Рекомбинантный штамм ad6-htert-gmcsf, содержащий встройку промотора теломеразы человека htert, а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, обладающий избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

Настоящее изобретение относится к генной терапии злокачественных опухолей, в частности к онколитическим аденовирусным векторам. Оно может быть применимо в производстве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (ГМ-КСФ) в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису, для включения противоопухолевого иммунного ответа. Настоящий штамм аденовируса как платформа для конструирования противоопухолевых и вакцинных препаратов обладает целым рядом преимуществ. Он реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях - вирусных фабриках, не контактирует с клеточным генетическим материалом, не встраивается в хромосомы, не имеет онкогенного потенциала. Аденовирус серотипа 6 имеет более низкую серопревалентность, что увеличивает эффективность его использования в качестве противоопухолевого препарата. 6 ил., 5 пр.

 

Настоящее изобретение относится к генной терапии злокачественных опухолей. Более точно, настоящее изобретение относится к онколитическим аденовирусным векторам и фармацевтическим композициям, содержащим такие векторы. Настоящее изобретение также относится к применению указанных векторов в производстве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования гранулоцитарно макрофагально колониестимулирующего фактора человека (ГМ-КСФ) в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису, для включения противоопухолевого иммунного ответа.

С середины XIX века известно множество кейс-репортов, когда регрессия опухоли совпадала с естественным заражением вирусной инфекцией. Чаще всего такие пациенты страдали от гематологических новообразований, таких как лейкемия или лимфома, которые ассоциированы со значительным снижением работы иммунитета. В одном часто цитируемом случае, произошедшем в 1896, доктор Джордж Док описал временную ремиссию после перенесенного гриппа у 42-летней женщины, больной лейкемией [1]. Однако эффект был заметен и на солидных опухолях, схожий случай регрессии был зафиксирован в 1912 году, когда больной раком шейки матки вводилась вакцина от вируса бешенства после укуса собаки [2].

Ко второй половине XX века накопилось достаточно большое количество подобных единичных случаев, когда естественное заражение вирусной инфекцией производило противоопухолевый эффект. Вследствие этого к середине двадцатого столетия идея использования вирусов стала набирать популярность. В 1950-1970 годы было начато множество клинических испытаний для исследования методов лечения, предполагающих введение различных представителей некоторых вирусных семейств, включая вирусы гепатита (Hepadnaviridae, Picornaviridae, Flaviviridae), лихорадку Западного Нила (Flaviviridae), желтую лихорадку (Flaviviridae), лихорадку денге (Flaviviridae), болезни Ньюкасла (Paramixoviridae), а также аденовирусов [3]. Поскольку на тот момент еще не возникли генно-инженерные методы, и молекулярные механизмы действия вирусов оставались неизвестными, использовались неаттенуированные вирусы дикого типа, что часто приводило к тяжелым побочным эффектам. К 90-м годам стали понятны некоторые молекулярные механизмы процессов, протекающих при заражении клеток вирусами, а также возник инструментарий генной инженерии. В настоящее время ведется более тысячи клинических испытаний противоопухолевых препаратов на основе различных вирусных векторов, среди которых, согласно ресурсу http://www.abedia.com/wiley/index.html. одними из наиболее часто встречающихся (26%) являются аденовирусы.

Существенными достоинствами аденовирусных векторов являются относительная простота получения очищенных вирусных суспензий, неспособность интегрироваться в геном клеток, рекомбинантные аденовирусы довольно стабильны и экспрессия встроенных генов может достигать высоких уровней [4]. Изначально для онколитической виротерапии создавались аденовирусные векторы, которые были лишены области ранних генов, необходимых для вирусной репликации. В настоящее время более перспективными противоопухолевыми агентами являются условно репликативные аденовирусы, либо экспрессию ранних генов контролируют опухолеспецифическими промоторами. Кроме того, появилась стратегия "вооружения" векторов генами-иммуномодуляторами для усиления противоопухолевого иммунного ответа.

Аденовирусы в генной терапии начали активно использовать в начале 90-х годов. Были предприняты попытки доставки дисфункциональных и дефицитных генов при различных заболеваниях [5, 6]. Разработка препаратов потребовала более тщательного изучения безопасности использования аденовирусных векторов в генной терапии. На данный момент наиболее часто встречается вариант с удаленными 24 п.о. в участке малого белка Е1А, отвечающего за связывание белков семейства ретинобластомы и выход из ареста клеточного цикла [7-9]. Такой вариант позволяет вирусу селективно реплицироваться в клетках с нарушенным Rb-путем.

Еще один способ модификации аденовирусных векторов для адресного воздействия на опухолевые клетки заключается во внедрении в геном ткане- и/или опухолеспецифичных промоторов вместо природного промотора области Е1А [10-12]. Одним из вариантов подобных модификаций является встройка промотора теломеразы человека hTERT, поскольку активна в более чем 90% злокачественных клеток [13]. Было установлено, что такие аденовирусные векторы подавляют рост опухоли in vitro и in vivo, проявляя при этом специфичность к опухолевым клеткам [14, 15]. Кроме того, онколитический аденовирус ОВР-301 с промотором hTERT был протестирован в клинических испытаниях 1 и 2 фаз, в доклиническом исследовании с антителом против PD-1 с хорошими результатами [16].

Несмотря на способность аденовирусов активировать разные звенья иммунного ответа, использование диких типов или аттенуированных векторов не приводит к полному уничтожению метастазирующих опухолей, вероятно, из-за их иммуносупрессивного клеточного микроокружения. Использование онколитических векторов с генами-иммуномодуляторами должно приводить к разрушению этой супрессии и, следовательно, к более эффективной терапии [17]. Примерами используемых трансгенов являются цитокины, хемокины, костимулирующие молекулы и молекулы BiTEs (Bi-specific T-cell engagers) [18].

Такой цитокин как ГМ-КСФ может нарабатываться в достаточном количестве в инфицированных клетках, затем в результате онколиза высвобождаться в микроокружение опухоли для стимуляции антиген-презентирующих клеток, в том числе дендритных клеток, которые взаимодействуют с CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами [19]. Клинические исследования с участием онколитических аденовирусов со встройкой гена ГМ-КСФ показывают хорошие результаты и безопасность применения таких векторов [20-22].

Одним из наиболее близких аналогов к создаваемому в рамках темы НИР аденовирусному вектору является конструкция онколитического аденовирусного вектора, разработанная китайской компанией Чэнгду Кангхонг Байотекнолоджиз (патент России 2361611, опубл. 20.06.2009). Вектор содержит генетически улучшенный промотор теломеразы человека, контролирующий ключевые для репликации вируса гены, а также встройку гена человеческого ГМ-КСФ. Однако данные модификации до сих пор применялись только к Ад5, но на основе Ад6 пока не было создано онколитических аденовирусов с подобными модификациями.

Использование Ад5 в качестве онколитика осложнено тем, что это широко встречающийся серотип, из чего следует высокая распространенность предсуществующего иммунитета, ограничивающий время существования вируса в организме пациента, получающего терапию [23]. Другая проблема кроется в способности клеток Купфера захватывать Ад5 из кровотока, что приводит к воспалительной реакции в печени, повышенной гепатотоксичности, а также снижению времени циркуляции вируса [23, 24]. Вариантом решения данной проблемы является использование альтернативных серотипов, среди которых наиболее близким к Ад 5, но при этом лишенным указанных недостатков является аденовирус серотипа 6 (Ад6) [25].

Техническим результатом является создание онколитического аденовируса серотипа 6, обладающего пониженной серопревалентностью, избегающего связывания клетками Купфера, предназначенного для лечения злокачественных опухолей, продуцирования гранулоцитарно макрофагально колониестимулирующего фактора человека в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису и включения противоопухолевого иммунного ответа.

Результат достигается созданием Рекомбинантного штамма Ad6-hTERT-GMCSF, сконструированного на основе штамма аденовируса серотипа 6, содержащего встройку промотора теломеразы человека (hTERT), структура которого соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, депонированного в GenBank (Accession АН007699) позиции 10854-11273 в месте удаленного промотора гена Е1А между позициями соответствующими позициям нуклеотидов 357-558 штамма Ад6 Tonsil99, депонированного в GenBank (Accession HQ413315), а также гена гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующего фактора человека, структура которого соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, депонированного в GenBank (Accession NM 000758) позиции 36-469, в месте удаленных генов Е3-6.7к и Е3-gp19k между позициями 28608 и 29270, обладающего избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующего активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор.

Модифицированный геном аденовируса серотипа 6, содержит:

- левый ITR

- промотор hTERT

- последовательность аденовируса, включающая гены от Е1А до Е3-12.5К

- ген человеческого GMCSF

- последовательность аденовируса, включающая гены от Е3-13.4К до правого ITR

Создание штамма достигается за счет гидролиза эндонуклеазой рестрикции AsiSI продукта гомологичной рекомбинации in vitro при помощи набора In-fusion (Takara Bio, Япония) между ДНК Ад6 штамма ЛМВ, гидролизованной эндонуклеазами рестрикции по сайтам ClaI и PacI, и плазмидной ДНК pBRAd4.2. Плазмида pBRAd4.2 (фиг. 1) была сконструирована на основе pBR322 за счет последовательных встроек фрагментов ДНК Ад6 штамма ЛМВ, соответствующих позициям нуклеотидов штамма Ад6 Tonsil99, депонированного в GenBank (Accession HQ413315): 1-1772, где вместо нуклеотидной последовательности 357-558 встроена последовательность промотора hTERT, затем 27576-27665 и 27667-35759, где вместо нуклеотидной последовательности 28608-29270 встроена последовательность гена ГМ-КСФ человека. Также были встроены сайты гидролиза эндонуклеазой рестрикци AsisI слева от участков, соответствующих позициям 1-1772 Ад6 и справа от участков, соответствующих 27667-35759 Ад6. Последовательность промотора теломеразы человека hTERT соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, депонированного в GenBank (Accession АН007699) позиции 10854-11273, но имеет дополнительные встройки: сайтов рестрикции BamHI слева от последовательности промотора, PstI справа от последовательности промотора и последовательность Козак GCCACC, примыкающая справа от сайта рестрикции PstI. Последовательность гена ГМ-КСФ человека соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, депонированного в GenBank (Accession NM_000758) позиции 36-469. Полученная в результате рекомбинации между плазмидой pBRAd4.2 и геномной ДНК Ад6 штамма ЛМВ плазмида pAd6-hTERT-GMCSF затем подвергалась гидролизу эндонуклеазой рестрикции AsiSI и дальнейшей трансфекции в клетки НЕК Ad293.

Штамм обладает следующими признаками: Морфологические признаки. Штамм относится к семейству Adenoviridae рода Mastadenovirus и обладает признаками, характерными для аденовирусов вида С: икосаэдрический вирион, однако отличается дополнительной экспрессей ГМ-КСФ и hTERT-зависимой репликацией.

Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного Ад6 имеет длину 35779 п.н. Наличие в его геноме встроек промотора hTERT и гена человеческого ГМ-КСФ было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Селективная репликация в hTERT-положительных клетках была подтверждена методом ХТТ(фиг. 3). Цитотоксическое действие вируса подтверждена методом ХТТ на клетках двух раковых линий (фиг. 4).Экспрессия гена ГМ-КСФ человека подтверждена Western blot анализом культуральной среды и лизатов клеток А549, инфицированных штаммом Ad6-hTERT-GMCSF (фиг. 5). Биологическая активность секретируемого рекомбинантного ГМ-КСФ была оценена в культуре клеток эритролейкоза человека TF-1, которая является ГМ-КСФ зависимой и пролиферирует только в присутствии ГМ-КСФ и ряда других цитокинов человека (фиг. 6).

Заявляемый штамм аденовируса, как платформа для конструирования противоопухолевых и вакцинных препаратов, обладает целым рядом преимуществ. Он реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях -вирусных фабриках, не контактирует с клеточным генетическим материалом, не встраивается в хромосомы, не имеет онкогенного потенциала. Аденовирус серотипа 6 имеет более низкую серопревалентность, что увеличивает эффективность его использования в качестве противоопухолевого препарата. Заявляемый штамм аденовируса Ad6-hTERT-GMCSF получен на основе штамма ЛМВ.

Изобретение иллюстрировано следующими фигурами:

Фигура 1. Схема получения полногеномной плазмиды, содержащей геном рекомбинантного аденовируса Ad6-hTERT-GMCSF

Фигура 2. Электрофореграмма гидролизованной плазмиды pAd6-hTERT-GMCSF: 1, 5 - маркерная ДНК (50 кб, СибЭнзим); 2, 6 - анализируемая плазмида, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции EcoICRI; 3, 7 - анализируемая плазмида, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции EcoRV; 4, 8 - анализируемая плазмида гидролизованная эндонуклеазой рестрикции АраЫ

Фигура 3. Жизнеспособность клеток молочной железы после обработки различными разведениями Ad6 и Ad6-hTERT-GMCSF. А - жизнеспособность клеток линии MCF-7, Б - жизнеспособность клеток линии MCF-10. Все распределения были проверены на нормальность тестом Шапиро-Уилка, показано среднее ± стандартное отклонение, достоверность отличий оценена тестом Стьюдента, *р<0.05.

Фигура 4. Жизнеспособность опухолевых клеток после обработки различными разведениями Ad6 и Ad6-hTERT-GMCSF. А - жизнеспособность клеток линии MDA-MB-231, Б - жизнеспособность клеток линии U87. Все распределения были проверены на нормальность тестом Шапиро-Уилка, показано среднее ± стандартное отклонение, достоверность отличий оценена тестом Стьюдента, *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001.

Фигура 5. Результаты вестерн-блот анализа: 1) среда после заражения Ад6 дикого типа; 2,3) среда после заражения рек2-Адб; 4) среда контрольных клеток; 5) лизат после заражения Ад6 дикого типа; 6, 7) лизат после заражения рек2-Адб; 8) лизат контрольных клеток; 9) рекомбинантный негликозилированный ГМ-КСФ из Е. coli. Контроль молекулярного веса - Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder

Фигура 6. Анализ биологической активности ГМ-КСФ человека, экспрессированного в составе рекомбинантного аденовируса на клетках Ad293. На оси Y показана биологическая активность ГМ-КСФ - % стимуляции пролиферации цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека TF-1. За 100% принимали количество живых клеток, выращенных в необработанной среде и при добавлении неразведенной среды с неинфицированных клеток Ad293 (отрицательный контроль). На оси X - концентрация рекомбинантного прокариотического препарата ГМ-КСФ (калибровка) или разведение культуральной среды клеток, инфицированных рекомбинантом.

Ниже приведены примеры воплощения изобретения.

Пример 1. Способ получения рекомбинантного аденовируса серотипа 6 Ad6-hTERT-GMCSF

Для получения плазмиды pAd6 проводилась рекомбинация in vitro при помощи набора In-fusion (Takara Bio, Япония) между линеаризованной плазмидой pBRAd4.2 и геномом Ад6 штамма ЛМВ, гидролизованным при помощи эндонуклеаз рестрикции ClaI и Pad (фиг. 1). ДНК полученной в результате плазмиды pAd6-hTERT-GMCSF была наработана в препаративных количествах из 250 мл среды Лурия-Бертани и выделена с использованием набора лабораторных реагентов для выделения плазмидной ДНК, очищенной от эндотоксинов, EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN). Линеаризация плазмиды pBRAd4.2 проводилась методом ПЦР с использованием праймеров:

Продуктами рекомбинации трансформировали клетки Е. coli штамма Stellar. Для подтверждения встройки из полученных колоний бьша выделена плазмидная ДНК, которые затем гидролизовали эндонуклеазами рестрикции EcoRV, EcoICRI и ApaLI; теоретическая и экспериментальная картины расщепления приведены на фигуре 2.

Полученную плазмиду pAd6-hTERT-GMCSF затем гидролизовали эндонуклеазой рестрикции AsiSI. Полученный продукт очищали этанольной преципитацией. Для трансфекции реагент Lipofectamine™ LTX в количестве 0,1 мкл добавляли к 100 нг гидролизованной плазмиды в 50 мкл среды opti-MEM (Invitrogen). Трансфекцию проводили на 90%-ном монослое клеток НЕК Ad293, вьфащенном в 96-луночных планшетах (Greiner). Клетки инкубировали 1 час при 37°С в атмосфере 5% СО₂, после чего добавляли 100 мкл среды DMEM (Invitrogen) и инкубировали еще 48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО₂ до развития цитопатического эффекта. Материал трижды замораживали-оттаивали для получения вирусной суспензии. Вирус клонировали методом серийного разведения на клетках линии А549. Наличие встройки промотора hTERT оценивали секвенированием по Сэнгеру с использованием праймера Вирус был препаративно наработан на клетках линии А549, его геномная ДНК выделена и определена геномным секвенированием. Приложение 1

Пример 2. Оценка селективности репликации рекомбинантного штамма Ad6-hTERT-GMCSF

Для оценки избирательной репликации полученного рекомбинантного штамма Ад6 проводили тест на цитотоксичность с использованием ХТТ реагента. Для этого брали две клеточные линии - MCF-10 и MCF-7, в которых известно, что теломеразная активность существенно различается, и заражали и с помощью рек2-Адб, с различным количеством вирусных частиц на клетку. Спустя три дня определялась жизнеспособность клеток путем измерения оптической плотности образовавшегося формазана. Из результатов ХТТ-теста (фиг. 3) видно, что оба варианта вируса обладали схожей цитотоксичностью на клетках линии MCF-7, однако в эксперименте на клетках линии MCF-10, hTERT-модифицированный вирус проявлял меньшую литическую активность.

Пример 3. Оценка цитотоксического эффекта в опухолевых линиях клеток.

Чтобы выяснить, не снижена ли противоопухолевая активность вируса из-за внесенных модификаций, проводили тест на жизнеспособность после обработки клеток различными количествами вирусных частиц природного Ad6 и Ad6-hTERT-GMCSF на клетку с использованием ХТТ реагента. Оценка проводилась на клетках рака молочной железы MDA-MB-231, а также клетках глиобластомы U87 (фиг. 4). При тестировании на клетках линии MDA-MB-231 достоверной разницы не было обнаружено, однако при тестировании на U87 были выявлены статистически значимые отличия. Таким образом, внесенные модификации не снижают цитотоксическое действие вируса.

Пример 4. Оценка продукции ГМ-КСФ человека рекомбинантным штаммом Ad6-hTERT-GMCSF

Для подтверждения экспрессии белка ГМ-КСФ в полученном рек2-Ад6 при инфицировании был проведен вестерн-блот анализ. Для этого клеточная линия А549 заражалась при 70%-ном монослое рек2-Ад6 и Ад6 дикого типа. В качестве контроля использовали незараженные клетки. Спустя 12 ч со всех матрасов собирали среду и концентрировали ее, а клетки подвергали лизису. Лизаты клеток и концентраты среды центрифугировали при 12 тыс об/мин 30 мин при 6°С, затем отбирали супернатант. Белки разделяли при помощи электрофореза в 14% полиакриламидном геле. Затем производили перенос белков на мембрану с последующим блокированием мембраны и окрашиванием белков мышиными античеловеческими антителами против ГМ-КСФ человека. После 16-часовой инкубации мембраны ее промывали и окрашивали вторичным антителом к мышиному IgG с конъюгированной щелочной фосфатазой. После инкубирования и промывки мембраны, мембрана переносилась в раствор с субстратом для щелочной фосфатазы (BCIP и NBT).

Из полученных результатов анализа следует, что встроенный ген ГМ-КСФ экспрессируется в клетках (фиг. 5). Наличие белка не наблюдается ни при заражении Ад6 дикого типа, ни в контрольном образце. При заражении рек2-Ад6 наибольшее количество белка наблюдается в среде, в которой росли клетки.

Пример 5. Анализ биологической активности ГМ-КСФ человека, экспрессированного в составе Ad6-hTERT-GMCSF

Биологическую активность ГМ-КСФ человека, секретируемого клетками Ad293, инфицированными рекомбинантными аденовирусом рек2-Ад6, оценивали по выраженному в процентах уровню стимуляции пролиферации цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека TF-1 [26]. Пролиферативный эффект препаратов определяли в фотометрическом тесте с использованием субстрата для митохондриальных дегидрогеназ 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент ХТТ). Оценивали стимулирующую пролиферативную активность культуральной среды, полученной через 48 часов после заражения клеток рекомбинантным аденовирусом с множественностью 0,5 БОЕ/клетка. Перед использованием культуральную среду центрифугировали 10 мин при 2000g для осаждения клеточного дебриса и фильтровали через ячейку Amicon Ultra - 100К (Millipore) для удаления вируса. Аналогично получали контрольный образец среды неинфицированных Ad293 клеток. Для оценки концентрации ГМ-КСФ в культуральной среде использовали очищенный и охарактеризованный препарат рекомбинантного ГМ-КСФ, полученного в клетках E.coli [26, 27]. Для проведения эксперимента в среде RPMI (Invitrogen) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки готовили 4-кратные разведения культуральной среды от инфицированных рекомбинантными вирусами клеток Ad293 в диапазоне 1:4-1024 или рекомбинантного белка ГМ-КСФ до конечных концентраций 0,25; 0,5; 1; 2 и 4 нг/мл (калибровка). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду неинфицированных клеток. В лунки 96-ти луночного планшета вносили 50 мкл вышеуказанных разведений или контрольных образцов и добавляли 50 мкл суспензии клеток TF-1 в среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки по 2×10⁴ клеток/лунка. Планшеты помещали в термостат при температуре 37°С, 5% СО₂, влажности 85% и инкубировали 72 часа. После инкубации в каждую тестируемую лунку добавляли 50 мкл реагента ХТТ (Sigma). Планшет инкубировали еще 4 часа и определяли оптическую плотность ОП490/620 на планшетном спектрофотометре SpectraCount (Packard). Каждую точку делали в пяти повторностях, определяли среднее значение и дисперсию для различных концентраций культуральной среды и очищенного рекомбинантного белка ГМ-КСФ, строили гистограмму зависимости ОП от разведений и концентрации. Стимуляцию пролиферации TF-1 клеток рассчитывали в процентах по отношению к контролю. За 100% принимали количество живых клеток в отрицательном контроле. Все расчеты проводили с использованием программного обеспечения LabView. Результаты представлены на фигуре 6.

Источники информации.

1. Dock G. The influence of complicating diseases upon leukaemia. Am J Med Sci, 1904. P.

2. DePace N. Sulla Scomparsa di un enorme cancro vegetante del callo dell'utero senza cura chirurgica. // Ginecologia. 1912. Vol. 9. P. 82-89.

3. Kelly E., Russell S.J. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. // Mol. Ther. 2007. Vol. 15, №4. P. 651-659.

4. Chaurasiya S., Hitt M.M. Adenoviral Vector Construction I: Mammalian Systems // Adenoviral Vectors for Gene Therapy: Second Edition. Second Edi. Elsevier Inc., 2016. 85-112 p.

5. Lemarchand P. et al. Adenovirus-mediated transfer of a recombinant human al-antitrypsin cDNA to human endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. Vol. 89, №14. P. 6482-6486.

6. Griesenbach U. et al. Gene therapy progress and prospects: Cystic fibrosis // Gene Therapy. Gene Ther, 2002. Vol. 9, №20. P. 1344-1350.

7. Fueyo J. et al. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo. // Oncogene. 2000. Vol. 19, №1. P. 2-12.

8. Kimball K.J. et al. A phase I study of a tropism-modified conditionally replicative adenovirus for recurrent malignant gynecologic diseases // Clin. Cancer Res. Clin Cancer Res, 2010. Vol. 16, №21. P. 5277-5287.

9. Page J.G. et al. Identifying the safety profile of a novel infectivity-enhanced conditionally replicative adenovirus, Ad5-A24-RGD, in anticipation of a phase I trial for recurrent ovarian cancer // Am. J. Obstet. Gynecol. Mosby Inc., 2007. Vol. 196, №4. P. 389.e1-389.e10.

10. Vile R.G., Hart I.R. In Vitro and in Vivo Targeting of Gene Expression to Melanoma Cells // Cancer Res. 1993. Vol. 53, №5. P. 962-967.

11. Osaki T. et al. Gene Therapy for Carcinoembryonic Antigen-producing Human Lung Cancer Cells by Cell Type-specific Expression of Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Gene // Cancer Res. Cancer Res, 1994. Vol. 54, №20. P. 5258-5261.

12. Chen L. et al. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter // J. Clin. Invest. American Society for Clinical Investigation, 1995. Vol. 96, №6. P. 2775-2782.

13. Hahn W.C., Weinberg R.A. Modelling the molecular circuitry of cancer // Nature Reviews Cancer. European Association for Cardio-Thoracic Surgery, 2002. Vol. 2, №5. P. 331-341.

14. Gu J., Kagawa S., Takakura M. Tumor-specific Transgene Expression from the Human Telomerase Reverse Transcriptase Promoter Enables Targeting of the Therapeutic Effects of the Bax Gene to Cancers Advances in Brief Tumor-specific Transgene Expression from the Human Telomerase Reverse Tr. 2000. Vol. 260, №16. P. 5359-5364.

15. Komata T. et al. A novel treatment of human malignant gliomas in vitro and in vivo: FADD gene transfer under the control of the human telomerase reverse transcriptase gene promoter. // Int. J. Oncol, bit J Oncol, 2001. Vol. 19, №5. P. 1015-1020.

16. Khan U. et al. Phase II study of a telomerase-specific oncolytic adenovirus (OBP-301, Telomelysin) in combination with pembrolizumab in gastric and gastroesophageal junction adenocarcinoma. // J. Clin. Oncol. 2019. Vol. 37, №15_suppl. P. TPS4145-TPS4145.

17. Rosewell Shaw A., Suzuki M. Recent advances in oncolytic adenovirus therapies for cancer // Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 2016. Vol. 21. P. 9-15.

18. Rosewell Shaw A., Suzuki M. Oncolytic Viruses Partner With T-Cell Therapy for Solid Tumor Treatment // Frontiers in immunology. NLM (Medline), 2018. Vol. 9. P. 2103.

19. Ramesh N. et al. CG0070, a Conditionally Replicating Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor-Armed Oncolytic Adenovirus for the Treatment of Bladder Cancer // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12, №1. P. 305-313.

20. Cerullo V. et al. Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients // Cancer Res. Cancer Res, 2010. Vol. 70, №11. P. 4297-4309.

21. Vassilev L. et al. T-cell response and robust cellular and transcriptional immune activation at tumor site in a patient with ovarian cancer.

22. Packiam V.T. et al. An open label, single-arm, phase II multicenter study of the safety and efficacy of CG0070 oncolytic vector regimen in patients with BCG-unresponsive non-muscle-invasive bladder cancer: Interim results // Urol. Oncol. Semin. Orig. Investig. Elsevier Inc., 2018. Vol. 36, №10. P. 440-447.

23. Mennechet F.J.D. et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence // Expert Rev. Vaccines. Taylor & Francis, 2019. Vol. 18, №6. P. 597-613.

24. Khare R. et al. Identification of Adenovirus Serotype 5 Hexon Regions That Interact with Scavenger Receptors // J. Virol. 2012. Vol. 86, №4. P. 2293-2301.

25. Weaver E.A. et al. Characterization of species С human adenovirus serotype 6 (Ad6) // Virology. 2011. Vol. 412, №1. P. 19-27.

26. Grazhdantseva A.A. et al. Highly effective production of biologically active, secreted, human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by recombinant vaccinia virus // Appl. Biochem. Microbiol. Pleiades Publishing, 2016. Vol. 52, №7. P. 685-691.

27. Топоркова Л.Б., Орловская И.А., Сенников С.В., Сахно Л.В., Козлова, Ю.Н., Лебедев Л.Р. И.П.Г. Изучение in vitro биологических свойств рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора // Иммунология. 2009. Vol. 4. Р. 203-205.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Новосибирский Государственный Университет

<120> Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, содержащий встройку промотора

теломеразы человека hTERT, а также гена гранулоцитарно-макрофагального

колониестимулирующего фактора человека, обладающий избирательной

цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток

и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный

колониестимулирующий фактор.

<130> 249/11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35779

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgtaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgccggatg tggtaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacgg gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccaag taatatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataattct gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcgga 360

tccgattcga cctctctccg ctggggccct cgctggcgtc cctgcaccct gggagcgcga 420

gcggcgcgcg ggcggggaag cgcggcccag acccccgggt ccgcccggag cagctgcgct 480

gtcggggcca ggccgggctc ccagtggatt cgcgggcaca gacgcccagg accgcgctcc 540

ccacgtggcg gagggactgg ggacccgggc acccgtcctg ccccttcacc ttccagctcc 600

gcctcctccg cgcggacccc gccccgtccc gacccctccc gggtccccgg cccagccccc 660

tccgggccct cccagcccct ccccttcctt tccgcggccc cgccctctcc tcgcggcgcg 720

agtttcaggc agcgctgcgt cctgctgcgc acgtgggaag ccctggcccc ggccaccccc 780

gcgctgcagg ccaccatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 840

gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct 900

agccattttg aaccacctac ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa 960

gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt tttcccgagt ctgtaatgtt ggcggtgcag 1020

gaagggattg acttattcac ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt 1080

tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt 1140

gtgccggagg tgatcgatct tacctgccac gaggctggct ttccacccag tgacgacgag 1200

gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg 1260

tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat 1320

atgaggacct gtggcatgtt tgtctacagt aagtgaaaaa ttatgggcag tgggtgatag 1380

agtggtgggt ttggtgtggt aatttttttt tttaattttt acagttttgt ggtttaaaga 1440

attttgtatt gtgatttttt aaaaggtcct gtgtctgaac ctgagcctga gcccgagcca 1500

gaaccggagc ctgcaagacc tacccggcgt cctaaattgg tgcctgctat cctgagacgc 1560

ccgacatcac ctgtgtctag agaatgcaat agtagtacgg atagctgtga ctccggtcct 1620

tctaacacac ctcctgagat acacccggtg gtcccgctgt gccccattaa accagttgcc 1680

gtgagagttg gtgggcgtcg ccaggctgtg gaatgtatcg aggacttgct taacgagtct 1740

gggcaacctt tggacttgag ctgtaaacgc cccaggccat aaggtgtaaa cctgtgattg 1800

cgtgtgtggt taacgccttt gtttgctgaa tgagttgatg taagtttaat aaagggtgag 1860

ataatgttta acttgcatgg cgtgttaaat ggggcggggc ttaaagggta tataatgcgc 1920

cgtgggctaa tcttggttac atctgacctc atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt 1980

tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagagc tctaacagta cctcttggtt ttggaggttt 2040

ctgtggggct cctcccaggc aaagttagtc tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa 2100

tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag ctgtttgatt ctttgaatct gggtcaccag 2160

gcgcttttcc aagagaaggt catcaagact ttggattttt ccacaccggg gcgcgctgcg 2220

gctgctgttg cttttttgag ttttataaag gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc 2280

ggggggtacc tgctggattt tctggccatg catctgtgga gagcggtggt gagacacaag 2340

aatcgcctgc tactgttgtc ttccgtccgc ccggcaataa taccgacgga ggagcaacag 2400

caggaggaag ccaggcggcg gcggcggcag gagcagagcc catggaaccc gagagccggc 2460

ctggaccctc gggaatgaat gttgtacagg tggctgaact gtttccagaa ctgagacgca 2520

ttttaaccat taacgaggat gggcaggggc taaagggggt aaagagggag cggggggctt 2580

ctgaggctac agaggaggct aggaatctaa cttttagctt aatgaccaga caccgtcctg 2640

agtgtgttac ttttcagcag attaaggata attgcgctaa tgagcttgat ctgctggcgc 2700

agaagtattc catagagcag ctgaccactt actggctgca gccaggggat gattttgagg 2760

aggctattag ggtatatgca aaggtggcac ttaggccaga ttgcaagtac aagattagca 2820

aacttgtaaa tatcaggaat tgttgctaca tttctgggaa cggggccgag gtggagatag 2880

atacggagga tagggtggcc tttagatgta gcatgataaa tatgtggccg ggggtgcttg 2940

gcatggacgg ggtggttatt atgaatgtga ggtttactgg tcccaatttt agcggtacgg 3000

ttttcctggc caataccaat cttatcctac acggtgtaag cttctatggg tttaacaata 3060

cctgtgtgga agcctggacc gatgtaaggg ttcggggctg tgccttttac tgctgctgga 3120

agggggtggt gtgtcgcccc aaaagcaggg cttcaattaa gaaatgcctg tttgaaaggt 3180

gtaccttggg tatcctgtct gagggtaact ccagggtgcg ccacaatgtg gcctccgact 3240

gtggttgctt tatgctagtg aaaagcgtgg ctgtgattaa gcataacatg gtgtgtggca 3300

actgcgagga cagggcctct cagatgctga cctgctcgga cggcaactgt cacttgctga 3360

agaccattca cgtagccagc cactctcgca aggcctggcc agtgtttgag cacaacatac 3420

tgacccgctg ttccttgcat ttgggtaaca ggaggggggt gttcctacct taccaatgca 3480

atttgagtca cactaagata ttgcttgagc ccgagagcat gtccaaggtg aacctgaacg 3540

gggtgtttga catgaccatg aagatctgga aggtgctgag gtacgatgag acccgcacca 3600

ggtgcagacc ctgcgagtgt ggcggtaaac atattaggaa ccagcctgtg atgctggatg 3660

tgaccgagga gctgaggccc gatcacttgg tgctggcctg cacccgcgct gagtttggct 3720

ctagcgatga agatacagat tgaggtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa 3780

agaatatata aggtgggggt ctcatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgcca 3840

tgagcgccaa ctcgtttgat ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg cgcatgcccc 3900

catgggccgg ggtgcgtcag aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc 3960

ccgcaaactc tactaccttg acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag 4020

cctccgccgc cgcttcagcc gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt 4080

tcctgagccc gcttgcaagc agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga 4140

cggctctttt ggcacaattg gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc 4200

tgttggatct gcgccagcag gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt 4260

aaaacataaa taaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt cttgctgtct 4320

ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt cgttgagggt 4380

cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat acatgggcat 4440

aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg gggtggtgtt 4500

gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt ctttcagtag 4560

caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt taagctggga 4620

tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt tggctatgtt 4680

cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag tgtatccggt 4740

gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact tggagacgcc 4800

cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg gcccacgggc 4860

ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt ccaggatgag 4920

atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg gtataatggt 4980

tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg ctttgagttc 5040

agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa accgtttccg gggtagggga 5100

gatcagctgg gaagaaagca ggttcctaag cagctgcgac ttaccgcagc cggtgggccc 5160

gtaaatcaca cctattaccg gctgcaactg gtagttaaga gagctgcagc tgccgtcatc 5220

cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact tgcatgtttt ccctgaccaa 5280

atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag caaagttttt 5340

caacggtttg aggccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa gcagttccag 5400

gcggtcccac agctcggtca cgtgctctac ggcatctcga tccagcatat ctcctcgttt 5460

cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag acgggccagg 5520

gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac ggtgaagggg 5580

tgcgctccgg gttgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct ggtgctgaag 5640

cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt gtcatagtcc 5700

agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc gccgcacgag 5760

gggcagtgca gacttttaag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga ttccggggag 5820

taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca ggtgagctct 5880

ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt cttacctctg 5940

gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc cccgtataca 6000

gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag aaactcggac 6060

cactctgaga cgaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg ggaggggtag 6120

cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat gtcgccctct 6180

tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttatag gtgtaggcca cgtgaccggg tgttcctgaa 6240

ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc atcgctgtct 6300

gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac ttctgcgcta 6360

agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc ggtgatgcct 6420

ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc aagcttggtg 6480

gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag ggtttggttt 6540

ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc gcgcgcaacg 6600

caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ctaggtgcac gcgccaaccg 6660

cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag gcgctcgttg 6720

gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagtgggtc tagctgcgtc 6780

tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc gtcgaagtag 6840

tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc aagcgcgcgc 6900

tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga ggcgtacatg 6960

ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt agggtagcat 7020

cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg agcgaggagg 7080

tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg cctgaagatg 7140

gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc gtctgtgaga 7200

cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac cagctcggcg 7260

gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc atacttatcc 7320

tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac 7380

tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta gaactggttg 7440

acggcctggt aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg cgcggccttc 7500

cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctaacca tgactttgag gtactggtat 7560

ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt gcgctttttg 7620

gaacgcgggt ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc cgcgcgaggc 7680

ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt aattacctgg 7740

gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta aagttccaag 7800

aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt gagctcttca 7860

ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt ggaagcgacg 7920

aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc atttgcaggt ggtcgcgaaa ggtcctaaac 7980

tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg gtcttgttcc 8040

cagcggtccc atccaaggtc cgcggctagg tctcgcgcgg cggtcactag aggctcatct 8100

ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc ccccatccaa 8160

gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg cgagccgatc 8220

gggaagaact ggatctcccg ccaccagttg gaggagtggc tgttgatgtg gtgaaagtag 8280

aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc gcagtactgg 8340

cagcggtgca cgggctgtac atcctgcacg aggttgacct gacgaccgcg cacaaggaag 8400

cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc gggtttggct ggtggtcttc tacttcggct 8460

gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac caccacgccg 8520

cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac aacatcgcgc 8580

agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg gagctcctgc 8640

aggtttacct cgcatagccg ggtcagggcg cgggctaggt ccaggtgata cctgatttcc 8700

aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg cggcgcgact 8760

acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc atctaaaagc 8820

ggtgacgcgg gcgggccccc ggaggtaggg ggggctcggg acccgccggg agagggggca 8880

ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga gctggtgctg cgcgcggagg ttgctggcga 8940

acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag acgacgggcc 9000

cggtgagctt gaacctgaaa gagagttcga cagaatcaat ttcggtgtcg ttgacggcgg 9060

cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc tcggccatga 9120

actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg gtggcggcga 9180

ggtcgttgga gatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc tcgttccaga 9240

cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc tgcgcgagat 9300

tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt agtttcgcag gcgctgaaag aggtagttga 9360

gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgccgc aacgtggatt 9420

cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc acggcgaagt 9480

tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga cggatgagct 9540

cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct tcttcttcaa 9600

tctcctcttc cataagggcc tccccttctt cttcttctgg cggcggtggg ggagggggga 9660

cacggcggcg acgacggcgc accgggaggc ggtcgacaaa gcgctcgatc atctccccgc 9720

ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc ggccgttctc gcgggggcgc agttggaaga 9780

cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg gcggggggct gccgtgcggc agggatacgg 9840

cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg taggtactcc gccaccgagg gacctgagcg 9900

agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag tcacagtcgc 9960

aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg tttctggcgg 10020

aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg gtcgacagaa 10080

gcaccatgtc cttgggtccg gcctgctgaa tgcgcaggcg gtcggccatg ccccaggctt 10140

cgttttgaca tcggcgcagg tctttgtagt agtcttgcat gagcctttct accggcactt 10200

cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg gcggcggagt 10260

ttggccgtag gtggcgccct cttcctccca tgcgtgtgac cccgaagccc ctcatcggct 10320

gaagcagggc caggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc acctgcgtga 10380

gggtagactg gaagtcgtcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg ttgatggtgt 10440

aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc gagagctcgg 10500

tgtacctgag acgcgagtaa gcccttgagt caaagacgta gtcgttgcaa gtccgcacca 10560

ggtactggta tcccaccaaa aagtgcggcg gcggctggcg gtagaggggc cagcgtaggg 10620

tggccggggc tccgggggcg aggtcttcca acataaggcg atgatatccg tagatgtacc 10680

tggacatcca ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cggaaagtca cggacgcggt 10740

tccagatgtt gcgcagcggc aaaaagtgct ccatggtcgg gacgctctgg ccggtcaggc 10800

gcgcgcagtc gttgacgctc tagaccgtgc aaaaggagag cctgtaagcg ggcactcttc 10860

cgtggtctgg tggataaatt cgcaagggta tcatggcgga cgaccggggt tcgaaccccg 10920

gatccggccg tccgccgtga tccatgcggt taccgcccgc gtgtcgaacc caggtgtgcg 10980

acgtcagaca acgggggagc gctccttttg gcttccttcc aggcgcggcg gatgctgcgc 11040

tagctttttt ggccactggc cgcgcgcggc gtaagcggtt aggctggaaa gcgaaagcat 11100

taagtggctc gctccctgta gccggagggt tattttccaa gggttgagtc gcgggacccc 11160

cggttcgagt ctcgggccgg ccggactgcg gcgaacgggg gtttgcctcc ccgtcatgca 11220

agaccccgct tgcaaattcc tccggaaaca gggacgagcc ccttttttgc ttttcccaga 11280

tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc ctcctcagca gcggcaagag caagagcagc 11340

ggcagacatg cagggcaccc tccccttctc ctaccgcgtc aggaggggca acatccgcgg 11400

ctgacgcggc ggcagatggt gattacgaac ccccgcggcg ccggacccgg cactacttgg 11460

acttggagga gggcgagggc ctggcgcggc taggagcgcc ctctcctgag cgacacccaa 11520

gggtgcagct gaagcgtgac acgcgcgagg cgtacgtgcc gcggcagaac ctgtttcgcg 11580

accgcgaggg agaggagccc gaggagatgc gggatcgaaa gttccatgca gggcgcgagt 11640

tgcggcatgg cctgaaccgc gagcggttgc tgcgcgagga ggactttgag cccgacgcgc 11700

ggaccgggat tagtcccgcg cgcgcacacg tggcggccgc cgacctggta accgcgtacg 11760

agcagacggt gaaccaggag attaactttc aaaaaagctt taacaaccac gtgcgcacgc 11820

ttgtggcgcg cgaggaggtg gctataggac tgatgcatct gtgggacttt gtaagcgcgc 11880

tggagcaaaa cccaaatagc aagccgctca tggcgcagct gttccttata gtgcagcaca 11940

gcagggacaa cgaggcattc agggatgcgc tgctaaacat agtagagccc gagggccgct 12000

ggctgctcga tttgataaac attctgcaga gcatagtggt gcaggagcgc agcttgagcc 12060

tggctgacaa ggtggccgcc attaactatt ccatgctcag tctgggcaag ttttacgccc 12120

gcaagatata ccatacccct tacgttccca tagacaagga ggtaaagatc gaggggttct 12180

acatgcgcat ggcgctgaag gtgcttacct tgagcgacga cctgggcgtt tatcgcaacg 12240

agcgcatcca caaggccgtg agcgtgagcc ggcggcgcga gctcagcgac cgcgagctga 12300

tgcacagcct gcaaagggcc ctggctggca cgggcagcgg cgatagagag gccgagtcct 12360

actttgacgc gggcgctgac ctgcgctggg ccccaagccg acgcgccctg gaggcagctg 12420

gggccggacc tgggctggcg gtggcacccg cgcgcgctgg caacgtcggc ggcgtggagg 12480

aatatgacga ggacgatgag tacgagccag aggacggcga gtactaagcg gtgatgtttc 12540

tgatcagatg atgcaagacg caacggaccc ggcggtgcgg gcggcgctgc agagccagcc 12600

gtccggcctt aactccacgg acgactggcg ccaggtcatg gaccgcatca tgtcgctgac 12660

tgcgcgcaac cctgacgcgt tccggcagca gccgcaggcc aaccggctct ccgcaattct 12720

ggaagcggtg gtcccggcgc gcgcaaaccc cacgcacgag aaggtgctgg cgatcgtaaa 12780

cgcgctggcc gaaaacaggg ccatccggcc cgatgaggcc ggcctggtct acgacgcgct 12840

gcttcagcgc gtggctcgtt acaacagcag caacgtgcag accaacctgg accggctggt 12900

gggggatgtg cgcgaggccg tggcgcagcg tgagcgcgcg cagcagcagg gcaacctggg 12960

ctccatggtt gcactaaacg ccttcctgag tacacagccc gccaacgtgc cgcggggaca 13020

ggaggactac accaactttg tgagcgcact gcggctaatg gtgactgaga caccgcaaag 13080

tgaggtgtat cagtccgggc cagactattt tttccagacc agtagacaag gcctgcagac 13140

cgtaaacctg agccaggctt tcaagaactt gcaggggctg tggggggtgc gggctcccac 13200

aggcgaccgc gcgaccgtgt ctagcttgct gacgcccaac tcgcgcctgt tgctgctgct 13260

aatagcgccc ttcacggaca gtggcagcgt gtcccgggac acatacctag gtcacttgct 13320

gacactgtac cgcgaggcca taggtcaggc gcatgtggac gagcatactt tccaggagat 13380

tacaagtgtt agccgcgcgc tggggcagga ggacacgggc agcctggagg caaccctgaa 13440

ctacctgctg accaaccggc ggcaaaaaat cccctcgttg cacagtttaa acagcgagga 13500

ggagcgcatt ttgcgctatg tgcagcagag cgtgagcctt aacctgatgc gcgacggggt 13560

aacgcccagc gtggcgctgg acatgaccgc gcgcaacatg gaaccgggca tgtatgcctc 13620

aaaccggccg tttatcaatc gcctaatgga ctacttgcat cgcgcggccg ccgtgaaccc 13680

cgagtatttc accaatgcca tcttgaaccc gcactggcta ccgccccctg gtttctacac 13740

cgggggattc gaggtgcccg agggtaacga tggattcctc tgggacgaca tagacgacag 13800

cgtgttttcc ccgcaaccgc agaccctgct agagttgcaa caacgcgagc aggcagaggc 13860

ggcgctgcga aaggaaagct tccgcaggcc aagcagcttg tccgatctag gcgctgcggc 13920

cccgcggtca gatgctagta gcccatttcc aagcttgata gggtctctta ccagcactcg 13980

caccacccgc ccgcgcctgc tgggcgagga ggagtaccta aacaactcgc tgctgcagcc 14040

gcagcgcgaa aagaacctgc ctccggcgtt tcccaacaac gggatagaga gcctagtgga 14100

caagatgagt agatggaaga cgtatgcgca ggagcacagg gatgtgcccg gcccgcgccc 14160

gcccacccgt cgtcaaaggc acgaccgtca gcggggtctg gtgtgggagg acgatgactc 14220

ggcagacgac agcagcgtct tggatttggg agggagtggc aacccgtttg cacaccttcg 14280

ccccaggctg gggagaatgt tttaaaaaaa gcatgatgca aaataaaaaa ctcaccaagg 14340

ccatggcacc gagcgttggt tttcttgtat tccccttagt atgcggcgcg cggcgatgta 14400

tgaggaaggt cctcctccct cctacgagag cgtggtgagc gcggcgccag tggcggcggc 14460

gctgggttca cccttcgatg ctcccctgga cccgccgttc gtgcctccgc ggtacctgcg 14520

gcctaccggg gggagaaaca gcatccgtta ctctgagttg gcacccctat tcgacaccac 14580

ccgtgtgtac cttgtggaca acaagtcaac ggatgtggca tccctgaact accagaacga 14640

ccacagcaac tttctaacca cggtcattca aaacaatgac tacagcccgg gggaggcaag 14700

cacacagacc atcaatcttg acgaccggtc gcactggggc ggcgacctga aaaccatcct 14760

gcataccaac atgccaaatg tgaacgagtt catgtttacc aataagttta aggcgcgggt 14820

gatggtgtcg cgctcgctta ctaaggacaa acaggtggag ctgaaatacg agtgggtgga 14880

gttcacgctg cccgagggca actactccga gaccatgacc atagacctta tgaacaacgc 14940

gatcgtggag cactacttga aagtgggcag gcagaacggg gttctggaaa gcgacatcgg 15000

ggtaaagttt gacacccgca acttcagact ggggtttgac ccagtcactg gtcttgtcat 15060

gcctggggta tatacaaacg aagccttcca tccagacatc attttgctgc caggatgcgg 15120

ggtggacttc acccacagcc gcctgagcaa cttgttgggc atccgcaagc ggcaaccctt 15180

ccaggagggc tttaggatca cctacgatga cctggagggt ggtaacattc ccgcactgtt 15240

ggatgtggac gcctaccagg caagcttgaa agatgacacc gaacagggcg ggggtggcgc 15300

aggcggcggc aacaacagtg gcagcggcgc ggaagagaac tccaacgcgg cagctgcggc 15360

aatgcagccg gtggaggaca tgaacgatca tgccattcgc ggcgacacct ttgccacacg 15420

ggcggaggag aagcgcgctg aggccgaggc agcggccgaa gctgccgccc ccgctgcgga 15480

ggctgcacaa cccgaggtcg agaagcctca gaagaaaccg gtgattaaac ccctgacaga 15540

ggacagcaag aaacgcagtt acaacctaat aagcaatgac agcaccttca cccagtaccg 15600

cagctggtac cttgcataca actacggcga ccctcaggcc gggatccgct catggaccct 15660

gctttgcact cctgacgtaa cctgcggctc ggagcaggta tactggtcgt tgcccgacat 15720

gatgcaagac cccgtgacct tccgctccac gcgccagatc agcaactttc cggtggtggg 15780

cgccgagctg ttgcccgtgc actccaagag cttctacaac gaccaggccg tctactccca 15840

gctcatccgc cagtttacct ctctgaccca cgtgttcaat cgctttcccg agaaccagat 15900

tttggcgcgc ccgccagccc ccaccatcac caccgtcagt gaaaacgttc ctgctctcac 15960

agatcacggg acgctaccgc tgcgcaacag catcggagga gtccagcgag tgaccattac 16020

tgacgccaga cgccgcacct gcccctacgt ttacaaggcc ctgggcatag tctcgccgcg 16080

cgtcctatcg agccgcactt tttgagcaag catgtccatc cttatatcgc ccagcaataa 16140

cacaggctgg ggcctgcgct tcccaagcaa gatgtttggc ggggccaaga agcgctccga 16200

ccaacaccca gtgcgcgtgc gcgggcacta ccgcgcgccc tggggcgcgc acaaacgcgg 16260

ccgcactggg cgcaccaccg tcgatgacgc catcgacgcg gtggtggagg aggcgcgcaa 16320

ctacacgccc acgccgccgc cagtgtccac cgtggacgcg gccattcaga ccgtggtgcg 16380

cggagcccgg cgctacgcta aaatgaagag acggcggagg cgcgtagcac gtcgccaccg 16440

ccgccgaccc ggcactgccg cccaacgcgc ggcggcggcc ctgcttaacc gcgcacgtcg 16500

caccggccga cgggcggcca tgcgagccgc tcgaaggctg gccgcgggta ttgtcactgt 16560

gccccccagg tccaggcgac gagcggccgc cgcagcagcc gcggccatta gtgctatgac 16620

tcagggtcgc aggggcaacg tgtactgggt gcgcgactcg gttagcggcc tgcgcgtgcc 16680

cgtgcgcacc cgccccccgc gcaactagat tgcaataaaa aactacttag actcgtactg 16740

ttgtatgtat ccagcggcgg cggcgcgcat cgaagctatg tccaagcgca aaatcaaaga 16800

agagatgctc caggtcatcg cgccggagat ctatggcccc ccgaagaagg aagagcagga 16860

ttacaagccc cgaaagctaa agcgggtcaa aaagaaaaag aaagatgatg atgatgatga 16920

acttgacgac gaggtggaac tgttgcacgc gaccgcgccc aggcgacggg tacagtggaa 16980

aggtcgacgc gtaagacgtg ttttgcgacc cggcaccacc gtagtcttta cgcccggtga 17040

gcgctccacc cgcacctaca agcgcgtgta tgatgaggtg tacggcgacg aggacctgct 17100

tgagcaggcc aacgagcgcc tcggggagtt tgcctacgga aagcggcata aggacatgct 17160

ggcgttgccg ctggacgagg gcaacccaac acctagccta aagcccgtga cactgcagca 17220

ggtgctgccc gcgcttgcac cgtccgaaga aaagcgcggc ctaaagcgcg agtctggtga 17280

cttggcaccc accgtgcagc tgatggtacc caagcgtcag cgactggaag atgtcttgga 17340

aaaaatgacc gtggagcctg ggctggagcc cgaggtccgc gtgcggccaa tcaagcaggt 17400

ggcaccggga ctgggcgtgc agaccgtgga cgttcagata cccaccacca gtagcactag 17460

tattgccact gccacagagg gcatggagac acaaacgtcc ccggttgcct cggcggtggc 17520

agatgccgcg gtgcaggcgg ccgctgcggc cgcgtccaag acctctacgg aggtgcaaac 17580

ggacccgtgg atgtttcgtg tttcagcccc ccggcgtccg cgccgttcaa ggaagtacgg 17640

cgccgccagc gcgctactgc ccgaatatgc cctacatcct tccatcgcgc ctacccccgg 17700

ctatcgtggc tacacctacc gccccagaag acgagcaact acccgacgcc gaaccaccac 17760

tggaacccgc cgccgccgtc gccgtcgcca gcccgtgctg gccccgattt ccgtgcgcag 17820

ggtggctcgc gaaggaggca ggaccctggt gctgccaaca gcgcgctacc accccagcat 17880

cgtttaaaag ccggtctttg tggttcttgc agatatggcc ctcacctgcc gcctccgttt 17940

cccggtgccg ggattccgag gaagaatgca ccgtaggagg ggcatggccg gccacggcct 18000

gacgggcggc atgcgtcgtg cgcaccaccg gcggcggcgc gcgtcgcacc gtcgcatgcg 18060

cggcggtatc ctgcccctcc ttattccact gatcgccgcg gcgattggcg ccgtgcccgg 18120

aattgcatcc gtggccttgc aggcgcagag acactgatta aaaacaagtt acatgtggaa 18180

aaatcaaaat aaaagtctgg actctcacgc tcgcttggtc ctgtaactat tttgtagaat 18240

ggaagacatc aactttgcgt cactggcccc gcgacacggc tcgcgcccgt tcatgggaaa 18300

ctggcaagat atcggcacca gcaatatgag cggtggcgcc ttcagctggg gctcgctgtg 18360

gagcggcatt aaaaatttcg gttccgccgt taagaactat ggcagcaaag cctggaacag 18420

cagcacaggc cagatgctga gggacaagtt gaaagagcaa aatttccaac aaaaggtggt 18480

agatggcctg gcctctggca ttagcggggt ggtggacctg gccaaccagg cagtgcaaaa 18540

taagattaac agtaagcttg atccccgccc tcccgtagag gagcctccac cggccgtgga 18600

gacagtgtct ccagaggggc gtggcgaaaa gcgtccgcga cccgacaggg aagaaactct 18660

ggtgacgcaa atagacgagc ctccctcgta cgaggaggca ctaaagcaag gcctgcccac 18720

cacccgtccc atcgcgccca tggctaccgg agtgctgggc cagcacacac ccgtaacgct 18780

ggacctgcct ccccccgccg acacccagca gaaacctgtg ctgccaggcc cgtccgccgt 18840

tgttgtaacc cgtcctagcc gcgcgtccct gcgccgcgcc gccagcggtc cgcgatcgtt 18900

gcggcccgta gccagtggca actggcaaag cacactgaac agcatcgtgg gtttgggggt 18960

gcaatccctg aagcgccgac gatgcttctg atagctaacg tgtcgtatgt gtgtcatgta 19020

tgcgtccatg tcgccgccag aggagctgct gagccgccgc gcgcccgctt tccaagatgg 19080

ctaccccttc gatgatgccg cagtggtctt acatgcacat ctcgggccag gacgcctcgg 19140

agtacctgag ccccgggctg gtgcagttcg cccgcgccac cgagacgtac ttcagcctga 19200

ataacaagtt tagaaacccc acggtggcgc ctacgcacga cgtgaccaca gaccggtctc 19260

agcgtttgac gctgcggttc atccccgtgg accgcgagga tactgcgtac tcgtacaagg 19320

cgcggttcac cctagctgtg ggtgataacc gtgtgctaga catggcttcc acgtactttg 19380

acatccgcgg cgtgctggac aggggcccta cttttaagcc ctactctggc actgcctaca 19440

acgcactggc ccccaagggt gcccccaact cgtgcgagtg ggaacaaaat gaaactgcac 19500

aagtggatgc tcaagaactt gacgaagagg agaatgaagc caatgaagct caggcgcgag 19560

aacaggaaca agctaagaaa acccatgtat atgcccaggc tccactgtcc ggaataaaaa 19620

taactaaaga aggtctacaa ataggaactg ccgacgccac agtagcaggt gccggcaaag 19680

aaattttcgc agacaaaact tttcaacctg aaccacaagt aggagaatct caatggaacg 19740

aagcggatgc cacagcagct ggtggaaggg ttcttaaaaa gacaactccc atgaaaccct 19800

gctatggctc atacgctaga cccaccaatt ccaacggcgg acagggcgtt atggttgaac 19860

aaaatggtaa attggaaagt caagtcgaaa tgcaattttt ttccacatcc acaaatgcca 19920

caaatgaagt taacaatata caaccaacag ttgtattgta cagcgaagat gtaaacatgg 19980

aaactccaga tactcatctt tcttataaac ctaaaatggg ggataaaaat gccaaagtca 20040

tgcttggaca acaagcaatg ccaaacagac caaattacat tgcttttaga gacaatttta 20100

ttggtctcat gtattacaac agcacaggta acatgggtgt ccttgctggt caggcatcgc 20160

agttgaacgc tgttgtagat ttgcaagaca gaaacacaga gctgtcctac cagcttttgc 20220

ttgattcaat tggcgacaga acaagatact tttcaatgtg gaatcaagct gttgacagct 20280

atgatccaga tgtcagaatt attgagaacc atggaactga ggatgagttg ccaaattatt 20340

gctttcctct tggtggaatt gggattactg acacttttca agctgttaaa acaactgctg 20400

ctaacgggga ccaaggcaat actacctggc aaaaagattc aacatttgca gaacgcaatg 20460

aaataggggt gggaaataac tttgccatgg aaattaacct gaatgccaac ctatggagaa 20520

atttccttta ctccaatatt gcgctgtacc tgccagacaa gctaaaatac aaccccacca 20580

atgtggaaat atctgacaac cccaacacct acgactacat gaacaagcga gtggtggctc 20640

ctgggcttgt agactgctac attaaccttg gggcgcgctg gtctctggac tacatggaca 20700

acgttaatcc ctttaaccac caccgcaatg cgggcctgcg ttaccgctcc atgttgttgg 20760

gaaacggccg ctacgtgccc tttcacattc aggtgcccca aaagtttttt gccattaaaa 20820

acctcctcct cctgccaggc tcatacacat atgaatggaa cttcaggaag gatgttaaca 20880

tggttctgca gagctctctg ggaaacgacc ttagagttga cggggctagc attaagtttg 20940

acagcatttg tctttacgcc accttcttcc ccatggccca caacacggcc tccacgctgg 21000

aagccatgct cagaaatgac accaacgacc agtcctttaa tgactacctt tccgccgcca 21060

acatgctata tcccataccc gccaacgcca ccaacgtgcc catctccatc ccatcgcgca 21120

actgggcagc atttcgcggt tgggccttca cacgcttgaa gacaaaggaa accccttccc 21180

tgggatcagg ctacgaccct tactacacct actctggctc cataccatac cttgacggaa 21240

ccttctatct taatcacacc tttaagaagg tggccattac ttttgactct tctgttagct 21300

ggccgggcaa cgaccgcctg cttactccca atgagtttga gattaagcgc tcagttgacg 21360

gggagggcta taacgtagct cagtgcaaca tgacaaagga ctggttccta gtgcagatgt 21420

tggccaacta caatattggc taccagggct tctacattcc agaaagctac aaagaccgca 21480

tgtactcgtt cttcagaaac ttccagccca tgagccggca agtggtggac gatactaaat 21540

acaaagatta tcagcaggtt ggaattatcc accagcataa caactcaggc ttcgtaggct 21600

acctcgctcc caccatgcgc gagggacaag cttaccccgc taatgttccc tacccactaa 21660

taggcaaaac cgcggttgat agtattaccc agaaaaagtt tctttgcgac cgcaccctgt 21720

ggcgcatccc cttctccagt aactttatgt ccatgggtgc gctcacagac ctgggccaaa 21780

accttctcta cgcaaactcc gcccacgcgc tagacatgac ctttgaggtg gatcccatgg 21840

acgagcccac ccttctttat gttttgtttg aagtctttga cgtggtccgt gtgcaccagc 21900

cgcaccgcgg cgtcatcgag accgtgtacc tgcgcacgcc cttctcggcc ggcaacgcca 21960

caacataaag aagcaagcaa catcaacaac agctgccgcc atgggctcca gtgagcagga 22020

actgaaagcc attgtcaaag atcttggttg tgggccatat tttttgggca cctatgacaa 22080

gcgcttccca ggctttgttt ccccacacaa gctcgcctgc gccatagtta acacggccgg 22140

tcgcgagact gggggcgtac actggatggc ctttgcctgg aacccgcgct caaaaacatg 22200

ctacctcttt gagccctttg gcttttctga ccaacgtctc aagcaggttt accagtttga 22260

gtacgagtca ctcctgcgcc gtagcgccat tgcctcttcc cccgaccgct gtataacgct 22320

ggaaaagtcc acccaaagcg tgcaggggcc caactcggcc gcctgtggcc tattctgctg 22380

catgtttctc cacgcctttg ccaactggcc ccaaactccc atggatcaca accccaccat 22440

gaaccttatt accggggtac ccaactccat gcttaacagt ccccaggtac agcccaccct 22500

gcgccgcaac caggaacagc tctacagctt cctggagcgc cactcgccct acttccgcag 22560

ccacagtgcg caaattagga gcgccacttc tttttgtcac ttgaaaaaca tgtaaaaata 22620

atgtactagg agacactttc aataaaggca aatgttttta tttgtacact ctcgggtgat 22680

tatttacccc cacccttgcc gtctgcgccg tttaaaaatc aaaggggttc tgccgcgcat 22740

cgctatgcgc cactggcagg gacacgttgc gatactggtg tttagtgctc cacttaaact 22800

caggcacaac catccgcggc agctcggtga agttttcact ccacaggctg cgcaccatca 22860

ccaacgcgtt tagcaggtcg ggcgccgata tcttgaagtc gcagttgggg cctccgccct 22920

gcgcgcgcga gttgcgatac acagggttac agcactggaa cactatcagc gccgggtggt 22980

gcacgctggc cagcacgctc ttgtcggaga tcagatccgc gtccaggtcc tccgcgttgc 23040

tcagggcgaa cggagtcaac tttggtagct gccttcccaa aaagggtgca tgcccaggct 23100

ttgagttgca ctcgcaccgt agtggcatca gaaggtgacc gtgcccagtc tgggcgttag 23160

gatacagcgc ctgcatgaaa gccttgatct gcttaaaagc cacctgagcc tttgcgcctt 23220

cagagaagaa catgccgcaa gacttgccgg aaaactgatt ggccggacag gccgcgtcat 23280

gcacgcagca ccttgcgtcg gtgttggaga tctgcaccac atttcggccc caccggttct 23340

tcacgatctt ggccttgcta gactgctcct tcagcgcgcg ctgcccgttt tcgctcgtca 23400

catccatttc aatcacgtgc tccttattta tcataatgct cccgtgtaga cacttaagct 23460

cgccttcgat ctcagcgcag cggtgcagcc acaacgcgca gcccgtgggc tcgtggtgct 23520

tgtaggttac ctctgcaaac gactgcaggt acgcctgcag gaatcgcccc atcatcgtca 23580

caaaggtctt gttgctggtg aaggtcagct gcaacccgcg gtgctcctcg tttagccagg 23640

tcttgcatac ggccgccaga gcttccactt ggtcaggcag tagcttgaag tttgccttta 23700

gatcgttatc cacgtggtac ttgtccatca acgcgcgcgc agcctccatg cccttctccc 23760

acgcagacac gatcggcagg ctcagcgggt ttatcaccgt gctttcactt tccgcttcac 23820

tggactcttc cttttcctct tgcatccgca taccccgcgc cactgggtcg tcttcattca 23880

gccgccgcac cgtgcgctta cctcccttgc cgtgcttgat tagcaccggt gggttgctga 23940

aacccaccat ttgtagcgcc acatcttctc tttcttcctc gctgtccacg atcacctctg 24000

gggatggcgg gcgctcgggc ttgggagagg ggcgcttctt tttctttttg gacgcaatgg 24060

ccaaatccgc cgtcgaggtc gatggccgcg ggctgggtgt gcgcggcacc agcgcatctt 24120

gtgacgagtc ttcttcgtcc tcggactcga gacgccgcct cagccgcttt tttgggggcg 24180

cgcggggagg cggcggcgac ggcgacgggg acgagacgtc ctccatggtt ggtggacgtc 24240

gcgccgcacc gcgtccgcgc tcgggggtgg tttcgcgctg ctcctcttcc cgactggcca 24300

tttccttctc ctataggcag aaaaagatca tggagtcagt cgagaaggag gacagcctaa 24360

ccgccccctt tgagttcgcc accaccgcct ccaccgatgc cgccaacgcg cctaccacct 24420

tccccgtcga ggcacccccg cttgaggagg aggaagtgat tatcgagcag gacccaggtt 24480

ttgtaagcga agacgacgaa gatcgctcag taccaacaga ggataaaaag caagaccagg 24540

acgacgcaga ggcaaacgag gaacaagtcg ggcgggggga ccaaaggcat ggcgactacc 24600

tagatgtggg agacgacgtg ctgttgaagc atctgcagcg ccagtgcgcc attatctgcg 24660

acgcgttgca agagcgcagc gatgtgcccc tcgccatagc ggatgtcagc cttgcctacg 24720

aacgccacct gttctcaccg cgcgtacccc ccaaacgcca agaaaacggc acatgcgagc 24780

ccaacccgcg cctcaacttc taccccgtat ttgccgtgcc agaggtgctt gccacctatc 24840

acatcttttt ccaaaactgc aagatacccc tatcctgccg tgccaaccgc agccgagcgg 24900

acaagcagct ggccttgcgg cagggcgctg tcatacctga tatcgcctcg ctcgacgaag 24960

tgccaaaaat ctttgagggt cttggacgcg acgagaagcg cgcggcaaac gctctgcaac 25020

aagaaaacag cgaaaatgaa agtcactgtg gagtgctggt ggaacttgag ggtgacaacg 25080

cgcgcctagc cgtgctgaaa cgcagcatcg aggtcaccca ctttgcctac ccggcactta 25140

acctaccccc caaggttatg agcacagtca tgagcgagct gatcgtgcgc cgtgcacgac 25200

ccctggagag ggatgcaaac ttgcaagaac aaaccgagga gggcctaccc gcagttggcg 25260

atgagcagct ggcgcgctgg cttgagacgc gcgagcctgc cgacttggag gagcgacgca 25320

agctaatgat ggccgcagtg cttgttaccg tggagcttga gtgcatgcag cggttctttg 25380

ctgacccgga gatgcagcgc aagctagagg aaacgttgca ctacaccttt cgccagggct 25440

acgtgcgcca ggcctgcaaa atttccaacg tggagctctg caacctggtc tcctaccttg 25500

gaattttgca cgaaaaccgc cttgggcaaa acgtgcttca ttccacgctc aagggcgagg 25560

cgcgccgcga ctacgtccgc gactgcgttt acttatttct gtgctacacc tggcaaacgg 25620

ccatgggcgt gtggcagcag tgcctggagg agcgcaacct gaaggagctg cagaagctgc 25680

taaagcaaaa cttgaaggac ctatggacgg ccttcaacga gcgctccgtg gccgcgcacc 25740

tggcggacat tatcttcccc gaacgcctgc ttaaaaccct gcaacagggt ctgccagact 25800

tcaccagtca aagcatgttg caaaacttta ggaactttat cctagagcgt tcaggaattc 25860

tgcccgccac ctgctgtgcg cttcctagcg actttgtgcc cattaagtac cgtgaatgcc 25920

ctccgccgct ttggggtcac tgctaccttc tgcagctagc caactacctt gcctaccact 25980

ccgacatcat ggaagacgtg agcggtgacg gcctactgga gtgtcactgt cgctgcaacc 26040

tatgcacccc gcaccgctcc ctggtctgca attcacaact gcttagcgaa agtcaaatta 26100

tcggtacctt tgagctgcag ggtccctcgc ctgacgaaaa gtccgcggct ccggggttga 26160

aactcactcc ggggctgtgg acgtcggctt accttcgcaa atttgtacct gaggactacc 26220

acgcccacga gattaggttc tacgaagacc aatcccgccc gccaaatgcg gagcttaccg 26280

cctgcgtcat tacccagggc cacatccttg gccaattgca agccattaac aaagcccgcc 26340

aagagtttct gctacgaaag ggacgggggg tttacttgga cccccagtcc ggcgaggagc 26400

tcaacccaat ccccccgccg ccgcagccct atcagcagcc gcgggccctt gcttcccagg 26460

atggcaccca aaaagaagct gcagctgccg ccgccgccac ccacggacga ggaggaatac 26520

tgggacagtc aggcagagga ggttttggac gaggaggagg agatgatgga agactgggac 26580

agcctagacg aggaagcttc cgaggccgaa gaggtgtcag acgaaacacc gtcaccctcg 26640

gtcgcattcc cctcgccggc gccccagaaa tcggcaaccg ttcccagcat tgctacaacc 26700

tccgctcctc aggcgccgcc ggcactgccc gttcgccgac ccaaccgtag atgggacacc 26760

actggaacca gggccggtaa gtctaagcag ccgccgccgt tagcccaaga gcaacaacag 26820

cgccaaggct accgctcgtg gcgcgtgcac aagaacgcca tagttgcttg cttgcaagac 26880

tgtgggggca acatctcctt cgcccgccgc tttcttctct accatcacgg cgtggccttc 26940

ccccgtaaca tcctgcatta ctaccgtcat ctctacagcc cctactgcac cggcggcagc 27000

ggcagcaaca gcagcggcca cgcagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa 27060

gcccaagaaa tccacagcgg cggcagcagc aggaggagga gcactgcgtc tggcgcccaa 27120

cgaacccgta tcgacccgcg agcttagaaa caggattttt cccactctgt atgctatatt 27180

tcaacagagc aggggccaag aacaagagct gaaaataaaa aacaggtctc tgcgctccct 27240

cacccgcagc tgcctgtatc acaaaagcga agatcagctt cggcgcacgc tggaagacgc 27300

ggaggctctc ttcagcaaat actgcgcgct gactcttaag gactagtttc gcgccctttc 27360

tcaaatttaa gcgcgaaaac tacgtcatct ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt 27420

cgtcagcgcc attatgagca aggaaattcc cacgccctac atgtggagtt accagccaca 27480

aatgggactt gcggctggag ctgcccaaga ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc 27540

gggaccccac atgatatccc gggtcaacgg aatccgcgcc caccgaaacc gaattctcct 27600

cgaacaggcg gctattacca ccacacctcg taataacctt aatccccgta gttggcccgc 27660

tgccctggtg taccaggaaa gtcccgctcc caccactgtg gtacttccca gagacgccca 27720

ggccgaagtt cagatgacta actcaggggc gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt 27780

gcggtcgccc gggcagggta taactcacct gaaaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa 27840

cgacgagtcg gtgagctcct ctcttggtct ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg 27900

cgctggccgc tcttcattta cgccccgtca ggcgatccta actctgcaga cctcgtcctc 27960

ggagccgcgc tccggaggca ttggaactct acaatttatt gaggagttcg tgccttcggt 28020

ttacttcaac cccttttctg gacctcccgg ccactacccg gaccagttta ttcccaactt 28080

tgacgcggta aaagactcgg cggacggcta cgactgaatg accagtggag aggcagagca 28140

actgcgcctg acacacctcg accactgccg ccgccacaag tgctttgccc gcggctccgg 28200

tgagttttgt tactttgaat tgcccgaaga gcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg 28260

gctcaccacc caggtagagc ttacacgtag cctgattcgg gagtttacca agcgccccct 28320

gctagtggag cgggagcggg gtccctgtgt tctgaccgtg gtttgcaact gtcctaaccc 28380

tggattacat caagatcttt gttgtcatct ctgtgctgag tataataaat acagaaatta 28440

gaatctactg gggctcctgt cgccatcctg tgaacgccac cgtttttacc cacccaaagc 28500

agaccaaagc aaacctcacc tccggtttgc acaagcgggc caataagtac cttacctggt 28560

actttaacgg ctcttcattt gtaatttaca acagtttcca gcgagacgaa gtaagtttgc 28620

cacacaacct tctcggcttc aactacaccg tcaagaaaaa caccaccacc accctcctca 28680

cctgccggga acgtacgagt gcgtcaccgg ttgctgcgcc cacacctaca gcctgagcgt 28740

aaccagacat tactcccatt ttcccaaaac aggaggtgag ctcaactccc ggaactcagg 28800

tcaaaaaagc attttgcggg gtgctgggat tttttaatta agtatatgtg gctgcagagc 28860

ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc 28920

agcacgcagc cctgggagca tgtgaatgcc atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg 28980

agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac 29040

ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc 29100

agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc atgatggcca gccactacaa gcagcactgc 29160

cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc cagattatca cctttgaaag tttcaaagag 29220

aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc tttgactgct gggagccagt ccaggagtga 29280

agctattttc cgcttgcttg tattcccctg gacaatttac tctatgtggg atatgcgcca 29340

ggcgggaaag attataccca caaccttcaa atcaaacttt cctggacgtt agcgcctgac 29400

ttctgccagc gcctgcactg caaatttgat caaacccagc ttcagcttgc ctgctccaga 29460

gatgaccggc tcaaccatcg cgcccacaac ggactatcgc aacaccactg ctaccggact 29520

aaaatctgcc ctaaatttac cccaagttca tgcctttgtc aatgactggg cgagcttggg 29580

catgtggtgg ttttccatag cgcttatgtt tgtttgcctt attattatgt ggcttatttg 29640

ttgcctaaag cgcagacgcg ccagaccccc catctatagg cctatcattg tgctcaaccc 29700

acacaatgaa aaaattcata gattggacgg tctcaaacca tgttctcttc ttttacagta 29760

tgattaaatg agacatgatt cctcgagtcc ttatattatt gacccttgtt gcgcttttct 29820

gtgcgtgctc tacattggct gcggtcgctc acatcgaagt agattgcatc ccacctttca 29880

cagtttacct gctttacgga tttgtcaccc ttatcctcat ctgcagcctc gtcactgtag 29940

tcatcgcctt cattcagttc attgactgga tttgtgtgcg cattgcgtac cttaggcacc 30000

atccgcaata cagagacagg actatagctg atcttctcag aattctttaa ttatgaaacg 30060

gattgtcact tttgttttgc tgattttctg cgccctacct gtgctttgct cccaaacctc 30120

agcgcctccc aaaagacata tttcctgcag attcactcaa atatggaaca ttcccagctg 30180

ctacaacaaa cagagcgatt tgtcagaagc ctggttatac gccatcatct ctgtcatggt 30240

tttttgcagt accatttttg ccctagccat atacccatac cttgacattg gttggaatgc 30300

catagatgcc atgaaccacc ctactttccc agcgcccaat gtcataccac tgcaacaggt 30360

tattgcccca atcaatcagc ctcgcccccc ttctcccacc cccactgaga ttagctactt 30420

taatttgaca ggtggagatg actgaatctc tagatctaga attggatgga attaacaccg 30480

aacagcgcct actagaaagg cgcaaggcgg cgtccgagcg agaacgccta aaacaagaag 30540

ttgaagacat ggttaacctg caccagtgta aaagaggtat cttttgtgtg gtcaagcagg 30600

ccaaacttac ctacgaaaaa accactaccg gcaaccgcct tagctacaag ctacccaccc 30660

agcgccaaaa actggtgctt atggtgggag aaaaacctat caccgtcacc cagcactcgg 30720

cagaaacaga aggctgcctg cacttcccct atcagggtcc agaggacctc tgcactctta 30780

ttaaaaccat gtgtggcatt agagatctta ttccattcaa ctaacaataa acacacaata 30840

aattacttac ttaaaatcag tcagcaaatc tttgtccagc ttattcagca tcacctcctt 30900

tccctcctcc caactctggt atttcagcag ccttttagct gcgaactttc tccaaagtct 30960

aaatgggatg tcaaattcct catgttcttg tccctccgca cccactatct tcatattgtt 31020

gcagatgaaa cgcgccagac cgtctgaaga caccttcaac cctgtgtacc catatgacac 31080

ggaaaccggc cctccaactg tgcctttcct tacccctccc tttgtgtcgc caaatgggtt 31140

ccaagaaagt ccccccggag tgctttcttt gcgtctttca gaacctttgg ttacctcaca 31200

cggcatgctt gcgctaaaaa tgggcagcgg cctgtccctg gatcaggcag gcaaccttac 31260

atcaaataca atcactgttt ctcaaccgct aaaaaaaaca aagtccaata taactttgga 31320

aacatccgcg ccccttacag tcagctcagg cgccctaacc atggccacaa cttcgccttt 31380

ggtggtctct gacaacactc ttaccatgca atcacaagca ccgctaaccg tgcaagactc 31440

aaaacttagc attgctacca aagagccact tacagtgtta gatggaaaac tggccctgca 31500

gacatcagcc cccctctctg ccactgataa caacgccctc actatcactg cctcacctcc 31560

tcttactact gcaaatggta gtctggctgt taccatggaa aacccacttt acaacaacaa 31620

tggaaaactt gggctcaaaa ttggcggtcc tttgcaagtg gccaccgact cacatgcact 31680

aacactaggt actggtcagg gggttgcagt tcataacaat ttgctacata caaaagttac 31740

aggcgcaata gggtttgata catctggcaa catggaactt aaaactggag atggcctcta 31800

tgtggatagc gccggtccta accaaaaact acatattaat ctaaatacca caaaaggcct 31860

tgcttttgac aacaccgcaa taacaattaa cgctggaaaa gggttggaat ttgaaacaga 31920

ctcctcaaac ggaaatccca taaaaacaaa aattggatca ggcatacaat ataataccaa 31980

tggagctatg gttgcaaaac ttggaacagg cctcagtttt gacagctccg gagccataac 32040

aatgggcagc ataaacaatg acagacttac tctttggaca acaccagacc catccccaaa 32100

ttgcagaatt gcttcagata aagactgcaa gctaactctg gcgctaacaa aatgtggcag 32160

tcaaattttg ggcactgttt cagctttggc agtatcaggt aatatggcct ccatcaatgg 32220

aactctaagc agtgtaaact tggttcttag atttgatgac aacggagtgc ttatgtcaaa 32280

ttcatcactg gacaaacagt attggaactt tagaaacggg gactccacta acggtcaacc 32340

atacacttat gctgttgggt ttatgccaaa cctaaaagct tacccaaaaa ctcaaagtaa 32400

aactgcaaaa agtaatattg ttagccaggt gtatcttaat ggtgacaagt ctaaaccatt 32460

gcattttact attacgctaa atggaacaga tgaaaccaac caagtaagca aatactcaat 32520

atcattcagt tggtcctgga acagtggaca atacactaat gacaaatttg ccaccaattc 32580

ctataccttc tcctacattg cccaggaata aagaatcgtg aacctgttgc atgttatgtt 32640

tcaacgtgtt tatttttcaa ttgcagaaaa tttcaagtca tttttcattc agtagtatag 32700

ccccaccacc acatagctta tactaatcac cgtaccttaa tcaaactcac agaaccctag 32760

tattcaacct gccacctccc tcccaacaca cagagtacac agtcctttct ccccggctgg 32820

ccttaaacag catcatatca tgggtaacag acatattctt aggtgttata ttccacacgg 32880

tctcctgtcg agccaaacgc tcatcagtga tgttaataaa ctccccgggc agctcgctta 32940

agttcatgtc gctgtccagc tgctgagcca caggctgctg tccaacttgc ggttgctcaa 33000

cgggcggcga aggagaagtc cacgcctaca tgggggtaga gtcataatcg tgcatcagga 33060

tagggcggtg gtgctgcagc agcgcgcgaa taaactgctg ccgccgccgc tccgtcctgc 33120

aggaatacaa catggcagtg gtctcctcag cgatgattcg caccgcccgc agcataaggc 33180

gccttgtcct ccgggcacag cagcgcaccc tgatctcact taagtcagca cagtaactgc 33240

agcacagtac cacaatattg tttaaaatcc cacagtgcaa ggcgctgtat ccaaagctca 33300

tggcggggac cacagaaccc acgtggccat cataccacaa gcgcaggtag attaagtggc 33360

gacccctcat aaacacgctg gacataaaca ttacctcttt tggcatgttg taattcacca 33420

cctcccggta ccatataaac ctctgattaa acatggcgcc atccaccacc atcctaaacc 33480

agctggccaa aacctgcccg ccggctatgc actgcaggga accgggactg gaacaatgac 33540

agtggagagc ccaggactcg taaccatgga tcatcatgct cgtcatgata tcaatgttgg 33600

cacaacacag gcacacgtgc atacacttcc tcaggattac aagctcctcc cgcgtcagaa 33660

ccatatccca gggaacaacc cattcctgaa tcagcgtaaa tcccacactg cagggaagac 33720

ctcgcacgta actcacgttg tgcattgtca aagtgttaca ttcgggcagc agcggatgat 33780

cctccagtat ggtagcgcgt gtctctgtct caaaaggagg taggcgatcc ctactgtacg 33840

gagtgcgccg agacaaccga gatcgtgttg gtcgtagtgt catgccaaat ggaacgccgg 33900

acgtagtcat atttcctgaa gcaaaaccag gtgcgggcgt gacaaacaga tctgcgtctc 33960

cggtctcgtc gcttagctcg ctctgtgtag tagttgtagt atatccactc tctcaaagca 34020

tccaggcgcc ccctggcttc gggttctatg taaactcctt catgcgccgc tgccctgata 34080

acatccacca ccgcagaata agccacaccc agccaaccta cacattcgtt ctgcgagtca 34140

cacacgggag gagcgggaag agctggaaga accatgtttt tttttttttt attccaaaag 34200

attatccaaa acctcaaaat gaagatctat taagtgaacg cgctcccctc cggtggcgtg 34260

gtcaaactct acagccaaag aacagataat ggcatttgta agatgttgca caatggcttc 34320

caaaaggcaa actgccctca cgtccaagtg gacgtaaagg ctaaaccctt cagggtgaat 34380

ctcctctata aacattccag caccttcaac catgcccaaa taattttcat ctcgccacct 34440

tatcaatatg tctctaagca aatcccgaat attaagtccg gccattgtaa aaatctgctc 34500

cagagcgccc tccaccttca gcctcaagca gcgaatcatg attgcaaaaa ttcaggttcc 34560

tcacagacct gtataagatt caaaagcgga acattaacaa aaataccgcg atcccgtagg 34620

tcccttcgca gggccagctg aacataatcg tgcaggtctg cacggaccag cgcggccact 34680

tccccgccag gaaccatgac aaaagaaccc acactgatta tgacacgcat actcggagct 34740

atgctaacca gcgtagcccc gatgtaagct tgttgcatgg gcggcgatat aaaatgcaag 34800

gtactgctca aaaaatcagg caaagcctcg cgcaaaaaag caagcacatc gtagtcatgc 34860

tcatgcagat aaaggcaggt aagttccgga accaccacag aaaaagacac catttttctc 34920

tcaaacatgt ctgcgggttc ctgcataaac acaaaataaa ataacaaaaa aaaaaaaaaa 34980

catttaaaca ttagaagcct gtcttacaac aggaaaaaca acccttataa gcataagacg 35040

gactacggcc atgccggcgt gaccgtaaaa aaactggtca ccgtgattaa aaagcaccac 35100

cgacagttcc tcggtcatgt ccggagtcat aatgtaagac tcggtaaaca catcaggttg 35160

gttaacatcg gtcagtgcta aaaagcgacc gaaatagccc gggggaatac atacccgcag 35220

gcgtagagac aacattacag cccccatagg aggtataaca aaattaatag gagagaaaaa 35280

cacataaaca cctgaaaaac cctcctgcct aggcaaaata gcaccctccc gctccagaac 35340

aacatacagc gcttccacag cggcagccat aacagtcagc cttaccagta aaaaaaccta 35400

ttaaaaaaca ccactcgaca cggcaccagc tcaatcagtc acagtgtaaa aagggccaag 35460

tacagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaacca 35520

cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc 35580

tcaaatcttc acttccgttt tcccacgata cgtcacttcc cattttaaaa aaaaaactac 35640

aattcccaat acatgcaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc ccgttcccac 35700

gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca atccaaaata 35760

aggtatatta ttgatgatg 35779

<---

Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, содержащий встройку промотора теломеразы человека hTERT, структура которого соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, позиции 10854-11273 в месте удаленного промотора гена Е1А между позициями, соответствующими позициям нуклеотидов 357-558 штамма Ад6 Tonsil99, а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, структура которого соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, позиции 36-469, в месте удаленных генов Е3-6.7k и E3-gp19k между позициями 28608 и 29270; обладающий избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор.