Способ получения продуктов сбраживания глюкозы из целлюлозосодержащего сырья и целлюлозосодержащих отходов термофильной бактерией
Владельцы патента RU 2751490:
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения продуктов сбраживания глюкозы: молочной, уксусной, янтарной, пропионовой, масляной, муравьиной, изовалериановой кислот и этанола, из целлюлозосодержащих сырья и отходов. Способ включает культивирование экстремально термофильных и гипертермофильных микроорганизмов рода Dictyoglomus на субстратах из целлюлозосодержащих сырья и отходов при температурах 50-80°C, значениях рН 6.0-8.0 и солености 0-2%, отделение продуктов разложения целлюлозы от биомассы посредством отгонки и/или жидкостной хроматографии, электродиализа и упаривания. Изобретение обеспечивает получение целевых продуктов, пригодных для использования в качестве кормовых добавок. 3 з.п. ф-лы, 4 табл., 5 пр., 3 ил.
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии. Более подробно изобретение относится к технологиям использования микроорганизмов для переработки сырья и отходов, содержащих целлюлозу, и получения соединений с добавленной стоимостью и конкретно к применению термофильных микроорганизмов рода Dictyoglomus для переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов с образованием перспективных для последующего применения в качестве кормовых добавок веществ, таких как жирные кислоты, в том числе летучие жирные кислоты (ЛЖК).
Уровень техники
Органические кислоты входят в наиболее обширный и разнообразный класс кормовых добавок - подкислители кормов. В состав подкислителей входят органические кислоты и (или) их соли. Применяемые в сельском хозяйстве подкислители различают по своим свойствам: снижающие рН или воздействующие на микробов, вводимые в жидком или сухом виде, обладающие летучестью, коррозионной активностью, запахом, вкусом, уровнем безопасности для животных и людей, и т.п. Яркий пример подкислителя - молочная кислота (лактат). Это органическая кислота, которая, по сравнению с муравьиной или уксусной кислотами, не обладает летучестью и имеет крайне малую коррозионную активность. Помимо снижения рН перспективность применения молочной кислоты обусловлена еще и ее антибактериальным действием, а также стимулированием потребления животными корма. Как подкислитель молочная кислота особенно востребована в качестве добавки в кормах для поросят.
По агрегатному состоянию подкислители бывают жидкими и порошкообразными. Жидкие подкислители, как правило, вносят в воду или жидкие корма, реже - в сухой корм. Если в состав подкислителей введены органические кислоты, находящиеся в жидком состоянии, то, как правило, их изготавливают методом иммобилизации жидких кислот на инертном носителе (чаще всего, на окиси кремния).
При этом содержание наполнителя в продукте колеблется от 30 до 60%. Этот наполнитель с точки зрения кормовой ценности является балластом. Существуют также подкислители без балласта, представляющие собой смесь сухих кислот и солей органических кислот. Они отличаются высокой кормовой ценностью при сохранении присущих им свойств.
В зависимости от состава препарата, подкислители могут выполнять следующие функции:
- консервируют корм, то есть препятствуют развитию в нем патогенной микрофлоры, дрожжей, плесеней;
- снижают буферность корма, повышая его кислотность;
- способствуют снижению pH в желудке при попадании туда корма;
- препятствуют развитию патогенных микроорганизмов в желудке и кишечнике;
- стимулируют развитие нормофлоры;
- способствуют увеличению уровня выработки ферментов;
- улучшают усвоение корма.
Однако применение ряда органических кислот, таких, как муравьиная, пропионовая, уксусная, масляная в виде собственно кислот имеет ряд недостатков. Они провоцируют возникновение коррозии металлических частей оборудования, могут вызывать раздражения кожи и органов дыхания, а также ожоги у людей при работе с ними. Вышеуказанные кислоты могут вступать в реакции с витаминами и микроэлементами, входящими в состав кормов, снижая их биологическую активность. Т.к. эти кислоты легко испаряются, то существует высокий риск их потери при хранении и очень высокий - при влаготермической обработке кормов (гранулировании, экспандировании, экструдировании).
Вышеописанных недостатков лишены соли органических кислот. Они менее агрессивны и более безопасны в работе, имеют низкую летучесть, имеют преимущества при прохождении ЖКТ и могут эффективно «работать» в нижних отделах пищеварительного тракта животных. Подобные продукты востребованы, но пока почти не представлены на российском рынке.
Основу травянистых кормов, в частности, соломы, сена, составляет целлюлоза. Молекулы целлюлозы представляют собой неразветвленную цепь, состоящую из молекул D-глюкозы, соединенных между собой 1,4-β-гликозидными связями. Степень полимеризации варьируется от 8 до 14 тысяч молекул мономеров. Несмотря на то, что молекулы целлюлозы неразветвленные, между параллельными целлюлозными тяжами образуются водородные связи, которые обуславливают высокую прочность волокон полимера. В растениях молекулы целлюлозы обычно окружены сетью, состоящей из гемицеллюлоз и лигнина, что дополнительно усложняет гидролиз растительных остатков. Частичное разложение целлюлозы с образованием ЛЖК и других органических соединений может, во-первых, существенно повысить усвояемость кормов, а во-вторых, улучшить сохранность данного субстрата при длительном хранении благодаря образованию органических кислот и соответственному подкислению среды. Наличие микроорганизма, способного разлагать целлюлозу с образованием органических кислот, в том числе ЛЖК, и спиртов, способствует достижению обеих целей.
Учитывая высокую потребность в подкислителях как добавок для кормов сельскохозяйственных животных, а также необходимость эффективной и безопасной интеграции таких добавок в корм, разработка новых способов получения соединений, которые могут быть использованы в качестве подкислителей и консервантов кормов, представляет актуальную задачу современной биотехнологии. Экстремально термофильные (температурный оптимум роста 75°С и выше) микроорганизмы являются продуцентами термозимов - термостабильных и термоактивных ферментов с оптимумами активности при высоких температурах (Zeikus и др., 1998). Термозимы обладают сходными с их мезофильными аналогами механизмами катализа, но имеют ряд преимуществ: высокая термостабильность, устойчивость к высоким концентрациям денатурирующих агентов (таких, как детергенты, растворители, денатурирующие агенты и др.), высокой солености, а также к экстремальным значениям рН (Friedrich и Antranikian, 1996; Egorova и Antranikian, 2005). Помимо собственно свойств термозимов, протекание биотехнологических процессов при повышенных температурах имеет ряд дополнительных преимуществ: повышение температуры оказывает значительное влияние на растворимость веществ (например, крахмала, что облегчает процесс его гидролиза амилазами); возрастают коэффициенты диффузии, а значит, снижается вязкость растворов (Bruins и др., 2001; Eichler, 2001); и главное - существенно снижается риск контаминации, и, следовательно, побочных процессов, (Egorova и Antranikian, 2005). Также при повышенных температурах возможно существенное увеличение доступности трудноразлагаемых нерастворимых веществ, благодаря чему происходит их более эффективная утилизация (Niehaus и др., 1999). Среди термофильных микроорганизмов известно значительное число представителей, обладающих способностью к гидролизу природных биополимеров (полисахаридов, белков и пр.) благодаря действию внеклеточных термозимов с соответствующими активностями. Использование термофильных гидролитиков для повышения питательной ценности травянистых кормов сельскохозяйственных животных привлекательно с точки зрения отсутствия контаминации субстрата посторонней микрофлорой, в том числе, патогенными микроорганизмами, что позволяет стабилизировать процессы и снизить затраты на производство. Все перечисленное делает термофильные микроорганизмы и их ферменты (термозимы) привлекательными для использования в биотехнологических целях, в том числе для получения ЛЖК.
Из уровня техники известен документ CN 110699389 A «Способ получения летучих жирных кислот с использованием микроорганизмов рубца», в котором описано изобретение, относящееся к области ресурсов и окружающей среды и раскрывающее способ получения летучих жирных кислот с использованием микроорганизмов рубца. Заявленный способ включает следующие этапы: внесение твердожидкой смеси из рубца жвачного животного в предварительно нагретый анаэробный резервуар, добавление измельченной целлюлозной биомассы, работу биореактора таким образом, что вода, сбрасываемая из анаэробного резервуара, проходит через циклонную сепарацию, отстойник обеспечивает стекание твердой части обратно в анаэробный резервуар и позволяет жидкости попадать в коагулирующий отстойник для отделения продукта - летучих жирных кислот. Авторы указывают, что данное изобретение реализует производство летучих жирных кислот из отходов биомассы целлюлозы, повышает эффективность реакции и снижает стоимость продукта. При этом не раскрываются способ получения твердожидкой смеси из рубца жвачного животного и микробный состав твердожидкой смеси, полученной из рубца жвачного животного, а также не уточняется вид жвачного животного, из рубца, которого берется твердожидкая смесь, содержащая комплекс микроорганизмов, обеспечивающих осуществление изобретения. В качестве примеров целлюлозной биомассы, применимых в данном изобретении, указаны муниципальные садовые отходы, кухонные отходы и кукуруза, рис, пшеница, виноградные лозы и кресс-салат. В публикации US 2014353163 A1 «Биологическое / электролитическое преобразование биомассы в углеводороды» раскрыт способ получения углеводородного и водородного топлива, а также других продуктов, при котором используется комбинация ферментации и электрохимических реакций. По данному способу биомасса, содержащаяся в культуральной среде, ферментируется с инокулятом, содержащим смешанную культуру микроорганизмов, выделенных из содержимого рубца жвачного животного. Эту инокулированную среду инкубируют в анаэробных условиях в течение времени, достаточного для образования летучих жирных кислот. Отмечается, что данным способом может быть переработан широкий спектр целлюлозосодержащих соединений для получения различных летучих жирных кислот. Микробный состав смешанной культуры в описании изобретения не охарактеризован должным образом, хотя в примере 6 предлагается использовать культуру Clostridium kluyveri - подобных бактерий для сбраживания целлюлозосодержащего сырья. Недостатками данных изобретений является использование не охарактеризованной микробной композиции, поскольку изменение микробного состава композиции для сбраживания отходов напрямую влияет и на эффективность процесса получения целевого продукта, и на состав самого продукта. Более того, охарактеризовать микробную композицию самостоятельно, исходя из текстов данных публикаций, не представляется возможным.
Раскрытие изобретения
В заявляемом изобретении предложено использование термофильных микроорганизмов рода Dictyoglomus для получения органических соединений, пригодных для использования в качестве кормовых добавок, в частности молочной и уксусной кислот, а также янтарной, пропионовой, масляной, муравьиной и изовалериановой кислот и этанола из целлюлозосодержащего сырья и отходов. Вещества, полученные при переработке целлюлозосодержащего сырья термофильной бактерией рода Dictyoglomus, могут использоваться в качестве кормовой добавки, обеспечивая подкисление кормов.
Предлагается новый способ переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов для получения кормовых добавок. Выращивание термофильных бактерий рода Dictyoglomus на питательных средах из целлюлозосодержащего сырья и отходов, обеспечивает их переработку с получением полезных для сельскохозяйственной промышленности продуктов, в частости, янтарной кислоты, молочной, уксусной, пропионовой, масляной, муравьиной и изовалериановой кислот и этанола, которые могут применяться в качестве кормовых добавок, улучшая пищевую ценность корма и способствуя подкислению кормов. В экспериментальных исследованиях показана эффективность использования термофильных бактерий рода Dictyoglomus для получения данных органических соединений из целлюлозосодержащих субстратов и отходов.
Задачей изобретения является разработка способа переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов термофильной бактерией для получения органических соединений, которые могут быть использованы в качестве кормовых добавок.
Техническим результатом, достигаемым заявленным изобретением, является обеспечение возможности переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов термофильной бактерией рода Dictyoglomus с получением следующих органических соединений: молочная, уксусная, янтарная, пропионовая, масляная, муравьиная и изовалериановая кислоты и этанол. Бактерии рода Dictyoglomus, выращиваемые на субстратах из целлюлозосодержащего сырья и отходов при оптимальных температурных условиях, обеспечивают получение указанных органических соединений в легко доступной форме за счет ферментативного расщепления целлюлозы до моносахаров и последующего сбраживания последних.
Заявляемый способ характеризуется простотой, низкой стоимостью, контролируемостью ввиду использования единственного штамма микроорганизмов, отсутствием необходимости дополнительных расходных материалов и специальных навыков, что позволит быстро и широко внедрить его в промышленность.
Поставленная задача решается тем, что способ получения органических соединений, пригодных для использования в качестве кормовых добавок, из целлюлозосодержащего сырья и отходов термофильной бактерией, включает следующие шаги:
1. Культивирование на субстратах из целлюлозосодержащего сырья и отходов микроорганизмов рода Dictyoglomus;
2. Отделение продуктов гидролиза целлюлозы и сбраживания глюкозы, представляющих органические соединения, включающие молочную, уксусную, янтарную, пропионовую, масляную, муравьиную и изовалериановую кислоты и этанол, от биомассы посредством отгонки и/или жидкостной хроматографии, электродиализа и упаривания.
Микроорганизмы рода Dictyoglomus являются экстремально термофильными анаэробными органотрофными бактериями, характеризующимися формой нитей длиной 10-30 мкм и шириной 0.5-0.7 мкм, клеточной стенкой грамотрицательного типа, отсутствием спор и жгутиков, использующими моно-, ди- и полисахариды в качестве субстратов роста, обладающие целлюлазной активностью за счет внеклеточных целлюлаз, при температурах 50-80°С, значениях рН 6.0-8.0 и солености 0-2%. Термофильные микроорганизмы рода Dictyoglomus, которые могут быть использованы для осуществления данного способа, включают, но не ограничиваются следующими штаммами: Dictyoglomus sp. 2307, 1923, 1445d, 1521-1, 1944, а также могут быть скомбинированы в 2-5 компонентные микробные композиции.
В качестве целлюлозосодержащего сырья и отходов для осуществления данного способа могут быть использованы следующие материалы или их комбинации: ячменная и пшеничная солома, листья кукурузы, сено.
Основные продукты разложения целлюлозы и сбраживания образовавшейся глюкозы, получаемые при осуществлении данного способа, включают молочную, уксусную, янтарную, пропионовую, масляную, муравьиную и изовалериановую кислоты и этанол.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 представлена микрофотография Dictyoglomus sp. Фазово-контрастная световая микрофотография.
На фиг. 2 представлена микрофотография Dictyoglomus sp., окрашенных акридином оранжевым, полученная при помощи флуоресцентного микроскопа.
На фиг. 3 представлена Зимограмма. Субстрат, КМЦ; инкубация 2 часа при 70°C в 40 мМ МОПС, рН 7,43, 100 мМ NaСl, 5 мМ CaCl2.
1. Клетки штамма Dictyoglomus sp., сконцентрированные в 10 раз под фазово-контрастным световым микроскопом Zeiss AxioLab;
2. Клетки штамма Dictyoglomus sp., окрашенные акридиновым оранжевым (сконцентрированы в 10 раз).
Осуществление изобретения
Штаммы Dictyoglomus spp., (2307, 1923, 1445d, 1521-1, 1944), выделенные из горячих источников Камчатки, культивируют в 18 мл пробирках Хангейта на минеральной среде Пфеннига (г/л): NH4Cl - 0.33, KCl - 0.33, KH2PO4 - 0.33, CaCl2*2H2O - 0.33, MgCl2*6H2O - 0.33, дрожжевой экстракт - 0.1, раствор микроэлементов [Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. // Микробиология. 1992. Т. 61, В. 5. C. 812-817] - 1 мл/л, витамины [Wolin E.A., Wolin M.J., Wolf R.S. // J. Biol. Chem. 1963. V. 238, P. 2882-2888] - 1 мл/л, содержащую целлобиозу в качестве субстрата. рН доводят до 7.0 с использованием 1Н растворов соляной кислоты или гидроксида натрия. Анаэробно приготовленную среду (рН 7.0) разливают под током очищенного от кислорода молекулярного азота порциями по 10 мл и автоклавируют при избыточном давлении (1.0 атм). Таким образом, нарабатывают чистые культуры клеток, которые затем инкубируют в анаэробных условиях на целлюлозосодержащих субстратах в течение не менее 4 суток при оптимальных условиях (76°С, рН=7.0). Динамику роста культуры контролируют стандартными методами. В ходе культивирования на целлюлозосодержащих субстратах микроорганизмы Dictyoglomus spp. гидролизуют целлюлозу и ее производные до глюкозы, которая служит штаммам Dictyoglomus spp. источником энергии и углерода и разлагается ими до конечных продуктов (молочная, уксусная, янтарная, пропионовая, масляная, муравьиная и изовалериановая кислоты и этанол) посредством субстратного фосфорилирования (брожения). Отбор газообразных продуктов брожения осуществляется стандартным образом.
Таким образом, в ходе роста экстремально термофильных бактерий Dictyoglomus spp. на целлюлозосодержащих субстратах при сбраживании глюкозы выделяются молочная, уксусная, янтарная, пропионовая, масляная, муравьиная и изовалериановая кислоты и этанол. Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Специалисту в данной области техники понятно, что данные примеры не являются ограничивающими изобретение, а лишь показывают возможность его реализации.
Пример 1
Выделение чистых культур и изучение их морфологии и физиологии.
Штаммы Dictyoglomus spp. выделяют из горячего источника в Долине Гейзеров на Камчатке, характеризующегося температурой 65°С и значением рН 7.0. Выделение и культивирование данного микроорганизма проводят в 18 мл пробирках Хангейта на минеральной среде Пфеннига (г/л): NH4Cl - 0.33, KCl - 0.33, KH2PO4 - 0.33, CaCl2*2H2O - 0.33, MgCl2*6H2O - 0.33, дрожжевой экстракт - 0.1, раствор микроэлементов [Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. // Микробиология. 1992. Т. 61, В. 5. C. 812-817] - 1 мл/л, витамины [Wolin E.A., Wolin M.J., Wolf R.S. // J. Biol. Chem. 1963. V. 238, P. 2882-2888] - 1 мл/л. рН доводят до 7.0 с использованием 1Н растворов соляной кислоты или гидроксида натрия. Анаэробно приготовленную среду (рН 7.0) разливают под током очищенного от кислорода молекулярного азота порциями по 10 мл и автоклавируют при избыточном давлении (1.0 атм). Процедуру очистки осуществляют посредством пересева микроорганизмов, населяющих накопительную культуру, последовательными 10-кратными разведениями на среду, содержащую целлобиозу в качестве субстрата, и последующем высевом каждого разведения на ту же среду, с добавлением 2% агарозы. После инкубации выросшие на максимальном разведении отдельные колонии отбирают и пересевают на свежую жидкую среду того же состава. Таким образом, получают чистую культуру клеток, численность которых в исходной накопительной культуре была максимальной.
Штаммы Dictyoglomus spp. имеют форму нитей длиной 10-30 мкм и шириной 0.5-0.7 мкм (Фиг. 1) с клеточной стенкой грамотрицательного типа, спор и жгутиков обнаружено не было. Штаммы являются экстремально термофильными и гипертермофильными анаэробными органотрофными микроорганизмами, использующими моно-, ди- (глюкозу, сахарозу, целлобиозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, ксилозу) и полисахариды (ксилан, пектин, целлюлоза, карбоксиметил целлюлоза, крахмал, декстран) в качестве субстратов роста. Способны расти при температурах 50-80°С, значениях рН 6.0-8.0 солености 0-2%. Оптимальными условиями для роста являются 70-75°С, рН 7.0-7.5 и соленость 0-0.5%.
Пример 2
Молекулярная идентификация штаммов Dictyoglomus spp. Геномную ДНК выделяют стандартными методами [Park, D. // Methods in Molecular Biology, v. 353: Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Second Edition. (Ed.) E. Hilario and J. Mackay. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2007. 3-13], последовательность гена 16S рРНК определяют, как описано в работе [Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kolganova T.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. // Int. J. Syst. Evolut. Microbiol. 2002. V. 59. N 6. P. 1961-1967].
Первичный сравнительный анализ полученной de novo последовательности гена 16S рРНК с последовательностями базы данных GenBank проводят с помощью утилиты Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Последовательности генов 16S рРНК штаммов Dictyoglomus spp. и родственных микроорганизмов (выявленных при помощи BLAST) выравнивают между собой с использованием MAFFT v. 7 [Katoh, K., Rozewicki, J., Yamada, K.D. MAFFT online service: multiple sequence alignment, interactive sequence choice and visualization. Brief. Bioinform. 2017. V.20, №4, P.1160-1166. Построение филогенетического дерева исследуемых микроорганизмов и их родственников осуществляют с использованием MEGA 7 (Метод максимального правдоподобия, модель General Time Reversible (GTR), [Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. (2016) MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol. Biol. Evol. 33(7), 1870-4]). Филогенетическое расстояние определяют в количестве замен на 1 нуклеотид, в соответствии с выбранной моделью. Достоверность порядка ветвления (Bootstrap value) рассчитывают при 1000 повторах.
Пример 3
Измерение целлюлазной активности штаммов Dictyoglomus spp. Целлюлазную активность штаммов Dictyoglomus spp.1445d и 1521-1 измеряют динитросалициловым методом (ДНС, DNS) определения восстановленных сахаров и методом зимографии.
Для определения целлюлазной активности методом ДНС исследуемые образцы центрифугируют при 13400 об/мин в течение 10 мин и определяют активность внеклетоных целлюлаз в полученном супернатанте культуральной жидкости, а связанных с клеточными оболочками ферментов - во фракциях клеток, ресуспендированных в 50 мМ МЭС (2-(N-морфолин)этансульфоновая кислота) буфере, рН 6,5, 20°С, содержащем 5 мМ CaCl2. Для измерения активности по 0.1 мл образцов супернатантов или ресуспендированных клеток добавляют к 0.2 мл 0.5% раствора аморфной целлюлозы в 50 мМ МЭС буфере, рН 6,5, 20°С, содержащем 5 мМ CaCl2 и инкубируют 16 часов при 70°C или 80°C. По окончании инкубации к 0.3 мл реакционной смеси добавляют 1.2 мл ДНС-реагента (0.05% динитросалициловая кислота, 1.6% NaOH, 30% K-Na субстрат), полученную смесь кипятят 10-15 минут, охлаждают и измеряют оптическую плотность при 510 нм. В качестве отрицательного контроля используют реакционную смесь, содержащую дистиллированную воду вместо образца целлюлазы и неинкубированные образцы ферментов без субстрата. Для калибровки готовят по 0.1 мл растворов глюкозы различной концентрации и проводят с ними те же операции, что и с опытными образцами. Значения, полученные при измерении контролей, вычитают из значений опытных образцов. В результате в супернатанте культуральной жидкости была детектирована целлюлазная активность, составляющая 150 мкм глюкозы на 1 мл культуральной жидкости в минуту. В клетках активности обнаружено не было.
Таблица 1. Измерение восстановленных сахаров методом ДНС при росте штаммов 1445d и 1521-1 на различных видах целлюлозы.
| Субстрат | Образец | Прирост с учетом контроля | Время инкубации, ч | мкмоль глюкозы/мин^1 мл |
| КМЦ | 1445d, клетки | 0,168 | 19 | 75,5 |
| КМЦ | 1521-1, клетки | 0,128 | 19 | 57,6 |
| Аморфная целлюлоза | 1445d, клетки | 0,219 | 19 | 174,8 |
| Аморфная целлюлоза | 1521-1, клетки | 0,05 | 22 | 34,5 |
Методом зимографии проводят электрофоретическое разделение находящихся в образце белков и визуализацию ферментов с искомой активностью благодаря гидролизу субстрата, находящегося в геле [Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assemblage of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685]. В качестве субстрата используют карбоксиметилцеллюлозу. Окрашивание и контрастирование гелей проводят с использованием красителя Congo red [Burianova, T., Kopecny, J., Sajdok, J., Kas, J. // Animal Feed Sci. Technol. 1991. V. 33 P. 41-48] с некоторыми модификациями. Методом зимографии были обнаружены связанные с клетками эндоглюканазы (Фиг. 3).
Таким образом, целлюлазная активность у штаммов Dictyoglomus определяется как внеклеточными целлюлазами, находящимися во внеклеточном пространстве, так и связанными с клетками микроорганизма-продуцента.
Пример 4
Культивирование чистых культур Dictyoglomus spp. на сельскохозяйственных растительных отходах. Коллекционные штаммы Dictyoglomus spp. 2307, 1923, 1445d, 1521-1, 1944 инкубируют 7 суток при оптимальных условиях (76°С, рН=7.0) и оценивают рост (Таблица 2), а также измеряют количество образовавшихся в ходе культивирования редуцирующих остатков сахаров с помощью колориметрического метода с использованием 3,5-динитросалициловой (ДНС) кислоты по следующей схеме: отбирают пробу культуральной жидкости объемом 1 мл, центрифугируют при 13400 об/мин, отбирают 500 мкл надосадочной жидкости и добавляют 500 мкл ДНС-реагента, инкубируют 15 минут при перемешивании и 98°С. Пробирки остужают и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 575 нм против контроля (вода+ДНС-реагент). Концентрацию редуцирующих сахаров определяют с помощью калибровочных кривых, построенных по результатам измерения OD575 растворов глюкозы и ксилозы с концентрациями от 50 до 500 мкг/мл. В качестве положительного контроля используют микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ).
Таблица 2. Оценка роста коллекционных штаммов Dictyoglomus spр. на сельскохозяйственных отходах.
| Культура/ субстрат | Рост |
| 1923 МКЦ | + |
| 1923 Кукуруза | +/- |
| 1923 Солома | - |
| 1944 МКЦ | + |
| 1944 Кукуруза | + |
| 1944 Солома | + |
| 1445d МКЦ | + |
| 1445d кукуруза | - |
| 1445d Солома | + |
| 1521-1 МКЦ | + |
| 1521-1 Кукуруза | + |
| 1521-1 Солома | - |
| 2307 МКЦ | + |
| 2307 Кукуруза | + |
| 2307 Солома | + |
Таблица 3. Образование редуцирующих сахаров в процессе культивирования термофильных бактерий рода Dictyoglomus spp. на растительных отходах.
| Измерения | мкг редуцирующих сахаров/мл |
| Контроль МКЦ | 77 |
| 1923 МКЦ | 85 |
| 1944 МКЦ | 77 |
| 1445d МКЦ | 71 |
| 1521-1 МКЦ | 87 |
| 2307 МКЦ | 82 |
| Контроль Кукуруза | 83 |
| 1923 Кукуруза | 81 |
| 1944 Кукуруза | 73 |
| 1445d Кукуруза | 80 |
| 1521-1 Кукуруза | 87 |
| 2307 Кукуруза | 86 |
| Контроль Солома | 86 |
| 1923 Солома | 83 |
| 1944 Солома | 77 |
| 1445d Солома | 80 |
| 1521-1 Солома | 0 |
| 2307 Солома | 79 |
Пример 5
Определение продуктов брожения штамма Dictyoglomus spp. Штаммы Dictyoglomus spp. культивируют в оптимальных условиях в присутствии целлюлозы. Образующаяся в процессе гидролиза целлюлозы и ее производных глюкоза служит штаммам Dictyoglomus spp. источником энергии и углерода и разлагается ими до конечных продуктов посредством субстратного фосфорилирования (брожения). Продукты, образуемые в ходе роста экстремально термофильных и гипертермофильных бактерий Dictyoglomus spp. на глюкозе, измеряют хроматографически (методами газовой и жидкостной хроматографии). Анализ летучих органических соединений проводят на газовом хроматографе Кристалл-5000 (ЗАО Хроматэк, Россия) с пламенноионизационным детектором. Колонка - Superox-FA (10 м × 0.53 мм × 1.2 мкм) (Alltech, США) при программировании температур 60-160°С; газ носитель - гелий; скорость потока - 20 см3/мин без деления, объем пробы - 1 мкл. Анализ органических кислот и спиртов проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Stayer (Аквилон, Россия). Перед измерением образцы суспензий центрифугируют, супернатант подкисляют 5М H2SO4 до рН 2 и анализируют на колонке Aminex HPX-87H (BioRAD, США) в изократическом режиме с элюентом 25 мМ H2SO4 со скоростью потока 0,6 мл/мин. Сигналы регистрировали при помощи двух детекторов - рефрактометрического Smartline (Knauer, Германия) и ультрафиолетового при 210 нм UVV 104 (Аквилон, Россия).
Состав газов в пробе измеряют на газожидкостном хроматографе Chrom-5 (Чехия) с использованием детектора теплопроводности (катарометра) со следующими параметрами: сорбент - активированный уголь АГ-3; газ-носитель - аргон; расход газа-носителя - 30 мл/мин; температура термостата - 25°С. Объем вводимой пробы был равен 0.5 мл газовой смеси. Основными продуктами, образующимися при сбраживании глюкозы, штаммами Dictyoglomus spp. оказались этанол, ацетат и лактат, углекислый газ и молекулярный водород. При росте на сельскохозяйственных отходах, экстремально термофильные и гипертермофильные штаммы бактерий рода Dictyoglomus spp образуют целый спектр органических соединений (Таблица 4): кислоты, такие как лактат, ацетат, формиат, пропионат, бутират и изо-валерат, а также спирт этанол. Помимо этого, с помощью ВЭЖХ детектируется глюкоза, образующаяся при разложении целлюлозосодержащих с/х отходов.
Таблица 4. Характеристика продуктов разложения целлюлозы и сбраживания глюкозы штаммами бактерий Dictyoglomus spp.
| Штамм | Продукт брожения | Концентрация мМ/100 г субстрата | ||
| Солома | Кукуруза | Сено | ||
| Dictyoglomus sp.1521-1 | Янтарная кислота | нд | 13,86 | 548,5 |
| Молочная кислота | нд | 6,87 | 131,9 | |
| Муравьиная кислота | 1,763 | нд | 142,8 | |
| Уксусная кислота | 65,02 | 85,77 | 131,9 | |
| Пропионовая кислота | 14,7 | нд | нд | |
| Этанол | 51,38 | 78,64 | 142,8 | |
| масляная кислота | 78,57 | 148,3 | 246,8 | |
| изовалериановая кислота | нд | 20,29 | ||
| Dictyoglomus sp.1445d | Янтарная кислота | нд | 28,24 | нд |
| Молочная кислота | нд | 1,198 | нд | |
| Уксусная кислота | 48,36 | 106,8 | нд | |
| Этанол | 84,63 | 215,8 | нд | |
| изовалериановая кислота | 1,571 | нд | нд | |
| Dictyoglomus sp.2307 | Янтарная кислота | 23,58 | 22,73 | нд |
| Молочная кислота | 3,945 | 9,447 | нд | |
| Муравьиная кислота | нд | 6,5 | нд | |
| Уксусная кислота | 60,18 | 91,75 | нд | |
| Этанол | 146,6 | 93,28 | нд | |
| масляная кислота | 85,02 | 163,6 | нд | |
| изовалериановая кислота | 14,49 | нд | ||
| Dictyoglomus sp.1923 | Янтарная кислота | нд | 4,567 | нд |
| Уксусная кислота | 45,65 | 55,65 | нд | |
| Этанол | 35,26 | 60,16 | нд | |
| масляная кислота | 87,68 | 133 | нд | |
| изовалериановая кислота | 12,78 | нд | нд | |
| Dictyoglomus sp.1944 | Янтарная кислота | нд | 14,69 | нд |
| Молочная кислота | 4,636 | 9,04 | нд | |
| Муравьиная кислота | 2,304 | 5,278 | нд | |
| Уксусная кислота | 61,16 | 61,94 | нд | |
| Пропионовая кислота | нд | 2,498 | нд | |
| Этанол | 92,55 | 84,19 | нд | |
| масляная кислота | 86,85 | 123,1 | нд |
1. Способ получения продуктов сбраживания глюкозы: молочной, уксусной, янтарной, пропионовой, масляной, муравьиной, изовалериановой кислот и этанола, пригодных для использования в качестве кормовых добавок, из целлюлозосодержащих сырья и отходов заключается в культивировании на субстратах из целлюлозосодержащих сырья и отходов экстремально термофильных и гипертермофильных микроорганизмов рода Dictyoglomus при температурах 50-80°С, значениях рН 6.0-8.0 и солености 0-2%, и отделения продуктов разложения целлюлозы и сбраживания образовавшейся глюкозы от биомассы посредством отгонки и/или жидкостной хроматографии, электродиализа и упаривания.
2. Способ по п.1, где гипертермофильный микроорганизм рода Dictyoglomus является штаммом Dictyoglomus sp. 2307, 1923, 1445d, 1521-1, 1944.
3. Способ по п.1, где целлюлозосодержащие сырье и отходы выбраны из группы: ячменная и пшеничная солома, листья кукурузы, сено и их комбинации.
4. Способ по п.1, где оптимальные условия культивирования штаммов гипертермофильных микроорганизмов рода Dictyoglomus характеризуются температурой 70-75°С, рН 7.0-7,5 и соленостью 0-0,5%.
