Штамм бактерий salmonella enterica в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований в диагностике сальмонеллёза
Владельцы патента RU 2753412:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм бактерий Salmonella enterica, обладающий множественной резистентностью к антимикробным препаратам, с выявленными генетическими детерминантами устойчивости, депонирован во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве», под номером ВКШМ-Б-850М. Изобретение обеспечивает выполнение диагностики сальмонеллеза штаммов, содержащих конъюгативную плазмиду pESI-like, с множественной устойчивостью к антимикробным средствам: амино- и карбосипенициллинам, цефалоспоринам, фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, фениколам, триметоприму. 1 ил., 2 пр.
Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике сальмонеллеза на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости к амино- и карбосипенициллинам, цефалоспоринам, фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, фениколам, триметоприму) и молекулярных исследований направленных на создание штамма сальмонелл, характеризующегося множественной резистентностью ассоциированной с шестью генами устойчивости к антимикробным препаратам, ассоциированных с pESI-подобной плазмидой (aadA1, blaCTX-M-14, dfrAl4, sull, tetA/tetR, tetM). Помимо плазмидных генов устойчивости к противомикробным препаратам, штамм несет мутацию в хромосомном гене gyrA (p.S83Y или p.D87Y), которая связана с устойчивостью к фторхинолонам.
В настоящее время описано более 1500 сероваров Salmonella enterica (Grimont and Weill, 2007). Однако только 10-15 сероваров ответственны за большинство случаев сальмонеллеза в мире (отчет ВОЗ, 2019). К таким сероварам относятся S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Heidelberg, S. Derby, S. Newport, S. Panama, S. London, S. Anatum (*Mollbak et al., 2006; Freitas Neto et al., 2010; NARMS report, 2015; EFSA and ECDC report, 2018a, 2018b). В последнее время наиболее распространенными нетифозными сальмонеллами сероваров, выделенных от человека в России, были те же, что и выделенные из пищи: S. Typhymuriurn, S. Enteritidis и S. Infantis. В 2017 году самым распространенным сероваром, выделенным из пищи в России, был S. Infantis (отчет Роспотребнадзора, 2018).
Геномный анализ плазмидных последовательностей показал, что S. Infantis ВКШМ-Б-850М имеет π лазмиду, очень похожую на pESI-подобные мега-плазмиды, о которых ранее сообщали Aviv et al. (2014), Franco et al. (2015) и Tate et al. (2017), не идентифицируемые ранее в РФ.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм бактерий S. Infantis идентифицированный в Италии Franco et al. (2015), содержащий 4 плазмиды, характеризующийся устойчивостью к цефалоспоринам, но имеющий несколько генов устойчивости, поэтому невозможно его использование в качестве контрольного. Предлагаемый штамм в качестве изобретения проявляет стабильное соответствие ненетичеких маркеров и микробиологического профиля AMP. Так же известен штамм бактерий SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROVAR TYPHI в качестве контрольного для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа, однако он характеризуется устойчивостью высокого уровня только к фторхинолонам, обусловленной двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида. Предлагаемый в качестве изобретения штамм имеет стабильные параметры множественной резистентности, что позволяет его более широкое использование. Плазмида pVGNKI-13 несет ген blaCTX-М-14, который располагается в генетическом контексте, состоящем из ISEcplΔ-IS10R-ΔISEcp1-blaCTX-M-14-IS903B (рис. 1С). Тот же генетический фон для гена blaCTX-М-14 был сообщен несколько раз ранее (Но et al., 2013; Riccobono et al, 2014; Hayashi et al., 2018; Di Pilato et al., 2019). Геном изолята ВКШМ-Б-850М содержит ген tetM, который находится в 4-килобайтном контиге, ограниченном инсерционными последовательностями IS26 (рис. 1). Таким образом, приобретенные гены AMR существуют в мобильных модулях, встроенных в pESI-подобные плазмиды.
Уникальной особенностью pESI-подобной плазмиды является последовательность 173 КБ, которая несет два оперона вирулентности и три системы токсин/антитоксин. Наличие этой последовательности способствует глобальному распространению pESI-подобных плазмид.
Штамм депонирован во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-850М.
Штамм бактерий Salmonella enterica ВКШМ-Б-850М в качестве контрольного штамма для молекулярных исследований при идентификации конъюгативной плазмиды pESI-like, обеспечивающей мультирезистентные свойства в диагностике сальмонеллеза.
Изобретение обеспечивает выполнение диагностики штаммов содержащих конъюгативную плазмиду pESI-like.
Таксономия и описание штамма: семейство Enterobacteriaceae род Salmonella вид Salmonella enterica серовар Infantis.
Штамм сальмонелл Salmonella enterica ВКШМ-Б-850М природный, выделен из биологического материала.
Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-850М, необходимого для обеспечения достоверной диагностики сальмонеллеза, ассоциированного с AMP.
Задача настоящего изобретения - референтный штамм, стабильно сохраняющий фенотипические свойства, содержащие гены, нуклеотидная последовательность которых специфична для вида, подвида, биовара, и создание на их основе комплекта контрольных препаратов ДНК для генно-диагностических исследований.
Характеристика штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-850М
Культурально-морфологические свойства штамма - грамотрицательные подвижные палочки без спор и капсул.
Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 4 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.
Культуральные свойства:
Через 18-24 час культивирования при температуре (37±1)°С штамм формирует:
- на среде Эндо бледно-розовые, прозрачные, круглые, плоские, с ровными краями колонии, диаметром 2-3 мм;
- на висмут-сульфит-агаре - круглые, плоские с ровными краями, черные с металлическим блеском и почернением среды под колонией, диаметром 1,5-2 мм;
- на XLD-агаре - круглые, плоские, с ровными краями, бесцветные (в цвет ага-ра) с черным центром колонии, диаметром 2-3 мм;
- на хромогенном агаре образуют сиреневые, характерные для сальмонелл колонии, диаметром 2-3 мм;
- на жидких питательных средах и полужидком ΜΠΑ (0,3%) наблюдается диффузное помутнение среды.
Особенности штамма: gyrA-p.D87Y, parC-p.T57S, aadA1, dfrA14, sull, tetA, tetR, aac6-Iaa.
Для поиска генов антибиотикорезистентности в бактериальном геноме использовали сервис ResFinder и базы данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, The Comprehensive Antibiotic Resistance Database и NCBI Bacterial Antimicrobial Resistance Reference Gene Database. Подтверждено наличие генетических факторов резистентности gyrA-p.D87Y, aadA1, dfrA14, sul-1, tetA/tetR.
Данные, полученные при помощи NGS на Miseq, и данные функциональных микробиологических тестов хорошо согласуются между собой.
Молекулярный механизм устойчивости - шесть генов устойчивости к антимикробным препаратам, ассоциированных с pESI-подобными плазмидами (aadA1, bla СТХ-М-14, dfrA14, sull, tetA / tetR, tetM), а так же мутация в хромосомном гене gyrA (p.S83Y или p.D87Y), которая связана с устойчивостью к фторхинолонам.
Стабильность наличия мутаций в геноме контрольного штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-850М подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности после хранения штамма в течение 6 месяцев в лиофилизированном виде в ампулах под вакуумом при температуре 2-8°С
Изобретение реализуется следующим образом.
Пример 1
Контроль качества определения механизма устойчивости к антимикробным препаратам, ассоциированных с pESI-подобными плазмидами (aadA1, bla СТХ-М-14, dfrA14, sull, tetA / tetR, tetM), а так же мутация в хромосомном гене gyrA (p.S83Y или p.D87Y), которая связана с устойчивостью к фторхинолонам по данным полногеномного секвенирования.
Выделение геномной ДНК из жидкой суточной бактериальной культуры Salmonella enterica проводили методом сорбции на силикагеле с использованием набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИЭ) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре QuantiFluor® ONE dsDNA System (Promega Corporation, США).
Подготовку библиотек проводили с использованием набора для NGS Nextera XT DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera XT Index Kit, магнитных шарики для очистки ампликонов (Agencourt AMPure ХР, Beckman Coulter, США), набор реагентов для секвенирования MiSeq® Reagent Kit v2/v3 согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq® Reagent Kit v2/v3 (США).
Поиск генетических факторов, обеспечивающих резистентность к антибиотикам, вели при помощи нескольких ресурсов: онлайн-ресурс ResFinder, находящегося на сервере Центра геномной эпидемиологии Датского технического университета [2]; база данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, база данных The Comprehensive Antibiotic Resistance Database. Аннотация геномов была выполнена с помощью сервера RAST на открытой платформе для сравнительного анализа геномов SEED.
Контрольный штамм Salmonella enterica ВКШМ-Б-850М проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались шесть генов устойчивости к антимикробным препаратам, ассоциированных с pESI-подобными плазмидами (aadA1, bla СТХ-М-14, dfrA14, sull, tetA / tetR, tetM), а так же мутация в хромосомном гене gyrA (p.S83Y или p.D87Y), которая связана с устойчивостью к фторхинолонам.
Пример 2
При использовании метода серийных разведений руководствовались следующими методическими рекомендациями: МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»; VET01-А4 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals, Approved Standard - Fourth Edition.
Использовали микрометод серийных разведений, т.е. с использованием стерильных 96-ти луночных планшетов и величине конечного объема 100 мкл.
В качестве питательной среды использовали бульон Мюллера-Хинтона с добавлением ионов кальция и магния. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Учет результатов проводили визуально, сравнивая рост микроорганизма в присутствии АБП с ростом культуры в ячейке без АБП. За минимальную подавляющую концентрацию принимали концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемого штамма.
Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам, амино- и карбосипенициллинам, цефалоспоринам, фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, фениколам, триметоприму уровень устойчивости расценивался как высокий.
Для обеспечения достоверной диагностики сальмонеллеза, ассоциированного с AMP, необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать этап определения механизма устойчивости фенотипическими и молекулярными методами.
Литературные источники
1. Gunell Μ. et al. Mechanisms of resistance in nontyphoidal Salmonella enterica strains exhibiting a nonclassical quinolone resistance phenotype // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2009. - N53(9). - P. 3832-3836.
2. Сидоренко С. В. и соавт.Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам. Антибиотики и химиотерапия 2011; 9(3):6-16.
3. Но P-L etal. Plasmid-mediated OqxAB is an important mechanism for nitrofurantoin resistance in Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 60:537-543. doi:10.1128/AAC.02156-15.
Штамм бактерий Salmonella enterica, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве», под номером ВКШМ-Б-850М, обладающий множественной резистентностью к антимикробным препаратам, с выявленными генетическими детерминантами устойчивости для фенотипических и молекулярных исследований при идентификации конъюгативной плазмиды pESI-like в диагностике сальмонеллеза.
