Новые конъюгаты аманитина

Изобретение относится к конъюгату, включающему в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением, (b) мишень-связывающий фрагмент и (с) необязательно линкер, связывающий указанный аматоксин и указанный мишень-связывающий фрагмент. Дополнительно изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой конъюгат. Конъюгат проявляет повышенную стабильность в стрессовых условиях и улучшенный терапевтический индекс. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к конъюгату, включающему в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением; (b) мишень-связывающий фрагмент и (с) необязательно линкер, связывающий указанный аматоксин и указанный мишень-связывающий фрагмент. Дополнительно изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой конъюгат.

Уровень техники

Аматоксины являются циклическими пептидами, состоящими из 8 аминокислот, содержащихся в грибах Amanita phalloides (см. фиг. 1). Аматоксины специфически ингибируют ДНК-зависимую РНК-полимеразу II клеток млекопитающих и за счет этого также транскрипцию и биосинтез белка пораженных клеток. Ингибирование транскрипции в клетке приводит к остановке роста и пролиферации. Несмотря на то, что данная связь не является ковалентной, комплекс между аманитином и РНК-полимеразой II очень прочный (K_D=3 нМ). Диссоциация аманитина из фермента (энзима) - очень медленный процесс, вследствие чего маловероятно восстановление поврежденной клетки. Если ингибирование транскрипции будет продолжаться слишком долго, клетка подвергнется запрограммированной клеточной смерти (апоптозу).

Применение аматоксинов в качестве цитотоксических фрагментов для терапии опухолей уже исследовалось в 1981 году путем связывания антитела анти-Thy 1.2 с α-аманитином при помощи линкера, присоединенного к индольному кольцу Trp (аминокислоты 4, см. фиг. 1) посредством диазотирования (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). У Davis & и Preston сайт присоединения определен в положении 7'. У Morris и Venton также показано, что замещение в положении 7' приводит к образованию производного, которое поддерживает цитотоксическую активность (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res., 1983, 21 419-430).

В заявке на патент ЕР 1859811 А1 (опубликованной 28 ноября 2007) описаны конъюгаты, в которых γ-атом углерода аминокислоты 1 аматоксина β-аманитина связывается напрямую, т.е. без линкерной структуры, с альбумином или моноклональным антителом НЕА125, OKT3 или РА-1. Кроме того, было показано ингибирующее действие этих конъюгатов на пролиферацию клеток рака молочной железы (MCF-7), клеток лимфомы Беркитта (Raji) и клеток Т-лимфомы (Jurkat). Было предложено применение линкеров, включая линкеры, включающие такие элементы, как амид, сложный эфир, простой эфир, тиоэфир, дисульфид, мочевину, тиомочевину, углеводородные фрагменты и т.п., но такие конструкты не были фактически показаны и не были предоставлены более подробные сведения, например, о сайтах присоединения на аматоксинах.

В патентных заявках WO 2010/115629 и WO 2010/115630 (обе опубликованы 14 октября 2010 года) описаны конъюгаты, в которых антитела, такие как антитела анти-ЕрСАМ, например, гуманизированное антитело huHEA125, связаны с аматоксинами через (i) γ-атом углерода аминокислоты 1 аматоксина, (ii) 6' атом углерода аминокислоты 4 аматоксина или (iii) через δ-атом углерода аминокислоты 3 аматоксина, в каждом случае либо напрямую, либо через линкер между антителом и аматоксинами. Предложенные линкеры включают такие элементы, как амид, сложный эфир, простой эфир, тиоэфир, дисульфид, мочевину, тиомочевину, углеводородные фрагменты и т.п. Кроме того, было показано ингибирующее действие этих конъюгатов на пролиферацию клеток рака молочной железы (клеточная линия MCF-7), клеток карциномы поджелудочной железы (клеточная линия Capan-1), клеток рака толстой кишки (клеточная линия Colo205) и клеток холангиокарциномы (клеточная линия OZ).

В патентной заявке WO 2012/119787 описано, что мишень-связывающие фрагменты могут быть присоединены к аматоксинам через линкеры в дополнительных сайтах присоединения на триптофановой аминокислоте 4, а именно, в положениях 1'-N, без вмешательства во взаимодействие таких аматоксинов с их мишенью, ДНК-зависимой РНК-полимеразой II клеток млекопитающих.

Известно, что аматоксины относительно нетоксичны при соединении с крупными биомолекулами-носителями, такими как молекулы антител, и что они свою проявляют цитотоксическую активность только после отщепления биомолекулы-носителя. В свете токсичности аматоксинов, в частности, в отношении клеток печени, крайне важно, чтобы конъюгаты аматоксинов для таргетной терапии опухолей оставались высокостабильными после введения в плазму и чтобы высвобождение аматоксина происходило после интернализации в клетках-мишенях. В этом контексте небольшие улучшения стабильности конъюгата могут иметь значительные последствия для терапевтического окна и безопасности конъюгатов аматоксина для терапевтических подходов.

В патентной заявке WO 2012/041504 описаны конъюгаты аматоксина со связывающей молекулой, в которых используют фрагмент мочевины в качестве линкера для связывающей молекулы. Было показано, что такая связь может быть значительно более стабильной, чем сложноэфирная связь.

Таким образом, был достигнут значительный прогресс в разработке конъюгатов на основе амотоксина для терапевтического применения. Тем не менее, авторы настоящего изобретения установили, что конструкты на основе α- и β-аматоксина не были полностью стабильны в стрессовых условиях в плазме крови и приводили к наличию существенного количества сшитых продуктов (см. фиг. 2-4). Тем не менее, стабильность конъюгатов, включающих в себя высокотоксичный аматоксин, имеет первостепенное значение для рассматриваемого применения в качестве терапевтической молекулы для введения людям.

Цель изобретения

Таким образом, по-прежнему существует большая потребность в вариантах аматоксина с улучшенной стабильностью. В известном уровне техники не предложено и не представлено решение этой проблемы, то есть, выявления определенных модификаций основной цепи из восьми аминокислотных остатков, образующих основную структуру аматоксина.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение основано на том неожиданном наблюдении, что вариантная форма аматоксинов с (i) аминокислотой 4 с 6'-дезокси положением и (ii) аминокислотой 8 с S-дезокси-положением показывает повышенную стабильность в стрессовых условиях и улучшенный терапевтический индекс.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением; (b) мишень-связывающий фрагмент и (с) необязательно линкер, связывающий указанный аматоксин и указанный мишень-связывающий фрагмент. В частности, необязательный линкер согласно пункту (с) присутствует и является расщепляемым линкером.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по настоящему изобретению.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату по настоящему изобретению для применения в лечении рака у пациента, в частности, в котором рак выбран из группы, включающей рак молочной железы, рак поджелудочной железы, холангиокарциному, колоректальный рак, рак легких, рак предстательной железы, рак яичников, рак желудка, рак почек, злокачественную меланому, лейкемию и злокачественную лимфому.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к конструкту, включающему в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением; и (с) фрагмент линкера, в частности расщепляемого линкера, который несет реакционно-способную группу для связывания указанного аматоксина с мишень-связывающим фрагментом.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны структурные формулы различных аматоксинов. Цифры, выделенные жирным шрифтом, (от 1 до 8) обозначают стандартную нумерацию восьми аминокислот, образующих аматоксин. Также показаны стандартные обозначения атомов в аминокислотах 1, 3 и 4 (греческие буквы от α до γ, греческие буквы от α до δ и цифры от 1' до 7', соответственно).

На фиг. 2 показаны результаты эксперимента с нарастающей нагрузкой в Вестерн-блоттинге против аманитина. Конъюгат трастузумаб-аманитин (Her-30.0643, конъюгация лизина через 6'-ОН, стабильный линкер) инкубировали в течение 5 дней при температуре 37°С в PBS (фосфатно-солевом буферном растворе) с рН 7,4, вследствие чего образовывалось обширное межцепочечное и внутрицепочечное перекрестное сшивание; перекрестное сшивание цепей антител можно предотвратить посредством добавления свободного цистеина.

На фиг. 3 показано, что α-аманитин демонстрирует сильную реакционную способность с цистеином в PBS буфере с рН 7,4. 1 мг/мл α-аманитина 10 мг/мл цистеина в PBS с рН 7,4 при температуре 37°С через 24 часа, 48 часов и 6 дней обращенно-фазовая ВЭЖХ (RP-HPLC) С18.

На фиг. 4 показано, что β-аманитин демонстрирует сильную реакционную способность с цистеином в PBS с рН 7,4. 1 мг/мл β-аманитина 10 мг/мл цистеина в PBS буфере с рН 7,4 при температуре 37°С через 24 часа, 48 часов и 6 дней обращенно-фазовая ВЭЖХ С18.

На фиг. 5 показано, что вариант 6'-дезокси в аминокислоте 4 («аманин») демонстрирует сниженную реакционную способность с цистеином. 1 мг/мл аманитина 10 мг/мл цистеина в PBS с рН 7,4 при температуре 37°С через 24 часа, 48 часов и 6 дней обращенно-фазовая ВЭЖХ С18.

На фиг. 6 и фиг. 7 показано, что двойной дезокси-вариант HDP 30.2105 (6'-дезокси в аминокислоте 4 и S-дезокси в аминокислоте 8; формула I с R³=-OR⁵ и каждый R⁵=Н) показывает полное отсутствие реакционной способности с цистеином. 1 мг/мл HDP 30.2105, 10 мг/мл цистеина в PBS с рН 7,4 при температуре 37°С через 24 часа, 48 часов и 6 дней обращенно-фазовая ВЭЖХ С18; *примесь.

На фиг. 8 показаны производное альфа-аманитина HDP 30.1699 с расщепляемым линкером во фрагменте АА4 - 6-ОН, производное бета-аманитина HDP 30.2060 с расщепляемым линкером в γ-положении АА1 и двойной вариант дезоксиаматоксина HDP 30.2115 с расщепляемым линкером в γ-положении АА1

На фиг. 9 показан анализ Вестерн-блоттинга производных аматоксинов HDP 30.1699, HDP 30.2060 и HDP 30.2115, конъюгированных с антителом Т-D265C после инкубирования при температуре 37°С в плазме крови человека, плазме крови мыши и фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в течение 0, 4 и 10 дней. Обнаружение выполняли при помощи поликлонального антитела к аманитину от кролика и антикроличьего антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена. HDP 30.1699 и HDP 30.2060 показали значительные сшивки и потерю фрагмента аматоксина. Вариант двойного дезокси аманитина HDP 30.2115 показывает высокую стабильность и значительно уменьшение поперечных сшивок.

На фиг. 10 показана цитотоксичность производных аматоксинов HDP 30.1699, HDP 30.2060 и HDP 30.2115, конъюгированных с антителом Т-D265C. Исследуемые образцы инкубировали в плазме крови человека при температуре 37°С в течение 0 и 4 дней. Анализ на цитотоксичность выполняли на клетках SKBR-3 в течение 96 часов. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADCs) на основании HDP 30.1699 и HDP 30.2060 показывают заметную потерю цитотоксичности после 4-дневных испытаний в стрессовых условий в плазме крови, при этом дезоксигенированное производное HDP 30.2115 по-прежнему показывает пикомолярную активность

На фиг. 11 показана цитотоксичность производных аматоксинов HDP 30.1699, HDP 30.2060 и HDP 30.2115, конъюгированных с антителом Т-D265C. Исследуемые образцы инкубировали в плазме крови мыши при температуре 37°С в течение 0 и 4 дней. Анализ на цитотоксичность выполняли на клетках SKBR-3 в течение 96 часов. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADCs) на основе HDP 30.1699 и HDP 30.2060 показывают заметную потерю цитотоксичности после испытаний в стрессовых условиях в плазме крови, при этом дезоксигенированное производное HDP 30.2115 остается практически неизменным.

На фиг. 12 показана цитотоксичность производных аматоксинов HDP 30.1699, HDP 30.2060 и HDP 30.2115, конъюгированных с антителом Т-D265C. Исследуемые образцы инкубировали в PBS при температуре 37°С в течение 0 и 4 дней. Анализ на цитотоксичность выполняли на клетках SKBR-3 в течение 96 часов. Все конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADCs) показывают достаточную стабильность к неферментативной среде.

На фиг. 13 показано сравнение противоопухолевой активности различных конъюгатов антитело-аматоксин chiBCE19-D265C в модели ксенотрансплантата клеток Раджи подкожно - эксперимент с одноразовой дозой. В зависимости от структуры линкера и токсина наблюдались значительные различия в противоопухолевой активности. Вариант дезокси-аманина chiBCE19-30.2115 (6'-дезокси в аминокислоте 4 и S-дезокси в аминокислоте 8) показал лучшую противоопухолевую активность всех ADCs аматоксина со значительно лучшим терапевтическим индексом, чем соответствующий расщепляемый линкер ADC chiBCE 19-30.1699 (конъюгация лизина через 6'-ОН, S=O в аминокислоте 8).

На фиг. 14 показан анализ выживаемости Каплана-Мейера в системной модели опухоли Раджи - эксперимент с одинарной дозой. Вкратце, в день 0 внутривенно инокулировали 2,5×10⁶ клеток опухоли Раджи (лимфомы Беркитта у человека) в 200 мкл PBS / мыши. Терапию (одноразовая доза, внутривенно) начали на 3-й день после инокуляции опухолевых клеток. Вариант дезокси-аманина chiBCE19-30.2115 (6'-дезокси в аминокислоте 4 и S-дезокси в аминокислоте 8) показал превосходную выживаемость по сравнению с производными α-аманитина HDP 30.1699, HDP 30.0880 и HDP 30.0643, а также с соответствующим производным ММАЕ.

Осуществление изобретения

Прежде чем подробно описать настоящее изобретение, следует понимать, что это изобретение не ограничивается частной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, и они могут варьироваться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем описании терминология использована только с целью описания частных вариантов изобретения и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значение, обычно понимаемое квалифицированным в данной области техники специалистом.

В частности, используемые в настоящем описании термины имеют определения, указанные в «А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and , H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

В настоящем описании и в формуле изобретения, если по контексту не требуется иное, подразумевается, что слово «включать» и его формы, такие как «включает» и «включающий», подразумевают включение указанного целого числа, композиции, этапа или группы целых чисел или этапов, при этом также могут быть представлены любое дополнительное целое число, композиция или этап или группа целых чисел, композиций или этапов, включая варианты изобретения, где отсутствует дополнительное целое число, композиция или этап или группа целых чисел, композиций или этапов. В последних вариантах термин «включающий» используется взаимозаменяемо с термином «состоящий из».

В тексте настоящего описания приводятся ссылки на несколько документов. Каждый из процитированных в настоящем описании документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации и инструкции производителей, представления последовательности номеров доступа GenBank и т.д.), включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме, в той степени, которая возможна согласно соответствующему патентному законодательству. Ничто в тексте настоящего описания не следует истолковывать, как признание, что это изобретение не дает права датировать такое изобретение задним числом на основании предыдущего изобретения.

Далее по тексту приведено более подробное описание настоящего изобретения. В следующих ниже фрагментах текста более детально раскрыты различные аспекты настоящего изобретения. Каждый из раскрытых аспектов можно скомбинировать с любым другим аспектом или аспектами, если в явном виде не указано противоположное. В частности, любой признак изобретения, который охарактеризован, как предпочтительный или преимущественный, может быть скомбинирован с любым другим признаком или признаками, которые указаны, как предпочтительные или преимущественные.

Настоящее изобретение основано на том неожиданном наблюдении, что вариантная форма аматоксинов с (i) аминокислотой 4 с 6'-дезокси положением и (ii) аминокислотой 8 с S-дезокси-положением показывает повышенную стабильность в стрессовых условиях и улучшенный терапевтический индекс.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением; (b) мишень-связывающий фрагмент и (с) необязательно линкер, связывающий указанный аматоксин и указанный мишень-связывающий фрагмент. В частности, необязательный линкер согласно пункту (с) присутствует и является расщепляемым линкером.

У Zhao и др., ChemBioChem 16 (2015) 1420-1425, сообщено о синтезе такого ди-дезокси-аматоксинового ядра. Тем не менее, способ, предложенный у Zhao и др., позволил получить смесь из четырех различных диастереомеров, при этом только один из них показывал желаемую токсичность природных продуктов. Таким образом, как полностью корректно установлено Zhao и др., получение одного токсичного диастереомера в чистой форме по-прежнему является ключевой потребностью (Zhao и др., процитировано выше, стр. 1424, левая колонка). Хотя Zhao и др. предложили длинный список потенциальных путей получения достижения такого результата, предлагаемые варианты представляют собой всего лишь приглашение для проведения исследований. Кроме того, хотя Zhao и др. смогли подтвердить, что синтетический вариант, по существу, поддерживает токсичность соответствующего природного продукта, они не показывают преимуществ своего нового соединения и, в частности, не предлагают теоретического обоснования или даже предположения о том, что производные аматоксина с дидезокси-ядром в соответствии с настоящим изобретением показывают повышенную стабильность в стрессовых условиях в плазме крови и не приводят к образованию поперечно сшитых продуктов. Таким образом, Zhao и др. не дают никаких конкретных стимулов для обычного специалиста в данной области техники для приложения необходимых усилий в целях осуществления таких исследований.

В частном варианте настоящее изобретение относится к конъюгату, имеющему структуру I:

в которой:

R² представляет собой S;

R³ выбран из -NHR⁵, -NH-OR⁵, и -OR⁵;

R⁴ представляет собой Н; и

в которой один из R⁵ представляет собой -L_n-X, причем L-линкер, в частности расщепляемый линкер, n выбирают из 0 и 1, и X представляет собой мишень-связывающий фрагмент, и при этом остальные R⁵ представляют собой Н.

В контексте настоящего изобретения термин «аматоксин» включает в себя все циклические пептиды, состоящие из 8 аминокислот, выделенные из рода Amanita и описанные у Wieland, Т. и Faulstich Н. (Wieland Т, Faulstich Н., CRC Crit Rev Biochem, 5 (1978) 185-260), которые включают специфические положения согласно пункту (i) (т.е. где индольный фрагмент аминокислотного остатка триптофана не имеет содержащего кислород заместителя в положении 6', в частности, где положение 6' несет атом водорода) и (ii) (т.е. в котором фрагмент тиоэфира сульфоксида природных аматоксинов замещен сульфидом), и дополнительно включает в себя все его химические производные, а также все его полусинтетические аналоги, также все его синтетические аналоги, созданные из структурных блоков в соответствии с основной структурой природных соединений (циклических, 8 аминокислот), а также все синтетические или полусинтетические аналоги, содержащие негидроксилированные аминокислоты вместо гидроксилированных аминокислот, а также все синтетические или полусинтетические аналоги, в каждом случае в которых любое такое производное или аналог имеет по меньшей мере положения (i) и (ii), указанные выше, и обладает функциональной активностью посредством ингибирования РНК-полимеразы II млекопитающих.

Функционально аматоксины определяются как пептиды или депсипептиды, которые ингибируют РНК-полимеразу II млекопитающих. Предпочтительными аматоксинами являются аматоксины, имеющие функциональную группу (например, карбоксильную группу или производное карбоксильной кислоты, такое как карбоксамид или гидроксамовая кислота, аминогруппу, гидроксильную группу, тиол или тиол-захватывающую группу), которые могут реагировать с молекулами-линкерами или мишень-связывающими фрагментами в соответствии с определением выше. Аматоксинами, которые особенно пригодны для конъюгатов настоящего изобретения, являются дидезокси-варианты α-аманитина, β-аманитина, γ-аманитина, ε-аманитина, амануллина ли амануллиновой кислоты, или монодезокси-варианты аманина, аманинамида, γ-аманина или γ-аманинамида, показанные на фиг. 1, а также их соли, химические производные, полусинтетические аналоги и синтетические аналоги.

В частном варианте конъюгат по настоящему изобретению имеет чистоту более 90%, в частности более 95%.

В контексте настоящего изобретения термин «чистота» относится к общему количеству представленных конъюгатов. Например, чистота более 90% означает, что в 1 мг композиции, содержащей конъюгат по настоящему изобретению, содержится более 90%, т.е. более 900 мкг такого конъюгата. Оставшаяся часть, т.е. примеси, могут включать непрореагировавший исходный материал и другие реагенты, растворители, продукты расщепления и/или побочные продукты.

В частном варианте композиция, содержащая конъюгат по настоящему изобретению, содержит более 100 мг, в частности более 500 мг и, более конкретно, более 1 г такого конъюгата. Таким образом, прямо исключено наличие ничтожно малого количества конъюгата по настоящему изобретению, которое, вероятно, может присутствовать в комплексных составах конъюгатов предшествующего уровня техники, например, вследствие частичного восстановления встречающихся в природе сульфоксидов.

Термин «мишень-связывающий фрагмент» при применении в настоящем описании относится к любой молекуле или части молекулы, которая может специфически связываться с молекулой-мишенью или эпитопом-мишенью. Предпочтительными мишень-связывающими фрагментами в контексте настоящей заявки являются (i) антитела или их антигенсвязывающие фрагменты; (ii) антителоподобные белки и (iii) аптамеры нуклеиновых кислот. «Мишень-связывающие фрагменты», пригодные для применения в настоящем изобретении, обычно имеют молекулярную массу 40000 Да (40 кДа) или больше.

При применении в настоящем описании считается, что первое соединение (т.е. антитело) «специфически связывается» со вторым соединением (т.е. антигеном, таким как белок-мишень), если оно имеет константу диссоциации K_D к указанному второму соединению 100 мкМ или менее, конкретнее 50 мкМ или менее, конкретнее 30 мкМ или менее, конкретнее 20 мкМ или менее, конкретнее 10 мкМ или менее, конкретнее 5 мкМ или менее, более конкретно, 1 мкМ или менее, более конкретно 900 нМ или менее, более конкретно 800 нМ или менее, более конкретно 700 нМ или менее, более конкретно 600 нМ или менее, более конкретно 500 нМ или менее, более конкретно 400 нМ или менее, более конкретно 300 нМ или менее, более конкретно 200 нМ или менее, еще более конкретно 100 нМ или менее, еще более конкретно 90 нМ или менее, еще более конкретно 80 нМ или менее, еще более конкретно 70 нМ или менее, еще более конкретно 60 нМ или менее, еще более конкретно 50 нМ или менее, еще более конкретно 40 нМ или менее, еще более конкретно 30 нМ или менее, еще более конкретно 20 нМ или менее и еще более конкретно 10 нМ или менее.

В контексте настоящей заявки термины «молекула-мишень» и «эпитоп-мишень», соответственно, относятся к антигену и эпитопу антигена, соответственно, который специфически связан мишень-связывающим фрагментом. В частности, молекула-мишень представляет собой опухоль-ассоциированный антиген, в частности антиген или эпитоп, который присутствует на поверхности одного или более типов опухолевых клеток в более высокой концентрации и/или в другой пространственной конфигурации по сравнению с поверхностью неопухолевых клеток. В частности, указанный антиген или эпитоп присутствует на поверхности одного или более типов опухолевых клеток, но не на поверхности неопухолевых клеток. В частных вариантах мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом антигена, выбранного из: PSMA, CD19, CD269, сиалил Льюис^а, HER-2/neu и адгезивной молекулы эпителиальных клеток (ЕрСАМ). В других вариантах указанный антиген или эпитоп предпочтительно экспрессируется на клетках, вовлеченных в аутоиммунные заболевания. В некоторых таких вариантах мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом рецептора IL-6 (IL-6R).

Термин «антитело или его антигенсвязывающий фрагмент», используемый в настоящем описании, относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина, т.е. к молекулам, которые содержат антиген-связывающий сайт, который иммуноспецифически связывает антиген. Таким образом, термин «их антигенсвязывающие фрагменты» относится к фрагменту антитела, включающему по меньшей мере функциональный антигенсвязывающий домен. Также в изобретение включены аналогичные иммуноглобулину белки, которые выбирают с помощью методов, включающих в себя, например, фаговый дисплей для специфического связывания с молекулой-мишенью, например, с белком-мишенью, выбранным из: PSMA, CD19, CD269, сиалил Льюис^а, HER-2/neu и ЕрСАМ. Молекулы иммуноглобулина по изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина. «Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты», пригодные для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, моновалентные, биспецифические, гетероконъюгатные, мультиспецифические, человеческие, гуманизированные (в частности, CDR-привиты t), деиммунизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела (например, scFv), фрагменты Fab, фрагменты F(ab')2, фрагменты, полученные посредством библиотеки экспрессии Fab, диатела или тетратела (Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993) 6444-8), нанотела, анти-идиотипические антитела (включая, например, антитела против Id к антителам по изобретению), и эпитоп-связывающие фрагменты любого из указанных выше.

В некоторых вариантах антигенсвязывающие фрагменты являются фрагментами по настоящему изобретению антигенсвязывающих антител человека и включают, но не ограничиваются ими, Fab, Fab' и F(ab')₂, Fd, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, связанные с дисульфидом Fvs (dsFv) и фрагменты, включающие домен VL или VH. Такие антигенсвязывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут включать вариабельный домен (домены) отдельно или в сочетании со всей или частью следующих участков: шарнирная область, домены CL, CH1, СН2 и СН3. Также в изобретение включены такие антигенсвязывающие фрагменты, которые также включают в себя любую комбинацию вариабельного домена (доменов) с шарнирной областью, доменами CL, CH1, СН2 и СН3.

Антитела, используемые в изобретении, могут быть получены из любого животного материала, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительнее, чтобы антитела были получены из материала человека, грызунов (например, мышей, крыс, морских свинок или кроликов), кур, свиней, овец, коз, верблюдов, коров, лошадей, ослов, кошек или собак. Особенно предпочтительно, чтобы антитела были человеческого или мышиного происхождения. При применении в настоящем описании «человеческие антитела» включают в себя антитела, имеющие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и включают в себя антитела, выделенные из библиотек человеческого иммуноглобулина или из животных, трансгенных для одного или нескольких человеческих иммуноглобулинов, и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано, например, в патенте США №5939598, Kucherlapati и Jakobovits.

Термин «антителоподобный белок» относится к белку, который был сконструирован (например, путем мутагенеза петлевой структуры) для специфического связывания с молекулой-мишенью. Как правило, такой антителоподобный белок содержит, по меньшей мере, одну вариабельную пептидную петлю, прикрепленную на обоих концах к белковому каркасу. Это двойное структурное ограничение значительно увеличивает аффинность связывания антителоподобного белка до уровней, сравнимых с аффинностью связывания антитела. Длина вариабельной пептидной петли обычно составляет от 10 до 20 аминокислот. Каркасным белком может быть любой белок, обладающий хорошей растворимостью. Предпочтительно каркасный белок представляет собой небольшой глобулярный белок. Антителоподобные белки включают в себя, не ограничиваясь этим, аффитела (affibodies), антикалины и сконструированные белки с анкириновым повтором (смотрите обзор: Binz et al., Nat Biotechnol. 2005, 1257-68). Антителоподобные белки могут быть получены из больших библиотек мутантов, например, отобраны из больших библиотек фаговых дисплеев и могут быть выделены по аналогии с обычными антителами. Кроме того, антителоподобные связывающие белки могут быть получены путем комбинаторного мутагенеза остатков, находящихся на поверхности глобулярных белков.

Термин «аптамер нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была сконструирована путем повторяющихся циклов отбора in vitro или с помощью методики SELEX (систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением) для связывания с молекулой-мишенью (для ознакомления с обзором смотрите: у Brody and Gold, J Biotechnol. 74 (2000) 5-13). Аптамером нуклеиновой кислоты может быть молекула ДНК или РНК. Аптамеры могут включать модификации, например, модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-фторзамещенные пиримидины.

В контексте настоящего изобретения «линкер» относится к структуре, соединяющей два компонента, при этом каждый из них прикреплен к одному концу линкера. Если линкер представляет собой связь, прямая связь аматоксина с антителом может уменьшить способность аматоксина взаимодействовать с РНК-полимеразой II. В частных вариантах изобретения линкер увеличивает расстояние между двумя компонентами и облегчает пространственное влияние между этими компонентами, такое как в данном случае между антителом и аматоксином. В частных вариантах линкер имеет непрерывную цепочку из от 1 до 30 атомов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 26, 27, 28, 29 или 30 атомов) в основной цепи, т.е. длина линкера определяется как наименьшее соединение, измеряемое числом атомов или связей между фрагментом аматоксина и антителом, при этом одна сторона основной цепи линкера прореагировала с аматоксином, а другая сторона доступна для реакции или прореагировала с антителом. В контексте настоящего изобретения, линкером, в частности, является C_1-20-алкилен, С_1-20-гетероалкилен, С_2-20-алкенилен, С_2-20-гетероалкенилен, С_2-20-алкинилен, С_2-20-гетероалкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, гетероарилен, аралкилен или гетероаралкиленовая группа, необязательно замещенная. Линкер может содержать один или несколько структурных элементов, таких как карбоксамид, сложный эфир, простой эфир, тиоэфир, дисульфид, мочевина, тиомочевина, углеводородные фрагменты и аналогичные соединения. Линкер также может содержать комбинации двух или более этих структурных элементов. Каждый из этих структурных элементов может присутствовать в линкере более одного раза, например, два, три, четыре, пять или шесть раз. В некоторых вариантах линкер может включать дисульфидную связь. Следует понимать, что линкер должен быть присоединен либо в ходе одного этапа, либо в ходе двух или более последующих этапов к аматоксину и антителу. Для этой цели предполагаемый линкер будет иметь две группы, в частности, на проксимальной и дистальном концах, которые могут (i) образовывать ковалентную связь с группой, присутствующей в одном из связываемых компонентов, в частности активированную группу на аматоксине или мишень-связывающем пептиде, или (ii), которая активирована или может быть активирована для образования ковалентной связи с группой на аматоксине. Соответственно, предпочтительнее, чтобы на дистальном и проксимальном конце линкера находились химические группы, которые образуются в результате такой реакции связывания, например, сложный эфир, простой эфир, уретан, пептидная связь и т.д.

В частных вариантах линкер L представляет собой линейную цепочку длиной от 1 до 20 атомов, независимо выбранных из С, О, N и S, в частности от 2 до 18 атомов, более конкретно от 5 до 16 атомов и еще более конкретно от 6 до 15 атомов. В частных вариантах по меньшей мере 60% атомов в линейной цепи являются С-атомами. В частных вариантах атомы в линейной цепи связаны одинарными связями.

В частных вариантах линкер L представляет собой алкилен, гетероалкилен, алкенилен, гетероалкенилен, алкинилен, гетероалкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, гетероарилен, аралкилен или гетероаралкиленовую группу, включающие от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, О и S, причем указанный линкер необязательно замещен.

Термин «алкилен» относится к двухвалентным насыщенным углеводородным группам с линейной цепью, включающим от 1 до 20 атомов углерода, включая группы, имеющие от 1 до 10 атомов углерода. В некоторых вариантах алкиленовыми группами могут быть низшие алкиленовые группы. Термин «низший алкилен» относится к алкиленовым группам, имеющим от 1 до 6 атомов углерода, и в некоторых вариантах от 1 до 5 или от 1 до 4 атомов углерода. Примеры алкиленовых групп включают, не ограничиваясь этим, метилен (-СН₂-), этилен (-СН₂-СН₂-), н-пропилен, н-бутилен, н-пентилен и н-гексилен.

Термин «алкенилен» относится к двухвалентным группам с линейной цепью, имеющим от 2 до 20 атомов углерода, причем по меньшей мере одна из углерод-углеродных связей является двойной, при этом другие связи могут быть одинарными, а также двойными. Термин «алкинилен», используемый в настоящем описании, относится к группам, имеющим от 2 до 20 атомов углерода, причем по меньшей мере одна из углерод-углеродных связей является тройной, при этом другие связи могут быть одинарными, двойными, а также тройными. Примеры алкениленовых групп включают этенилен (-СН=СН-), 1-пропенилен, 2-пропенилен, 1-бутенилен, 2-бутенилен, 3-бутенилен и т.п. Примеры алкиниленовых групп включают этинилен, 1-пропинилен, 2-пропинилен и так далее.

При применении в настоящем описании термин «циклоалкилен» подразумевает двухвалентное кольцо, являющееся частью любой стабильной моноциклической или полициклической системы, где такое кольцо имеет от 3 до 12 атомов углерода, но не включает гетероатомов, и где такое кольцо является полностью насыщенным, а термин «циклоалкенилен» подразумевает двухвалентное кольцо, являющееся частью любой стабильной моноциклической или полициклической системы, где такое кольцо имеет от 3 до 12 атомов углерода, но не включает гетероатомов, и где такое кольцо является, по меньшей мере частично, ненасыщенным (но за исключением любого ариленового кольца). Примеры циклоалкиленов включают в себя, но не ограничиваясь этим, циклопропилен, циклобутилен, циклопентилен, циклогексилен и циклогептилен. Примеры циклоалкениленов включают в себя, но не ограничиваясь этим, циклопентенилен и циклогексенилен.

При применении в настоящем описании термины «гетероциклоалкилен» и «гетероциклоалкенилен» подразумевают двухвалентное кольцо, являющееся частью любой стабильной моноциклической или полициклической системы, где такое кольцо имеет от 3 до 12 атомов, и где такое кольцо состоит из атомов углерода и по меньшей мере одного гетероатома, в частности, по меньшей мере, одного гетероатома, независимо выбранного из группы, состоящей из N, О и S, при этом гетероциклоалкилен относится к такому кольцу, которое является полностью насыщенным, и гетероциклоалкенилен относится к кольцу, которое является, по меньшей мере частично, ненасыщенным (но за исключением любого ариленового или гетероариленового кольца).

Термин «арилен» означает двухвалентное кольцо или кольцевую систему, являющееся частью любой стабильной моноциклической или полициклической системы, где такое кольцо или кольцевая система имеет от 3 до 20 атомов углерода, но не имеет гетероатомов, и такое кольцо или кольцевая система состоит из ароматического фрагмента, определяемого правилом «4n+2»π электронов, включая фенилен.

При применении в настоящем описании термин «гетероарилен» означает двухвалентное кольцо или кольцевую систему, являющееся частью любой стабильной моноциклической или полициклической системы, где такое кольцо или такая кольцевая система имеет от 3 до 20 атомов углерода, и такое кольцо или кольцевая система состоит из ароматического фрагмента, определяемого правилом «4n+2»π электронов и содержит атомы углерода и один или несколько гетероатомов азота, серы и/или кислорода.

В контексте настоящего изобретения термин «замещенный» подразумевает, что один или несколько атомов водорода, присутствующих в основной цепи линкера, замещены атомом, выбранным из указанной группы (групп), при условии, что нормальная валентность указанного атома или соответствующего атома группы, которая замещена, не превышена и что замещение приводит к образованию стабильного соединения. Термин «необязательно замещенный» подразумевает, что линкер либо не замещен, либо замещен как определено в настоящем описании одним или несколькими заместителями, в соответствии с указанным в настоящем описании. Когда заместителем является кето (или оксо, то есть =O) группа, тио- или иминогруппа или т.п., то замещаются два атома водорода на атоме основной цепи линкера. Примеры заместителей включают, например, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арил, гетероарил, аралкил, гетероаралкил, ацил, ароил, гетероароил, карбоксил, алкокси, арилокси, ацилокси, ароилокси, гетероароилокси, алкоксикарбонил, галоген, (тио) сложный эфир, циано, фосфорил, амино, имино, (тио)амидо, сульфгидрил, алкилтио, ацилтио, сульфонил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, азидо, галогеналкил, включая перфторалкил (такой как трифторметил), галогеналкокси, алкилсульфанил, алкилсульфинил, алкилсульфонил, алкилсульфониламино, арилсульфонамино, фосфорил, фосфат, фосфонат, фосфинат, алкилкарбокси, алкилкарбоксиамид, оксо, гидрокси, меркапто, амино (необязательно моно- или дизамещенный, например, алкилом, арилом или гетероарилом), имино, карбоксамид, карбамоил (необязательно моно- или дизамещенный, например, алкилом, арилом или гетероарилом), амидино, аминосульфонил, ациламино, ароиламино, (тио)уреидо, (арилтио)уреидо, алкил(тио)уреидо, циклоалкил(тио)уреидо, арилокси, аралкокси или -O(СН₂)_n-OH, -O(СН₂)_n-NH₂, -O(СН₂)_nCOOH, -(СН₂)_nCOOH, -C(O)O(CH₂)_nR, -(CH₂)_nN(H)C(O)OR или N(R)S(O)₂R, где n равно 1-4, и R независимо выбран из водорода, -алкила, -алкенила, -алкинила, - циклоалкила, - циклоалкенила, -(С-связанный-гетероциклоалкил), -(С-связанный-гетероциклоалкенил), - арил и - гетероарил, при этом допускаются несколько степеней замещения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что заместители, такие как гетероциклоалкил, арил, гетероарил, алкил и т.д., или функциональные группы, такие как -ОН, -NHR и т.д., сами могут быть замещены при необходимости. Специалистам в данной области также будет понятно, что сами замещенные фрагменты также могут быть замещены, при необходимости.

В частных вариантах линкер L включает фрагмент, выбранный из одного из следующих фрагментов: дисульфид (-S-S-), простой эфир (-О-), тиоэфир (-S-), амин (-NH-), сложный эфир (-O-С(=O)- или -С(=O)-O-), карбоксамид (-NH-C(=O)- или - C(O)-NH-), уретан (-NH-C(=O)-O- или -О-C(=O)-NH-) и фрагмент мочевины (-NH-C(=O)-NH-).

В частных вариантах настоящего изобретения линкер L включает несколько m групп, выбранных из следующего перечня: алкилен, алкенилен, алкинилен, циклоалкилен, гетероалкилен, гетероалкенилен, гетероалкинилен, гетероциклоалкилен, арилен, гетероарилен, аралкилен и гетероаралкиленовая группа, причем каждая группа может необязательно быть независимо замещена, линкер дополнительно включает несколько n фрагментов, независимо выбранных из одного из следующих фрагментов: дисульфид ((-S-S-), простой эфир (-О-), тиоэфир (-S-), амин (-NH-), сложный эфир (-O-С(=O)- или -С(=O)-O-), карбоксамид (-NH-C(=O)- или - C(-O)-NH-), уретан (-NH-С(=O)-O- или -O-C(=O)-NH-) и фрагмент мочевины (-NH-C(=O)-NH-), причем m=n+1. В частных вариантах m равно 2 и n равно 1 или m равно 3 и n равно 2. В частных вариантах линкер включает 2 или 3 незамещенные алкиленовые группы и 1 или 2, соответственно, дисульфида, простого эфира, тиоэфира, амина, сложного эфира, карбоксамида, уретана или мочевины фрагмента, связывающих незамещенные алкиленовые группы.

В частных вариантах линкер L не включает гетероариленовую группу.

В частных вариантах С-атомы в линейной цепи независимо являются частью необязательно замещенных метиленовых групп (-СН₂-). В некоторых из таких вариантов необязательные заместители независимо выбраны из галогена и C_1-6-алкила, в частности метила.

В частных вариантах линкер L является стабильным линкером.

В контексте настоящего изобретения термин «стабильный линкер» относится к линкеру, который является стабильным (i) в присутствии ферментов и (ii) во внутриклеточной восстановительной среде.

В частных вариантах стабильный линкер не содержит (i) ферментативно расщепляемую субструктуру и/или (ii) дисульфидную группу. В частных таких вариантах линкер имеет длину до 12 атомов, в частности от 2 до 10, более конкретно от 4 до 9 и еще более конкретно от 6 до 8 атомов.

В частных иных вариантах линкер является расщепляемым линкером.

В контексте настоящего изобретения термин «расщепляемый линкер» относится к линкеру, который (i) может быть расщеплен каким-либо ферментом или (ii) является восстанавливаемым линкером. В частных вариантах этот термин относится только к линкеру, который расщепляется ферментом (не к восстанавливаемому линкеру).

В контексте настоящего изобретения термин «линкер, который расщепляется … ферментом» относится к линкеру, который может быть расщеплен каким-либо ферментом, в частности лизосомальной пептидазой, такой как катепсин В, что приводит к внутриклеточному высвобождению нагрузки токсина, конъюгированной к целевому антителу после интернализации (см. Dubowchik et al., Bioconjug Chem., 13 (2002) 855-69). В частных вариантах расщепляемый линкер включает дипептид, выбранный из: Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit и Val-Cit, в частности где расщепляемый линкер дополнительно включает п-аминобензил (РАВ) спейсер между дипептидами и аматоксином.

В частных таких вариантах расщепляемый линкер включает структуру L¹-L*-L²

где L¹ является частью линкера, который соединяет L* с аматоксином, в частности, где L¹ связан с L* через группу -NH- или -О-, в частности -C(=O)-NH-, -C(=O)-NH-O или -С(=O)-O- группу, и

где L² является частью линкера, который соединяет L* с мишень-связывающим фрагментом, в частности, где L¹ связан с L* через -(СН₂)_m-фрагмент, при этом m является целым числом, выбранным из диапазона от 1 до 8, в частности от 1 до 5, или через-(СН₂ СН₂О)_n - фрагмент, при этом n является целым числом, выбранным из диапазона от 1 до 3, в частности от 1 до 2.

В частных других таких вариантах L* имеет следующую структуру

В частных вариантах линкер L¹ представляет собой линейную цепь от 1 до 4 атомов, независимо выбранных из С, О, N и S, в частности от 1 до 3 атомов, более конкретно от 1 до 2 атомов и еще более конкретно всего 1 атом. В частных вариантах по меньшей мере 50% атомов в линейной цепи являются С-атомами. В частных вариантах атомы в линейной цепи связаны одинарными связями.

В контексте настоящего изобретения термин «восстанавливаемый линкер» относится к линкеру, который может быть расщеплен во внутриклеточной восстановительной среде, в частности линкер, который содержит дисульфидные группы, что приводит к внутриклеточному высвобождению нагрузки токсина, конъюгированной с мишень-связывающим фрагментом после интернализации внутриклеточной восстановительной средой (см. Shen et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 10905-10908). В частных вариантах восстанавливаемый линкер включает фрагмент

где R1-R4 независимо выбраны из Н и метила.

В некоторых таких вариантах такой расщепляемый линкер имеет длину до 20 атомов, в частности от 6 до 18, более конкретно от 8 до 16 и наиболее предпочтительно от 10 до 15 атомов. В таких частных вариантах часть линкера, связывающего аматоксин по настоящему изобретению и расщепляемую дисульфидную группу, представляет собой линейную цепь из 3 или 4 атомов углерода, в частности 3 С-атомов. В частных вариантах 3 или 4 С-атома в линейной цепи связаны одинарными связями. В частных вариантах линкер представляет сбой н-пропиленовую группу.

В частных вариантах указанный линкер присутствует и соединен с одной стороны с положением в аматоксине формулы I, выбранным из

(i) атома азота амидной группы у γ С-атома аминокислоты 1 аматоксина (амидная связь) в случае конъюгата формулы I с R³=-NHR⁵;

(ii) атома кислорода кислотной группы у γ С-атома аминокислоты 1 аматоксина (сложноэфирная связь) в случае конъюгата формулы I с R³=-OR⁵;

(iii) атома кислорода группы гидроксамовой кислоты у γ С-атома аминокислоты 1 аматоксина в случае конъюгата формулы I с R³=-NHOR⁵;

(iv) атома кислорода гидроксильной группы у δ С-атома аминокислоты 3 аматоксина, в частности, через сложноэфирную связь, эфирную связь или уретановую связь, или

(v) кольцевого азота аминокислоты 4.

В таких частных вариантах указанный линкер присутствует и соединен с одной стороны с положением в аматоксине формулы I, выбранным из вариантов (ii)-(v), указанных выше. В частных вариантах указанный линкер присутствует и соединен с одной стороны с положением в аматоксине формулы I, выбранным из вариантов (iv)-(v), указанных выше.

Связывание линкера с мишень-связывающим фрагментом может быть осуществлено различными способами, хорошо известными специалисту в данной области, в частности в области конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADCs).

В частных вариантах указанный линкер соединен с мишень-связывающим фрагментом через фрагмент мочевины (…-линкер-NH-С(=O)-NH-мишень-связывающий фрагмент). В таких частных вариантах фрагмент мочевины получают за счет реакции первичного амина, первоначально присутствующего в мишень-связывающем фрагменте, таком как аминогруппа боковой цепи лизина, с производным карбаминовой кислоты … -линкер-NH-С(О)-Z, где Z представляет собой замещаемую группу, которая может быть заменена первичным амином.

В других частных вариантах указанный линкер присутствует и соединен с мишень-связывающим фрагментом через тиоэфирный фрагмент (…-линкер-S-мишень-связывающий фрагмент). Таким образом, в таких вариантах настоящее изобретение относится к конъюгату общей формулы:

Дидезоксиксаматоксин - L - X* - S - Tbm,

где дидезоксиксаматоксин представляет собой аматоксин по настоящему изобретению, L - линкер, X* - фрагмент, полученный при соединении тиольной группы с тиол-реагирующей группой, S - атом серы указанной тиольной группы, в частности тиольной группы аминокислотного остатка цистеина, и Tbm - мишень-связывающий фрагмент, в частности антитело или функциональный фрагмент антитела, включающий указанный аминокислотный остаток цистеина. В частных вариантах указанный аминокислотный остаток цистеина (i) расположен в домене антитела, выбранном из CL, CH1, СН2 и СН3; (ii) расположен в положении, где последовательность зародышевой линии, проявляющая самую близкую гомологию к последовательности указанного домена антитела, содержит какой-либо аминокислотный остаток, отличный от цистеина и (iii) расположен в положении, на которое воздействует растворитель.

В контексте настоящего изобретения термин «тиол-реагирующая группа» относится к группе, которая избирательно реагирует с тиольной группой, например, свободного цистеина антитела, в частности, при значении рН в диапазоне от 6,0 до 8,0, более конкретно, при значении рН в диапазоне от 6,5 до 7,5. В частности, термин «избирательно» означает, что менее 10% реакций соединения молекулы, включающей тиол-реагирующую группу, с антителом, включающим по меньшей мере один свободный цистеиновый остаток, представляют собой реакции соединения с нецистеиновыми остатками антитела, такими как лизиновые остатки, в частности, менее 5%, более конкретно менее 2%. В частных вариантах тиол-реагирующую группу выбирают из бромацетамида, иодацетамида, малеимида, при этом малеимид имеет замещаемую группу в положении 3, в частности замещаемую группу, выбранную из -Br и замещенного тиола (см., например, US 9295729), 1,2-дигидропиридазин-3,6-дион имеет замещаемую группу в положении 4, в частности замещаемую группу, выбранную из -Br и замещенного тиола (см., например, US 9295729), метилсульфонилбензотиазол, метилсульфонилфенилтетразол, метилсульфонилфенилоксадиазол (см. Toda et al., Angew. Chem. Int. Ed., Engel., 52 (2013) 12592-6), 3-арилпропионитрил (см. Kolodych et al., Bioconjugate Chem., 2015, 26, 197-200) и 5-нитропиридин-2-ил-дисульфид (…-L-S-S-(5-нитропиридин-2-ил).

В частных вариантах указанное положение или функциональная группа, которые на одной стороне соединены с линкером и которые могут быть соединены прямо или косвенно с положением или функциональной группой, присутствующими в мишень-связывающем фрагменте, представляет собой фрагмент, который может реагировать с двумя тиольными группами, присутствующими в одном мишень-связывающем фрагменте или в двух мишень-связывающих фрагментах. В частных вариантах тиол-реагирующие группы представляют собой малеимид, имеющий две замещаемые группы в положениях 3 и 4, в частности выбранные из 3,4-диброммалеимида, 3,4-бис(арилтио)-малеимида, в частности 3,4-дифенилтио-малеимида и 3,4-бис(гетероарилтио)-малеимида, в частности 3,4-бис(2-пиридинилсульфанил)-малеимида, и. В других частных вариантах тиол-реагирующие группы представляют собой 1,2-дигидропиридазин-3,6-дион, имеющий две замещаемые группы в положениях 4 и 5, в частности выбранные из 4,5-бром-1,2-дигидропиридазин-3,6-диона, 4,5-бис(арилтио)-1,2-дигидропиридазин-3,6-диона, в частности 4,5-дифенилтио-1,2-дигидропиридазин-3,6-диона и 4,5-бис(гетероарилтио)-1,2-дигидропиридазин-3,6-диона, в частности 4,5-бис(2-пиридинилсульфанил)-1,2-дигидропиридазин-3,6-диона.

В частных вариантах фрагмент, полученный вследствие соединения тиольной группы с тиол-реагирующей группой, выбран из следующих вариантов: тиолзамещенный ацетамид; тиолзамещенный сукцинимид; тиолзамещенная сукцинаминовая кислота; тиолзамещенный гетероарил, в частности тиолзамещенный бензотиазол, тиолзамещенный фенилтетразол и тиолзамещенный фенилоксадиазол; и дисульфид, где один атом серы получают из цистеинового остатка антитела. В частных вариантах фрагмент, полученный вследствие соединения тиольной группы с тиол-реагирующей группой, является тиолзамещенным сукцинимидом.

В частных вариантах линкер L во фрагменте L-X*-S, присутствующем в общей формуле, выбран из следующей группы фрагментов:

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-X-S- (сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₃-S-S-(CH₂)₂-X-S- (сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₃-X-S- (сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₃-S-S-(CH₂)₃-X-S- (сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₄-S-S-(CH₂)₄-X-S- (сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₂-CMe₂-S-S-(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₂-S-S-CMe₂-(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -(CH₂)₃-S-S- (сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Cit-Val-CO(CH₂)₅-X-S-(сторона Tbm)

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Ala-Val-CO(CH₂)₅-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Ala-Val-CO(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Ala-Phe-CO(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Lys-Phe-CO(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Cit-Phe-CO(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Val-Val-CO(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Ile-Val-CO(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-His-Val-CO(CH₂)₂-X-S-(сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Met-Val-CO(CH₂)₂-X-S- (сторона Tbm);

(сторона дидезоксиаматоксина) -CH₂-C₆H₄-NH-Asn-Lys-CO(CH₂)₂-X-S- (сторона Tbm); и

где -NH- и -СО-, расположенные по краям дипептидных последовательностей, представляют собой амино и карбонильные фрагменты линкера, образующие амидные связи с карбокси- и амино-концом дипептида, соответственно.

В контексте настоящего изобретения термин «фрагмент, полученный вследствие соединения тиольной группы с тиол-реагирующей группой» относится к структуре, полученной вследствие (i) нуклеофильного замещения замещаемой группы Y, присутствующей в тиол-реагирующей группе, атомом серы цистеинового остатка, например, бромацетамидной группы, иодацетамида, 4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-иламиногруппы, алкилсульфона или гетероарилсульфона; (ii) добавления HS-группы цистеинового остатка к активированной двойной связи тиол-реагирующей группы, например, малеимиду, или (iii) дисульфидного обмена активированного дисульфида или метантиосульфоната с атомом серы цистеинового остатка, например, с пиридин-2-тиолом, 5-нитропиридин-2-тиолом или метансульфинатом в качестве замещаемой группы; или (iv) любой иной химической реакции, которая приводит к образованию стабильной связи между атомом серы цистеинового остатка и реакционноспособным фрагментом, входящим в тиол-реагирующую группу.

Первичный фрагмент, полученный в результате соединения тиольной группы, может быть необязательно дополнительно дериватизирован, например, сукцинимидилтиоэфир, полученный из малеимида, может быть гидролизован до тиоэфиров сукцинаминовой кислоты следующих общих структур

В других частных вариантах сайт-специфическое связывание может быть достигнуто восстановлением дисульфидного мостика, присутствующего в мишень-связывающем фрагменте, и при помощи реакции двух остатков цистеина с мостиковым фрагментом X*, присутствующим в конструкте дидезоксиксаматокин-L-X* (см. Badescu et al. Bridging disulfides for stable and defined antibody drug conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (2014) 1124-1136).

В аналогичном варианте сайт-специфическое связывание может быть достигнуто восстановлением дисульфидного мостика, присутствующего в мишень-связывающем фрагменте, и при помощи реакции двух остатков цистеина с мостиковым фрагментом X*, присутствующим в конструкте дидезоксиксаматокин-L-X*, в частности, где X* представляет собой

(см. Bryden et al., Bioconjug Chem, 25 (2014) 611-617; Schumacher et al., Org Biomol Chem, 2014, 7261-7269).

В другом частном варианте связывание достигается путем региоспецифического связывания аминогруппы, присутствующей в линкере, с остатком глутамина, присутствующим в мишень-связывающем фрагменте, через трансаминазу, в частности путем связывания с глутамином Q295 антитела.

В частном варианте связывание достигается путем сайта-специфичной конъюгации с мишень-связывающими фрагментами, включающими N-гликановые боковые цепи. В частности, N-гликановая боковая цепь может разлагаться ферментативно, с последующим трансгликозилированием азидогалактозой. При помощи клик-химии такой модифицированный мишень-связывающий фрагмент может быть соединен с соответствующим образом модифицированными конструктами дидезоксиксаматоксин - L - X*, где X* представляет собой, например, дибензоциклооктин (DIBO) или аналогичный фрагмент, включающий С-С тройную связь. Например, конструкт дидезоксиксаматоксин - L - NH₂ может быть соединен с DIBO-SE путем нуклеофильного замещения гидроксисукцинимидного фрагмента, где

Полученный конструкт DIBO-модифицированный линкер затем может быть соединен с азидо-производным, упомянутым выше. В альтернативном варианте мишень-связывающий фрагмент может быть модифицирован путем введения искусственной аминокислоты, которая позволяет использовать клик-химию, в частности, путем введения пара-азидометил-L-фенилаланина (pAMF).

В частных вариантах линкер L в - L - X* представляет собой линейную цепочку длиной по меньшей мере 5, в частности по меньшей мере 10, более конкретно от 10 до 20 атомов, независимо выбранных из С, О, N и S, в частности от 10 до 18 атомов, более конкретно от 10 до 16 атомов и еще более конкретно от 10 до 15 атомов. В частных вариантах по меньшей мере 60% атомов в линейной цепи являются С-атомами. В частных вариантах атомы в линейной цепи связаны одинарными связями.

В альтернативных вариантах положение или функциональная группа, которые могут быть соединены прямо или косвенно с положением или функциональной группой, присутствующими в мишень-связывающем фрагменте, не являются этинильной группой или в более общем случае не являются алкинильной группой, или не являются группой, которая может реагировать с 1,3-диполем в 1,3-диполярном циклоприсоединении (клик-химия).

В других частных вариантах сайт-специфическое связывание конструкта дидезоксиксаматоксин - L - X* с мишень-связывающим фрагментом может быть достигнуто введением искусственной аминокислоты, включающей кетогруппу, в частности п-ацетилфенилаланин (pAcPhe), в мишень-связывающий фрагмент и путем реакции такого модифицированного мишень-связывающего фрагмента с конструктом дидезоксиксаматоксин - L - X*, где X* представляет собой гидроксиламинный фрагмент.

В дополнительном варианте формильная группа может быть введена при помощи фермента, генерирующего формилглицин (FGE), который является высокоселективным для цистеиновой группы в распознающей последовательности CxPxR для генерирования альдегидной метки. Такая альдегидная метка может вступать в реакцию с соответствующей группой X*, присутствующей в конструкте дидезоксиксаматоксин - L - X*, в частности, где X * представляет собой

(см. Agarwal et al., Bioconjugate Chem 24 (2013) 846-851).

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по настоящему изобретению.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату по настоящему изобретению для применения в терапии рака у пациента, в частности, рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, колоректального рака, рака легких, рака предстательной железы, рака яичников, рака желудка, рака почек, злокачественной меланомы, лейкемии и злокачественной лимфомы.

При применении в настоящем описании, слова «лечить», «лечение» заболевания или нарушения означает выполнение одного или нескольких из следующего: (а) снижение тяжести нарушения; (b) ограничение или предотвращение развития симптомов, характерных для нарушения (нарушений), в отношении которых проводят лечение; (с) ингибирование ухудшения симптомов, характерных для нарушения (нарушений), в отношении которых проводят лечение; (d) ограничение или предотвращение рецидива нарушения (нарушений) у пациентов, которые ранее имели нарушение (нарушения); и (е) ограничение или предотвращение повторного возникновения у пациентов симптомов, которые ранее были характерны для нарушения (нарушений).

При применении в настоящем описании лечение может включать в себя введение конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению пациенту, при этом «введение» включает в себя введение in vivo, а также введение непосредственно в ткань ex vivo, такое как венозные трансплантаты.

В частных вариантах используют терапевтически эффективное количество конъюгата по настоящему изобретению.

«Терапевтически эффективным количеством» является количество терапевтического агента, достаточное для достижения намеченной цели. Эффективное количество данного терапевтического агента будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как характер агента, путь введения, размер и вид животного, которому вводят терапевтический агент и цель введения. Эффективное количество в каждом отдельном случае может быть эмпирически определено квалифицированным специалистом в соответствии с существующими методами в данной области техники.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей аматоксин по настоящему изобретению или конъюгат по настоящему изобретению аматоксина с мишень-связывающим фрагментом, а также содержащей один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей, эксципиентов, наполнителей, связующих, смазывающих веществ (лубрикантов), скользящих веществ (глидантов), разрыхлителей (дезинтегрантов), адсорбентов и/или консервантов.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает утвержденный регулирующим ведомством федерального правительства или правительства штата или указанный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более конкретно у людей.

В частных вариантах фармацевтическая композиция применяется в форме системно вводимого лекарственного средства. Лекарственное средство включает в себя парентеральные препараты, которые включают в себя, помимо прочего, инъекционные и инфузионные препараты. Инъекционные препараты производят либо в форме ампул, либо в виде так называемых готовых к применению инъекционных форм, например, готовых к применению шприцов или одноразовых шприцов и, кроме того, в виде флаконов с прокалываемой пробкой для неоднократного извлечения препарата. Введение инъекционных препаратов может быть выполнено в форме подкожного (п/к), внутримышечного (в/м.), внутривенного (в/в) или внутрикожного (в/к) применения. В частности, возможно получить соответственно подходящие инъекционные лекарственные формы в виде суспензии кристаллов, растворов, дисперсных систем наночастиц или коллоидных частиц, таких, например, как гидрозоли.

Инъекционные лекарственные формы могут быть дополнительно изготовлены в виде концентратов, которые можно растворять или диспергировать водными изотоническими разбавителями. Инфузии могут быть также получены в виде изотонических растворов, жирных эмульсий, липосомальных составов и микроэмульсий. Аналогично инъекциям инфузионные составы могут быть также изготовлены в виде концентратов для разбавления. Инъекционные составы можно также применять в виде перманентных инфузий как в стационарной, так и в амбулаторной терапии, например, при помощи мини-насосов.

К парентеральным лекарственным составам могут быть добавлены, например, альбумин, плазма, средство для увеличения объема (expander), поверхностно-активные вещества, органические разбавители, вещества, влияющие на рН, комплексообразующие вещества или полимерные вещества, в частности в качестве веществ, влияющих на адсорбцию конъюгатов мишень-связывающих фрагментов с токсинами по изобретению на белки или полимеры, или они также могут быть добавлены с целью снижения адсорбции конъюгатов мишень-связывающих фрагментов с токсинами по изобретению на такие материалы, как инструменты для инъекций или упаковочные материалы, например, пластик или стекло.

Аматоксины по настоящему изобретению, включающие мишень-связывающий фрагмент, могут быть связаны с микроносителями или наночастицами в парентеральных препаратах, например, с мелкодисперсными частицами на основе поли(мет)акрилатов, полилактатов, полигликолятов, полиаминокислот или полиэфируретанов. Парентеральные препараты также могут быть модифицированы как депо-препараты, например, на основе «систему доставки на основе множественных гранул/частиц» («multiple unit principle))), если конъюгаты мишень-связывающих фрагментов с токсинами по изобретению вводят в тонкодисперсной, диспергированной и суспендированной форме, соответственно, или в виде суспензии кристаллов в лекарственном средстве, или на основе «системы доставки на основе одной дозирующей единицы» («single unit principle))), если конъюгат мишень-связывающих фрагментов с токсинами по изобретению помещен в лекарственную форму, например, в таблетку или палочку, которая впоследствии имплантируется. Такие имплантаты или депо-препараты в однодозовых и многодозовых лекарственных формах часто состоят из так называемых биоразлагаемых полимеров, таких как, например, полиэфиры молочной кислоты и гликолевой кислоты, полиэфируретаны, полиаминокислоты, поли(мет)акрилаты или полисахариды.

Адъюванты и носители, добавляемые при производстве фармацевтических композиций по настоящему изобретению, приготовленные в виде парентеральных препаратов, в частности, включают в себя aqua sterilisata (стерилизованную воду, вещества, влияющие на значение рН, такие как, например, органические или неорганические кислоты или основания, а также их соли, буферные вещества для регулирования значений рН, вещества для регулирования изотоничности, такие как, например, хлорид натрия, гидрокарбонат натрия, глюкоза и фруктоза, тензиды и поверхностно-активные вещества, соответственно, и эмульгаторы, такие как, например, неполные эфиры жирных кислот полиоксиэтиленсорбитана (например, Tween®) или, например, сложные эфиры жирных кислот полиоксиэтиленов (например, Cremophor®), жирные масла, такие как, например, арахисовое масло, соевое масло или касторовое масло; синтетические сложные эфиры жирных кислот, например, этилолеат, изопропилмиристат и нейтральное (например, Miglyol®), а также полимерные адъюванты, такие как, например, желатин, декстран, поливинилпирролидон, добавки, увеличивающие растворимость органических растворителей, такие как, например, пропиленгликоль, этанол, N,N-диметилацетамид, пропиленгликоль или комплексообразующие вещества, такие как, например, цитрат и мочевина, консерванты, такие как, например, гидроксипропиловый эфир и метиловый эфир бензойной кислоты, бензиловый спирт, антиоксиданты, такие как, например, сульфит натрия, и стабилизаторы, такие как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).

При изготовлении лекарственных форм фармацевтических композиций по настоящему изобретению в виде суспензий в предпочтительном варианте добавляют загустители для предотвращения осаждения конъюгатов мишень-связывающих фрагментов с токсинами по изобретению или тензиды и полиэлектролиты для обеспечения ресуспендируемости осадка и/или комплексообразующие вещества, такие как, например, EDTA. Также возможно получить комплексы активного ингредиента с различными полимерами. Примерами таких полимеров являются полиэтиленгликоль, полистирол, карбоксиметилцеллюлоза, Pluronics® или сложный эфир полиэтиленгликоль сорбит жирной кислоты. Конъюгаты мишень-связывающих фрагментов с токсинами по изобретению также могут быть введены в жидкие составы в форме соединений включения, например, с циклодекстринами. В частных вариантах в качестве дополнительных адъювантов могут быть добавлены диспергирующие агенты. Для производства лиофилизатов могут быть использованы наполняющие агенты, такие как маннит, декстран, сахароза, человеческий альбумин, лактоза, поливинилпирролидон (PVP) или виды желатина.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к конструкту, включающему в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением, и (с) фрагмент линкера, который несет реакционноспособную группу для связывания указанного аматоксина с мишень-связывающим фрагментом.

В частном варианте настоящее изобретение относится к конструкту, имеющему структуру II

где:

R² представляет собой S;

R³ выбран из NHR⁵, -NH-OR⁵ или OR⁵;

R⁴ представляет собой H; и

где один из R⁵ представляет собой -L-Y, где L - линкер и Y - реакционноспособная группа для связывания указанного конструкта с мишень-связывающим фрагментом.

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение поясняется более подробно при помощи неограничивающих примеров:

1. Синтез синтетической молекулы K дидезокси-прекурсора

Синтез молекулы K дидезокси-прекурсора описан в WO 2014/009025 в примере 5.5.

Соединение K может быть депротектировано путем обработки 7 N метанольным раствором NH₃ (3,0 мл) и перемешиванием в течение ночи.

2. Синтез синтетического дидезокси-прекурсора HDP 30.2105

Альтернативные молекулы дидезокси-прекурсора, включающие -СООН-группу вместо карбоксамидной группы в аминокислоте 1, можно синтезировать (HDP 30.1895) и депротектировать для получения HDP 30.2105.

Этап 1: 4-гидроксипирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты 2-аллиловый эфир 1-(9Н-флуорен-9-илметил)-эфир (HDP 30.0013)

FmocHypOH (10,0 г, 28,3 ммоль) суспендировали в 100 мл 80% МеОН и добавляли Cs2CO3 (4,6 г, 14,1 ммоль). Суспензию перемешивали при температуре 50°С в течение 30 минут до полного растворения. Реакционную смесь выпаривали до сухого остатка и растворяли в 100 ДМФ. Добавляли по каплям аллилбромид (1,6 мл, 3,6 г, 29,7 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. ДМФ отгоняли, а остаток растворяли в трет-бутилметиловом эфире. Осадки отфильтровывали, и прозрачный раствор абсорбировали на целите перед колоночной хроматографией. Соединение очищали на 220 г силикагеля с градиентом н-гексан/этилацетат.

Выход: 11,5 г, 100%

Этап 2: Нагрузка смолы (HDP 30.0400)

В суспензию 1,3-дигидро-2Н-пиран-2-ил-метоксиметильной смолы (5,0 г, 1,0 ммоль/г тетрагидропиранильной (ТНР) смолы) в 40 мл дихлорэтана добавляли HDP 30.0013 (5,0 г, 14,1 ммоль), пиридиний 4-толуолсульфонат (1,33 г, 5,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при температуре 80°С. После охлаждения смолу отфильтровывали и обильно промывали дихлорэтаном, диметилформамидом (ДМФ), ацетонитрилом, дихлорметаном и трет-бутилметиловым эфиром

Нагрузка составляла 0,62 ммоль/г (определено с помощью УФ-спектроскопии флуорен-метильной группы после депротектирования).

Этап 3: Синтез твердофазного прекурсора (HDP 30.1894)

Предварительная обработка смолы:

HDP 30.0400 (0,5 г, 0,31 ммоль) обрабатывали N,N-диметилбарбитуровой кислотой (483 мг, 3,1 ммоль) и Pd(PPh3)4 (69 мг, 0,06 ммоль). Смолу встряхивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем смолу интенсивно промывали дихлорметаном, N-метил-2-пирролидоном, ацетонитрилом, дихлорметаном и трет-бутилметиловым эфиром и сушили при пониженном давлении.

Процедура связывания (соединения):

Все реактивы и реагенты растворяли в дихлорметане/N-метил-2-пирролидоне, содержащем 1% Triton-Х100 (растворитель А).

HDP 30.0477 (257 мг, 0,38 ммоль) растворяли в 3,0 мл растворителя А и обрабатывали 3,0 мл 0,2 N раствора РуВОР (333 мг, 0,63 ммоль, 2,0 экв.), 3,0 мл 0,2 N раствора HOBt (130 мг, 0,63 ммоль, 2,0 экв.) и 439 мкл DIEA (4,0 экв.). Реакционную смесь нагревали при температуре 50°С в течение 8 минут с помощью микроволнового излучения (20 Вт, СВЧ-реактор СЕМ) и промывали N-метил-2-пирролидоном после связывания.

Депротектирование:

Депротектирование выполняли путем добавления 6,0 мл 20% пиперидина в N-метил-2-пирролидоне при температуре 50°С в течение 8 минут. Смолу промывали N-метил-2-пирролидоном.

(Примечание: после связывания конечной аминокислоты депротектирование не выполняют)

Связывание всех остальных аминокислот выполняли, следуя вышеуказанному протоколу, весовые коэффициенты указаны ниже:

0,63 ммоль, 498 мг Fmoc Asp(OAll)OH

0,63 ммоль, 738 мг Fmoc Cys(Tri)OH

0,63 ммоль, 375 мг Fmoc GlyOH

0,63 ммоль, 445 мг Fmoc IleOH

0,63 ммоль, 375 мг Fmoc GlyOH

0,38 ммоль, 242 мг N-Boc-HPIOH (HDP 30.0079)

4,5-диацетокси-2-амино-3-метилпентановой кислоты трет-бутиловый эфир; гидрохлорид (HDP 30.0477) синтезировали, как описано в WO 2014/009025.

N-Boc-HPIOH (HDP 30.0079) получали согласно Zanotti, Giancarlo; Birr Christian; Wieland Theodor; International Journal of Peptide & Protein Research 18 (1981) 162-8.

Этап 4: HDP 30.1895

Удаление из смолы и образование В-кольца

Смолу встряхивали с 10 мл трифторуксусной кислоты, содержащей 5% триизопропилсилана, в течение 30 минут и в конце элюировали в колбу объемом 50 мл. Смолу дважды промывали метанолом (по 10 мл каждый раз). Объединенные элюаты концентрировали в вакууме и повторно суспендировали в 2-4 мл метанола. Метаноловый раствор дважды вливали по каплям в 50 мл холодного диэтилового эфира для осаждения пептида. После центрифугирования осадок промывали диэтиловым эфиром (2 раза) и сушили при пониженном давлении. Белый осадок растворяли в приблизительно 4-5 мл метанола (0,5 мл на 100 мг) и очищали препаративной обращенно-фазовой колоночной хроматографией. За один раз очищали приблизительно 100 мг неочищенного осадка. Фракции анализировали с помощью масс-спектрометрии, соединяли и метанол отгоняли при пониженном давлении. Водную фазу сушили сублимацией.

Выход: 24,4 мг, 23,7 ммооль

Масс-спектрометрия: [М+Н]⁺, 1030,5

Образование А-кольца

Вышеуказанное промежуточное соединение, высушенное сублимацией, растворяли в 25 мл диметилформамида и обрабатывали дифенилфосфорилазидом (63 мкл, 1185 мкмоль, 5 экв.) и диизопропилэтиламином (201 мкл, 1185 мкмоль, 5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи (20 часов). Конверсию контролировали обращенно-фазовой колоночной хроматографией и в конце быстро охлаждали 100 мкл водой. Смесь концентрировали при пониженном давлении и повторно суспендировали в 1-2 мл метанола. Осаждение продукта осуществляли добавлением по каплям к 20 мл диэтилового эфира. Осадок дважды промывали диэтиловым эфиром и сушили при пониженном давлении. Следующий этап осуествляли без дополнительной очистки.

Масс-спектрометрия: [M+Na]⁺, 1034,6

Депротектирование сложного эфира:

К неочищенному продукту процесса циклизации добавляли 2,5 мл дихлорметана, диэтилбарбитуровой кислоты (22,3 мг, 118,5 мкмоль) и Pd(PPh₃)₄ (27 мг, 23,7 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию контролировали обращенно-фазовой ВЭЖХ. После достижения полной конверсии смесь добавляли по каплям в 20 мл охлажденного диэтилового эфира и осадок дважды промывали диэтиловым эфиром. После сушки при пониженном давлении осадок растворяли в метаноле (1,0 мл) и очищали препаративной обращенно-фазовой хроматографией.

Выход: 15,0 мг

Масс-спектрометрия: [М+Н]⁺, 972,3; [M+Na]⁺, 994,5

Этап 5: HDP 30.2105

HDP 30.1895 (15,0 мг, 15,3 мкмоль) растворяли в 7 N метанольного раствора NH₃ (3,0 мл) и перемешивали в течение ночи. Конверсию контролировали масс-спектрометрией. После достижения полной конверсии реакционную смесь концентрировала в вакууме, суспендировали в 80% трет-бутаноле и лиофилизировали. Продукт очищали препаративной ВЭЖХ.

Выход: 12,1 мг

Масс-спектрометрия: [М+Н]⁺, 888,0; [M+Na]⁺, 910,2

3. Синтез синтетического дидезокси-прекурсора HDP 30.2115

Молекулу дидезокси-прекурсора, включающую тиол-реагирующую группу с расщепляемым линкером, можно синтезировать из продукта примера 2 в 7 этапов следующим образом:

Этап 1: Fmoc-Val-OSu (HDP 30.1343)

Это соединение получают согласно R.A. Firestone и др., US 6214345. Fmoc-Val-OH (20,24 г, 59,64 ммоль) и N-гидроксисукцинимид (6,86 г = 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (200 мл) при 0°С обрабатывали N,N'-дициклогексилкарбодиимидом (12,30 г, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 6 часов, затем твердый побочный продукт дициклогексилмочевины (DCU) отфильтровывали и промывали ТГФ, растворитель удаляли при помощи роторного вакуумного испарителя. Остаток растворяли в 300 мл дихлорметана, охлаждали на ледяной бане в течение 1 часа и снова фильтровали для удаления дополнительного DCU. Дихлорметан выпаривали и твердую пену (26,51 г) использовали на следующем этапе без дополнительной очистки.

Этап 2: Fmoc-Val-Ala-OH (HDP 30.1414)

Продукт этапа 2 получают аналогично P.W. Howard и др., US2011/0256157. Раствор L-аланина (5,58 г, 1,05 экв.) и гидрокарбоната натрия (5,51 г, 1,1 экв.) в 150 мл воды готовили и добавляли к раствору HDP 30.1343 (26,51 г, не более 59,6 ммоль) в 225 мл тетрагидрофурана. Смесь перемешивали в течение 50 часов при комнатной температуре. После израсходования исходного материала раствор делили между 240 мл 0,2 М лимонной кислоты и 200 мл этилацетата. Водный слой отделяли и экстрагировали этил ацетатом (3×200 мл). Объединенные органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором (300 мл каждого) сушили (над MgSO₄), и растворитель выпаривали до объема приблизительно 200 мл. В этот момент выполняли осаждение и фильтрование чистого продукта. Маточный раствор выпаривали досуха и остаток перемешивали в течение 1 часа с 100 мл МТВЕ для получения дополнительного кристаллического материала. Два сбора продукта объединяли и получали 18,01 г (74%) белого порошка (температура плавления: 203-207°С).

MS(ESI+) [M+Na]⁺ получено: 410,94; расчет: 411,19 (C₂₃H₂₇N₂O₅)

[M+Na]⁺ получено: 433,14; расчет: 433,17 (C₂₃H₂₇N₂O₅)

[2М+Н]⁺ получено: 842,70; расчет: 843,36 (C₄₆H₅₂N₄NaO₁₀)

Этап 3: Fmoc-Val-Ala-PAB-NHBoc (HDP 30.1713)

Полученный на этапе 2 продукт HDP 30.1414 (1,76 г, 4,28 ммоль) и 4-[(N-Вос)аминометил]анилин (1,00 г, 1,05 экв.) растворяли в 26 мл абсолютного тетрагидрофурана. Добавляли 2-этокси-N-(этоксикарбонил)-1,2-дигидрохинолин (EEDQ 1,11 г; 1,05 экв.) и смесь перемешивали при комнатной температуре в защищенном от света месте. По ходу реакции из первоначально прозрачного раствора образуется гелеобразное вещество. Через 40 часов реакционную смесь разбавляли 25 мл трет-бутилметилового эфира (МТВЕ) и перемешивали в течение 1 часа. Затем осадок фильтровали с отсасыванием, промывали МТВЕ и сушили в вакууме до получения 2,30 г (выход 85%) белого твердого вещества.

¹Н NMR (500 МГц, ДМСО-d6) δ 9,87 (s, 1Н), 8,11 (d, J=7,1 Гц, 1Н), 7,88 (d, J=7,5 Гц, 2Н), 7,74 (q, J=8,4, 7,9 Гц, 2Н), 7,51 (d, J=8,2 Гц, 2Н), 7,45-7,23 (m, 7Н), 7,17 (d, J=8,3 Гц, 2Н), 4,44 (р, J=7,0 Гц, 1Н), 4,36-4,17 (m, 3Н), 3,96-3,89 (m, 1Н), 2,01 (гепт, J=6,9 Гц, 1Н), 1,39 (s, 9Н), 1,31 (d, J=7,1 Гц, 3Н), 0,90 (d, J=6,8 Гц, 3Н), 0,87 (d, J=6,8 Гц, 3Н).

¹³С NMR (126 МГц, ДМСО-d6) δ 170,84, 170,76, 156,04, 155,63, 143,77, 143,69, 140,60, 137,41, 134,99, 127,50, 127,26, 126,93, 125,22, 119,95, 118,97, 77,60, 65,62, 59,95, 48,86, 46,62, 42,93, 30,28, 28,16, 19,06, 18,10, 18,03.

Этап 4: H-Val-Ala-PAB-NHBoc (HDP 30.1747)

Полученное на этапе 3 соединение HDP 30.1713 (1,230 г, 2,00 ммоль) помещали в колбу объемом 100 мл и растворяли в 40 мл диметилформамида (ДМФ). Добавляли диэтиламин (7,5 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре. Реакцию контролировали с помощью ТСХ (хлороформ/метанол/НОАс 90:8:2). После расходования исходного материала (30 минут) летучие вещества выпаривали, и остаток выпаривали совместно с 40 мл свежего ДМФ для удаления следовых количеств диэтиламина. Неочищенный продукт использовали без дополнительной очистки для следующего этапа.

MS(ESI+) [МН]⁺ получено: 393,26; расчет: 393,25 (C₂₀H₃₃N₄O₄)

[M+Na]⁺ получено: 415,35; расчет: 415,23 (C₂₀H₃₂N₄NaO₄)

[2М+Н]⁺ получено: 785,37; расчет: 785,49 (C₄₀H₆₅N₈O₈)

Этап 5: BMP-Val-Ala-PAB-NHBoc (HDP 30.2108)

Полученный на этапе 4 неочищенный продукт HDP 30.1747 (не более 2,00 ммоль) растворяли в 40 мл ДМФ, добавляли 3-(малеимидо)пропионовой кислоты N-гидроксисукцинимидный эфир (BMPS 532 мг, 1,0 экв.) и N-этилдиизопропиламин (510 мкл, 1,5 экв.), и смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. После расходования исходного материала HDP 30.1747 (ТСХ: хлороформ/ метанол/ НОАс с соотношением 90:8:2) летучие вещества выпаривали, и остаток перемешивали с 50 мл МТВЕ до образования тонкодисперсной суспензии (1 час). Осадок фильтровали с отсасыванием, промывали МТВЕ и сушили. Неочищенный продукт (1,10 г) растворяли в 20 мл дихлорметана/метанола с соотношением 1:1, добавляли кизельгур (15 г) и растворители удаляли. Твердый материал помещали на верхнюю часть колонки с 80 г силикагеля и элюировали с линейным градиентом 0-10% метанола в дихлорметане. Фракции продукта соединяли и выпаривали до 793 мг (73% за два этапа) аморфного твердого вещества.

MS(ESI⁺) [M+Na]⁺ получено: 566,24; расчет: 566,26 (C₂₇H₃₇N₅NaO₇)

¹H NMR (500 МГц, ДМСО-d₆) δ 9,75 (s, 1H), 8,09 (d, J=7,1 Гц, 1H), 7,98 (d, J=8,4 Гц, 1H), 7,52 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7,29-7,23 (m, 1H), 7,16 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,98 (s, 2H), 4,39 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,13 (dd, J=8,4, 6,7 Гц, 1H), 4,06 (d, J=6,1 Гц, 2H), 3,67-3,56 (m, 2H), 2,49-2,41 (m, 2H), 1,96 (h, J=6,8 Гц, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,30 (d, J=7,1 Гц, 3Н), 0,86 (d, J=6,8 Гц, 3Н), 0,82 (d, J=6,8 Гц, 3Н).

¹³C NMR (126 МГц, ДМСО-d₆) δ 170,80, 170,63, 170,60, 169,72, 155,65, 137,45, 134,94, 134,44, 127,26, 118,95, 77,62, 57,71, 48,92, 42,95, 33,96, 33,64, 30,17, 28,17, 19,02, 18,06, 17,82.

Этап 6: BMP-Val-Ala-PAB-NH₂ (HDP 30.2109)

Полученный на этапе 5 продукт HDP 30.2108 (400 мг, 736 мкмоль) растворяли в 4 000 мкл трифторуксусной кислоты (ТФУК) и перемешивали в течение 2 минут. Затем летучие вещества выпаривали при комнатной температуре, и остатки дважды выпаривали совместно с 4000 мкл толуола. Остаток растворяли в 5000 мкл 1,4-диоксана/воды в соотношении 4:1, осуществляли его отверждение в жидком азоте и сушили сублимацией: 410 мг (количественно) бесцветного порошка

MS(ESI+) [M+Na]⁺ получено: 415,35; расчет: 466,21 (C₂₂H₂₉N₅NaO₅)

[2М+Н]⁺ получено: 887,13; расчет: 887,44 (C₄₄H₅₉N₁₀O₁₀)

¹Н NMR (500 МГц, ДМСО-d₆) δ 9,89 (s, 1Н), 8,13 (d, J=6,9 Гц, 1Н), 7,99 (d, J=8,2 Гц, 1Н), 7,66-7,60 (m, 2Н), 7,41-7,34 (m, 2Н), 6,98 (s, 2Н), 4,39 (р, J=7,1 Гц, 1Н), 4,11 (dd, J=8,2, 6,6 Гц, 1Н), 3,97 (q, J=5,6 Гц, 2Н), 3,69-3,58 (m, 2H), 2,49-2,40 (m, 2H), 1,96 (h, J=6,8 Гц, 1H), 1,32 (d, J=7,1 Гц, 3Н), 0,86 (d, J=6,8 Гц, 3Н), 0,83 (d, J=6,7 Гц, 3Н).

¹³C NMR (126 МГц, ДМСО-d₆) δ 171,24, 170,78, 170,72, 169,85, 158,12 (q, J=33,2 Гц, ТФУК), 158,25, 157,99, 157,73, 139,19, 134,53, 129,45, 128,52, 119,02, 116,57 (q, J=296,7 Гц, ТФК), 57,78, 49,08, 41,90, 34,00, 33,68, 30,21, 19,07, 18,16, 17,76.

Этап 6: HDP 30.2115

HDP 30.2105 (15,0 мг, 16,5 мкмоль) обрабатывали 429 мкл 0,1 М раствора HDP 30.2109 (25,2 мкмоль, 1,5 экв.), 492 мкл 0,1 М TBTU (25,2 мкмоль, 1,5 экв.) и 492 мкл 0,2 М DIEA (49,1 мкмоль, 3,0 экв.) при комнатной температуре. Реакцию контролировали при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ. После завершения реакции реакционную смесь быстро охлаждали 100 мкл H₂O, перемешивали в течение 15 минут и впрыскивали на препаративную обращенно-фазовую ВЭЖХ.

Выход: 12,2 мг, 56%

Масс-спектрометрия: 1313,2 [М+Н]⁺, 1335,5 [M+Na]⁺

^{4. Синтез синтетического дидезокси-прекурсора HDP 2179}

4.1 Синтез HDP 30.2179

4.2 Синтез HDP 30.2007

770,0 мг (1,96 ммоль) HDP 30.1960, полученного в соответствии с ЕР15 000 681.5, 319,2 мг (1,96 ммоль) N-гидроксифталимида и 513,3 (1,96 ммоль) трифенилфосфина растворяли в 40 мл сухого тетрагидрофурана. В атмосфере аргона в течение 30 минут добавляли 889,2 мкл (1,96 ммоль) раствора этилдиазокарбоксилата в толуоле (40%). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре и выпаривали до сухого остатка. Твердый остаток очищали на колонке с силикагелем с градиентом от CHCl₃ до CHCl₃/МеОН (30/1) в качестве элюента. Неочищенный HDP 30.2007 получали в виде желтого твердого вещества. Сырой продукт дополнительно очищали на колонке с силикагелем с градиентом от н-гексана до н-гексана/этилацетата/метанола (10/10/1) в качестве элюента. HDP 30.2007 получали в виде белого твердого вещества.

Выход: 270,0 мг (22%).

MS (ESI⁺) получено: 561,14 [M+Na]⁺; расчет: 561,24 (C₂₈H₃₄N₄NaO₇)

MS(ESI⁺) получено: 1099,70 2 [M+Na]⁺; расчет: 1099,48 (C₅₆H₆₈N₈NaO₁₄)

4.3 Синтез HDP 30.2011

270,0 мг (0,50 ммоль) HDP 30.2007 суспендировали в 16 мл дихлорметана. В атмосфере аргона сразу добавляли 50,3 мкл (1,04 ммоль) гидразингидрата и реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов в атмосфере аргона и при комнатной температуре. Суспензию фильтровали, и твердое вещество промывали дихлорметаном. Фильтраты выпаривали, и остаток сушили в высоком вакууме. HDP 30.2011 получали в виде белого твердого вещества и использовали для следующих этапов без дополнительной очистки. Выход: 199,0 мг (97%).

MS (ESI⁺) получено: 431,50 [M+Na]⁺; расчет: 431,24 (C₂₀H₃₂N₄NaO₅)

4.4 Синтез HDP 30.2177

20,59 мг (23,17 мкмоль) HDP 30.2105 растворяли в 1200 мкл сухого диметилформамида (ДМФ). Раствор продували аргоном и обрабатывали 18,85 мг (46,10 мкмоль) HDP 30.2011, растворенного в сухом диметилформамиде (ДМФ), 24,05 мг (46,10 мкмоль) РуВОР (бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфоний-гексафторфосфат), растворенного в 450 мл сухого диметилформамида (ДМФ) и 86,20 мкл (82,30 ммоль) раствора N-этил-диизопропиламина (DIPEA) в ДМФ (100 мкл DIPEA, растворенного в 500 мкл ДМФ). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона. Через 5 часов реакционный объем разбавляли холодным метил-трет-бутиловым эфиром (МТВЕ). Белый осадок центрифугировали и промывали холодным МТВЕ. Неочищенное твердое вещество очищали обращенно-фазовой 18 ВЭЖХ (Luna™ 10 мк, 250×21 мм, Phenomenex®, 290 нм) с градиентом 95% H₂O/5% МеОН до 95% МеОН/5% H₂O и расходом 15 мл/мин. Фракцию продукта собирали в 17,5 мин выпаривали и сушили сублимацией в воде до 13,84 мг (47%) HDP 30.2177 в виде белого аморфного твердого вещества.

MS (ESI⁺) получено: 1278,45 [МН]⁺; расчет: 1277,58 (C₅₉H₈₃N₁₃O₁₇S)

MS (ESI⁺) получено: 1300,84 [M+Na]⁺; расчет: 1300,58 (C₅₉H₈₃N₁₃NaO₁₇S)

4.5 Синтез HDP 30.2179

13,84 мг (10,82 мкмоль) HDP 30.2177 растворяли в 2 000 мкл трифторуксусной кислоты (ТФУК) и перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре. Избыток ТФУК удаляли с помощью роторного испарителя на водяной бане с температурой 33°С, и оставшийся остаток обрабатывали 5 мл метанола и выпаривали до сухого остатка. Маслянистый остаток сушили в высоком вакууме до образования белого твердого вещества. Твердое вещество растворяли в 1700 мкл сухого диметилформамида (ДМФ) и обрабатывали 5,77 мг (21,67 мкмоль) N-сукцинимидил-3-малеимидопропионата (BMPS). Добавляли 75,40 мкл раствора DIPEA (50 мкл DIPEA, растворенного в 450 мкл сухого ДМФ). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 5 часов и обрабатывали 20 мл холодного МТВЕ. Осадок центрифугировали, промывали холодным МТВЕ и сушили. Сырой продукт очищали обращенно-фазовой 18 ВЭЖХ (Luna™ 10 мк, 250×21 мм, Phenomenex®, 290 нм) с градиентом 95% H₂O/5% МеОН до 95% МеОН/5% H₂O и расходом 15 мл/мин. Фракцию продукта в 14,5 мин собирали, выпаривали и сушили сублимацией в воде до 7,40 мг (51%) HDP 30.2179 в виде белого аморфного твердого вещества.

MS (ESI⁺) получено: 1351,50 [M+Na]⁺; расчет: 1351,55 (C₆₁H₈₀N₁₄NaO₁₈S)

Кроме того, альтернативная молекула дидезокси-прекурсора, включающая группу -CO-NHOH вместо карбоксамидной группы в аминокислоте 1, может быть синтезирована, например, реакцией прекурсора карбоксилата HDP 30.2105 с О-бензилгидроксиламином в стандартных условиях конденсации (РуВОР, DCC, смешанный ангидрид и т.д.). Бензильную группу полученного таким образом производного О-бензилгидроксамовой кислоты HDP 30.2105 можно легко удалить в каталитических гидрогенолитических условиях (Pd/H2) с образованием свободной группы -CO-NHOH. Затем эту кислотную гидроксамовую функциональную группу можно алкилировать до -CO-NHOR с помощью различных галогенированных или О-тозилированных алкил-линкерных структурных блоков. Такое алкилирование протекает в щелочных условиях с LiOH, NaOH, KO-t-Bu или другими подходящими основаниями.

5. Синтез синтетического дидезокси-прекурсора HDP 30.2191

Молекулу дидезокси-прекурсора, включающую тиол-реагирующую группу со стабильным линкером, можно синтезировать из продукта примера 2 следующим образом:

Продукт примера 2 (HDP 30.2105) 11,0 мг, (12,39 мкмоль) растворяли в 123,9 мкл сухого ДМФ. Затем добавляли 1 М растворов N-гидроксисукцинимида и диизопропилкарбодиимида в ДМФ (123,9 мкл, 10 экв. каждого). Через 1 час при комнатной температуре добавляли 1 М раствор N-(2-аминоэтил)малеимида трифторацетатной соли в ДМФ и реакционную смесь перемешивали еще 4 часа. Затем реакционную смесь вливали по капле в 10 мл МТВЕ при температуре 0°С. Полученный осадок собирали центрифугированием и промывали дополнительным объемом 10 мл МТВЕ. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ на С18 колонке с градиентом 5-100% метанола. Продукт, содержащий фракции, выпаривали и лиофилизировали из трет-бутанола/воды с получением 9,27 мг (54%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного порошка

MS(ESI+) [МН]⁺ получено: 1010,3; расчет: 1010,4 (C₄₅H₆₀N₁₁O₁₄S)

[M+Na]⁺ получено: 1032,5; расчет: 1032,39 (C₄₅H₅₉N₁₁NaO₁₄S)

6. Синтез синтетического дидезокси-прекурсора HDP 30.2157

Молекулу дидезокси-прекурсора, включающую тиол-реагирующую группу с восстанавливаемым линкером, можно синтезировать из продукта примера 2 следующим образом:

Этап 1:

Продукт примера 2 (HDP 30.2105) 11,36 мг, (12,97 мкмоль) растворяли в 512 мкл сухого ДМФ. Затем добавляли А 0,1 М раствора РуВОР в ДМФ (512 мкл, 4 экв.) и 8,70 мкл (4 экв.) DIPEA. Через 1 мин добавляли 0,1 М раствор 3-[(трифенилметил)сульфанил]пропан-1-амина в дихлорметане и реакционную смесь перемешивали еще 3,5 часа. Затем реакционную смесь вливали по капле в 10 мл МТВЕ при температуре 0°С. Полученный осадок собирали центрифугированием и промывали дополнительным объемом 10 мл МТВЕ. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ на С18 колонке с градиентом 5-100% метанола. Продукт, содержащий фракции, выпаривали и лиофилизировали из трет-бутанола/воды с соотношением 4:1 с получением 9,52 мг (62%) продукта в виде аморфного твердого вещества.

MS(ESI+) [M+Na]⁺ получено: 1225,30; расчет: 1225,48 (C₆₁H₇₄N₁₀NaO₁₂S₂)

Этап 2:

К полученному на этапе 1 продукту (9,52 мг, 7,91 мкмоль) добавляли 0,5 М раствор 2,2'-дитиобис(5-нитропиридин), DTNP в трифторуксусной кислоте (79,1 мкл, 5 экв.). Через 4 минуты реакционную смесь осаждали в 10 мл МТВЕ при температуре 0°С. Полученные твердые вещества собирали центрифугированием и промывали дополнительным объемом 10 мл МТВЕ. Сырой продукт очищали препаративной ВЭЖХ на С18-колонке с градиентом 5-100% метанола с 0,05 ТФУК. Чистую фракцию выпаривали и остаток лиофилизировали из 2 мл трет-бутанола/воды с соотношением 4:1 с получением 7,48 мг (85%) HDP 30.2157 в виде слегка желтоватого порошка. MS (ESI⁺) 1146,97 [М+Н]⁺, 1169,17 [M+Na]⁺

^{7. Синтез конъюгата chiBCE19-D265C-30.2115}

Конъюгация HDP 30.2115 с 10 мг chiBCE19-D265C

Для конъюгации с HDP 30.2115 будут использованы 10 мг Thiomab chiBCE19-D265C в PBS.

Довести раствор антител до 1 мМ EDTA:

2 мл раствора антител (10,0 мг)+20 мкл 100 мМ EDTA, рН 8,0

Количество антител: 10 мг = 6,8×10^-8 моль

Разблокирование цистеинов реакцией антител с 40 экв. ТСЕР:

- 2 мл раствора антител (6,8×10^-8 моль)+54,5 мкл 50 мМ раствора ТСЕР (2,72×10^-6 моль)

- Инкубировать течение 3 часов при температуре 37°С на шейкере.

- Два последовательных диализа при температуре 4°С в 2,0 л 1 × PBS, 1 мМ EDTA, рН 7,4 в кассете для диализа Slide-A-Lyzer 20'000 MWCO, первый диализ приблизительно 4 часа, второй диализ в течение ночи

- Концентрировать до приблизительно 4,0 мл, используя центробежные фильтры Amicon Ultra 50'000 MWCO.

Окисление реакцией антитела с 20 экв. дегидроаскорбиновой кислоты (dhAA):

- приблизительно 2 мл раствора антител (6,8×10^-8 моль)+27,2 мкл свежего 50 мМ раствора dhAA (1,36×10^-6 моль)

- Инкубировать в течение 3 часов при комнатной температуре на шейкере.

Конъюгация с аматином, используя 6 эк. HDP 30.2115 и быстрое охлаждение 25 экв. N-ацетил-L-цистеином:

Растворять 0,7 мг HDP 30.2115 в 70 мкл ДМСО = 10 мкг/мкл

- приблизительно 2 мл раствора антител (=9,5 мг; 6,46×10^-8 моль)+50,9 мкл HDP 30.2115 (509 мкг; 3,88×10^-7 моль).

- Инкубировать 1 час при комнатной температуре.

- Быстро охладить добавлением 16 мкл 100 мМ N-ацетил-L-цистеина (1,62×10^-6 моль).

- Инкубировать 15 минут при комнатной температуре (или в течение ночи при 4°С).

- Очистить каждую реакционную смесь при помощи PD-10 колонок, кондиционированных 1 × PBS, рН 7,4.

Определить белоксодержащие фракции при помощи реактива Брэдфорда на парафильме и объединить белоксодержащие фракции.

- Диализ каждого раствора антител при 4°С в течение ночи в 2,0 л PBS, рН 7,4 и в кассетах для диализа Slide-A-Lyzer 20'000 MWCO.

Определение концентрации белка и соотношения содержания лекарственного средства к антителу (DAR) при помощи УФ-спектров (абсорбция при 280 нм и 310 нм), используя голое антитело против ADC с доведением до идентичных концентраций белка.

Довести концентрацию белка до 5,0 мг/мл (3,4×10^-5 М) и привести в стерильное состояние фильтрованием. Хранить при температуре 4°С.

8. Синтез конъюгата chiBCE19-D265C-30.2179

Конъюгация HDP 30.2179 с 10 мг chiBCE19-D265C

Для конъюгации с HDP 30.2179 будут использованы 10 мг Thiomab chiBCE19-D265C в PBS.

Довести раствор антител до 1 мМ EDTA:

2 мл раствора антител (10,0 мг) + 20 мкл 100 мМ EDTA, рН 8,0

Количество антител: 10 мг = 6,8×10^-8 моль

Разблокирование цистеинов реакцией антитела с 40 экв. ТСЕР:

- 2 мл раствора антител (6,8×10^-8 моль)+54,5 мкл 50 мМ раствора ТСЕР (2,72×10^-6 моль)

- Инкубировать в течение 3 часов при температуре 37°С на шейкере.

- Два последовательных диализа при температуре 4°С в 2,0 л 1 × PBS, 1 мМ EDTA, рН 7,4 в кассете для диализа Slide-A-Lyzer 20'000 MWCO, первый диализ приблизительно 4 часа, второй диализ в течение ночи

- Концентрировать до приблизительно 4,0 мл, используя центробежные фильтры Amicon Ultra 50'000 MWCO.

Окисление реакцией антитела с 20 экв. дегидроаскорбиновой кислоты (dhAA):

приблизительно 2 мл раствора антител (6,8×10^-8 моль)+27,2 мкл свежего 50 мМ раствора dhAA (1,36×10^-6 моль)

- инкубировать в течение 3 часов при комнатной температуре на шейкере.

Конъюгация с аматином, используя 6 эк. HDP 30.2179 и быстрое охлаждение 25 экв. N-ацетил-L-цистеином:

Растворить 0,7 мг HDP 30.2179 в 70 мкл ДМСО = 10 мкг/мкл

- приблизительно 2 мл раствора антител (=9,5 мг; 6,46×10^-8 моль)+51,5 мкл HDP 30.2179 (=515 мкг; 3,88×10^-7 моль).

- Инкубировать 1 час при комнатной температуре.

- Быстро охладить добавлением 16 мкл 100 мМ N-ацетил-L-цистеина (1,62×10^-6 моль).

- Инкубировать 15 минут при комнатной температуре (или в течение ночи при 4°С).

- Очищать каждую реакционную смесь при помощи PD-10 колонок, кондиционированных 1 × PBS, рН 7,4.

Определить белоксодержащие фракции при помощи реактива Бредфорда на парафильме и объединить белоксодержащие фракции.

- Диализ каждого раствора антител при 4°С в течение ночи в 2,0 л PBS, рН 7,4 и в кассетах для диализа Slide-A-Lyzer 20'000 MWCO.

Определение концентрации белка и соотношения содержания лекарственного средства к антителу (DAR) при помощи УФ-спектров (абсорбция при 280 нм и 310 нм), используя голое антитело против ADC с доведением до идентичных концентраций белка.

Довести концентрацию белка до 5,0 мг/мл (3,4×10^- М) и привести в стерильное состояние фильтрованием. Хранить при температуре 4°С.

9. Конъюгация HDP 30.2115 с 30 мг DIG-D265C

Для конъюгации с HDP 30.2115 будут использованы 30 мг сконструированного с цистеином антитела в PBS при 5,0 мг/мл

- Довести раствор антител до 1 мМ EDTA:

- 6 мл раствора антител (30 мг) + 60 мкл 100 мМ EDTA, рН 8,0

- Количество антител: 2,05×10^-7 моль

Разблокирование цистеинов реакцией антитела с 40 экв. ТСЕР:

- 6 мл раствора антител (2,05×10^-7 моль)+164 мкл 50 мМ раствора ТСЕР (8,21×10^-6 моль)

- Инкубировать в течение 3 часов при температуре 37°С.

- Очистить каждое антитело от ТСЕР двумя последовательными диализами при температуре 4°С в 2,0 л 1 × PBS, 1 мМА EDTA, рН 7,4 в кассете для диализа Slide-A-Lyzer 20'000 MWCO, первый диализ приблизительно 4 часа, второй диализ в течение ночи Окисление реакцией антитела с 20 экв. дегидроаскорбиновой кислоты (dhAA):

- приблизительно 6 мл раствора антител (2,05×10^-7 моль) + 82 мкл свежего 50 мМ раствора dhAA (4,1×10^-6 моль)

- Инкубировать в течение 3 часов при комнатной температуре.

Конъюгация с аматином, используя 6 эк. HDP 30.2115 и быстрое охлаждение 25 экв. N-ацетил-L-цистеином:

Растворить 2,0 мг HDP 30.2115 в 200 мкл ДМСО = 10 мкг/мкл

- приблизительно 6 мл раствора антител (= приблизительно 29 мг; 1,98×10^-7 моль)+156 мкл HDP 30.2115 (1563 мкг; 1,19×10^-6 моль).

- Инкубировать 1 час при комнатной температуре.

- Быстро охладить добавлением 49,6 мкл 100 мМ N-ацетил-L-цистеина (4,96×10^-6 моль).

- Инкубировать 15 минут при комнатной температуре (или в течение ночи при 4°С).

- Центрифугировать на полной скорости в течение приблизительно 3 минут, взять надосадочную жидкость и точно измерить объем для препаративной FPLC.

- Очистить каждую реакционную смесь препаративной FPLC с применением HiLoad 16/600-Superdex 200 pg и XK-16 колонки, кондиционированной 1 × PBS, рН 7,4 (1,0 мл/мин); собрать фракции УФ-абсорбцией с длиной волны 280 нм.

- Диализ каждого раствора антител при 4°С в течение ночи в 1 × 3,0 л PBS, рН 7,4 и кассетах для диализа Slide-A-Lyzer 20'000 MWCO.

Определение концентрации белков, используя голое антитело против ADC с доведением до идентичных концентраций белка.

Довести концентрацию белка до 5 мг/мл (3,42×10^-5 М) и привести в стерильное состояние фильтрованием. Хранить при температуре 4°С.

1. Конъюгат, включающий в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением, (b) мишень-связывающий фрагмент и (с) расщепляемый линкер, связывающий указанный аматоксин и указанный мишень-связывающий фрагмент, причем конъюгат имеет структуру I

в которой R² представляет собой S;

R³ выбран из -NHR⁵, -NH-OR⁵ и -OR⁵;

R⁴ представляет собой Н; и

в которой один из R⁵ представляет собой -L_n-X, в котором L - линкер, который является ферментативно расщепляемым линкером, причем указанный ферментативно расщепляемый линкер включает дипептид, выбранный из группы, состоящей из Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit и Val-Cit, где n выбран из 0 и 1, и X представляет собой мишень-связывающий фрагмент, и в которой остальные R⁵ представляют собой Н, при этом указанный мишень-связывающий фрагмент является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

2. Конъюгат по п. 1, в котором R³ выбран из -NH-L_n-X, -NH-O-L_n-X и -O-L_n-X.

3. Конъюгат по п. 1 или 2, в котором указанный ферментативно расщепляемый линкер дополнительно включает п-аминобензил (РАВ) спейсер между указанным дипептидом и указанным аматоксином.

4. Конъюгат по п. 3, в котором ферментативно расщепляемый линкер включает структуру

или структуру L¹-L*-L², в которой L* представляет собой

где L¹ является частью линкера, который соединяет L* с аматоксином через -C(=O)-NH-, -C(=O)-NH-O- или -С(=O)-O-группу, и где L² является частью линкера, который соединяет L* с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем L¹ связан с L* через -(СН₂)_m-фрагмент, при этом m является целым числом, выбранным из диапазона от 1 до 8, в частности от 1 до 5, или через -(CH₂CH₂O)_n-фрагмент, при этом n является целым числом, выбранным из диапазона от 1 до 3, в частности от 1 до 2.

5. Конъюгат по любому из пп. 1-4, в котором указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент прикреплен к конструкту, выбранному из конструктов HDP 30.2115 и HDP 30.2179

6. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата по любому из пп. 1-5, а также содержащая один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей, эксципиентов, наполнителей, связующих, смазывающих веществ (лубрикантов), скользящих веществ (глидантов), разрыхлителей (дезинтегрантов), адсорбентов и/или консервантов, для применения в лечении рака у пациента, где рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, лимфомы Беркитта и Т-клеточной лимфомы.

7. Применение конъюгата по любому из пп. 1-5 в лечении рака у пациента, включающем этап введения конъюгата по любому из пп. 1-5 или фармацевтической композиции по п. 6 указанному пациенту, в котором рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, лимфомы Беркитта и Т-клеточной лимфомы.

8. Конструкт, включающий в себя (а) аматоксин, включающий (i) аминокислоту 4 с 6'-дезокси-положением и (ii) аминокислоту 8 с S-дезокси-положением, и (с) фрагмент линкера, несущий реакционноспособную группу для связывания указанного аматоксина с мишень-связывающим фрагментом, причем конъюгат имеет структуру I

в которой R² представляет собой S;

R³ выбран из -NHR⁵, -NH-OR⁵ и -OR⁵;

R⁴ представляет собой Н; и

в которой один из R⁵ представляет собой -L_n-X, в котором L - линкер, который является ферментативно расщепляемым линкером, включающим дипептид, выбранный из Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit и Val-Cit, где n выбран из 0 и 1, a X представляет собой мишень-связывающий фрагмент, и в которой остальные R⁵ представляют собой Н, при этом указанный мишень-связывающий фрагмент является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем ферментативно расщепляемый линкер дополнительно включает п-аминобензил (РАВ) спейсер между дипептидами и аматоксином и при этом линкер включает тиол-реагирующую группу.

9. Конструкт по п. 8, в котором ферментативно расщепляемый линкер включает структуру

или структуру L¹-L*-L², в которой L* представляет собой

где L¹ является частью линкера, который соединяет L* с аматоксином через -C(=O)-NH-, -C(=O)-NH-O- или -С(=O)-O-группу, и где L² является частью линкера, который соединяет L* с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем L¹ связан с L* через -(СН₂)_m-фрагмент, при этом m является целым числом, выбранным из диапазона от 1 до 8, в частности от 1 до 5, или через -(CH₂CH₂O)_n-фрагмент, при этом n является целым числом, выбранным из диапазона от 1 до 3, в частности от 1 до 2.

10. Конструкт по п. 9, в котором указанная тиол-реагирующая группа выбрана из малеимида и малеимида, имеющего замещаемую группу в положении 3.

11. Конструкт по п. 9, который выбран из конструктов HDP 30.2115 и HDP 30.2179