содержащих остатки, контактирующие с антигеном («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в составе VH (Н1, Н2, Н3) и три в составе VL (L1, L2, L3).

HVR включают:

(а) гипервариабельные петли, образованные аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, С. and Lesk, А.М., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(б) CDR, образованные аминокислотными остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);

(в) контакты с антигеном, образованные аминокислотными остатками 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (Н1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262 (1996) 732-745) и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (Н1), 26-35b (Н1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в составе вариабельного домена (например, остатки FR) пронумерованы согласно Kabat et al., см. выше.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более чем одной гетерологичной молекулой, включая цитотоксический агент, но не ограничиваясь им.

«Индивидуум» или «субъект» в данном описании является млекопитающим. Млекопитающие включают одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и не являющихся человеком приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях индивидуумом или субъектом является человек.

«Выделенное» антитело обозначает антитело, изолированное от компонентов его естественного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до степени чистоты более чем 95% или 99% по данным, например, электрофоретического (например, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ), изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографического определения (например, с помощью ионообменной или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)). Обзор способов оценки чистоты антител представлен, например, Flatman S., et al., J. Chromatogr. В 848 (2007) 79-87.

«Выделенная» нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, изолированную от компонентов ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, как правило содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты находится внехромосомно или в участке хромосомы, отличном от ее естественного положения на хромосоме.

«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина», относится к одной или более чем одной молекуле, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такие молекулы нуклеиновых кислот в составе одного вектора или в отдельных векторах, и такие молекулы нуклеиновых кислот присутствуют в клетке-хозяине в одном или более чем одном местоположении.

Термин «моноклональное антитело» в данном документе обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих естественные мутации или образующиеся в ходе получения препарата моноклональных антител, указанные варианты обычно присутствуют в незначительном количестве. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Так, прилагательное «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с данным изобретением, могут быть получены множеством способов, включая гибридомную технологию, способы ДНК-рекомбинации, способы фагового дисплея и способы, в которых применяют трансгенных животных, содержащих все или часть иммуноглобулиновых локусов человека, но не ограничиваясь ими, такие способы и другие приведенные в качестве примера способы получения моноклональных антител описаны в данном документе.

«Голое антитело» относится к антителу, не конъюгированному с гетерологичной группировкой (например, цитотоксической группировкой) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.

«Нативные антитела» относятся к молекулам иммуноглобулинов естественного происхождения, имеющим различные структуры. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины размером приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными связями. В направлении от N-конца к С-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также обозначаемую вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следуют три константных домена (СН1, СН2 и СН3), при этом между первым и вторым константными доменами расположен шарнирный участок. Аналогично, в направлении от N-конца к С-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также обозначаемую вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен (CL). В зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ).

Термин «листовка-вкладыш» используется для обозначения инструкций по применению, обычно вкладываемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях к применению, применении, дозировках, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения этих терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно референтной полипептидной последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков (гэпов), если это необходимо для достижения наибольшего процента идентичности последовательностей, и без принятия каких-либо консервативных замен за часть идентичной последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может выполняться различными способами, известными в данной области техники, например, с помощью общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить надлежащие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей настоящего описания, значения % идентичности аминокислотных последовательностей получены при помощи компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана в компании Genentech, Inc., исходный код был представлен вместе с пользовательской документацией в бюро по охране авторских прав США, Washington D.C., 20559, где было зарегистрировано авторское право под номером TXU510087. Доступ к программе ALIGN-2 можно получить в компании Genentech, Inc., Южный Сан Франциско, Калифорния, или код программы может быть скомпилирован на основе исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для работы на платформе UNIX, включая платформу digital UNIX V4.0D. Все параметры для сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и остаются неизменными.

В случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, процент идентичности заданной аминокислотной последовательности А с последовательностью В, относительно последовательности В или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В (что можно также сформулировать как заданная аминокислотная последовательность А, имеющая или содержащая определенный процент идентичной аминокислотной последовательности с последовательностью В, относительно последовательности В или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В) рассчитывают по формуле:

X/Y×100,

где X это число аминокислотных остатков, которые были расценены программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 как абсолютные совпадения при выравнивании А и B в рамках этой программы, и где Y это общее число аминокислотных остатков в B. Следует принимать во внимание, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, процент идентичности аминокислотной последовательности А с последовательностью В не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности В с последовательностью А. Если не указано иначе, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, приведенные здесь, получены согласно описанию в предыдущем параграфе о применении компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективное проявление биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будут вводить композицию.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, являющемуся нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Используемый в данном документе термин «лечение» (и его грамматические производные, такие как «лечить» или «проводить лечение») обозначает клиническое вмешательство в попытке изменить естественный ход заболевания у индивидуума, получающего лечение, и может осуществляться как для профилактики, так и при наличии патологического состояния. Желательные эффекты лечения включают предупреждение возникновения или повторного проявления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению применяют, чтобы отсрочить развитие заболевания или чтобы замедлить прогрессирование заболевания.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» обозначает домен тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют схожую структуру, каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три гипервариабельных области (HVR) (см., например, Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Для обеспечения антигенсвязывающей специфичности может быть достаточно одного домена VH или VL. Кроме того, антитела, связывающиеся с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH или VL домен антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL или VH доменов, соответственно (см., например, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин «вектор», используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной передавать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин охватывает вектор как самореплицирующуюся нуклеиновокислотную структуру, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе обозначают «экспрессирующими векторами».

Термин «иммуносупрессивный агент», используемый в данном документе применительно к вспомогательной терапии, относится к веществам, которые действуют, подавляя или инактивируя иммунную систему млекопитающего, получающего лечение. Сюда входят вещества, которые подавляют продукцию цитокинов, снижают или подавляют экспрессию собственных антигенов или инактивируют антигены главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Примеры таких агентов включают 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. US 4,665,077); азатиоприн; циклофосфамид; бромокриптин; даназол; дапсон; глутаровый альдегид (который инактивирует антигены ГКГС, как описано в US 4,120,649); антиидиотипические антитела к антигенам ГКГС и фрагментам ГКГС; циклоспорин А; стероиды, такие как глюкокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон; антагонисты цитокинов или рецепторов цитокинов, включая антитела против интерферона-γ, -β или -α, антитела против фактора некроза опухолей-α, антитела против фактора некроза опухолей-β, антитела против интерлейкина-2 и антитела против рецептора IL-2; антитела против LFA-1, включая антитела против CD11a и против CD18; антитела против L3T4; гетерологичный анти-лимфоцитарный глобулин; пан-Т-антитела, предпочтительно антитела против CD3 или против CD4/CD4a; растворимый пептид, включающий LFA-3-связывающий домен (WO 90/08187); стрептокиназу; TGF-β; стрептодорназу; РНК или ДНК от хозяина; FK506; RS-61443; дезоксиспергуалин; рапамицин; Т-клеточный рецептор (US 5,114,721); фрагменты Т-клеточного рецептора (Offner et al., Science 251 (1991) 430-432; WO 90/11294; laneway, Nature 341 (1989) 482 и WO 91/01133) и антитела к Т-клеточному рецептору (ЕР 0,340,109) такие, как Т10В9.

«Химиотерапевтический агент» представляет собой химическое соединение, которое может найти применение в лечении злокачественных новообразований. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (цитоксан); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквуон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые аналоги иприта такие, как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, хлорметин, хлорметина гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики такие, как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихимицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсаторы фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эфлорнитин; эллиптиния ацетат; этоглюцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (таксол, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) и доцетаксел (таксотер, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДФМО); ретиноевую кислоту; эсперамицины; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанного выше. Также в данное определение входят антигормональные агенты, действие которых регулирует или подавляет действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, ингибиторы ароматазы 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленного выше.

II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

В одном аспекте изобретение частично основано на том, что биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина по данному описанию обладает улучшенными свойствами. В некоторых воплощениях предложены биспецифические антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина. Предложенные в данном изобретении антитела могут найти применение, например, в диагностике или лечении болезни Паркинсона или рассеянного склероза.

А. Примеры биспецифических антител к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина

В одном аспекте изобретения предложены выделенные биспецифические антитела, которые связываются с человеческим CD20 и человеческим рецептором трансферрина. Антитела представляют собой биспецифические антитела, состоящие из (полноразмерного) основного антитела и слитого Fab-фрагмента с перекрестной заменой некоторых доменов. Таким образом, полученное биспецифическое антитело является асимметричным. Таким образом, биспецифические антитела получают при помощи технологии гетеродимеризации, называемой выступы-во-впадины, используя первую тяжелую цепь с так называемыми мутациями типа «выступ» (HCknob) и вторую тяжелую цепь с так называемыми мутациями типа «впадина» (HChole).

Антитело 0039, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06-09.

Антитело 0039 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически связываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Антитело 0041, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01-03 и SEQ ID NO: 10.

Антитело 0041 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, специфически связываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (СН1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Антитело 0040, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из трех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11-13 и SEQ ID NO: 22.

Антитело 0040 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, специфически связываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (СН1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Антитело 0042, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14-17.

Антитело 0042 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь, происходящие из первого антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и

а) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь, происходящие из второго антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном; где

во второй легкой цепи константный домен CL замещен константным доменом СН1 второй тяжелой цепи; и

во второй тяжелой цепи константный домен СН1 замещен константным доменом CL второй легкой цепи; и

i) где в константном домене CL первой легкой цепи аминокислоты в положениях 124 и 123 (нумерация согласно Kabat) замещены независимо друг от друга аминокислотами, выбранными из K, R и Н; и где в константном домене СН1 первой тяжелой цепи аминокислоты в положениях 147 и 213 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat) замещены независимо друг от друга аминокислотами, выбранными из Е или D; или

ii) где в константном домене CL второй тяжелой цепи аминокислоты в положениях 124 и 123 (нумерация согласно Kabat) замещены независимо друг от друга аминокислотами, выбранными из K, R и Н; и где в константном домене СН1 первой легкой цепи аминокислоты в положениях 147 и 213 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat) замещены независимо друг от друга аминокислотами, выбранными из Е или D.

Биспецифические антитела по данному описанию получали посредством транзиторной экспрессии в клетках СНО. Выход представлен в таблице, приведенной ниже.

Для рекомбинантного получения биспецифических антител применяли различные расположения/комбинации соответствующих полипептидов в различных экспрессирующих плазмидах и различные соотношения полученных плазмид. Результаты, полученные в клетках НЕK 293, представлены в таблице, приведенной ниже.

Биспецифические антитела получали в клетках СНО в небольшом количестве и анализировали спектр побочных продуктов после первой стадии очистки посредством аффинной хроматографии с белком А и после второй стадии очистки посредством препаративной эксклюзионной хроматографии. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

Биспецифические антитела получали в клетках разных линий. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

Температура агрегации антител 0039, 0040, 0041 и 0042 составляла приблизительно 54-56°С, приблизительно 50-53°С, приблизительно 51-53°С и приблизительно 55-57°С, соответственно.

Таким образом, антитело 0041 демонстрировало улучшенные свойства и, следовательно, является предпочтительным аспектом изобретения. Улучшенные свойства, среди прочих, включают улучшенный профиль побочных продуктов.

Одним аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, специфически связываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (СН1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Одним аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, специфически связываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (СН1) заменены друг на друга,

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина,

где сайт связывания человеческого CD20 содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 18, и последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 19 и

где сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 20, и последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 21.

В некоторых воплощениях последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но при этом сайт связывания, содержащий указанную последовательность, сохраняет способность связываться со своим антигеном. В некоторых воплощениях осуществлена замена, вставка и/или делеция в общем от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 18 или 20. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции возникают в участках за пределами HVR (т.е. в FR).

В некоторых воплощениях последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но при этом сайт связывания, содержащий указанную последовательность, сохраняет способность связываться со своим антигеном. В некоторых воплощениях осуществлена замена, вставка и/или делеция в общем от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 19 или 21. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции возникают в участках за пределами HVR (т.е. в FR).

В одном воплощении сайт связывания человеческого CD20 содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 18, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 19, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.

В одном воплощении сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 20, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 21, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.

В одном воплощении биспецифическое антитело содержит

i) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 01 по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,

ii) тяжелую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 02 по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,

iii) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 03 по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,

iv) Fab фрагмент тяжелой цепи, последовательность которого идентична последовательности SEQ ID NO: 04 по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,

где

SEQ ID NO: 01 имеет аминокислотную последовательность

SEQ ID NO: 02 имеет аминокислотную последовательность

SEQ ID NO: 03 имеет аминокислотную последовательность,

и

SEQ ID NO: 04 имеет аминокислотную последовательность

Одним аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, специфически связываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (СН1) заменены друг на друга,

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина,

где сайт связывания человеческого CD20 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и

где сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

Одним аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, специфически связываются с первым антигеном, и где полноразмерное антитело содержит Fc-область, образованную полипептидами Fc-области, каждый из которых содержит домены СН1, СН2 и СН3, двух полноразмерных тяжелых цепей и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с С-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (СН1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147Е) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213Е) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (СН1) заменены друг на друга,

где первый антиген представляет собой человеческий CD20 и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина,

где сайт связывания человеческого CD20 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19,

где сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и

где полипептиды Fc-области относятся

а) к подклассу IgG1 человека,

б) к подклассу IgG4 человека,

в) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) к подклассу IgG4 человека с мутациями S228P, L235E и P329G,

д) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно,

е) к подклассу IgG4 человека с мутациями S228P и P329G в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно,

ж) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, Н310А и Н435А в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно, или

з) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и Т256Е в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно, или

и) к полноразмерному человеческому антителу подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, Н310А, Н433А и Y436A в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно.

В следующем аспекте биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина согласно любому из вышеуказанных воплощений может иметь любой из признаков, описанных в разделах 1-3 ниже, в отдельности или в комбинации.

1. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых воплощениях предложенное антитело представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте US 4,816,567, а также Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело содержит вариабельный участок, не являющийся человеческим (например, вариабельный участок, происходящий из организма мыши, крысы, хомяка, кролика или не являющегося человеком примата, такого как обезьяна), и константный участок человеческого происхождения. В следующем примере химерное антитело представляет собой антитело «с переключенным классом», у которого класс или подкласс были изменены по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают также их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, не являющееся человеческим, подвергают гуманизации, чтобы снизить иммуногенность для человека, при этом сохраняя специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более чем один вариабельный домен, в котором HVR, например, CDR (или их части) происходят из антитела, не являющегося человеческим, а каркасные участки FR (или их части) происходят из последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может также содержать по меньшей мере часть константной области человеческого антитела. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим (например, антитела из которого получены аминокислотные остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Гуманизированные антитела и способы их получения описаны, например, Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, и дополнительно описаны, например, Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5, 821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, and US 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описание пересадки областей, определяющих специфичность (SDR)); Padlan, Е.А., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описание «изменения поверхности»); Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описание «перетасовки FR»); Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68; and Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (описание подхода «направленного отбора» при перетасовке FR).

Каркасные области человеческого происхождения, которые можно использовать для гуманизации, включают: каркасные области, выбранные с помощью метода «наилучшего соответствия» (см., например, Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; каркасные области, происходящие из консенсусной последовательности человеческих антител с вариабельными участками легких или тяжелых цепей определенной подгруппы (см., например, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; and Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); зрелые каркасные области человеческого происхождения (с соматическими мутациями) или каркасные области первичных антител (см., например, Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) и каркасные области, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Васа, М., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684; and Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618), но не ограничиваются ими.

2. Человеческие антитела

В некоторых воплощениях предложенное антитело представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать различными способами, известными в области техники. Человеческие антитела описаны van Dijk, М.А. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 and Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному, чтобы продуцировать интактные человеческие антитела или интактные антитела с вариабельными участками человеческого происхождения в ответ на введение антигена. Такие животные обычно имеют все или часть локусов иммуноглобулинов человека, заменяющие локусы эндогенных иммуноглобулинов, находящиеся вне хромосом или случайным образом интегрированные в хромосомы животных. У таких трансгенных мышей локусы эндогенных иммуноглобулинов обычно бывают инактивированы. Обзор способов получения человеческих антител в трансгенных животных представлен Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. См. также, например, US 6,075,181 и US 6,150,584, где описана технология XENOMOUSE™; US 5,770,429 где описана технология HuMab®; US 7,041,870 где описана технология K-М MOUSE®, и US 2007/0061900, где описана технология VelociMouse®). Вариабельные участки человеческого происхождения интактных антител, полученных в таких животных, могут быть далее модифицированы, например, путем комбинации с различными константными участками человеческого происхождения.

Антитела человека могут также быть получены при помощи гибридомной технологии. Описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек для продукции моноклональных человеческих антител. (См., например, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; and Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Также описаны человеческие антитела, полученные с применением гибридомной технологии с использованием В-клеток человека Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Дополнительные способы включают те, что описаны, например, в патенте US 7,189,826 (описание получения моноклональных антител человека класса IgM из гибридомных клеточных линий) и Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (описание гибридом человек-человек). Технология человеческих гибридом (технология триом) также описана Vollmers, Н.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 и Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.

Человеческие антитела могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельных доменов Fv клонов, отобранных из библиотек фагового дисплея, созданных на основе генов человека. Такие последовательности вариабельных доменов затем могут быть объединены с необходимым константным доменом человека.

3. Варианты антител

В некоторых воплощениях рассматриваются варианты аминокислотных последовательностей предложенных в данном документе биспецифических антител. Например, может требоваться улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в составе аминокислотной последовательности антитела. Для получения конечной конструкции можно осуществлять любые комбинации делеции, вставок и замен, при условии, что конечная конструкция будет обладать желаемыми характеристиками, например, связыванием антигена.

а) Варианты с заменами, вставками и делециями

В некоторых воплощениях предложены варианты антитела, имеющие одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для проведения замещающего мутагенеза включают HVR и FR. Консервативные замены представлены в Таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более значительные замены представлены в Таблице 1 под заголовком «примеры замен» и подробнее описаны ниже, с указанием классов боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно вводить в антитело, представляющее интерес, и проводить скрининг полученных продуктов на предмет желаемой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена или понижения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.

Аминокислоты можно разбить на группы с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ilе;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) отрицательно заряженные: Asp, Glu;

(4) положительно заряженные: His, Lys, Arg;

(5) влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Тrр, Туr, Phe.

Неконсервативные замены влекут за собой замещение представителя одного из этих классов представителем другого класса.

Один вид замен включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) вариант(ы), отбираемый(е) для дальнейшего изучения, будет(ут) иметь модификации (например, улучшение) определенных биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или будут по существу сохранять определенные биологические свойства родительского антитела. Примером варианта с заменами является антитело, прошедшее аффинное созревание, которое может получено стандартным способом, например, технологии аффинного созревания на основе фагового дисплея, описанной в данном документе. Вкратце, осуществляют мутации одного или более чем одного остатка HVR и проводят скрининг вариантов антитела, экспрессируемых фагом, по определенной биологической активности (например, аффинности связывания).

Изменения (например, замены) могут осуществляться внутри HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения можно проводить в «горячих точках» HVR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые в процессе соматического созревания с высокой частотой подвергаются мутациям (см., например, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), и/или остатках, контактирующих с антигеном, а у полученных вариантов VH или VL исследовать аффинность связывания. Увеличение аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. В некоторых воплощениях для повышения аффинности увеличивают разнообразие вариабельных генов, выбранных для аффинного созревания, любым из существующих способов (например, ПЦР пониженной точности, комбинирования вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). После этого создают вторичную библиотеку. Затем проводят скрининг библиотеки для выявления любых вариантов антител с необходимой аффинностью. Другой способ повышения изменчивости включает методы, нацеленные на изменение HVR, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, одновременно 4-6 остатков). HVR остатки, задействованные в связывании антигена, можно специально идентифицировать, например, при помощи аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, изменениям часто подвергаются CDR-Н3 и CDR-L3.

В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут возникать в составе одного или нескольких HVR, при условии, что такие изменения существенным образом не снижают способность антитела связывать антиген. Например, могут быть выполнены консервативные замены в HVR (например, консервативные замены, представленные в данном документе), которые существенным образом не снижают аффинность связывания. Такие замены, например, могут не затрагивать остатки HVR, контактирующие с антигеном. В некоторых воплощениях каждый HVR либо остается без изменений, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен в составе вариантов последовательностей VH и VL, приведенных выше.

Эффективным способом выявления остатков или участков антитела, которые могут быть мишенями направленного мутагенеза, является так называемый "аланин-сканирующий мутагенез", описанный Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. В этом способе выявляют аминокислотный остаток или группу таргетных остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы выяснить, изменится ли взаимодействие антитела с антигеном. Если при первоначальной замене аминокислот происходят изменения функциональных свойств молекулы, в этих положениях можно проводить дальнейшие замены. В альтернативном варианте или в качестве дополнения можно провести анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для выявления точек контакта между антителом и антигеном. Такие остатки, задействованные в контактах, а также соседние с ними остатки могут быть выбраны или не выбраны в качестве кандидатов для замен. Можно проводить скрининг вариантов, чтобы выявить у них наличие желаемых свойств.

Вставки аминокислотных последовательностей включают слияния по амино- и/или карбокси-концу, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотни или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионила. Другие варианты молекулы антитела с вставками включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (например, ADEPT) или полипептидом, увеличивающим время полужизни антитела в сыворотке.

б) Варианты с измененным гликозилированием

В некоторых воплощениях предложенное биспецифическое антитело модифицировано для повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования антитела можно осуществлять стандартным способом, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы создать или удалить один или несколько сайтов гликозилирования.

В случае, когда антитело содержит Fc область, можно изменять присоединенные к ней углеводы. Нативные антитела, продуцируемые в клетках млекопитающих, обычно содержат разветвленные двухантенные олигосахариды, которые, как правило, присоединены посредством N-гликозидной связи к Asn297 СН2 домена Fc области. См., например, Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Олигосахариды могут включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» двухантенной олигосахаридной структуры. В некоторых воплощениях для создания вариантов антитела с некоторыми улучшенными свойствами можно модифицировать олигосахариды в составе антитела, предложенного в данном описании.

В одном воплощении предложены варианты антител, имеющие присоединенную (напрямую или опосредовано) к Fc области углеводную структуру, в которой отсутствует фукоза. Например, содержание фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют путем расчета среднего содержания фукозы в составе углеводной цепи, присоединенной к Asn297, относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), при масс-спектрометрическом определении MALDI-TOF, например, согласно описанию WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, находящийся приблизительно в положении 297 в Fc области (нумерация остатков в области Fc приведена в соответствии с системой EU); однако, вследствие незначительных вариаций в последовательности антител Asn297 может также находиться на расстоянии ±3 аминокислот от положения 297 по ходу или против хода транскрипции, т.е., между положениями 294 и 300. Такие варианты с модифицированным фукозилированием могут проявлять повышенную ADCC. См, например, US 2003/0157108; US 2004/0093621. Примеры публикаций, относящихся к «дефукозилированным» или «лишенным фукозы» вариантам антител, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки Lес13 СНО с нарушением фукозилирования белков (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, в частности, Пример 11) и клеточные линии с нокаутом, например, гена α-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, клетки СНО с нокаутом (см., например, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688 и WO 2003/085107).

Также предложены варианты антител с разделенными надвое олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигосахарид, присоединенный к Fc области антитела, разделен надвое GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженное содержание фукозы и/или повышенную ADCC. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878; US 6,602,684 и US 2005/0123546. Также предложены варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в составе олигосахарида, присоединенного к Fc области. Такие варианты антител могут обладать улучшенной CDC функцией. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

в) Варианты с модификациями Fc области

В некоторых воплощениях в Fc область биспецифического антитела, описанного в данном документе, могут быть введены одна или более аминокислотных модификаций, и таким образом получены варианты Fc области. Вариант с модификацией Fc области может содержать последовательность Fc области человеческого происхождения (например, Fc области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.

В некоторых воплощениях изобретения рассматривается вариант антитела, обладающий некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его подходящим кандидатом для применений, в которых важное значение имеет время полужизни антитела in vivo, однако некоторые эффекторные функции (например, комплемент- и антитело-зависимая клеточная цитотоксичность) являются необязательными или нежелательными. Для подтверждения снижения/устранения CDC и/или ADCC активностей можно проводить исследование цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, исследование связывания с Fc рецепторами (FcR) можно проводить для подтверждения того, что антитело не связывается с FcγR (следовательно, по всей вероятности, не обладает ADCC активностью), но сохраняет способность связывать FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только Fc(RIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные, касающиеся экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, кратко изложены в Таблице 3 на стр. 464 в публикации Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. He являющиеся исчерпывающими примеры исследований in vitro, позволяющих оценить ADCC активность молекулы, представляющей интерес, описаны в US 5,500,362 (см., например, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063 и Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). В альтернативном варианте можно использовать нерадиоактивные методы исследования (см., например, нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности для проточной цитометрии ACTI™ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Подходящие эффекторные клетки для таких исследований включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные киллерные клетки (NK). В альтернативном варианте или в качестве дополнения ADCC активность молекулы, представляющей интерес, можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, такой как описанная Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Можно также исследовать связывание C1q для подтверждения того, что антитело не способно связывать C1q и, следовательно, не обладает CDC активностью. См., например, определение связывания C1q и С3с методом ИФА в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно выполнять исследование CDC (см., например, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Можно также исследовать связывание FcRn и клиренса/времени полужизни in vivo, используя способы, известные в области техники (см., например, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18(2006: 1759-1769).

Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких остатков в положениях 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 Fc области (US 6,737,056). Такие мутанты Fc области включают мутанты Fc области с заменами двух или более аминокислот в положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемые Fc мутанты «DANA» с заменой остатков в положениях 265 и 297 на аланин (US 7,332,581).

Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или ослабленным связыванием с FcR. (См., например, US 6,737,056; WO 2004/056312 и Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

В некоторых воплощениях вариант антитела содержит Fc область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, заменами в положениях 298, 333 и/или 334 в Fc области (нумерация остатков согласно EU).

В некоторых воплощениях изменения затрагивают Fc область и вызывают изменение (т.е. улучшение или ослабление) связывания C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в US 6,194,551, WO 99/51642 и Idusogie, Е.Е. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

Антитела с увеличенным временем полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором FcRn, отвечающим за транспорт материнских IgG к плоду (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), описаны в US 2005/0014934. Эти антитела содержат Fc область с одной или несколькими заменами, которые улучшают связывание Fc области с FcRn. Такие варианты с модификациями Fc включают варианты с заменами одного или нескольких остатков Fc области в положениях: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка в положении 434 в Fc области (US 7,371,826).

См. также Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821 и WO 94/29351, касающиеся других примеров вариантов с модификациями Fc области.

г) Модифицированные цистеином варианты антител

В некоторых воплощениях может быть целесообразным создание модифицированных цистеином антител, например, «thioMAbs», в которых один или несколько остатков антитела заменены остатками цистеина. В конкретных воплощениях замененные остатки располагаются в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков на цистеин реакционноспособные тиоловые группы размещаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгирования антитела с другими группировками, например, лекарственными группировками или группировками линкер-лекарство, для создания конъюгата антитела, согласно описанию ниже. В некоторых воплощениях цистеином могут быть заменены любой или любые из следующих остатков: V205 легкой цепи (нумерация по Kabat); А118 тяжелой цепи (нумерация EU) и S400 тяжелой цепи (нумерация EU) Fc области тяжелой цепи. Модифицированные цистеином антитела могут быть получены, как описано, например, в патенте US 7,521,541.

д) Производные антител

В некоторых воплощениях предложенное биспецифическое антитело может быть дополнительно модифицировано с целью введения дополнительных небелковых группировок, известных в данной области техники и легко доступных. Группировки, подходящие для получения производных антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Не являющиеся исчерпывающими примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1, 3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры) и декстран или поли(n-винил пирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве благодаря своей стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать и в случае присоединения более, чем одного полимера, их молекулы могут быть идентичными или различаться. Как правило, число и/или тип полимеров, применяемых для получения производных, может определяться исходя из того, какие конкретные свойства или функции антитела нуждаются в улучшении, и того, будет ли производное антитела применяться в терапии при определенных условиях, и т.д., но не ограничиваться данными соображениями.

В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковые группировки, которые могут избирательно нагреваться под воздействием излучения. В одном воплощении, небелковая группировка представляет собой углеродную нанотрубку (Kam, N.W. et al., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны, включая, но не ограничиваясь длинами волн, не повреждающими обычные клетки, но нагревающими небелковый компонент до температуры, которая вызывает гибель клеток, расположенных вблизи небелковой группировки антитела.

Б. Рекомбинантные способы и композиции

Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте US 4,816,567. В одном воплощении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело к человеческому СО20/человеческому рецептору трансферрина, описанное в данном документе. В следующем воплощении предложены один или более векторов (например, экспрессирующих векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В следующем воплощении предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО, от англ. Chinese Hamster Ovary) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20). В одном воплощении предложен способ получения биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, описанное выше, при условиях, подходящих для экспрессии антитела, и возможно, выделение антитела из клетки-хозяина (или среды культивирования клетки-хозяина).

Для рекомбинантной продукции биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, и встраивают в один или более векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанную нуклеиновую кислоту можно легко выделить и секвенировать при помощи стандартных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).

Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают клетки прокариот или эукариот, описанные в данном документе. Например, антитела могут производиться в бактериях, в частности, когда гликозилирование и эффекторные функции Fc не являются необходимыми. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, патенты US 5,648,237, US 5,789,199 и US 5,840,523. (См. также Charlton, K.А., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, описывающие экспрессию фрагментов антител в Е.coli). После экспрессии антитело можно выделить из бактериальной массы в виде растворимой фракции и затем очистить.

Кроме прокариот в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, подходят микроорганизмы-эукариоты, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, у которых пути гликозилирования были «гуманизированы» для обеспечения продукции антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 и Li, Н. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированных антител, также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Также были найдены многочисленные штаммы бакуловирусов, которые могут использоваться совместно с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев также можно использовать культуры клеток растений. См., например, патенты US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 и US 6,417,429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).

В качестве хозяев также могут использоваться клетки позвоночных. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами линий клеток млекопитающих, используемых в качестве хозяев, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированных SV40 (COS-7); линия человеческих эмбриональных клеток почки (293 или клетки 293, например, согласно описанию Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клеток почки новорожденного хомяка (ВНK); мышиных клеток Сертоли (клетки ТМ4, например, согласно описанию Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клеток почки обезьяны (CV1); клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клеток карциномы шейки матки человека (HELA); клеток почки собаки (MDCK); клеток печени крысы буффало (BRL 3А); клеток легких человека (W138); клеток печени человека (Hep G2); клеток опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клеток TRI (например, согласно описанию Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68); клеток MRC 5 и клеток FS4. Другие линии клеток млекопитающих, используемых в качестве хозяев, включают клетки яичников китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR- СНО (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток млекопитающих, подходящих в качестве хозяев для получения антител, представлен, например, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

В. Способы и композиции для диагностики и определения

В некоторых воплощениях любое из предложенных в данном документе биспецифических антител к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина можно применять для определения наличия CD20 в биологическом образце. Термин «определение» в данном описании охватывает количественное и качественное определение. В некоторых воплощениях биологический образец включает клетку или ткань.

В одном воплощении предложено биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе диагностики или определения. В следующем аспекте предложен способ определения наличия CD20 в биологическом образце. В некоторых воплощениях способ включает приведение в контакт биологического образца с биспецифическим антителом к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, описанным в данном документе, в условиях, подходящих для связывания биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, и определение, образовался ли комплекс между биспецифическим антителом к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина и CD20. Такой способ может представлять собой способ in vitro или способ in vivo.

В некоторых воплощениях предложены биспецифические антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина. Метки охватывают детектируемые напрямую метки или группировки (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также группировки, например, ферменты или лиганды, детектируемые опосредовано, например, при помощи ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия, но не ограничиваются ими. Примеры меток включают радиоизотопы ³²Р, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н и ¹³¹I, флуорофоры, например, хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (US 4,737,456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP, от англ. horseradish peroxidase), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказа и ксантин-оксидаза, связанные с ферментом, использующим пероксид водорода для окисления хромогена, таким как пероксидаза хрена, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы, и им подобные, но не ограничиваются ими.

Г. Иммуноконъюгаты

В изобретении также предложены иммуноконъюгаты, содержащие антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, описанное в данном документе, конъюгированное с одним или более цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарства, подавляющие рост агенты, токсины (например, белковые токсины, энзиматически активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагменты), или радиоактивными изотопами.

В одном воплощении иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарство (ADC, от англ. antibody-drug conjugate), в составе которого биспецифическое антитело конъюгировано с одним или более лекарствами, включая майтансиноид (см. US 5,208,020, US 5,416,064 и ЕР 0425235 В1); ауристатин, например, лекарственные фрагменты DE и DF монометилауристатина (ММАЕ и MMAF) (см. US 5,635,483, US 5,780,588 и US 7,498,298); доластатин, калихимицин или его производные (см. US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001 и US 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; and Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); антрациклин, например, дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343 и US 6,630,579); метотрексат; виндезин; таксан, например, доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецен; и СС1065, но не ограничиваясь ими.

В другом воплощении иммуноконъюгат содержит описанное в данном документе биспецифическое антитело, конъюгированное с энзиматически активным токсином или его фрагментом, включая А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, ретстриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены, но не ограничиваясь ими. См., например, WO 93/21232, дата публикации 28 октября 2993.

В другом воплощении иммуноконъюгат содержит описанное в данном документе биспецифическое антитело, конъюгированное с радиоактивным изотопом с образованием «радиоконъюгата». Для получения радиоконъюгатов существуют разнообразные радиоактивные изотопы. Примеры их включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Если для детекции применяется радиоконъюгат, он может содержать радиоактивный изотоп для проведения сцинтиграфического исследования, например, TC^99m или I¹²³, или спиновую метку для проведения исследования методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного под названием магнитного резонансного исследования), например, иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Конъюгаты биспецифического антитела с цитотоксическим агентом могут быть получены с применением различных бифункциональных сшивающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональных производных имидоэфиров (таких как диметил адипимидат HCl), активных эфиров (таких как дисукцинимидил суберат), альдегидов (таких как глутаровый альдегид), бис-азидо соединений (таких как бис (р-азидобензоил) гександиамин), производных бисдиазония (таких как бис-(р-диазоний-бензоил)-этилендиамин), диизоцианатов (таких как толуол 2,6-диизоцианат) и соединений с двумя активными атомами фтора (таких как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина может быть получен согласно описанию Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. Меченая углеродом-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгирования меченого радиоактивным изотопом нуклеотида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может быть «расщепляемым линкером», способствующим высвобождению цитотоксического лекарства в клетку. Например, можно применять кислото-неустойчивый линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или линкер, содержащий дисульфидную группу (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5,208,020).

Иммуноконъюгаты или конъюгаты антитело-лекарство в данном документе явным образом предусматривают, но не ограничиваются конъюгатами, полученными с помощью образующих поперечные связи реагентов, включающих, но не ограничивающихся BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)-бензоат), которые доступны для приобретения (например, в компании Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A).

В данном описании также рассматриваются конъюгаты биспецифического антитела, описанного в данном документе, и одного или более чем одного низкомолекулярного токсина, такого как калихимицин, майтансин (US 5,208,020), трихотен и СС1065. В одном воплощении изобретения биспецифическое антитело конъюгировано с одной или более чем одной молекулой майтансина (например, от приблизительно 1 до приблизительно 10 молекул майтансина на молекулу антагониста). Майтансин (May) может, например, конвертироваться в May-SS-Me, который может восстанавливаться до May-SH3 и вступать в реакцию с модифицированным антагонистом (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) с образованием конъюгата майтансиноид-антитело.

В альтернативном варианте биспецифическое антитело, описанное в данном документе, конъюгировано с одной или более чем одной молекулой калихимицина.

Антибиотики группы калихимицина способны образовывать двуцепочечные разрывы ДНК в суб-пикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихимицина, которые могут применяться, включают γ1 I, α2 I, α3 I, N-acetyl-γ1 I, PSAG и θI 1, но не ограничиваются ими (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) и Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

В данном изобретении также предусмотрено биспецифическое антитело, описанное в данном документе, конъюгированное с соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или эндонуклеазой ДНК, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

В альтернативном варианте слитый белок, содержащий биспецифическое антитело, описанное в данном документе, и цитотоксический агент, могут быть получены, например, рекомбинантными способами или посредством пептидного синтеза.

Д. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, описанные в данном документе, изготавливают в форме лиофилизированных композиций или водных растворов путем смешивания такого антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или более чем одним возможным фармацевтически приемлемым носителем (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Фармацевтически приемлемые носители в используемых дозировках и концентрациях, как правило, являются нетоксичными для реципиентов и включают: буферы, например, фосфатный, цитратный и содержащие другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; углеводы, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), но не ограничиваются ими. Примеры фармацевтически приемлемых носителей в данном документе также включают средства диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве, такие как активные в нейтральных условиях растворимые гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Примеры некоторых sHASEGPs и способов их применения, включая rHuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP дополнительно комбинируют с одной или более чем одной гликозаминогликаназой, такой как хондроитиназа.

Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в патенте US 6,267,958. Водные композиции антител включают описанные в патентах US 6,171,586 и WO 2006/044908, композиции в последнем включают гистидин-ацетатный буфер. Примеры композиций антитела к CD20 описаны в WO 98/56418, непосредственно включенном путем ссылки.

Лиофилизированные композиции, предназначенные для подкожного введения, описаны в WO 97/04801. Такие лиофилизированные композиции можно разводить подходящим разбавителем до высокой концентрации белка и разведенную композицию можно вводить подкожно млекопитающему, которому назначено лечение.

Композиции могут также содержать более одного активного ингредиента, необходимых при конкретных показаниях к терапии, предпочтительно, обладающих комплементарной активностью и не оказывающих друг на друга отрицательного влияния. Такие активные ингредиенты соответственно находятся в комбинации в количествах, эффективных для намеченного использования.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, с помощью технологии коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, в микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы поли-(метилметакрилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

Можно изготавливать препараты с пролонгированным высвобождением. Примеры подходящих препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, в которых матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, в виде пленок или микрокапсул. Примеры матриц с пролонгированным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт)), полилактиды (US 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ этил-L-глутамата, недеградируемый этилен-винилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимеров молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксибутировую кислоту.

Композиции, предназначенные для введения in vivo, как правило, стерильны. Стерильность может быть достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. В одном воплощении композиция является изотонической.

Е. Терапевтические способы и композиции

В терапевтических способах может применяться любое биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, предложенное в данном изобретении.

В одном аспекте предложено биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для применения в качестве лекарственного средства. В других аспектах предложено биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для применения в предупреждении и/или лечении В-клеточного лимфопролиферативного заболевания. В некоторых воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе лечения. В некоторых воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе лечения индивидуума, имеющего В-клеточное лимфопролиферативное заболевание, включающем введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, такого как указан ниже. В следующих воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для применения в истощении секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20. В некоторых воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20, у индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений предпочтительно является человеком.

В следующем аспекте изобретения предложено применение биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина в изготовлении лекарственного средства. В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения В-клеточного лимфопролиферативного заболевания. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения В-клеточного лимфопролиферативного заболевания, включающем введение индивидууму, имеющему заболевание, ассоциированное с пролиферацией В-клеток, эффективного количества лекарственного средства. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, такого как указан ниже. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20, у индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного количества лекарственного средства для истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений может быть человеком.

В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения В-клеточного лимфопролиферативного заболевания. В одном воплощении способ включает введение индивидууму, имеющему В-клеточное лимфопролиферативное заболевание, эффективного количества биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, такого как указан ниже. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений может быть человеком.

В следующем аспекте изобретения предложен способ истощения секвестрированных в головном мозге индивидуума В-клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении способ включает введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина для истощения секвестрированных в головном мозге В-клеток, экспрессирующих CD20. В одном воплощении «индивидуум» является человеком.

В следующем аспекте предложены фармацевтические композиции, содержащие любое из биспецифических антител к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, предложенных в данном изобретении, например, для применения в любом из описанных выше терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтическая композиция содержит любое из биспецифических антител к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, предложенных в данном изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтическая композиция содержит любое из биспецифических антител к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина, предложенных в данном изобретении, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, приведенный ниже.

Антитела, описанные в данном документе, могут применяться либо в виде монотерапии, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело, описанное в данном документе, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент является эффективным для лечения того же В-клеточного лимфопролиферативного заболевания, для лечения которого применяют биспецифическое антитело, описанное в данном документе, или иного В-клеточного лимфопролиферативного заболевания.

Такие комбинированные терапии, упомянутые выше, включают комбинированное введение (когда два или более терапевтических агентов включены в состав одной или нескольких композиций) и раздельное введение, когда введение антитела по изобретению осуществляют до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента или агентов. В одном воплощении введение биспецифического антитела к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина и введение дополнительного терапевтического агента происходит в течение приблизительно одного месяца или в течение приблизительно одной, двух или трех недель, или в течение приблизительно одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дней. Антитела, описанные в данном документе, также можно применять в комбинации с другими вмешательствами, такими как лучевая терапия, психотерапия или другие виды терапии, известными в области техники и подходящими для лечения или предупреждения неврологического нарушения.

Антитело, описанное в данном документе (и любой дополнительный терапевтический агент), можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, при необходимости местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым подходящим способом, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. В данном описании предусматриваются различные режимы дозирования, включающие однократное или многократное введение через различные промежутки времени, болюсное введение и пульсовое введение, но не ограничивающиеся ими.

Помимо этого, биспецифическое антитело можно вводить посредством импульсной инфузии, например, со снижением доз биспецифического антитела. Дозирование можно осуществлять при помощи инъекций, внутривенных или подкожных инъекций, в том числе, в зависимости от того, является ли введение краткосрочным или длительным.

Антитела, предложенные в данном изобретении, изготавливают, дозируют и вводят в соответствии с требованиями надлежащей медицинской практики. Факторы, которые необходимо при этом учитывать, включают конкретное заболевание, лечение которого осуществляют, конкретное млекопитающее, получающее лечение, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место введения агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные медицинскому персоналу. Антитело не обязательно, но возможно находится в комбинации с одним или более чем одним агентом, используемым на данный момент для предупреждения или лечения обсуждаемого нарушения. Эффективное количество этих иных агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа нарушения или лечения, а также других факторов, обсуждавшихся выше. Как правило, их применяют в таких же дозировках и вводят такими же способами, как описанные в данном документе, или как приблизительно от 1 до 99% описанных здесь дозировок, или в любой дозировке и любым способом, который считаются подходящим на основе эмпирических/клинических данных.

Способы переноса слитой конструкции или соединения через ГЭБ, основанные на использовании липидов, включают инкапсулирование слитой конструкции или соединения в липосомы с присоединенным к ним моновалентным связывающим компонентом, который связывается с рецепторами на сосудистом эндотелии ГЭБ (см., например, US 2002/0025313), и заключение моновалентного связывающего компонента в частицы липопротеина низкой плотности (см., например, US 2004/0204354) или связывание с аполипопротеином Е (см., например, US 2004/0131692), но не ограничиваются ими.

Соответствующая дозировка антитела по изобретению (при использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами) для предупреждения или лечения заболевания будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело в целях профилактики или лечения, от предшествующего лечения, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от выбора лечащего врача. Подходящим является введение антитела пациенту однократно или в ходе серии процедур. В зависимости от типа и тяжести заболевания возможная первоначальная дозировка антитела для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг), например, в виде одного или нескольких отдельных введений, или в виде непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. При повторном введении на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от патологического состояния, лечение должно длиться до тех пор, когда не наступит желаемое подавление симптомов заболевания. Одним из примеров дозировки антитела может быть диапазон от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Эти дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получил от приблизительно двух до приблизительно двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Можно производить введение первоначальной ударной дозы с последующим введением одной или нескольких более низких доз. Однако, можно применять и другие режимы дозирования. Успешность такой терапии легко отслеживать при помощи известных методик и тестов.

Очевидно, что в любой из вышеупомянутых композиций или в любом из вышеупомянутых терапевтических способов в качестве альтернативы или дополнения к биспецифическому антителу к человеческому СD20/человеческому рецептору трансферрина можно применять иммуноконъюгат, описанный в данном документе.

Композицию, содержащую биспецифическое антитело, предложенное в данном изобретении, которое связывается с поверхностным антигеном В-клетки, изготавливают, дозируют и вводят в соответствии с требованиями надлежащей медицинской практики. Факторы, которые необходимо при этом учитывать, включают конкретное заболевание или расстройство, лечение которого осуществляют, конкретное млекопитающее, получающее лечение, клиническое состояние отдельного пациента, причину заболевания или расстройства, место введения агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные медицинскому персоналу. Терапевтически эффективное количество вводимого антагониста будет определяться указанными соображениями.

Помимо лечения В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний биспецифическое антитело по данному описанию можно применять в лечении аутоиммунных заболеваний. Примеры аутоиммунных заболеваний или расстройств включают иммуно-опосредованные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, дерматомиозит, хорея Сиденгама, волчаночный нефрит, ревматическая атака, полигландулярные синдромы, пурпура Шенлейна-Геноха, нефрит вследствие заболевания, вызванного стрептококком, узелковая эритема, артериит Такаясу, болезнь Аддисона, мультиформная эритема, узелковый полиартериит, анкилозирующий спондилит, синдром Гудпасчера, облитерирующий тромбангиит, первичный билиарный цирроз, тиреоидит Хашимото, тиреотоксикоз, хронический активный гепатит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, пузырчатка обыкновенная, гранулематоз Вегенера, мембранозная нефропатия, боковой амиотрофический склероз, сухотка спинного мозга, полимиалгия, пернициозная анемия, быстро прогрессирующий гломерулонефрит и фиброзирующий альвеолит, воспалительные ответы, такие как воспалительные кожные заболевания, включая псориаз и дерматит (например, атопический дерматит); системную склеродермию и склероз; ответы, связанные с воспалительными заболеваниями кишечника (такими как болезнь Крона и язвенный колит); респираторный дистресс-синдром (включая респираторный дистресс синдром взрослых; РДСВ); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; колит; гломерулонефрит; аллергические состояния, такие как экзема и астма и другие состояния, включающие инфильтрацию Т-клетками и хронические воспалительные ответы; атеросклероз; нарушение адгезии лейкоцитов; ревматоидный артрит; системную красную волчанку (СКВ); сахарный диабет (например, сахарный диабет I типа или инсулин-зависимый сахарный диабет); рассеянный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит; аллергический энцефаломиелит; синдром Шегрена; юношеский диабет; а также иммунные ответы, ассоциированные с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типов, опосредуемые цитокинами и Т-лимфоцитами, обычно встречающиеся при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, гранулематозе и васкулите; пернициозную анемию (болезнь Аддисона); заболевания, включающие диапедез лейкоцитов; воспалительные нарушения в центральной нервной системе (ЦНС); синдром полиорганной недостаточности; гемолитическую анемию (включая криоглобулинемию или анемию с положительной пробой Кумбса); миастению гравис; заболевания, опосредуемые комплексами антиген-антитело; заболевания с образованием антител к базальной мембране клубочков; антифосфолипидный синдром; аллергический неврит; базедову болезнь; миастенический синдром Ламберта-Итона; буллезный пемфигоид; пузырчатку; аутоиммунные полиэндокринопатии; болезнь Рейтера; синдром мышечной скованности; болезнь Бехчета; гигантоклеточный артериит; нефрит, вызванный иммунными комплексами; IgA нефропатию; IgM полинейропатию; иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП) или аутоиммунную тромбоцитопению, но не ограничиваются ими. В данном аспекте изобретения моноклональные антитела по изобретению используют для истощения нормальных В-клеток крови в течение продолжительного периода.

Как отмечено выше, предложенные количества биспецифического антитела в значительной степени зависят от терапевтического выбора. Ключевым фактором в выборе надлежащей дозы и схемы является результат, полученный, как указано выше. Например, для лечения существующих и острых заболеваний вначале могут требоваться относительно высокие дозы. В зависимости от заболевания или расстройства, для получения наиболее эффективных результатов, антагонист вводят как можно раньше при появлении первых признаков, постановке диагноза, проявлении или возникновении заболевания или расстройства или во время ремиссий заболевания или расстройства.

Помимо введения пациенту выделенных биспецифических антител по данному описанию данная заявка предусматривает введение биспецифических антител посредством генной терапии. Такое введение нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифическое антитело, охватывается выражением «введение терапевтически эффективного количества биспецифического антитела». См., например, WO 96/07321, где рассматривается применение генной терапии для выработки внутриклеточных антител.

Существует два основных способа поступления нуклеиновой кислоты (возможно содержащейся в векторе) в клетки пациента; in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo осуществляют непосредственную инъекцию нуклеиновой кислоты пациенту, обычно в участок, где требуется биспецифическое антитело. При терапии ex vivo клетки пациента удаляют, в эти выделенные клетки вводят нуклеиновую кислоту и модифицированные клетки вводят пациенту либо непосредственно, либо, например, инкапсулированными в пористые мембраны, которые имплантируют пациенту (см., например, US 4,892,538 и US 5,283,187). Существует множество способов внедрения нуклеиновых кислот в живые клетки. Способы могут варьировать в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культивируемые клетки in vitro или в клетки заданного хозяина in vivo. Способы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, ДЭАЭ-декстран, кальций-фосфатную преципитацию и т.д. Для доставки генов ех vivo часто используют ретровирусные векторы.

Предпочтительный в настоящее время способ переноса нуклеиновой кислоты in vivo включает трансфекцию векторами на основе вирусов (таких как аденовирус, вирус простого герпеса I типа или адено-ассоциированный вирус) и системы на основе липидов (подходящими липидами для липид-опосредованного переноса генов являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых ситуациях желательно обеспечить источник нуклеиновой кислоты агентом, который нацелен на клетки-мишени, таким как антитело, специфичное к мембранному белку клеточной поверхности клетки-мишени, лиганду рецептора клетки-мишени и т.д. Когда используют липосомы, для таргетирования и/или облегчения поглощения можно использовать белки, которые связываются с мембранным белком клеточной поверхности, связанным с эндоцитозом, например, белки капсида или их фрагменты, обладающие тропностью к конкретному типу клеток, антитела к белкам, которые подвергаются интернализации в ходе цикла, а также белки, которые обеспечивают внутриклеточную локализацию и увеличивают время полужизни внутри клетки. Способ рецептор-опосредованного эндоцитоза описан, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). Обзор известных в настоящее время протоколов маркировки генами и генной терапии представлен Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). См. также WO 93/25673 и процитированные в нем документы.

Общие способы конъюгирования дополнительных терапевтических агентов с антителами хорошо известны (см., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985) и Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62 (1982) 119-58).

III. Изделия

В другом аспекте изобретения предложено изделие, содержащее материалы, которые могут найти применение в лечении, предупреждении и/или диагностике нарушений, описанных выше. Изделия содержат контейнер и этикетку или листовку-вкладыш, размещенную на контейнере или ассоциированную с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты с раствором для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая самостоятельно или в комбинации с другой композицией является эффективной при лечении, предупреждении и/или диагностике состояний, и может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный ингредиент в композиции представляет собой антитело, предложенное в данном документе. На этикетке или листовке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения соответствующего патологического состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит антитело по изобретению и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие в данном воплощении может дополнительно содержать листовку-вкладыш с указанием, что композиции можно применять в лечении конкретного патологического состояния. В качестве альтернативы или дополнения изделие может также содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может также содержать другие материалы, привлекательные с коммерческой и с потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Очевидно, что любое из вышеупомянутых изделий в качестве альтернативы или дополнения к биспецифическому антителу, описанному в данном документе, может включать в себя иммуноконъюгат, описанный в данном документе.

IV. ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приведены примеры способов и композиций по изобретению. Следует понимать, что возможны и другие варианты воплощений, в соответствии с приведенным выше описанием.

Материалы и общие методы

Общая информация, относящаяся к нуклеотидным последовательностям легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека, приведена Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Нумерация аминокислот в цепях антитела указана согласно Kabat (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Методы рекомбинирования ДНК

Для манипуляций с ДНК применяли стандартные методы, описанные Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали в соответствии с инструкциями производителя.

Синтез генов

Необходимые генные сегменты получали из олигонуклеотидов, полученных при помощи химического синтеза. Длинные генные сегменты, фланкированные уникальными сайтами для расщепления рестрикционными эндонуклеазами, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая амплификацию ПЦР, и затем клонировали по указанным сайтам рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных фрагментов генов верифицировали посредством секвенирования ДНК. Фрагменты синтезируемых генов заказывали в соответствии с техническими условиями Geneart (Регенсбург, Германия).

Определение последовательности ДНК

Последовательности ДНК определяли посредством секвенирования двух цепей в компаниях MediGenomix GmbH Мартинсрид, Германия) или SequiServe GmbH (Фатерштеттен, Германия).

Анализ последовательностей ДНК и белка и обработка данных секвенирования

Для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей использовали пакет программ GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) версии 10.2 и набор программных инструментов Infomax's Vector NT1 Advance версии 8.

Экспрессирующие векторы

Для экспрессии описанных биспецифических антител можно применять экспрессирующие плазмиды для транзиторной экспрессии (например, в клетках НЕK293), используя промотор CMV с интроном А или без интрона А при организации в виде кДНК либо промотор CMV при организации в виде геномной ДНК.

Помимо кассеты для экспрессии антитела векторы содержат:

- ориджин репликации, позволяющий данной плазмиде реплицироваться в Е.coli, и

- ген β-лактамазы, обеспечивающий резистентность Е.coli к ампициллину.

Транскрипционная единица гена антитела состоит из следующих элементов:

- уникальный(е) сайт(ы) рестрикции на 5' конце

- немедленный ранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,

- последовательность интрона А в случае организации в виде кДНК,

- 5'-нетранслируемая область, происходящая из гена антитела человека,

- сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,

- нуклеиновая кислота, кодирующая соответствующую цепь антитела, либо в виде кДНК, либо имеющая геномную экзон-интронную организацию,

- 3' нетранслируемая область с сигнальной последовательностью полиаденилирования,

- терминирующую последовательность и

- уникальный(е) сайт(ы) рестрикции на 3' конце.

Слитые гены, кодирующие цепи антитела, получают при помощи ПЦР и/или синтеза генов и осуществляют их сборку известными рекомбинантными способами и методами, соединяя соответствующие сегменты нуклеиновых кислот, например, используя уникальные рестрикционные сайты в соответствующих векторах. Последовательности субклонированных нуклеиновых кислот верифицировали посредством секвенирования ДНК. Для транзиторной трансфекции плазмиды получали в большем количестве, выделяя плазмиды из культур, трансформированных Е.coli (Nucleobond АХ, Macherey-Nagel).

Для всех конструкций применяли технологию гетеродимеризации выступы-во-впадины с типичной заменой T366W, приводящей к образованию выступа в первом СН3 домене и соответствующими заменами T366S, L368A и Y407V, приводящими к образованию впадин во втором СН3 домене (а также дополнительно внедряли два остатка цистеина S354C/Y349'C) (располагающиеся в соответствующих последовательностях тяжелой цепи (НС), приведенных выше).

Методы культивирования клеток

Использовали стандартные методы культивирования клеток, описанные в

Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.В., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

Транзиторные трансфекции в системе НЕK293

Биспецифические антитела получали посредством транзиторной экспрессии. Для этого осуществляли трансфекцию соответствующими плазмидами с использованием системы НЕK293 (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Вкратце, клетки НЕK293 (Invitrogen), культивируемые в суспензии либо во встряхиваемой колбе, либо в ферментере с перемешиванием в бессывороточной среде для экспрессии Freestyle™ 293 (Invitrogen), трансфицировали смесью соответствующих экспрессирующих плазмид с помощью реагента 293fectin™ или fectin (Invitrogen). Для 2 л встряхиваемой колбы (Corning) клетки НЕK293 высаживали в плотности 1,0*10⁶ клеток/мл в 600 мл и инкубировали при 120 об/мин, 8% СO₂. На следующие сутки клетки трансфицировали в плотности приблизительно 1,5*10⁶ клеток/мл с использованием приблизительно 42 мл смеси: А) 20 мл среды Opti-MEM (Invitrogen), содержащей суммарно 600 мкг плазмидной ДНК (1 мкг/мл) и В) 20 мл среды Opti-MEM с добавлением 1,2 мл реагента 293 fectin или fectin (2 мкг/мл). В зависимости от потребления глюкозы в процессе ферментации добавляли раствор глюкозы. Надосадочную жидкость, содержащую секретируемое антитело, собирали через 5-10 суток и либо выделяли антитела непосредственно из надосадочной жидкости, либо надосадочную жидкость замораживали и хранили.

Определение белка

Для очищенных антител и производных определяли концентрацию белка путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности согласно Расе, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423.

Определение концентрации антител в надосадочной жидкости

Концентрацию антител и производных в культуральной надосадочной жидкости оценивали посредством иммунопреципитации с использованием гранул агарозы с белком A (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия). Так, 60 мкл гранул агарозы с белком А трехкратно промывали TBS-NP40 (50 мМ Tris буфер, рН 7,5 с добавлением 150 мМ NaCl и 1% Nonidet-P40). Затем 1-15 мл культуральной надосадочной жидкости наносили на гранулы агарозы с белком А, предварительно уравновешенные TBS-NP40. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре гранулы промывали однократно на колонке Ultrafree-MC-filter (Amicon) 0,5 мл TBS-NP40, двукратно 0,5 мл 2х фосфатно-солевым буфером (2xPBS, Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) и быстро четырехкратно 0,5 мл 100 мМ Na цитратным буфером (рН 5,0). Связанное антитело элюировали добавлением 35 мкл буфера для нанесения образца NuPAGE® LDS (Invitrogen). Половину образца смешивали с восстанавливающим агентом для образца NuPAGE® или оставляли невосстановленным, соответственно, и нагревали в течение 10 мин при 70°С. Затем 5-30 мкл вносили в 4-12% гель NuPAGE® Bis-Tris (Invitrogen) (с буфером MOPS для электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и буфером MES с антиоксидантной добавкой NuPAGE® antioxidant (Invitrogen) в электродный буфер для ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях) и окрашивали Кумасси синим.

Количественное определение концентрации антител в культуральной надосадочной жидкости осуществляли при помощи аффинной ВЭЖХ. Вкратце, культуральную надосадочную жидкость, содержащую антитела, которые связывались с белком А, наносили на колонку Applied Biosystems Poros А/20 в 200 мМ KН₂РO₄, 100 мМ цитрата натрия, рН 7,4 и элюировали 200 мМ NaCl, 100 мМ лимонной кислоты, рН 2,5 в системе Agilent HPLC 1100. Количественное определение элюированного антитела проводили по поглощению в УФ области, измеряя площади пиков. В качестве стандарта использовали очищенное стандартное IgG1 антитело.

В альтернативном варианте концентрацию антител и производных в культуральной надосадочной жидкости определяли посредством сэндвич-IgG-ИФА. Вкратце, на 96-луночных планшетах для микротитрования StreptaWell с высокой связывающей способностью, покрытых стрептавидином (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия), иммобилизовали биотинилированные молекулы F(ab')2<h-Fcγ> BI (Dianova), захватывающие человеческий IgG, по 100 мкл/лунку в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре или, в альтернативном варианте, в течение ночи при 4°С и затем промывали трехкратно 200 мкл/лунку PBS, содержащим 0,05% Tween (PBST, Sigma). Затем в лунки добавляли серийные разведения в PBS (Sigma) культуральной надосадочной жидкости, содержащей соответствующее антитело, по 100 мкл/лунку и инкубировали в течение 1-2 ч на качалке при комнатной температуре. Лунки трехкратно промывали PBST в количестве по 200 мкл/лунку и для определения связанного антитела добавляли детектирующее антитело F(ab')2<hFcγ>POD (Dianova) в количестве 100 мкл и концентрации 0,1 мкг/мл и инкубировали в течение 1-2 часов на качалке при комнатной температуре. Несвязанное детектирующее антитело удаляли посредством трехкратной промывки PBST по 200 мкл/лунку. Связанное детектирующее антитело определяли путем добавления ABTS по 100 мкл/лунку и последующей инкубации. Поглощение при длине волны 405 нм определяли при помощи спектрометра Tecan Fluor (референтная длина волны 492 нм).

Препаративная очистка антитела

Антитела выделяли из профильтрованной культуральной надосадочной жидкости в соответствии со стандартными протоколами. Вкратце, антитела наносили на колонку с сефарозой, конъюгированной с белком A (GE healthcare), и промывали PBS. Антитела элюировали при рН 2,8 с последующей немедленной нейтрализацией. Агрегированный белок отделяли от мономерных антител посредством эксклюзионнрй хроматографии (Superdex 200, GE Healthcare) в PBS или в 20 мМ гистидиновом буфере, содержащем 150 мМ NaCl (рН 6,0). Фракции, содержащие мономерное антитело, объединяли, концентрировали (при необходимости), например, используя центрифужный концентратор MILLIPORE Amicon Ultra (НОММ 30), замораживали и хранили при -20°С или -80°С. Часть образцов использовали для последующего определения белка и аналитического исследования, например, посредством ДСН-ПААГ, эксклюзионной хроматографии (ЭХ) или масс-спектрометрии.

ДСН-ПААГ

Готовые системы гелей NuPAGE® (Invitrogen) использовали в соответствии с инструкциями производителя. В частности, использовали готовые системы 10% или 4-12% гелей NuPAGE® Novex® Bis-TRIS (рН 6,4) и электродный буфер NuPAGE® MES (для электрофореза в восстанавливающих условиях, с добавлением в электродный буфер реагента NuPAGE® antioxidant) или MOPS (для электрофореза в невосстанавливающих условиях).

Капиллярный электрофорез в присутствии ДСН (КЭ-ДСН)

Чистоту и интактность антитела исследовали посредством КЭ-ДСН, используя микрофлюидную технологию Labchip (PerkinElmer, USA). Так, 5 мкл раствора антитела подготавливали для анализа КЭ-ДСН с использованием набора реагентов НТ Protein Express согласно инструкциям производителя и анализировали с использованием системы LabChip GXII и чипа НТ Protein Express. Для анализа данных использовали программу LabChip GX.

Аналитическая эксклюзионная хроматография

Для определения агрегации и олигомерного состояния антител выполняли ВЭЖХ в варианте эксклюзионной хроматографии (ЭХ). Вкратце, антитела, очищенные с использованием белка А, наносили на колонку Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ KН₂РО₄/K₂НРО₄ буфере (рН 7,5) в системе Dionex Ultimate® (Thermo Fischer Scientific) или на колонку Superdex 200 (GE Healthcare) в 2 x PBS в системе Dionex HPLC. Количественное определение элюированного антитела проводили по поглощению в УФ области, измеряя площади пиков. В качестве стандарта использовали стандарт для гель-фильтрации BioRad 151-1901.

Масс-спектрометрия

В данном разделе описано исследование характеристик биспецифических антител с уделением особого внимания правильности их сборки. Искомые первичные структуры анализировали посредством масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ESI-MS) дегликозилированного интактного антитела и в особых случаях дегликозилированного антитела, подвергшегося ограниченному расщеплению эндопротеиназой LysC.

Дегликозилирование антител осуществляли с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Tris буфере при 37°С в течение времени до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Осуществляли ограниченное расщепление 100 мкг дегликозилированного антитела с помощью LysC (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) в Tris буфере (рН 8) при комнатной температуре в течение 120 часов или при 37°С в течение 40 мин, соответственно. Перед масс-спектрометрическим анализом образцы обессоливали при помощи ВЭЖХ на колонке Sephadex G25 (GE Healthcare). Общую массу определяли посредством ESI-MS с использованием системы maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik), оборудованной источником ионов TriVersa NanoMate (Advion).

Анализ химического разрушения

Образцы делили на три аликвоты и забуферивали 20 мМ His/His*HCl, 140 мМ NaCl, рН 6,0 или PBS, соответственно, и хранили при 40°С (His/NaCl) или 37°С (PBS). Контрольный образец хранили при -80°С.

После окончания инкубации определяли относительную активную концентрацию (BIAcore), агрегацию (ЭХ) и фрагментацию (капиллярный электрофорез или ДСН-ПААГ) и сравнивали с контролем, который не подвергался воздействию.

Термостабильность

Готовили образцы с концентрацией 1 мг/мл в 20 мМ растворе гистидин/гистидина хлорид, 140 мМ NaCl, рН 6,0, переносили в оптически прозрачный 384-луночный планшет путем центрифугирования через 0,4 мкм фильтровальный планшет и покрывали парафиновым маслом. Гидродинамический радиус определяли по динамическому светорассеиванию с помощью считывающего устройства для планшетов DynaPro (Wyatt) при нагревании образцов от 25°С до 80°С со скоростью 0,05°С/мин.

В альтернативном варианте образцы переносили в 10 мкл микрокюветы и регистрировали статическое светорассеивание и флуоресценцию при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 266 нм при помощи инструмента Optim1000 (Avacta Inc.) при нагревании от 25°С до 90°С со скоростью 0,1°С/мин.

Температуру начала агрегации определяли, как температуру, при которой гидродинамический радиус (DLS) или интенсивность рассеянного светового излучения (Optim1000) начинали увеличиваться.

В альтернативном варианте образцы переносили в 9 мкл ячейки мультикюветы. Мультикюветы, помещенные в инструмент Optim1000 (Avacta Analytical Inc.), нагревали от 35°С до 90°С с постоянной скоростью 0,1°С/минуту. Прибор непрерывно регистрирует интенсивность рассеянного лазерного излучения с длиной волны 266 нм приблизительно через каждые 0,5°С. На графике откладывали зависимость интенсивности рассеянного светового излучения от температуры. Температуру начала агрегации (T_agg) определяли, как температуру, при которой интенсивность рассеянного светового излучения (Optim1000) начинала увеличиваться.

Температуру плавления определяли, как точку перегиба графика зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны.

Пример 1. Экспрессия и очистка

Биспецифические антитела получали, как описано выше в разделе «Материалы и методы».

Биспецифические антитела выделяли из надосадочной жидкости при помощи аффинной хроматографии с белком А и эксклюзионной хроматографии. Полученные продукты идентифицировали посредством масс-спектрометрии, аналитические характеристики, такие как чистота, определяли при помощи КЭ-ДСН, а также определяли содержание мономеров и стабильность.

Искомые первичные структуры анализировали посредством масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ESI-MS) дегликозилированного интактного антитела и дегликозилированного антитела, подвергнутого расщеплению плазмином, или в альтернативном варианте дегликозилированного антитела, подвергнутого ограниченному расщеплению эндопротеиназой LysC, как описано в разделе «Общие методы».

Дополнительные аналитические методы (например, исследование термостабильности, масс-спектрометрический анализ и исследования функциональной активности) применяли только после очистки с использованием белка А и эксклюзионной хроматографии.

Пример 2. Определение связывания с рецептором трансферрина in vitro

Связывание биспецифических антител с мышиным рецептором трансферрина определяли при помощи проточной цитометрии (FACS) с использованием клеток миеломы мыши X63.AG8-563. Если антитело к Аβ демонстрирует некоторую тенденцию к неспецифическому связыванию с клетками Аg8, специфическое связывание можно определить при совместной инкубации с 20-кратным избытком антитела к TfR мыши. Клетки собирали посредством центрифугирования, однократно отмывали PBS и 5×10⁴ клеток инкубировали с серией разведений от 1,5 пМ до 10 нМ слитого полипептида с добавлением или без добавления 200 нМ антитела к TfR мыши в 100 мкл RPMI/10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) в течение 1,5 ч на льду. После 2 отмывок RPMI/10% FCS клетки инкубировали с козьим антителом к IgG человека, конъюгированным с фикоэритрином (Jackson Immunoresearch) в разведении 1:600 в RPMI/19% FCS в течение 1,5 ч на льду. Затем клетки снова промывали, ресуспендировали в RPMI/10% FCS и определяли флуоресценцию фикоэритрина на приборе FACS-Array (Becton-Dickinson).

Пример 3. Исследование взаимодействия с человеческим TfR методом поверхностного плазмонного резонанса

Исследование связывания проводили на биоанализаторе BIAcore В 4000 (GE Healthcare) с сенсор-чипом С1 (GE Healthcare, кат. номер BR1005-35), предварительно обработанным для захвата Fab фрагментов антитела человека (GE Healthcare, кат. номер 28-9583-25) с использованием стандартной процедуры связывания по аминогруппе согласно инструкциям производителя.

Для измерения кинетики образцы антитела иммобилизовали в течение 60 секунд при скорости тока 10 мкл/мин в фосфатно-солевом буфере рН 7,4, 0,05% Tween 20 при 25°С. Рекомбинантный человеческий рецептор трансферрина с гексагистидиновой меткой (R&D systems, кат.номер 2474-TR-050) использовали в увеличивающихся концентрациях и регистрировали сигнал с течением времени. В среднем интервал времени, в течение которого регистрировали ассоциацию, составлял 150 секунд, а интервал времени, в течение которого регистрировали диссоциацию, составлял 600 секунд, скорость потока составляла 30 мкл/мин. Данные аппроксимировали с использованием модели связывания 1:1 (изотерма Ленгмюра).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ CD20/ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ

РЕЦЕПТОРУ ТРАНСФЕРРИНА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> P33110

<150> EP15188067.1

<151> 2015-10-02

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0041-легкая цепь 1

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 2

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0041-тяжелая цепь 1

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 3

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0041-легкая цепь 2

<400> 3

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn

85 90 95

Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

180 185 190

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215

<210> 4

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0041-Fab

<400> 4

Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr

85 90 95

Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

145 150 155 160

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

165 170 175

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

195 200 205

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

210 215 220

Asn Arg Gly Glu Cys

225

<210> 5

<211> 297

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser

130 135 140

His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

165 170 175

Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys

210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro

245 250 255

Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro

290 295

<210> 6

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0039-легкая цепь 1

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 7

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0039-тяжелая цепь 1

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 8

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0039-легкая цепь 2

<400> 8

Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr

85 90 95

Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

145 150 155 160

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

165 170 175

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

195 200 205

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

210 215 220

Asn Arg Gly Glu Cys

225

<210> 9

<211> 681

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0039-тяжелая цепь 2

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

465 470 475 480

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

485 490 495

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

500 505 510

Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

515 520 525

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

530 535 540

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser

545 550 555 560

Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

565 570 575

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

580 585 590

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

595 600 605

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

610 615 620

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

625 630 635 640

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

645 650 655

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

660 665 670

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

675 680

<210> 10

<211> 695

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0041-тяжелая цепь 2

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

465 470 475 480

Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser

485 490 495

Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

500 505 510

Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala

515 520 525

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys

530 535 540

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

545 550 555 560

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp

565 570 575

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala

580 585 590

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

595 600 605

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

610 615 620

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

625 630 635 640

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

645 650 655

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

660 665 670

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

675 680 685

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

690 695

<210> 11

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0040-легкая цепь 1

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0040-тяжелая цепь 1

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 13

<211> 695

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0040-тяжелая цепь 2

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

465 470 475 480

Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser

485 490 495

Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

500 505 510

Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala

515 520 525

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys

530 535 540

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

545 550 555 560

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp

565 570 575

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala

580 585 590

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

595 600 605

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

610 615 620

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

625 630 635 640

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

645 650 655

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

660 665 670

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

675 680 685

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

690 695

<210> 14

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0042-легкая цепь 1

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 15

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0042-тяжелая цепь 1

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 16

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0042-легкая цепь 2

<400> 16

Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr

85 90 95

Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

145 150 155 160

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

165 170 175

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

195 200 205

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

210 215 220

Asn Arg Gly Glu Cys

225

<210> 17

<211> 674

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0042-тяжелая цепь 2

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser

225 230 235 240

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

245 250 255

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

260 265 270

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala

275 280 285

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

290 295 300

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

305 310 315 320

Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly

325 330 335

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

340 345 350

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

355 360 365

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

370 375 380

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

385 390 395 400

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

405 410 415

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

420 425 430

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

435 440 445

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

450 455 460

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

465 470 475 480

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

485 490 495

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

500 505 510

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

515 520 525

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

530 535 540

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

545 550 555 560

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

565 570 575

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

580 585 590

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

595 600 605

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

610 615 620

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

625 630 635 640

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

645 650 655

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

660 665 670

Pro Gly

<210> 18

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> VH антитела к CD20

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> VL антитела к CD20

<400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 299-023 VH гуманизированного варианта_DASG

<400> 20

Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr

85 90 95

Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 110

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 299-009 VL гуманизированного варианта_NYA

<400> 21

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn

85 90 95

Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Иcкусственная последовательность

<220>

<223> 0040-легкая цепь 2

<400> 22

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn

85 90 95

Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

180 185 190

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215

<---

1. Биспецифическое антитело для связывания с CD20 человека и с рецептором трансферрина человека, содержащее:

одно антитело, содержащее по две пары легких цепей антитела и тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой тяжелой цепи и легкой цепи, специфически связываются с первым антигеном, и

один дополнительный Fab фрагмент, который слит с C-концом одной из тяжелых цепей антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

при этом указанное биспецифическое антитело состоит из:

- SEQ ID NO: 06-09, или

- SEQ ID NO: 01-03 и SEQ ID NO: 10, или

- SEQ ID NO: 11-13 и SEQ ID NO: 22, или

- SEQ ID NO: 14-17.

2. Антитело по п. 1, где

тяжелая цепь, которая слита с дополнительным Fab-фрагментом, имеет в качестве C-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи трипептид LSP, у которого пролин непосредственно слит с первым аминокислотным остатком дополнительного Fab-фрагмента или пептидного линкера посредством пептидной связи, и

тяжелая цепь, которая не слита с дополнительным Fab-фрагментом, имеет в качестве C-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи трипептид LSP, или SPG, или PGK.

3. Антитело по п. 1, где антитело является моноклональным.

4. Фармацевтическая композиция для связывания с CD20 человека и с рецептором трансферрина человека, содержащая антитело по любому из пп. 1-3 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Применение антитела по любому из пп. 1-3 в качестве лекарственного средства, связывающегося с CD20 человека и с рецептором трансферрина человека.

6. Применение антитела по любому из пп. 1-3 в изготовлении лекарственного средства, связывающегося с CD20 человека и с рецептором трансферрина человека.

7. Способ связывания CD20 человека и рецептора трансферрина человека, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из пп. 1-3.